DE3116856C2 - - Google Patents
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Description
L-Aminosäure-Oxidase ist eine L-Aminosäure : Sauerstoff-Oxidoreductase
(desaminierend) mit der Systemnummer EC 1.4.3.2.,
die folgende Gleichung katalysiert:
Bisher war es bekannt, daß man dieses Enzym in Schlangengift,
in den Nieren von Ratten und Mäusen, der Leber von
Vögeln, wirbellosen Tieren und neurospora crassa findet
(vgl. "Arch. Biochem. Biophys.", Bd. 146, S. 54 bis 63 (1971);
"J. Bacteriol.", Bd. 121, S. 656 bis 663 (1975); "Protein,
Nucleic Acid, Enzyme", Bd. 17, S. 42 bis 55 (1972).
Es wurde nun festgestellt, daß man L-Aminosäure-Oxidase
aus dem Mycel eines Schimmelpilzes der Gattung Colletotrichum
gewinnen kann, der aus den Samen von Calophyllum
inophyllum in Hahajima, Bonin Inseln, Tokyo, Japan, isoliert
wurde und als sp. M 5073 identifiziert wurde.
Die Eigenschaften einer Kultur des Schimmelpilzes sp. M 5073 sind
nach Beobachtung mit bloßem Auge und Mikroskop in verschiedenen
Kulturmedien wie folgt:
Sehr schnelles Wachstum, das nach der Inkubation bei 26°C
die Gesamtfläche einer Petrischale (85 mm innerer Durchmesser)
in 5 Tagen bedeckt. In der Anfangsphase der Inkubation
sind die Lufthyphen flaumig weiß, mit wachsendem Mikroorganismus
werden sie kittähnlich (etwa grau 1 dc). Klare Exudate
auf den Kolonien. Die Grundfarbe der Rückseite ist aprikosenfarben
(hue 4 ga) und teilweise braun überdeckt (hue 2 nl).
Sehr schnelles Wachstum, die Gesamtfläche einer Petrischale
(85 mm innerer Durchmesser) in 5 Tagen bei der Inkubation bei
26°C bedeckend. Flaumig weiße Lufthyphen in der Anfangsphase
der Inkubation, die gräulich (etwa grau 1 fe) oder olivgrau
(etwa grau 1 ih) werden. Klare Exudate schneiden sich
schwach auf den Kolonien aus. Die Farbe der Rückseite ist
perlrosa (hue 3 ca), teilweise neblig blau (hue 14 ig).
Schnelles Wachstum, bei einer Inkubation bei 26°C erreicht
es 75 bis 80 mm im Durchmesser in 7 Tagen. Flaumige Lufthyphen,
die Hyphe steigt relativ dick auf. In der Anfangsphase
der Inkubation ist sie weiß, wird jedoch allmählich
olivgrau (etwa grau 1 ih), sich mit wachsendem Organismus
von der Mitte aus gegen die Ränder verändernd. Die Rückseite
ist fleischfarben rosa (hue 4 ca), teilweise schokoladenfarben
(hue 4 nl).
Die angegebenen Farbbeschreibungen stimmen mit der Farbbeschreibungsmethode
gemäß "Color Harmony Manual", Container
Corporation of America 1958, überein.
pH-Optimum: 4,8;
Temperaturoptimum: 24 bis 30°C.
Temperaturoptimum: 24 bis 30°C.
pH-Wert, bei dem der Mikroorganismus wachsen kann:
2,5 bis 11;
Temperatur, bei der der Mikroorganismus wachsen kann: 8 bis 42°C.
Temperatur, bei der der Mikroorganismus wachsen kann: 8 bis 42°C.
Braune acervuli, platten- oder polsterförmig, auf dem Medium
verstreut. Einige braune Stiele an den Rändern der acervuli
oder zwischen den Konidiosporen. Die Konidiosporen bilden
sich gerade aus einfachen und gut gewaschsenen Stromata.
Farblose Oberfläche mit glatten Wänden, mit 1 bis 2 Segmenten,
10-60×3-4 µm.
Die Stiele sind dunkelbraun oder dunkeloliv, 50 bis 150 µm
lang und 5 bis 7 µm breit an der Basis, mit einer glatten Wandoberfläche
und ein oder mehreren Segmenten. Die Konidien
sind einzellig, 10 bis 20×3-5 µm, oval und an der Basis
etwas zugespitzt. Die Wandoberfläche ist glatt, die Konidien
bilden sich als Klumpen am Ende der Konidiosporen. Der Schleim
ist orange, jede einzelne Konidie ist farblos oder schwachgelblich
grün.
Entsprechend den Befunden, daß der Schimmelpilz M 5073 dunkelbraune
Kolonien bildet, die acervuli mit Stielen gut entwickelt
sind und sich die Konidien in Form von Klumpen am
Ende der einfachen und gut entwickelten Konidiosporen bilden,
gehört er zur Gattung Colletotrichum. Ein Artname konnte bis
jetzt noch nicht festgestellt werden, da ein Mikroorganismus,
der zur Gattung Colletotrichum gehört, auf Pflanzen parasitär
ist und eine Identifizierung der Art anhand von Kulturen
schwierig ist (J. A. von Arx, "The Genera of Fungi Sporulating
Pure Culture", S. 315, 1974; J. Cramer, G. L. Barron, "The
Genera of Hyphomycetes from soil", S. 364, The Williams &
Wilkins Co., 1968; L. H. Tiffany und J. C. Gilman, "Species
of Colletotrichum from Legumes, Mycologia", Bd. 46, S. 52 bis
75, 1954).
Anhand dieser Ergebnisse wird der Schimmelpilz M 5073 Colletotrichum
sp. M 5073 benannt und er ist beim Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology, Japan,
unter der Nummer FERM-BP-1825 hinterlegt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung
von L-Aminosäure-Oxidase durch Züchten eines Mikroorganismus
in einem Medium und Isolieren der L-Aminosäure-Oxidase
daraus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm
Colletotrichum sp. M 5073 (FERM BP - 1825) züchtet.
Die Fig. 1 bis 4 zeigen das pH-Optimum, die pH-Stabilität,
die Hitzestabilität bzw. die optimale Temperatur der erfindungsgemäß
gewonnenen L-Aminosäure-Oxidase.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Mikroorganismus in
herkömmlicher Weise entweder in Flüssigkultur oder in fester
Form kultiviert. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist es
jedoch günstiger, den Mikroorganismus in einem Kulturmedium
in großtechnischem Maßstab unter Belüftung und Bewegung zu
kultivieren.
Als Nährstoffquellen kommen alle für die herkömmliche Kultur
von Mikroorganismen verwendeten Substanzen in Frage. Als
Kohlenstoffquelle ist jede Substanz, die assimilierbaren
Kohlenstoff liefert, geeignet, z. B. Reis, Reiskleie, Stärke,
Glukose, Maltose, Glycerin, Melassen oder lösliche Stärke.
Als Stickstoffquelle ist jede Verbindung geeignet, die Stickstoff
zur Verfügung stellt, z. B. Pepton, Sojabohnenmehl,
Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Aminosäuren,
Nitrate, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid. Gegebenenfalls
kann man dem Kulturmedium Salze, wie Natriumchlorid,
Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder
Kaliumdihydrogenphosphat, zusetzen.
Die Bebrütungstemperatur liegt im erfindungsgemäßen Verfahren
günstigerweise zwischen 20 bis 35°C. Die Bebrütungsdauer
hängt von verschiedenen Bedingungen ab, im allgemeinen beträgt
sie 2 bis 4 Tage. Die Bebrütung wird nach einer in bezug
auf die Aktivität geeigneten Zeit abgebrochen, z. B. dann,
wenn die Aktivität der L-Aminosäure-Oxidase ihr Maximum erreicht
hat. In der so erhaltenen Kulturbrühe befindet sich
die L-Aminosäure-Oxidase angereichert im Mycel.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die L-Aminosäure-
Oxidase zum Beispiel wie folgt gewinnen:
Zuerst wird die Kulturbrühe in einen festen und einen flüssigen
Teil aufgetrennt, die erhaltenen feuchten Zellen werden
gegebenenfalls in einem Tris-HCl-Puffer oder einem
Phosphat-Puffer suspendiert. Die L-Aminosäure-Oxidase wird
aus den Zellen in herkömmlichen, gegebenenfalls kombinierten Verfahren
extrahiert, z. B. durch Lysozym, Ultraschall oder Hochdruckpresse.
Auf diese Weise erhält man einen Rohextrakt, der
die L-Aminosäure-Oxidase enthält.
Diese rohe L-Aminosäure-Oxidase-Lösung kann man in herkömmlichen
Verfahren zur Gewinnung und/oder Reinigung von Proteinen
oder Enzymen reinigen. So kann man zum Beispiel die
Roh-L-Aminosäure-Oxidase auch aus der Flüssigkeit durch Aussalzen
mit Ammoniumsulfat gewinnen. Man kann aber auch organische
Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol oder Isopropanol,
zusetzen, um die L-Aminosäure-Oxidase auszufällen.
Man kann das Rohprodukt aber auch dadurch reinigen, daß man
die Eigenschaften der L-Aminosäure-Oxidase ausnützt und zum
Beispiel durch Elektrophorese ein homogenes Protein erhält.
So kann man zum Beispiel die rohe L-Aminosäure-Oxidase in
einem geeigneten Medium lösen, wie einem Tris-HCl-Puffer,
an einem Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose
(im folgenden mit DEAE-Cellulose bezeichnet) oder vernetztem
Diätylaminoäthyldextrangel oder einem Gelfiltrationsmittel,
wie Dextran- oder Polyacrylamidgel, chromatographieren
und gegebenenfalls mit Dialysemembranen, Hohlfasern oder Ultrafiltrationsmembranen
behandeln. Schließlich erhält man ein
reines L-Aminosäure-Oxidase-Produkt durch geeignetes Trocknen
des Produkts, z. B. durch Gefriertrocknen.
Die Enzymaktivität sowie die physiko-chemischen Eigenschaften
der im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen L-Aminosäure-
Oxidase werden wie folgt bestimmt:
0,9 ml des folgenden Reaktionsgemisches werden in ein kleines
Proberöhrchen eingefüllt und auf 37°C erwärmt.
0,2 m L-Leucin|0,1 ml | |
0,2 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) | 0,2 ml |
0,3% 4-Aminoantipyrin | 0,1 ml |
0,2% Phenol | 0,1 ml |
Peroxidase (50 U/ml) | 0,1 ml |
Wasser | 0,3 ml |
0,1 ml einer L-Aminosäure-Oxidase enthaltenden Flüssigkeit
werden zum Reaktionsgemisch zugegeben und genau 10 Minuten
bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2,0 ml
Äthanol unterbrochen. Die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid
wird kolorimetrisch bei 480 nm bestimmt. Die Enzymaktivität
errechnet sich aus der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids
anhand folgender Gleichung:
U/ml = ΔA 480 nm × 0,699 × Verdünnung.
Die Menge an Enzym, die bei 37°C in einer Minute ein
µMol Wasserstoffperoxid bildet, wird als eine Einheit (1 U)
definiert.
In Gegenwart von Sauerstoff katalysiert das Enzym die oxidative
Desaminierung von α-Aminogruppen von L-Aminosäuren
zu α-Oxosäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid.
Die enzymatische Aktivität der L-Aminosäure-Oxidase wird bei
verschiedenen pH-Werten mit Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-
Puffer, pH 4 bis 7,5, Phosphat-Puffer, p 6,5 bis 8,0,
Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer,
pH 8,8 bis 9,6, bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Fig. 1 dargestellt, das pH-Optimum liegt bei 7,0
bis 8,5.
Das Enzym wird mit Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-Puffer,
pH 4,5 bis 7,5, Phosphat-Puffer, pH 6,5 bis 8, Tris-Salzsäure-Puffer,
pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-
Puffer, pH 9 bis 10, bei 37°C 24 Stunden inkubiert, dann
wird die Enzymaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in
Fig. 2 angegeben, die L-Aminosäure-Oxidase ist bei einem
pH-Wert von 8 oder darüber stabil.
Die L-Aminosäure-Oxidase wird in einem Tris-Salzsäure-Puffer,
pH 7,5, 10 Minuten bei verschiedenen Temperaturen inkubiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Das Enzym ist bei
einer Temperatur von 60°C oder darunter stabil.
Die optimale Reaktionstemperatur wird mit der gleichen Reaktionslösung
wie für die Bestimmung der Enzymaktivität gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 angegeben, die optimale
Reaktionstemperatur der L-Aminosäure-Oxidase liegt bei 40
bis 50°C.
Die Enzymaktivität mit verschiedenen Substraten zeigt Tabelle
I, wobei die Aktivität mit 5 mMol Substrat und 0,007 U
Enzym wie unter 1. angegeben bestimmt wird.
Tabelle I zeigt, daß das im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene
Enzym nicht nur mit L-Laurin, sondern auch mit verschiedenen
anderen L-Aminosäuren reagiert.
Die Enzymaktivität wird wie unter 1. angegeben mit 0,01 U
Enzym bestimmt. Die in Tabelle II zusammengestellten verschiedenen
Metallionen oder andere Zusätze werden in einer
Menge von 1 mMol der Reaktionslösung zugesetzt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle II angegeben, wobei das Cyanion
die stärkste Hemmwirkung auf das Enzym hat. Eine aktivierende
Wirkung auf das Enzym konnte mit keinem Ion festgestellt
werden.
Er liegt bei pH 3,9.
Der Km-Wert beträgt 1,7×10-4 Mol (mit L-Leucin).
Es beträgt etwa 200 000, bestimmt durch Gelfiltration
mit vernetztem Polyacryl (Sephacryl S-200).
Aus diesen physilogischen Daten ergibt sich, daß das im erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnene Enzym eine L-Aminosäure-
Oxidase mit der Systemnummer EC 1.4.3.2. ist.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene L-Aminosäure-
Oxidase ist für die quantitative Bestimmung von Aminosäuren
geeignet, wie für klinische Analysen, in denen die Menge
an Aminosäure aus einem synthetischen Substrat für die Bestimmung
von Peptidasen, wie Leucin-Amino-Peptidase, bestimmt
wird, oder für die Herstellung von α-Oxosäuren für Patienten,
die an Urämie leiden.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
100 ml Kulturmedium, pH 6,7, das 1,0% Maltose, 1,0%
Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat
(MgSO₄ · 7 H₂O), 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 1,0% Reiskleie
und 0,5% Antischaummittel enthält, werden in zwei
500 ml fassenden Kolben bei 120°C 20 Minuten sterilisiert,
dann mit Colletotrichum sp. M 5073 FERM BP-1825 beimpft und
3Tage unter Schütteln bei 30°C bebrütet.
Mit diesen beiden Impfkulturen werden in einem 30 Liter fassenden
Fermentator 20 Liter eines Kulturmediums der angegebenen
Zusammensetzung beimpft und bei einer Temperatur von
30°C, unter Rühren bei 300 UpM und einer Belüftung mit
20 Litern Luft/Minute 3 Tage bebrütet. Die Kulturbrühe
wird dann bei 3000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, die isolierten
Naßzellen werden in 2 Liter eines 0,01 m Tris-HCl-
Puffers, pH 7,5, suspendiert. Die Zellen werden in einem
Destruktor (DYNOMIL) zertrümmert und 10 Minuten bei 15 000 UpM
zentrifugiert. Man erhält 1,55 Liter eines Überstands mit
einer Enzymaktivität von 2700 U, der mit Ammoniumsulfatlösung
(Sättigungsgrad: 0,61) fraktioniert ausgefällt und bei
15 000 UpM 10 Minuten zentrifugiert wird.
Der dabei erhaltene Überstand wird erneut mit Ammoniumsulfatlösung
(Sättigungsgrad: 0,88) fraktioniert ausgefällt und
bei 15 000 UpM 10 Minuten zentrifugiert. Die Niederschläge
werden in 400 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gelöst und
10 Minuten auf 60°C erwärmt. Die dabei entstandenen Niederschläge
werden durch Zentrifugieren bei 15 000 UpM während
10 Minuten enfernt, man erhält 385 ml eines Überstands, der
mit 456 ml kaltem Aceton versetzt wird. Die Niederschläge
werden abgetrennt und in 150 ml eines 0,2 m Tris-HCl-Puffers,
pH 7,5, gelöst. Die ungelösten Feststoffe werden abzentrifugiert,
man erhält 112 ml eines Überstands, der über Nacht
gegen 5 Liter einer 0,01 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5,
in einem Celluloseacetat-Schlauch dialysiert wird. Die entstandene
Lösung wird auf eine DEAE-Cellulose-Säule (4,0×
30 cm) mit 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, aufgegeben und
mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 m Kaliumchlorid
eluiert. Die bei 0,4 m Kaliumchlorid eluierten aktiven Fraktionen
werden gesammelt, durch Ultrafiltration eingeengt
(Ultrafiltration-Membran XM-50),
auf eine mit vernetztem Polyacryl (Sephacryl S-200) gefüllte
Säule (3,6×80 cm) aufgegeben und mit 0,01 m Tris-HCl-Puffer,
pH 7,5, eluiert. Das Eluat zwischen 580 ml und 640 ml wird
gesammelt und gefriergetrocknet. Man erhält 152 mg (entsprechend
621 U) L-Aminosäure-Oxidase in Pulverform.
Claims (1)
- Verfahren zur Gewinnung von L-Aminosäure-Oxidase durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Medium und Isolieren der L-Aminosäure-Oxidase daraus, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Colletotrichum sp. M 5073 FERM BP- 1825 züchtet.
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