JP3507860B2 - 酵母由来の新規リパーゼｃｓ２ - Google Patents
酵母由来の新規リパーゼｃｓ２Info
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- JP3507860B2 JP3507860B2 JP2000068227A JP2000068227A JP3507860B2 JP 3507860 B2 JP3507860 B2 JP 3507860B2 JP 2000068227 A JP2000068227 A JP 2000068227A JP 2000068227 A JP2000068227 A JP 2000068227A JP 3507860 B2 JP3507860 B2 JP 3507860B2
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- JP
- Japan
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- lipase
- stable
- activity
- cryptococcus
- triolein
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リパーゼに関する
ものであり、更に詳細には、油脂分解能が高いだけでな
く、弱酸性からアルカリ性までの広い範囲で強い油脂分
解活性を示し、更に有機溶媒に安定であるといった数多
くの有用な性質を有する従来未知の新規リパーゼに関す
るものである。
ものであり、更に詳細には、油脂分解能が高いだけでな
く、弱酸性からアルカリ性までの広い範囲で強い油脂分
解活性を示し、更に有機溶媒に安定であるといった数多
くの有用な性質を有する従来未知の新規リパーゼに関す
るものである。
【０００２】したがって本発明に係る新規リパーゼは、
油脂分解に利用できることはもちろんのこと、試薬、医
薬成分、特定保健用飲食品成分、洗剤、化粧品その他広
範囲な用途に利用することができ、また、特に有機溶媒
に安定であるという特質から、エステル交換反応やエス
テル合成にも利用できるものと期待される。
油脂分解に利用できることはもちろんのこと、試薬、医
薬成分、特定保健用飲食品成分、洗剤、化粧品その他広
範囲な用途に利用することができ、また、特に有機溶媒
に安定であるという特質から、エステル交換反応やエス
テル合成にも利用できるものと期待される。
【０００３】
【従来の技術】リパーゼは、トリグリセリドに作用し、
グリセリンと脂肪酸に加水分解する酵素であり、現在、
多くのリパーゼが薬品、食品、洗剤等に広く使用されて
いる。一方、リパーゼは分解だけでなく、逆反応の合成
作用も触媒することができ、有機溶媒中において有用な
アシルグリセロールの生産に使用することも可能である
が、多くのリパーゼは有機溶媒中で不安定であるのが難
点であった。
グリセリンと脂肪酸に加水分解する酵素であり、現在、
多くのリパーゼが薬品、食品、洗剤等に広く使用されて
いる。一方、リパーゼは分解だけでなく、逆反応の合成
作用も触媒することができ、有機溶媒中において有用な
アシルグリセロールの生産に使用することも可能である
が、多くのリパーゼは有機溶媒中で不安定であるのが難
点であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記したよ
うにリパーゼが有する数多くの有用性に鑑み、従来未知
の新規リパーゼを新たに開発する目的でなされたもので
ある。
うにリパーゼが有する数多くの有用性に鑑み、従来未知
の新規リパーゼを新たに開発する目的でなされたもので
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
達成のために各方面から検討の結果、多数の酵母を自然
界から分離し、その性質についての研究の過程におい
て、クリプトコッカスエスピー S−2が、α−アミラー
ゼ、キシラナーゼ等の酵素のほか、本菌は、多量のリパ
ーゼ（１種類）を生産分泌し、その酵素は中性からアル
カリ性で強い油脂分解性を示すこと、さらに、本酵素は
ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサンなどの有機
溶媒に安定であることより、近年注目されている有機溶
媒存在下でのエステル交換反応やエステル合成にも有効
であろうことを知った。
達成のために各方面から検討の結果、多数の酵母を自然
界から分離し、その性質についての研究の過程におい
て、クリプトコッカスエスピー S−2が、α−アミラー
ゼ、キシラナーゼ等の酵素のほか、本菌は、多量のリパ
ーゼ（１種類）を生産分泌し、その酵素は中性からアル
カリ性で強い油脂分解性を示すこと、さらに、本酵素は
ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサンなどの有機
溶媒に安定であることより、近年注目されている有機溶
媒存在下でのエステル交換反応やエステル合成にも有効
であろうことを知った。
【０００６】本発明は、上記新知見に基づいてなされた
ものであって、本酵素の理化学的性質を研究して本酵素
が従来未知の新規酵素であることを確認し、更に、その
分離、精製に成功しただけでなく、その大量生産法の確
立にも成功し、遂に本発明を完成したものである。以
下、本発明について詳述する。
ものであって、本酵素の理化学的性質を研究して本酵素
が従来未知の新規酵素であることを確認し、更に、その
分離、精製に成功しただけでなく、その大量生産法の確
立にも成功し、遂に本発明を完成したものである。以
下、本発明について詳述する。
【０００７】本発明に係るリパーゼは、次のような理化
学的性質を有するものである。
学的性質を有するものである。
【０００８】（１）作用
油脂分解性にすぐれ、トリグリセリドに作用して、グリ
セリンと脂肪酸に加水分解する。
セリンと脂肪酸に加水分解する。
【０００９】（２）基質特異性
各脂肪酸のトリグリセライド及びオイルに対する基質特
異性は、下記表１に示すとおりである。
異性は、下記表１に示すとおりである。
【００１０】
＊各基質の比活性はトリオレインに対する比活性を１００としたときの％で示
した。
【００１１】本酵素は、トリグリセライドの内、トリブ
チリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレイ
ンを効率よく分解する。一方トリアセチン、トリカプリ
ン、トリラウリンは中程度、トリミリスチン、トリステ
アリンに対しては分解力が弱かった。本酵素は、テスト
した全てのオイルに対し良好な分解活性を示し、特に米
糠油、イワシ油をよく分解した。
チリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレイ
ンを効率よく分解する。一方トリアセチン、トリカプリ
ン、トリラウリンは中程度、トリミリスチン、トリステ
アリンに対しては分解力が弱かった。本酵素は、テスト
した全てのオイルに対し良好な分解活性を示し、特に米
糠油、イワシ油をよく分解した。
【００１２】（３）位置特異性
本酵素がトリオレインに作用する際の、分解の位置特異
性を調べた。酵素反応により、オレイン酸と少量の１，
２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレイ
ンとモノオレインは検出されなかった。
性を調べた。酵素反応により、オレイン酸と少量の１，
２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレイ
ンとモノオレインは検出されなかった。
【００１３】（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
精製酵素の反応至適ｐＨは７．０であった。ｐＨ８．０
においても高い活性を示した。またｐＨの安定性ではｐ
Ｈ５からｐＨ９において安定であり、弱酸性から弱アル
カリ性まで広い範囲で機能するリパーゼであった。（図
１）
においても高い活性を示した。またｐＨの安定性ではｐ
Ｈ５からｐＨ９において安定であり、弱酸性から弱アル
カリ性まで広い範囲で機能するリパーゼであった。（図
１）
【００１４】（５）反応最適温度及び温度による失活の
条件 反応最適温度は３７℃であった。しかし温度上昇による
活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理に
おいても７１％の活性を維持していた。（図２）なお、
これらの図面において−◆−は活性、−■−は安定性、
Relative activityは比活性、Residual activityは残存
活性をそれぞれ示す。
条件 反応最適温度は３７℃であった。しかし温度上昇による
活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理に
おいても７１％の活性を維持していた。（図２）なお、
これらの図面において−◆−は活性、−■−は安定性、
Relative activityは比活性、Residual activityは残存
活性をそれぞれ示す。
【００１５】（６）阻害、活性化及び安定化
種々の有機溶媒を０、２．５、５．０、７．５、１０．
０％の濃度で添加し、リパーゼの活性に与える効果を調
査し、下記表２の結果を得た。その結果、本リパーゼ
は、ベンゼンを除く各種有機溶媒に安定であり、ＤＭＳ
Ｏ（dimethylsulfoxide）、ジエチルエーテルによって
はむしろ活性の上昇がみられ、ＤＭＳＯ７．５％の状態
において６４．２％の活性上昇が見られた。
０％の濃度で添加し、リパーゼの活性に与える効果を調
査し、下記表２の結果を得た。その結果、本リパーゼ
は、ベンゼンを除く各種有機溶媒に安定であり、ＤＭＳ
Ｏ（dimethylsulfoxide）、ジエチルエーテルによって
はむしろ活性の上昇がみられ、ＤＭＳＯ７．５％の状態
において６４．２％の活性上昇が見られた。
【００１６】
＊比活性（％）は、各種溶媒濃度（％、ｖ／ｖ）における比活性を示す。
【００１７】このように、本リパーゼが有機溶媒に安定
であることは特記すべきことである。近年リパーゼを使
用したエステル交換反応やエステル合成が注目されるよ
うになってきた。リパーゼによるエステル交換反応やエ
ステル合成は、有機溶媒とわずかな水の混在する系によ
りはじめてその反応が進行するが、一般にリパーゼはそ
のような有機溶媒と水の混在する系では不安定であるこ
とが問題であった。ところが本リパーゼは、ジエチルエ
ーテル、クロロホルム、ヘキサンの存在によっても５０
％以上の活性と安定性を示すことより、エステル交換反
応やエステル合成に有効であることが大いに期待され
る。
であることは特記すべきことである。近年リパーゼを使
用したエステル交換反応やエステル合成が注目されるよ
うになってきた。リパーゼによるエステル交換反応やエ
ステル合成は、有機溶媒とわずかな水の混在する系によ
りはじめてその反応が進行するが、一般にリパーゼはそ
のような有機溶媒と水の混在する系では不安定であるこ
とが問題であった。ところが本リパーゼは、ジエチルエ
ーテル、クロロホルム、ヘキサンの存在によっても５０
％以上の活性と安定性を示すことより、エステル交換反
応やエステル合成に有効であることが大いに期待され
る。
【００１８】（７）リパーゼ活性の測定法
リパーゼ活性は、p-nitorophenyl laurate (p-NPL)を反
応基質とした４１０nmの吸光度法にて測定した。また必
要に応じ、オリーブオイルを基質とした滴定法にてリパ
ーゼ活性を測定した。
応基質とした４１０nmの吸光度法にて測定した。また必
要に応じ、オリーブオイルを基質とした滴定法にてリパ
ーゼ活性を測定した。
【００１９】（８）分子量
２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２０】本酵素は、上記した理化学的性質からみ
て、従来既知のリパーゼにはこのようなタイプの酵素は
見当らず、新規物質と認定し、これをリパーゼＣＳ２と
命名した（なお、これをＣＳ２リパーゼということもあ
る）。
て、従来既知のリパーゼにはこのようなタイプの酵素は
見当らず、新規物質と認定し、これをリパーゼＣＳ２と
命名した（なお、これをＣＳ２リパーゼということもあ
る）。
【００２１】本発明に係る新規酵素は、微生物、例えば
クリプトコッカス属に属するＳ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５１５５）（以下、Ｓ−２株ということもある）の培
養物から分離、取得することができる。ここに創製分離
された菌株は、新規酵素（リパーゼＣＳ２）を生産分泌
できる点できわめて特徴的であり、これをCryptococcus
sp. S-2と命名し、工業技術院生命工学工業研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５１５５として寄託した。
クリプトコッカス属に属するＳ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５１５５）（以下、Ｓ−２株ということもある）の培
養物から分離、取得することができる。ここに創製分離
された菌株は、新規酵素（リパーゼＣＳ２）を生産分泌
できる点できわめて特徴的であり、これをCryptococcus
sp. S-2と命名し、工業技術院生命工学工業研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１５１５５として寄託した。
【００２２】本酵素は、Ｓ−２株を常法にしたがって培
養し、培養物から分離、精製することにより取得するこ
とができる。例えば、ＹＭ培地（酵母エキス０．３％、
麦芽エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース１
％）にて２５℃、４０時間前培養（５．４〜５．８×１
０8ケ／ｍｌ）した菌体を通常の本培養への接種菌とす
る。
養し、培養物から分離、精製することにより取得するこ
とができる。例えば、ＹＭ培地（酵母エキス０．３％、
麦芽エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース１
％）にて２５℃、４０時間前培養（５．４〜５．８×１
０8ケ／ｍｌ）した菌体を通常の本培養への接種菌とす
る。
【００２３】酵母エキス０．５％、ＫＨ2ＰＯ4１％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、トリオレイン１％を基本とし、必要
に応じ、窒素、炭素源、そして誘導物質を変化させたも
のを酵素生産培地とした。１００mlの酵素生産培地に、
前培養した菌を１％(v/v)接種し、２５℃１００rpmの振
とう培養にて、酵素の生産を行えばよい。トリオレイン
は添加しなくてもよいが、Cryptococcus sp. S-2による
リパーゼの生産はオリーブオイル、トリオレインなどの
油脂を炭素源にすることでグルコース培地より約３倍の
リパーゼ活性の分泌が見られ、油脂を炭素源にすること
でリパーゼの生産は優位に高められる。油脂としては、
上記のほかにイワシ油、大豆油、トリグリセリドなどか
ら選ばれる少なくともひとつを使用すると好適である。
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、トリオレイン１％を基本とし、必要
に応じ、窒素、炭素源、そして誘導物質を変化させたも
のを酵素生産培地とした。１００mlの酵素生産培地に、
前培養した菌を１％(v/v)接種し、２５℃１００rpmの振
とう培養にて、酵素の生産を行えばよい。トリオレイン
は添加しなくてもよいが、Cryptococcus sp. S-2による
リパーゼの生産はオリーブオイル、トリオレインなどの
油脂を炭素源にすることでグルコース培地より約３倍の
リパーゼ活性の分泌が見られ、油脂を炭素源にすること
でリパーゼの生産は優位に高められる。油脂としては、
上記のほかにイワシ油、大豆油、トリグリセリドなどか
ら選ばれる少なくともひとつを使用すると好適である。
【００２４】Ｓ−２株の培養は、酵母の培養と同様に実
施すればよいが、上記のように炭素源として油脂を使用
すると酵素の生産が上昇する。また、窒素源として酵母
エキス、糖としてラクトースを追加使用することで、酵
素の生産がさらに上昇する。
施すればよいが、上記のように炭素源として油脂を使用
すると酵素の生産が上昇する。また、窒素源として酵母
エキス、糖としてラクトースを追加使用することで、酵
素の生産がさらに上昇する。
【００２５】Ｓ−２株を培養した後、本酵素を培養物か
ら分離、精製する。その方法は常法にしたがえばよい
が、例えば培養液を濃縮した後、クロマトグラフィー処
理等既知の精製法を組み合わせて行えばよい。
ら分離、精製する。その方法は常法にしたがえばよい
が、例えば培養液を濃縮した後、クロマトグラフィー処
理等既知の精製法を組み合わせて行えばよい。
【００２６】このようにして得られた本酵素（ＣＳ２リ
パーゼ）は、医薬、化粧品、飲食品、洗剤、試薬その他
各種の用途に広範に利用できるだけでなく、各種の有機
溶媒に安定であるという特質を有するため、有機溶媒存
在下でのエステル交換反応やエステル合成にも利用可能
であって、新しい用途も期待することができる。以下、
本発明の実施例について述べる。
パーゼ）は、医薬、化粧品、飲食品、洗剤、試薬その他
各種の用途に広範に利用できるだけでなく、各種の有機
溶媒に安定であるという特質を有するため、有機溶媒存
在下でのエステル交換反応やエステル合成にも利用可能
であって、新しい用途も期待することができる。以下、
本発明の実施例について述べる。
【００２７】
【実施例１】酵母エキス０．５％、ＫＨ2ＰＯ4１％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、トリオレイン１％を基本培地とし、
これに各種の成分を加えた酵素生産培地に前培養したＳ
−２菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）を１％（v/v）接
種し、２５℃、１００rpmの振とう培養にて、酵素の生
産を行った。
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、トリオレイン１％を基本培地とし、
これに各種の成分を加えた酵素生産培地に前培養したＳ
−２菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）を１％（v/v）接
種し、２５℃、１００rpmの振とう培養にて、酵素の生
産を行った。
【００２８】（１）窒素源
窒素源の酵素生産にあたる影響を、無機窒素源（尿素、
硝酸アンモニウム）、有機窒素源（酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー、カザミノ酸）により比較
検討した。結果、酵母エキスを窒素源とすることで最も
高い生産性が見られた。（図３）
硝酸アンモニウム）、有機窒素源（酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー、カザミノ酸）により比較
検討した。結果、酵母エキスを窒素源とすることで最も
高い生産性が見られた。（図３）
【００２９】図中、Lipase activityはリパーゼ活性、T
ime（ｈ）は時間（時間）、controlは対照、Yeast extr
actは酵母エキス、Peptoneはペプトン，Corn steepliqu
orはコーンスティープリカー、Casamino acidsはカザミ
ノ酸、Ureaは尿素、Ammonium nitrateは硝酸アンモニウ
ムをそれぞれ示す。
ime（ｈ）は時間（時間）、controlは対照、Yeast extr
actは酵母エキス、Peptoneはペプトン，Corn steepliqu
orはコーンスティープリカー、Casamino acidsはカザミ
ノ酸、Ureaは尿素、Ammonium nitrateは硝酸アンモニウ
ムをそれぞれ示す。
【００３０】（２）糖の添加効果
酵母エキス０．５％、ＫＨ2ＳＯ4１％、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ、トリオレインの基本培地に、グルコース、フラ
クトース、ガラクトース、シュークロース、ラクトー
ス、キシロース、スターチを各０．５％添加し、リパー
ゼ生産に与える影響を見た。結果、ラクトースがリパー
ゼの生産を促進することが分かった。（下記表３、図
４）。
Ｈ2Ｏ、トリオレインの基本培地に、グルコース、フラ
クトース、ガラクトース、シュークロース、ラクトー
ス、キシロース、スターチを各０．５％添加し、リパー
ゼ生産に与える影響を見た。結果、ラクトースがリパー
ゼの生産を促進することが分かった。（下記表３、図
４）。
【００３１】
【００３２】そのラクトースの添加効果を、０．２５、
０．５、１、１．５％の濃度で調べたところ、０．５％
で最も高い促進効果を示した。このラクトースの添加に
より、培地中リパーゼ活性は５４．２％上昇し、９６時
間で４０．１U/mlに達した（図５）。なお、これらの図
中において、Lipase activityはリパーゼ活性、Time
（ｈ）は時間（時間）、controlは対照、Glucoseはグル
コース、Fructoseはフラクトース、Galactoseはガラク
トース、Sucroseシュークロース、Lactoseはラクトー
ス、Xyloseはキシロース、Starchはスターチをそれぞれ
示す。
０．５、１、１．５％の濃度で調べたところ、０．５％
で最も高い促進効果を示した。このラクトースの添加に
より、培地中リパーゼ活性は５４．２％上昇し、９６時
間で４０．１U/mlに達した（図５）。なお、これらの図
中において、Lipase activityはリパーゼ活性、Time
（ｈ）は時間（時間）、controlは対照、Glucoseはグル
コース、Fructoseはフラクトース、Galactoseはガラク
トース、Sucroseシュークロース、Lactoseはラクトー
ス、Xyloseはキシロース、Starchはスターチをそれぞれ
示す。
【００３３】（３）オイルの種類とリパーゼ生産
使用するオイルの種類とリパーゼの生産性について検討
した。イワシ油、大豆油、トリオレインはどれも良好な
リパーゼの生産性を示し、なかでもイワシ油、大豆油は
それぞれ、トリオレインに比較し４７．４％、１５．９
％の活性増大が見られた（図６）。しかし将来的な研究
のしやすさを考え、以降の実験は基質としてトリオレイ
ンを用いることとした。なお、図中において、Lipase a
ctivityはリパーゼ活性、Time（ｈ）は時間（時間）、c
ontrolは対照、Trioleinはトリオレイン、Olive oilは
オリーブ油、Soy bean oilは大豆油、Sardine oilはイ
ワシ油をそれぞれ示す。
した。イワシ油、大豆油、トリオレインはどれも良好な
リパーゼの生産性を示し、なかでもイワシ油、大豆油は
それぞれ、トリオレインに比較し４７．４％、１５．９
％の活性増大が見られた（図６）。しかし将来的な研究
のしやすさを考え、以降の実験は基質としてトリオレイ
ンを用いることとした。なお、図中において、Lipase a
ctivityはリパーゼ活性、Time（ｈ）は時間（時間）、c
ontrolは対照、Trioleinはトリオレイン、Olive oilは
オリーブ油、Soy bean oilは大豆油、Sardine oilはイ
ワシ油をそれぞれ示す。
【００３４】（４）オイルと酵母エキス量の関係
トリオレインを１〜３％、酵母エキスを０．５〜２％に
それぞれの範囲で変化させ、リパーゼの生産性を見た。
その結果、トリオレイン１％、酵母エキス１％の組み合
わせで、１２０時間目に６５．７U/mlを示した。（表
４）
それぞれの範囲で変化させ、リパーゼの生産性を見た。
その結果、トリオレイン１％、酵母エキス１％の組み合
わせで、１２０時間目に６５．７U/mlを示した。（表
４）
【００３５】
【００３６】（５）培地初期ｐＨ及び培養温度
培地初期ｐＨは５．６、培養温度は２５℃が最適であっ
た（図７、図８）。なお、図中、lipase activityはリ
パーゼ活性、Time（ｈ）は時間（時間）、−●−は２０
℃、−■−は２５℃、−▲−は３０℃をそれぞれ示す。
た（図７、図８）。なお、図中、lipase activityはリ
パーゼ活性、Time（ｈ）は時間（時間）、−●−は２０
℃、−■−は２５℃、−▲−は３０℃をそれぞれ示す。
【００３７】（６）酵素の精製
酵母細胞を除いた培養液を８，０００rpm、１０min遠心
分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過
後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂TSK-ge
l SP-5PWカラムによる高速液体クロマトグラフ（ｐＨ
７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ
添加したものによるグラジエント溶出）によってリパー
ゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％で
あった（表５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとな
り、分子量はＤＳＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンで
あることが判明した。
分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過
後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂TSK-ge
l SP-5PWカラムによる高速液体クロマトグラフ（ｐＨ
７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ
添加したものによるグラジエント溶出）によってリパー
ゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％で
あった（表５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとな
り、分子量はＤＳＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンで
あることが判明した。
【００３８】
【００３９】
【発明の効果】本発明によって分離、精製して得た本リ
パーゼは、上記のような理化学的性質を有する新規な酵
素である。本酵素は、油脂分解能が高いだけでなく有機
溶媒に安定であるという特性を有しているため、薬品、
飲食品、化粧品、洗剤等従来からのリパーゼの用途に加
え、有機溶媒存在下でのエステル交換やエステル合成と
いった分解の逆反応である合成反応への利用も大いに期
待できる。
パーゼは、上記のような理化学的性質を有する新規な酵
素である。本酵素は、油脂分解能が高いだけでなく有機
溶媒に安定であるという特性を有しているため、薬品、
飲食品、化粧品、洗剤等従来からのリパーゼの用途に加
え、有機溶媒存在下でのエステル交換やエステル合成と
いった分解の逆反応である合成反応への利用も大いに期
待できる。
【図１】リパーゼの活性と安定性に及ぼすｐＨの影響を
示す。
示す。
【図２】リパーゼの活性と安定性に及ぼす温度の影響を
示す。
示す。
【図３】リパーゼ生産に及ぼす各種窒素源の影響を示
す。
す。
【図４】リパーゼ生産に及ぼす各種炭素源の影響を示
す。
す。
【図５】リパーゼ生産に及ぼす各種ラクトース濃度
（％、w/v）の影響を示す。
（％、w/v）の影響を示す。
【図６】リパーゼ生産に及ぼす各種インデューサー（１
％、w/v）の影響を示す。
％、w/v）の影響を示す。
【図７】リパーゼ生産に及ぼすｐＨの影響を示す。
【図８】リパーゼ生産に及ぼす温度の影響を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 黒須 猛行
広島県東広島市鏡山３丁目７番１号 国
税庁醸造研究所内
(56)参考文献 特開 平11−244892（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/14 - 9/46
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するリパーゼＣ
Ｓ２。 （１）作用 油脂分解性を有し、トリグリセリドに作用して、グリセ
リンと脂肪酸に加水分解する。 （２）基質特異性 トリブチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリ
オレインをよく分解する。トリアセチン、トリカプリ
ン、トリラウリンは中程度に分解する。トリミリスチ
ン、トリステアリンに対する分解力は弱い。 （３）位置特異性 トリオレインに作用せしめると、オレイン酸と少量の
１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオ
レインとモノオレインは検出されない。 （４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：７．０ 安定ｐＨ範囲：５〜９ （５）反応最適温度及び温度による失活の条件 反応最適温度：３７℃ 温度による失活の条件：温度上昇による活性の失活は緩
やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても活性を
維持している。 （６）有機溶媒に対する安定性、活性化 有機溶媒に安定であり、更に、ジメチルスルホキシド、
ジエチルエーテルによって活性が上昇する。 （７）分子量 ２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）由来 クリプトコッカス属菌由来である。 - 【請求項２】 クリプトコッカス属菌がクリプトコッカ
ス エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．Ｓ−２）（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）であること
を特徴とする請求項１に記載のリパーゼＣＳ２。 - 【請求項３】 クリプトコッカス属に属するリパーゼＣ
Ｓ２生産菌を培養して培養物からリパーゼＣＳ２を分離
採取することを特徴とする下記の理化学的性質を有する
リパーゼＣＳ２の製造方法。 （１）作用 油脂分解性を有し、トリグリセリドに作用して、グリセ
リンと脂肪酸に加水分解する。 （２）基質特異性 トリブチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリ
オレインをよく分解する。トリアセチン、トリカプリ
ン、トリラウリンは中程度に分解する。トリミリスチ
ン、トリステアリンに対する分解力は弱い。 （３）位置特異性 トリオレインに作用せしめると、オレイン酸と少量の
１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオ
レインとモノオレインは検出されない。 （４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：７．０ 安定ｐＨ範囲：５〜９ （５）反応最適温度及び温度による失活の条件 反応最適温度：３７℃ 温度による失活の条件：温度上昇による活性の失活は緩
やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても活性を
維持している。 （６）有機溶媒に対する安定性、活性化 有機溶媒に安定であり、更に、ジメチルスルホキシド、
ジエチルエーテルによって活性が上昇する。 （７）分子量 ２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）由来 クリプトコッカス属菌由来である。 - 【請求項４】 油脂の存在下で製造工程を実施すること
を特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 油脂としてイワシ油、大豆油、オリーブ
油、トリグリセリドから選ばれる少なくともひとつを使
用することを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 更に、酵母エキス及び必要あればラクト
ースを使用することを特徴とする請求項４又は５に記載
の方法。
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| JP2000068227A JP3507860B2 (ja) | 2000-03-13 | 2000-03-13 | 酵母由来の新規リパーゼｃｓ２ |
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