DE69828338T2

DE69828338T2 - Esterase und seine Verwendung zur Herstellung von optisch aktiven Chroman-Verbindungen

Info

Publication number: DE69828338T2
Application number: DE69828338T
Authority: DE
Inventors: Toshihiro Omuta-shi Oikawa; Nobuhiro Omuta-shi Fukuhara; Yasuko Mizuma-gun Matsuba
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2018-07-16
Also published as: CN1218110A; KR19990013989A; EP0892044A3; EP0892044A2; HUP9801621A2; HU9801621D0; US6303349B1; KR100300443B1; EP0892044B1; HUP9801621A3; DE69828338D1; US6060290A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Esterase, die als Katalysator für die Hydrolysen von Estern einsetzbar ist, auf Verfahren zur Isolierung dieser Esterase, auf Verfahren für die kinetische Aufspaltung eines Gemisches aus der (R)-Form und der (S)-Form eines Chroman-3-essigsäureesters unter Verwendung der Esterase, und auf die Verwendung solcher Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Chroman-3-essigsäuren und -estern, die als medizinische Materialien nützlich sind.
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Anstrengungen unternommen, um Enzyme in organischen Synthesen anzuwenden. Insbesondere die Verwendung von Esterasen, die hohe Substratspezifitäten für die optisch selektive Hydrolyse verschiedener Esterverbindungen, um dadurch optisch aktive Verbindungen zu erhalten, oder zur Herstellung chiraler Verbindungen aus prochiralen Esterverbindungen haben, hat hohe industrielle Wirksamkeit.
Zu den Zwecken, wie sie oben genannt wurden, wird im Allgemeinen eine Esterase aus Schweineleber verwendet, allerdings schließen ihre hohe Kosten und die begrenzte Verfügbarkeit ihre industrielle Verwendung aus. Die Verwendung von Esterasen aus mikrobiellen Quellen anstelle der Esterase, die aus Schweineleber stammt, wurde versucht. Da Enzyme, die von verschiedenen Organismen stammen, charakteristischerweise in ihren Substratspezifitäten unterschiedlich sind, variieren die Selektivität und Reaktionsgeschwindigkeit der Enzyme in Abhängigkeit von den Verbindungen, auf die die Enzyme angewendet werden, deutlich.
Ein 6-Aminochroman-3-essigsäureester, der in den europäischen Patentpublikationen EP 0 709 370 und EP 0 760 364 offenbart wird, ist ein nützliches Zwischenprodukt für eine Antiplättchenverbindung. Allerdings wurde noch keine Esterase, die hohe optische Selektivität für 6-Aminochroman-3-essigsäureester zeigt und die diese wirksam hydrolysieren kann, beschrieben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Esterase zu verwenden, die optisch selektiv ist und als Katalysator zur Herstellung optisch aktiver Chroman-3-essigsäuren und Estern derselben, die als medizinische Materialien verwendbar sind, einsetzbar ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren für die einfache und effiziente Produkte von optisch aktiven Chroman-3-essigsäuren und -estern derselben.
Zusammenfassung der Erfindung
Als Resultat intensiver Studien zur Suche nach einem Verfahren für die einfache und effiziente Produktion von optisch aktiven Chroman-3-essigsäuren und -estern haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass optisch aktive Chroman-3-essigsäuren und -ester erhalten werden können, indem ein Gemisch aus (3R)- und (3S)-Chroman-3-essigsäureestern mit einer Esterhydrolase, die eine optisch selektive hydrolysierende Aktivität hat, oder Mikroorganismen, die die Hydrolase tragen, oder einem Enzympräparat daraus behandelt wird. Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine neue Esterase, die optisch selektive hydrolysierende Aktivität hat und ausgezeichnete Wärme- und pH-Stabilität hat, aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudonocardia unter Anwendung einer Vielzahl von Reinigungstechniken gefunden und haben so die vorliegende Erfindung vollendet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich nämlich auf eine neue Esterase, die in einem Mikroorganismus der Gattung Pseudonocardia gefunden wird, die als Katalysator für Hydrolysen von Chroman-3-essigsäurestern verwendbar ist, auf Verfahren zur Isolierung der Esterase, auf Verfahren für die kinetische Aufspaltung eines Gemisches aus (R)- und (S)-Chroman-3-essigsäureester-Verbindungen unter Verwendung dieser Esterase, und auf Verfahren unter Verwendung der Esterase zur Herstellung optisch aktiver Chroman-3-essigsäuren und Estern davon, die in medizinischen Materialien verwendbar sind.
In einer bevorzugten Form bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Chroman-3-essigsäuren und -estern, wobei ein Gemisch aus (3R)- und (3S)-Chroman-3-essigsäureestern, dargestellt durch die Formel (I)
[worin R₁ eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe ist] mit der Esterase oder Mikroorganismen, die die Esterase tragen, oder einem Präparat davon behandelt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung wird wie folgt detaillierter beschrieben:
(1) Enzymtragende Mikroorganismen und Verfahren zur Kultivierung derselben
Die neue Zielesterase ist in Zellen von Pseudonocardia thermophila FERM-BP-6275 enthalten. Diese Zellen können nach irgendeinem bekannten Verfahren kultiviert werden. Es kann ein beliebiges Medium, das als Nährmedium für allgemeine Mikroorganismen bekannt ist, verwendet werden. Organische Nährstoffquellen, z. B. Fleischextrakt, Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton und NZ-Amin; Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glucose, Maltose, Saccharose, Stärke und organische Säuren; Stickstoffquellen, wie z. B. Ammoniumsulfat, Harnstoff und Ammoniumchlorid; anorganische Nährstoffquellen, wie z. B. Phosphate, Magnesium, Kalium und Eisen; und Vitamine können in geeigneten Kombinationen eingesetzt werden. Die Zellen werden aerob in einem Medium bei einem pH zwischen 6 und 9 und bei einer Temperatur zwischen 30°C und 60°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C, kultiviert. Eine Kultivierung wird für 1 bis 7 Tage, bis der Gehalt an Zielesterase sein Maximum erreicht, durchgeführt.
(2) Reinigung des Enzyms
Das Enzym kann unter Verwendung eines herkömmlichen Enzymreinigungsverfahrens gereinigt werden. Zellen werden aus der beendeten Kultur durch Zentrifugation geerntet und mechanisch unter Verwendung einer Beschallung, FRENCH^® PRESSURE CELL PRESS, DYNO^®-MILL oder dergleichen zerstört. Feststoffe, z. B. Zelldebris, werden durch Zentrifugation unter Erhalt einer rohen Enzymlösung entfernt. Das Enzym wird dann durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder anderen Salzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Kristallisation oder dergleichen gereinigt. Ein Beispiel wird in Beispiel 1 beschrieben werden.
(3) Messung der Enzymaktivität
Ein Reaktionsgemisch (1 ml), das 10 μmol racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester, 0,1 mmol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) und eine geeignete Menge an Esterase enthielt, wurde bei 55°C für 30 min umgesetzt. Nach der Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemisches mit 10 mM Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,0) – 30% Acetonitrillösung verdünnt und 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und 6-Aminochroman-3-essigsäure wurden jeweils quantitativ durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemessen. Die Elution wurde an einer Inertsil ODS-2-Säule (ein Produkt von GL Science) unter Verwendung einer 10 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 6,0) – 30% Acetonitril als Träger mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,7 ml/min durchgeführt. Zur Detektion wurde die Extinktion bei 254 nm gemessen. Als Nächstes wurde ein äquivalentes Chloroformvolumen zu der verbleibenden Reaktionslösung gegeben, um den restlichen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester zu extrahieren. Das Chloroform wurde dann durch Destillation unter Vakuum entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethanol gelöst und außerdem mit einer Hexan/Ethanol-Lösung (3/2, V/V) verdünnt. (3S)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und (3R)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester in der so hergestellten Lösung wurden jeweils quantitativ gemessen, um die optische Reinheit festzustellen. Die Elution wurde an einer CHIRALCEL OD-H-Säule zur optischen Aufspaltung (ein Produkt von DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) unter Verwendung einer Hexan/Ethanol-Lösung (3 : 2 im Volumenverhältnis) als Träger bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Zur Detektion wurde die Extinktion bei 254 nm gemessen.
Die Enzymmenge, die 1 μml 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester pro Minute hydrolysiert, wurde als eine Einheit definiert.
(4) Homogenität des Enzyms
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde nach dem Laemmli-Verfahren an einem 10 bis 20%-Gel unter Verwendung einer Tris-Glycin-Pufferlösung durchgeführt (Nature 227, 680, 1970). Nach Färben mit Coomassie-Brilliantblau wurde eine homogene Proteinbande beobachtet. Das Molekulargewicht dieses Proteins wurde aus einem Vergleich mit bekannten Standardproteinen als 50.000 ± 2.000 geschätzt.
(5) Eigenschaften des Enzyms
Die Esterase der vorliegenden Erfindung zeigte die folgenden Eigenschaften:
(1) Enzymwirkung
Das Enzym wirkt als Katalysator in der Hydrolyse einer Esterverbindung zu einer Verbindung, die eine Carboxylgruppe hat, und einer Alkoholverbindung und bei einer Esteraustauschreaktion zwischen einer Esterverbindung und einer Alkoholverbindung.
(2) Substratspezifität
Das Enzym hydrolysiert vornehmlich (R)-Formen von 6-Aminochroman-3-essigsäureestern.
Für Ester von geradkettigen Fettsäuren und p-Nitrophenol gilt, je kleiner die Zahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäure ist, desto stärker ist die hydrolytische Aktivität.
(3) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des Enzyms ist 50.000 ± 2.000 (SDS-PAGE).
(4) Optimaler pH
Eine Hydrolyse erfolgt optimalerweise bei pH 7 bis 10.
(5) Optimale Temperatur
Eine Hydrolyse erfolgt optimalerweise zwischen 55°C und 60°C in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2).
(6) Temperaturstabilität
90% der Hydrolyseaktivität kann über 30 min bei pH 7,2 und bei Temperaturen unter 60°C aufrechterhalten werden.
(7) pH-Stabilität
Das Enzym ist in einem pH-Bereich von 5 bis 10 stabil.
(8) Inhibitoren
Bei Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) bei 30°C für 30 min verliert das Enzym mit Kupfersulfat (1 mM) 30% seiner Aktivität, mit Phenylmethylsulfonylfluorid (0,1 mM) 85% seiner Aktivität und mit Diisopropylfluorphosphat (0,5 mM) 15% seiner Aktivität. Keine Verringerung bei der Enzymaktivität wird mit Natriumlaurylsulfat (5 mM) oder Natriumdesoxycholat (5 mM) beobachtet. Weitere Details werden in den Beispielen nachfolgend beschrieben.
Wie oben erwähnt wurde, ist das Enzym der vorliegenden Erfindung eine Esterase, die stereospezifisch auf 6-Aminochroman-3-essigsäureester wirkt und ausgezeichnete Wärmebeständigkeit und pH-Stabilität hat.
Die Verbindungen der Formel (I) können in Gegenwart der obigen Esterase aus Pseudonocardia thermophila FERM-BP-6275 stereoselektiv hydrolysiert werden.
Diese kann verwendet werden, um eine optische Auflösung zu erreichen.
Mikroorganismen, die die Esterase enthalten, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, können beliebige Mikroorganismen sein, die vornehmlich eine der optischen Verbindungen in einem Gemisch aus (3R)- und (3S)-Chroman-3-essigsäureestern hydrolysieren und zur Gattung Pseudonocardia gehören. Der Stamm FERM BP-6275 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology of The Agency of Industrial Science and Technology in the Ministry of International Trade and Industry, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan, unter dieser Hinterlegungsnummer entsprechend dem Budapester Vertrag am 27. Februar 1998 hinterlegt.
Diese Mikroorganismen sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, sie haben die für die vorliegende Erfindung notwendigen Fähigkeiten. Beispiele für Mikroorganismen, die zu verwenden sind, umfassen Mutantenstämme, die z. B. durch ultraviolette Strahlung oder durch die Verwendung eines mutierenden Mittels erhalten werden, oder solche, die durch Induktion mittels Gentechnologie erhalten werden.
Mikrobielle Kulturen oder Präparate daraus sind keinen besonderen Beschränkungen unterworfen, vorausgesetzt, sie haben die für die vorliegende Erfindung notwendigen Fähigkeiten. Beispiele für mikrobielle Kulturen umfassen Kulturflüssigkeiten und mikrobielle Zellen. Beispiele für Präparate aus Kulturen umfassen gewaschene Zellen, getrocknete Zellen, Kulturüberstände, zersetzte Zellen, z. B. Zelldebris, Zellautodigests, Zellextrakte oder Enzympräparate, die unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens gereinigt oder teilweise gereinigt sind. Darüber hinaus können diese mikrobiellen Kulturen und Präparate daraus zur Verwendung immobilisiert werden; Immobilisierungsverfahren umfassen eine Behandlung mit Polyacrylamid, Alginsäure und Carrageenan, oder eine Immobilisierung an einem geeigneten Träger unter Verwendung bekannter Verfahren, z. B. das Verfahren der kovalenten Bindung und das Absorptionsverfahren.
Es kann ein beliebiges Medium verwendet werden, das im Allgemeinen auf dieses Gebiet zum Kultivieren von Mikroorganismen verwendet wird. Zum Beispiel können organische Nährstoffquellen, z. B. Fleischextrakt, Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton und NZ-Amin; Kohlenstoffquellen, z. B. Glucose, Maltose, Saccharose, Stärke und organische Säuren; Stickstoffquellen, z. B. Ammoniumsulfat, Harnstoff und Ammoniumchlorid; anorganische Nährstoffquellen, z. B. Phosphate, Magnesium, Kalium und Eisen, und Vitamine in geeigneten Kombinationen eingesetzt werden. Die Kultivierung kann aerob bei einem pH zwischen 6 und 9 bei einer Temperatur zwischen 20°C und 60°C durchgeführt werden. Ein Kultivieren bei einer Temperatur zwischen 45°C und 55°C ist für Pseudonocardia thermophila FERM-BP-6275 vorteilhaft. Ein Kultivieren wird für 1 bis 7 Tage, bis der Gehalt an Zielesterase sein Maximum erreicht, durchgeführt.
Die lebenden Kulturzellen und der Kulturüberstand werden durch ein Verfahren, wie z. B. Zentrifugation und Filtration aus dem Fluid, das durch Kultivieren der Mikroorganismen, wie sie oben genannt wurden, erhalten wird, hergestellt. Gewaschene Zellen werden durch Waschen lebender Zellen mit einer physiologischen Salzlösung hergestellt. Getrocknete Zellen werden durch Lyophilisierung oder Acetontrocknung von lebenden Zellen oder gewaschenen Zellen hergestellt. Zersetzte Zellen werden hergestellt, indem verschiedene physikalisch-chemische Verfahren, wie z. B. Ultraschallzersetzung, eine französische Presse, osmotischer Druck, Gefrierfusion, Verwendung von lytischen Enzymen oder Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln und organischen Lösungsmitteln, verwendet werden. Ein gereinigtes oder partiell gereinigtes Enzym wurde z. B. aus zersetzten Zellen oder dem Kulturüberstand durch Fraktionierung unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, z. B. Ammoniumsulfatpräzipitation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration oder hydrophobe Chromatographie, erhalten.
Beispiele für die Gruppe R₁ in der Formel (I) umfassen geradkettige und verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, spezifischer eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- oder Butylgruppe, bevorzugter eine Methylgruppe oder Ethylgruppe.
Beispiele für die Substitutionsgruppe, wenn R₂ eine Aminogruppe ist, umfassen eine Acetyl-, tert-Butoxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe.
Für die optisch selektive Hydrolyse kann ein Reaktionsmedium, das keine nachteilige Wirkung auf die Reaktion hat, oder Gemische davon verwendet werden. Das Reaktionsmedium kann ein homogenes System, das Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel verwendet, oder ein Zweiphasensystem, das ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittelsystem verwendet, sein.
Beispiele für das mit Wasser mischbare Lösungsmittel umfassen geradkettige und verzweigte Alkylalkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Acetonitril, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran. Das mit Wasser mischbare Lösungsmittel kann in einer Menge zwischen 0,1 und 20,0% (V/V) in Wasser verwendet werden.
Beispiele für das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel umfassen organische Lösungsmittel, z. B. Toluol und Xylol. Die Menge des mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels kann 1,0 bis 40,0% (V/V) in Wasser sein.
Die Konzentration an racemischen Chroman-3-essigsäureestern, die dem Reaktionslösungsmittel zuzusetzen ist, ist im allgemeinen 0,01 bis 50% (G/V), vorzugsweise 0,01 bis 20% (G/V).
Die Reaktion wird bei Raumtemperatur oder unter Erwärmen, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 15°C und 70°C, bevorzugter zwischen 20°C und 60°C durchgeführt.
Der pH der Reaktionslösung variiert in Abhängigkeit vom Typ des hydrolysierenden Enzyms oder der Mikroorganismenquelle. Allerdings wird die Reaktion im Allgemeinen bei einem pH zwischen 3 und 11 durchgeführt. Wenn der pH der Reaktionslösung sich mit fortschreitender Hydrolyse ändert, ist es vorteilhaft, den pH beim pH-Optimum zu kontrollieren.
Die Reaktivität zwischen dem Substrat und dem Enzym kann durch Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels oder dergleichen zu der Reaktionslösung erhöht werden.
Die Isolierung von optisch aktiven Chroman-3-essigsäureestern und optisch aktiven Chroman-3-essigsäuren nach optisch selektiver Hydrolyse kann durch Extraktion von optisch aktiven Chroman-3-essigsäureestern mit einem nicht mit Wasser mischbaren Extraktionslösungsmittel in dem homogenen System, das Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel verwendet, oder durch Trennung der organischen Lösungsmittelschicht und der Wasserschicht im Zweiphasensystem unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder Wasser und einem Gemisch aus einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel sehr einfach durchgeführt werden. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung können die resultierenden optisch aktiven Chroman-3-essigsäureester in der organischen Lösungsmittelschicht so, wie sie sind, in Lösung verwendet werden, oder sie können als Synthesezwischenprodukte nach Entfernen des Lösungsmittels eingesetzt werden. Optisch aktive Chroman-3-essigsäure mit höherer optischer Reinheit kann durch Kristallisieren unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels erhalten werden. Optisch aktive Chroman-3-essigsäuren in der Wasserschicht können durch ein bekanntes Verfahren, z. B. konzentrierte Kristallisation, nach Entfernung von Zellkomponenten unter Verwendung eines bekannten Verfahrens, z. B. Filtration, erhalten werden.
Beispiel
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter durch die folgenden Beispiele erläutert. Allerdings sollte klar sein, dass diese Beispiele nicht als Definition der Grenzen der Erfindung zu verstehen sind.
Beispiel 1: Verfahren zur Kultivierung Esterase-enthaltender Mikroorganismen
In ein sterilisiertes Medium (1 l), das 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt (Ehrlich), 0,2% NZ-Amin (Typ 1), 0,5% Natriumchlorid, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat und 1,0% lösliche Stärke (pH 7,4) enthielt, wurden 5% Pseudonocardia thermophila FERM BP-6275 geimpft, die vorher in demselben Medium kultiviert worden war. Nach anaerobem Kultivieren bei 52°C für 96 Stunden wurde die resultierende Kultur unter Erhalt von 10 g nassen Zellen zentrifugiert.
Beispiel 2: Esterase-Reinigung
Die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen wurden in 100 ml einer 0,05 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,2) (im Folgenden als Puffer bezeichnet) suspendiert, durch Ultraschallbehandlung dispergiert und dann unter Verwendung einer französischen Presse zersetzt. Zelldebris wurde durch Zentrifugation entfernt (15.000 × g, 20 Minuten), wobei ein zellfreier Extrakt erhalten wurde. Ammoniumsulfat wurde bis zu 60% zum zellfreien Extrakt gegeben und durch Zentrifugation wurde eine aktive Fraktion als Präzipitat erhalten. Dieses Präzipitat wurde in 100 ml des Puffers gelöst und die Lösung wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Ultrogel^® ACA44 (ein Produkt von Pharmacia) als Träger unterworfen. Eine aktive Fraktion wurde gesammelt und auf eine DEAE TOYOPEARL 650 M (ein Produkt von TOSOH)-Säule aufgetragen und mit dem Puffer, der 0,8 M Ammoniumsulfat enthielt, und dem Puffer unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten eluiert. Die resultierende aktive Fraktion wurde unter Verwendung einer Ultrafiltration konzentriert und gegen den Puffer dialysiert. Auf diese Weise wurde die Esterase homogen gereinigt. Das Reinigungsverfahren ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Beispiel 3: Optisch selektive Hydrolyse von racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäureestern
Racemischer 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester oder racemischer 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester wurde unter Verwendung der in Beispiel 2 homogen gereinigten Esterase unter den folgenden Bedingungen hydrolysiert.
Eine Reaktionslösung (1 ml), die 0,1 mmol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2), 10 μmol racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und eine geeignete Menge Esterase enthielt, wurde 30 min bei 55°C umgesetzt. Nach der Reaktion wurde ein Teil der Reaktionslösung mit einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,0) – 30% Acetonitrillösung verdünnt und 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und 6-Aminochroman-3-essigsäure wurden jeweils quantitativ durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen. Eine Elution wurde an einer Inertsil ODS-2-Säule (ein Produkt von GL Science) unter Verwendung einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,0) – 30% Acetonitrillösung als Träger mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,7 ml/min durchgeführt. Zur Detektion wurde die Extinktion bei 254 nm gemessen. Als Nächstes wurde ein äquivalentes Volumen Chloroform zu der verbleibenden Reaktionslösung gegeben, um den restlichen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester zu extrahieren. Das Chloroform wurde dann durch Destillation unter Vakuum entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethanol gelöst und außerdem mit einer Hexan/Ethanol-(3/2, V/V)-Lösung verdünnt. (3S)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und (3R)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester in der so hergestellten Lösung wurden jeweils quantitativ gemessen, um die optische Reinheit zu bestimmen. Eine Elution wurde an einer Chiral Cell OD-II-optischen Aufspaltungssäule (ein Produkt von Daicel) unter Verwendung von Hexan/Ethanol (3 : 2 im Volumenverhältnis) als Träger bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Zur Detektion wurde die Extinktion bei 254 nm gemessen.
Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester anstelle von 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester verwendet wurde und dann wurden die Menge an (R)-6-Aminochroman-3-essigsäure in der Reaktionslösung und die Mengen an (S)-6-Aminochroman-3-essigsäureethylester und (R)-6-Aminochroman-3-essigsäureethylester in der Hexan/Ethanol-Lösung in der gleichen Weise, wie es oben beschrieben, bestimmt.
Die Resultate sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2: Optisch selektive Hydrolyse von racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäureestern
Beispiel 4: Hydrolyse unter Verwendung von Estern geradkettiger Fettsäuren und als Substrate
Eine geeignete Menge der Enzymlösung wurde zu 2,5 ml einer 0,2 M Kaliumphosphat-Puffer-Lösung (pH 7,0) gegeben, die 1 mM eines von verschiedenen p-Nitrophenylestern enthielt. Die resultierende Reaktionslösung wurde für 8 min bei 45°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1 ml Methanol gestoppt, und dann wurde die Zunahme der Extinktion bei 400 nm bestimmt.
In Kontrollproben wurde die Pufferlösung anstelle der Enzymlösung verwendet. Relative Aktivitäten für p-Nitrophenylester wurden aus Änderungen der Extinktion berechnet. Die Resultate sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: Relative Aktivitäten für p-Nitrophenylester (basierend auf 100% Aktivität für p-Nitrophenylessigsäureester)
Beispiel 5: pH-Optimum für die Enzymreaktion
Das pH-Optimum wurde unter Verwendung der Esterase untersucht, die in Beispiel 2 homogen gereinigt worden war. Ein Reaktionsgemisch (1,0 ml), das 10 μmol racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester, 0,1 mmol eines der Puffer, die verschiedene pH-Bereiche, wie sie unten beschrieben werden, bereitstellen, und 0,1 Einheit Esterase wurden bei 55°C für 30 min inkubiert. Nach der Reaktion wurde ein äquivalentes Chloroformvolumen zugesetzt, um den restlichen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester zu extrahieren. Das Chloroform wurde dann durch Destillation unter Vakuum entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethanol gelöst und außerdem mit einer Hexan/Ethanol-Lösung (3/2, V/V) verdünnt. (3S)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester und (3R)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester wurden quantitativ durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemessen. Die Enzymaktivität wurde durch Abnahme der Menge an 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester gemessen.
Die verwendeten Puffer waren Kaliumphosphatpuffer für pH 5,0 bis 7,2, Tris-HCl-Puffer für pH 8,0 bis 9,5 und CAPS-Puffer (Good-Puffer) für pH 10,0. Wie in den Resultaten in Tabelle 4 gezeigt ist, lag das pH-Optimum im Bereich von 8,0 bis 10,0.
Beispiel 6: pH-Stabilität des Enzyms
pH-Stabilität wurde unter Verwendung der in Beispiel 2 homogen gereinigten Esterase untersucht. 0,5 Einheiten der Esterase wurden zu einer 0,1 M Pufferlösung mit einem spezifizierten pH wie in Beispiel 5 gegeben und die Lösung wurde für 30 min bei 30°C gehalten, wonach die restliche Aktivität unter Verwendung von 0,1 Einheit des Enzyms gemessen wurde. Die relative Aktivität basierte auf 100 Esteraseaktivität einer Kontrollprobe ohne pH-Behandlung. Die Resultate in Tabelle 4 zeigen, dass es in einem pH-Bereich von 5,0 bis 10,0 nur eine geringe Änderung in der Aktivität gab.
Tabelle 4: pH-Optimum und pH-Stabilität
Beispiel 7: Temperaturoptimum für die Enzymreaktion
Die Reaktion wurde in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, durchgeführt, außer dass die Reaktionstemperatur 30, 40, 50, 55, 60 und 70°C waren und der verwendete Puffer Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) war. Die Resultate zeigten, dass die Aktivität bei 60°C am höchsten war. Die relative Aktivität basiert auf 100% Aktivität, die bei 60°C erhalten wird (Tabelle 5).
Beispiel 8: Temperaturstabilität des Enzyms
Die Temperaturstabilität wurde unter Verwendung der in Beispiel 2 homogen gereinigten Esterase untersucht. 0,1 Einheiten der Esterase wurden zu einer 0,1 mmol Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,2) gegeben, um ein Gesamtvolumen von 0,95 ml herzustellen. Das Gemisch wurde für 30 min bei einer spezifizierten Temperatur, d. h. 30, 40, 50, 55, 60 oder 70°C gehalten. Dazu wurden 0,05 ml 0,2 M racemisches 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester-Hydrochlorid gegeben und die Reaktion wurde für 30 min bei 55°C durchgeführt, wonach die verbleibende Aktivität gemessen wurde. Die relative Aktivität basierte auf 100 Esteraseaktivität, die ohne Wärmebehandlung erhalten worden war. Die Resultate in Tabelle 5 zeigen, dass bei Temperaturen bis zu 60°C mehr als 90% der Aktivität beibehalten wurde.
Tabelle 5: Temperatur-Optimum und Temperaturstabilität
Beispiel 9: Wirkung von Inhibitoren
Die Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die in Beispiel 2 homogen gereinigte Esterase wurde untersucht. 0,1 Einheit der Esterase, eine 0,1 mmol Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,2) und ein spezifizierter Inhibitor wurde Einstellung eines Gesamtvolumen von 0,95 ml vermischt, und das Gemisch wurde für 30 min bei 30°C gehalten. Dazu wurden 0,05 ml 0,2 M racemisches 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester-Hydrochlorid gegeben und die Reaktion wurde für 30 min bei 55°C durchgeführt, wonach die Restaktivität gemessen wurde. Die relative Aktivität basierte auf 100% Esteraseaktivität, die ohne Inhibitoren erhalten worden war. Die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt. Von Metallen war Cu²⁺ inhibitorisch. Von anderen waren Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), ein Proteaseinhibitor, und Diisopropylfluorphosphorsäure (DFP) inhibitorisch. Es wurde keine deutliche Verringerung der Enzymaktivität mit Oberflächenaktiven Mitteln, z. B. Natriumlaurylsulfat (5 mM) oder Natriumdesoxycholat (5 mM) (Tabelle 6) beobachtet.
Tabelle 6: Wirkung von Inhibitoren
Beispiel 10: Optisch-selektive Hydrolyse von racemischem 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester durch Pseudonocardia thermophila
10 ml eines sterilisierten Mediums (pH 7,4), das 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt (Ehrlich), 0,2% NZ-Amin (Typ 1), 0,5% Natriumchlorid, 0,05% Kaliumdhydrogenphosphat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat und 0,1% lösliche Stärke enthielt, wurden mit 5% Pseudonocardia thermophila FERM BP-6275, die vorher in demselben Medium kultiviert worden war, beimpft. Die Kultur wurde für 72 Stunden bei 52°C durchgeführt. Nasse Zellen, die durch Zentrifugation erhalten worden waren, wurden zu 50 ml einer Reaktionslösung (pH 8,0, eingestellt mit Kaliumhydroxid), die 1 g racemischen 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester enthielt, gegeben. Eine hydrolytische Reaktion wurde bei 55°C für 3 h durchgeführt, während der pH mit 2% Kaliumhydroxidlösung bei 8,0 gehalten wurde. Nach der Reaktion wurden 20 ml Toluol zugesetzt und nicht-umgesetzter 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester wurde extrahiert. Das Meiste des verbleibenden 6-Aminochroman-3-essigsäuremethylesters wurde in die Toluolschicht extrahiert und hydrolysierte 6-Aminochroman-3-essigsäure war in der Wasserschicht vorhanden. (S)-6-Aminochroman-3-essigsäuremethylester mit einer Reinheit von mehr als 99% wurde durch Konzentrieren der Toluolschicht erhalten (Ausbeute: 40%).
Beispiel 11: Optisch-selektive Hydrolyse von racemischem 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester durch Pseudonocardia thermophila
10 ml eines sterilisierten Mediums (pH 7,4), das 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt (Ehrlich), 0,2% NZ-Amin (Typ 1), 0,5% Natriumchlorid, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 1,0% lösliche Stärke enthielt, wurden mit 5% Psuedonocardia thermophila FERM BP-6275-Kultur beimpft, welche vorher in demselben Puffer kultiviert worden war. Die Kultur wurde für 72 h bei 52°C durchgeführt. Nasse Zellen, die durch Zentrifugation erhalten worden waren, wurden zu 50 ml einer Reaktionslösung (pH 8,0, eingestellt mit Kaliumhydroxid), die 1 g racemisches 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester-Hydrochlorid enthielt, gegeben. Die hydrolytische Reaktion wurde für 6 h bei 55°C durchgeführt, während der pH mit 2% Kaliumhydroxidlösung bei 8,0 gehalten wurde. Nach der Reaktion wurden 20 ml Toluol zugesetzt und nicht-umgesetzter 6-Aminochroman-3-essigsäureethylester wurde extrahiert. Das Meiste des verbleibenden 6-Aminochroman-3-essigsäureethylesters wurde in die Toluolschicht extrahiert und hydrolysierte 6-Aminochroman-3-essigsäure wurde in der Wasserschicht zurückgehalten. (S)-6-Aminochroman-3-essigsäureethylester wurde mit einer Reinheit von mehr als 99% erhalten, indem die Toluolschicht konzentriert wurde (Ausbeute: 35%).
Wirksamkeit der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine neue Esterase gefunden, die ausgezeichnete Wärme- und pH-Stabilität hat, die die Hydrolyse von Estern mit einer extrem kleinen Menge unter Normaldruck und bei normaler Temperatur katalysieren kann und die optisch selektive Hydrolyseaktivität bei nützlichen medizinischen Zwischenprodukten, Chroman-3-essigsäuren und -estern, hat. Diese Esterase kann für die einfache und effiziente Produktion von optisch aktiven Chroman-3-essigsäuren und -estern, die als medizinische Zwischenprodukte einsetzbar sind, verwendet werden. Darüber hinaus können optisch aktive Chroman-3-essigsäuren und optische aktive Chroman-3-essigsäureester auf einfache Weise aus einem Gemisch von (3R)- und (3S)-Chroman-3-essigsäureestern hergestellt werden, indem sie mit der Esterase, die eine optisch selektive Hydrolyseaktivität hat, oder mit Mikroorganismen, die die Hydrolase tragen, oder einem Präparat davon, behandelt werden.

Claims

Esterase, wie sie durch einen Mikroorganismus der Gattung Pseudonocardia produziert wird, die folgende physikochemischen Eigenschaften hat: (1) Enzymwirkung: das Enzym wirkt als Katalysator in der Hydrolyse einer Esterverbindung zu einer Carboxyl-Gruppe und Alkohol und in einer Esteraustauschreaktion zwischen einer Esterverbindung und Alkohol; (2) Substratspezifität: das Enzym hydrolysiert vornehmlich (R)-Formen von 6-Aminochroman-3-essigsäureestern; für Ester von geradkettigen Fettsäuren und p-Nitrophenol gilt: je geringer die Zahl der Kohlenstoffatome in den Fettsäuren ist, desto stärker ist die hydrolytische Aktivität; (3) Molekulargewicht: das Molekulargewicht des Enzyms ist 50 000 ± 2000 (SDS-PAGE); (4) optimaler pH: die Hydrolyse erfolgt optimalerweise bei pH 7–10; (5) optimale Temperatur: die Hydrolyse erfolgt optimalerweise bei 55°C bis 60°C; (6) Temperaturstabilität: 90% der Hydrolyseaktivität kann für 30 Minuten bei pH 7,2 und bei Temperaturen unter 60°C aufrecht erhalten werden; (7) pH-Stabilität: das Enzym ist in einem pH-Bereich von 5 bis 10 stabil; (8) Inhibitoren: bei Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) bei 30°C für 30 Minuten verliert das Enzym 30% seiner Aktivität mit Kupfersulfat (1 mM), 85% seiner Aktivität mit Phenylmethylsulfonylfluorid (0,1 mM) und 15% seiner Aktivität mit Diisopropylfluorphosphat (0,5 mM); keine Verringerung der Enzymaktivität wird mit Natriumlaurylsulfat (15 mM) oder Natriumdesoxycholat (5 mM) beobachtet.
Verfahren zur Herstellung der Esterase nach Anspruch 1, wobei Mikroorganismen der Gattung Pseudonocardia, die die Esterase nach Anspruch 1 produzieren, kultiviert werden und die Esterase aus der resultierenden Kultur isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mikroorganismen der Gattung Pseudonocardia Pseudonocardia thermophila FERM-BP-6275 sind.
Verfahren zur optischen Aufspaltung eines Gemisches von (R)- und (S)-Chroman-3-essigsäureestern, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen der in Anspruch 1 beschriebenen Esterase mit dem Gemisch aus (R)- und (S)-Estern in einem Reaktionsmedium unter Erhalt einer optisch aktiven Säureverbindung durch stereoselektives Hydrolysieren von einer der Verbindungen: (R)-Ester-Verbindung und (S)-Ester-Verbindung; (b) Isolieren der optisch aktiven Säureverbindung oder des optischen aktiven Esters, der nicht hydrolysiert wurde und zurückbleibt, aus dem Reaktionsmedium.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Esterase in einer Form, ausgewählt aus einem isolierten und gereinigten Enzym, einem rohen Enzympräparat, Zellen eines Mikroorganismus, die die Esterase enthalten, einem Kulturüberstand des Mikroorganismus, Zelldebris des Mikroorganismus, einem Extrakt aus Zellen des Mikroorganismus und immobilisierter Esterase oder immobilisierten Zellen eines Mikroorganismus, die die Esterase enthalten, verwendet wird.
Verfahren, wie es in Anspruch 4 oder Anspruch 5 beansprucht ist, wobei die Esterverbindungen Chromanverbindungen der Formel (I) sind:
worin R₁ eine geradkettige oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Amino-Gruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei R₂ eine Amino-Gruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin R₁ Methyl oder Ethyl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei das Reaktionsmedium ein Zweiphasensystem aus Wasser und einem nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das nicht-mischbare organische Lösungsmittel ein aromatischer Kohlenwasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das nicht-mischbare organische Lösungsmittel Toluol oder Xylol ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Menge des nicht-mischbaren organischen Lösungsmittels, die zuzusetzen ist, 1,0 bis 40,0% (V/V) in Wasser ist.