DE69114935T2

DE69114935T2 - Mutanter Stamm von Clostridium histolyticum, Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Clostripain-freier Kollagenase.

Info

Publication number: DE69114935T2
Application number: DE69114935T
Authority: DE
Inventors: Sonja Cizmek; Vladimir Delic; Stjepan Gamulin; Milan Holjevac; Vlasta Sojak-Derkos; Ivan Udovicic
Original assignee: Pliva Farmaceutska Kemijska Prehrambena I Kozmeticka Industrija dd
Current assignee: Pliva Farmaceutika dd
Priority date: 1990-07-23
Filing date: 1991-07-22
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2011-07-23
Also published as: EP0468411A2; US5252481A; HU912453D0; BG94868A; EP0468411B1; PL291186A1; ATE130867T1; EP0468411A3; CS227791A3; JPH05219942A; DE69114935D1; CA2047306A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mutanten des Bakteriums Clostridium histolyticum, ein Verfahren zur dessen herstellung mittels eines chemischen Mutagenmittels, sowie dessen Verwendung in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von clostripain-freier Kollagenase (Clostridiopeptidase A).
Es ist wohlbekannt dass man das Enzym Kollagenase nicht nur zu Forschungszwecken, sondern auch in der Human- und Tiermedizin, insbesondere zur Behandlung von Hauterkrankungen verwendet. In Kombination mit eineigen nichtspezifischen Proteasen beschleunigt es den Wundheilungsvorgang durch die Entfernung des nekrotischen Gewebes und sich daraus ergebende Verbesserung der Epithelisation. Kollagenase wird auch in der Chirurgie bei Gewebetransplantationen zur Gewebeauflösung verwendet.
In der Humanmedizin wird Kollagenase in der Behandlung von Verbrennungen verschiedener Grade, von Decubitus, Hautgeschwüren, Schorfen usw. verwendet. Mittels Kolagenase verlaufen nicht nur die Epithelisation und Hautgenesung wirksamer und schneller, sondern es werden auch die keloidbildung sowei hypertrophische Auswüsche verhindert, was eine Folge des Zerfalls des gebildeten Kollagens durch die Wirkung von Kollagenase ist.
Es ist bekannt dass verschiedene Mikroorganismusarten unter bestimmten Bedingungen Kollagenase synthetisieren.
Bei Verfahren zur Reinigung von Kollagenase werden sehr viele Schwierigkeiten durch das Begelitenzym Clostripain verursacht, da seine chemischen und physikalischen Eigenschaften denjenigen von Kollagenase sehr ähnlich sind. Medizinische Zubereitungen enthalten kein Clostripain.
Maschman E.O. (Biochem. Z., 297, 284, 1938) beschrieb als erster Kollagenase, die durch die kultivierung des Bakteriums Clostridium perfringens erhalten wurde. Es hat sich herausgestellt, dass unter allen kollagenase-synthetisierenden Organismen Clostridium histolyticum der beste ist. macLennan J.D., Mandl I. und Hoews E.I. (J. Clin. Inv., 32, 1317, 1953) beschrieben die Wachstumsbedingungen von Clostridium histolyticum. Sie untersuchten die Zusammensetzung des flüssigen Mediums, das zum grössten Teil aus Proteose-Pepton, anorganischen Salzen und einer Vitaminlösung bestand. Das Kakterium wrude bei der Temperatur von 37ºC und beim pH 7,2 kultiviert.
Berman S., Lowenthal J.P., Webster M.E., Altieri P.L. und Gochenour R.B. (J. Bact., 82, 582, 1961) untersuchten auch die Wachstumsbedingungen von Colstridium histolyticum zwecks Herstellung von Kollagenase. Es geland ihnen, Clostridium histolyticum in einem keine anorganischen Salze, sondern nur Proteose-Pepton, enzymatisch hydrolysierte Kasein- und Sojaproteine (tryptische Sojabrühe) und Vitaminlösung enthaltenden Nährmedium zu kultivieren. Durch eine solche Zusammensetzung des Nährmediums waren auch andere, für ein zufriedenstellendes Bakteriumwachstum und für die Biosynthese von Kollagenase notwendige Anforderungen wie z.B. der pH-Wert von 8,5 und die Temperatur von 30ºC bedingt.
Lettl A. (J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol., 18 (4)47, 1974) gelang es, das Proteose-Pepton in der für die Kultiviertung von Clostridium hystoliticum verwendeten Nährmediumzusammensetzung mit anderen hydrolisierten Proteinen zu ersetzen.
Da Clostridium histolyticum ein anaerobes Bakterium ist, müssen für dessen kultivierung in einem flüssigen Medium anaerobe Bedingungen gewährleistet werden. Takashi S. und Seifert S.(J. Appl. Bact., 35, 47, 1972) verwendeten bei ihren untersuchungen die Reduktionsmittel Natriumthioglycolat und Natriumbisulfit, um anaerobe, für Bakterienwachstum notwendige Bedingungen zu erhalten. Die optimalen Ergebnisse, d.h. die höchste Kollagenase-Ausbeute wurde bei der Verwendung der vorgennanten Reduktionsmittel in einem 1:1-Verhältnis erreicht.
Chiulli, A.J. und Wegman, E.H. (US 3,705,083) beschrieben die Herstellung von Kollagenase durch die kultivierung eines Mutanten von Clostridium hystolyticum, der verbesserte Eigenschaften, nämlich eine Mutanten von Clostridium hystolyticum, der verbesserte Eigenschaften, nämlich eine verminderte Toxizität im Vergleich zu der Muttertoxizität sowie die Fähigkeit zur Wachstumshemmung von andern Bakterien aufwies.
Das Bakterium Clostridium histolyticum schüttet das Enzym Kollagenase zusammen mit grösseren mengen von anderen extrazellularen Proteasen (nicht-spezifische Proteasen, α-Toxin, begelitendes Braunpigment), insbesondere Clostripain (Clostridiopeptidase B) in das Meidum aus. So wurde festgestellt, dass kommerziell erhältliche Zubereitungen Spuren von Clostripian enthalten (Keil B., Mol. Cell Biochem., 23, 87, 1979). Wegen sehr ähnlicher chemischer und physikalischer Eigenschaften dieser Proteasen gibt es Schwierigkeiten beim Reinigungsprozess und individueller Isolation aus dem Fermentationsmedium.
Das Bakterium Clostridium histolyticum, das unter bekannten anaeroben submersen Bedingungen in einem die konventionellen kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze un Vitaminlösungen enthaltenden medium bei einer Temperatur von 32ºC bis 37ºC und in einem pH-Beriech von 7,2 bis 8,8 innerhalb von 10 bis 24 Stunden kultiviert wird, schüttet das Enzym Kollagenase (Clostridiopeptidase A), Clostripain (Clostridiopeptidase B) und andere nicht-spezifische Proteasen in das Medium aus. Das Problem bei einer solchen Enzymproduktion besteht darin, dass beide Enzyme, also sowohl Kollagenase als auch Clostripain in dem filtrat vorhanden sind. Bei der Trennung der Kollagenase von Clostripain geht eine grosse Menge von Kollagenase verloren, was eine verminderte Ausbeute des Enzyms und somit auch gesteigerte Kosten pro Produkteinheit zu Folge hat.
Überraschenderweise haben wir gefunden, dass bei der Herstellung von Kollagenase durch die Verwendung eines neuen Mutanten des Bakteriums Clostridium histolyticum alle obengenannten Probleme gelöst werden.
Somit ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein neuer Mutant des Bakteriums clostridium histolyticum, gekennzeichnet als Clostridium histolyticum K-26 cl 88, der
i) beim Institut für biochemische Technologie, Laboratorium für Mikrobiologie, Zagreb, Pierottijeva 6,
am 22. Mai 1990, unter dem Aktenzeichen 4043, und
ii) aufgrund des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von mikroorganismen für die Zwecke von patentverfahren nach Regel 6.1,
bei national Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Department of Microbiology and Biotechnoloby, University of Horticulture and Food Industry, Somloi ut 14-16, H-1118 Budapest, Ungarn, am 4. juni 1991 unter dem Aktenzeichen NCAIM B (P) 001145 hintergelegt wurde.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des angegebenen neuen Mutanten Clostridium histolyticum K-26 cl 88 durch die Behandlung der Sporen von Clostridium histolyticum K-26 (hintergelegt beim Institut für biochemische Technologie, Laboratorium für Mikrobiologie, Zagreb, Pierottijeva 6, am 22. Mai 1990, unter dem Aktenzeichen 4043) mit dem Mutagenmittel N-Methyl-N'-nitrol-N-nitrosoguanidin von 45 bis 90 Minuten bei etwa Zimmertemperatur, wonach die Sporen mittels Zentrifugation getrennt, in einer physiologischen Lösung suspendiert, auf ein festes Meidum geimpt und bei 37ºC etwa 3 Tage unter aeroben Bedingungen inkubiert werden.
Der erfindungsgemässe neue Mutant Clostridium histolyticum K-26 cl 88 unterscheidet sich vom Mutterstamm Clostridium histolyticum K-26 in zwei wesentlichen Eigenschaften. Wie es aus den durch Elektronenmikrographie erhaltenen Fig 1 und 2 (beigelegt) ersichtlich ist, verliert der Mutant sein Bewegungssystem, das ein Grundmerkmal des gemäss Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Scharpe, M.E., Holt, J.G., Eds., Williams and Wilking, Baltimore, London, Los Angeles, Sidney, Vol.2, 1170, 1986) klassifizierten Mutterstammes ist.
Das zweite neue Merkmal des neuen Mutanten im Unterschied zum mutterstamm besteht in seiner Unfähigkeit, die Bisoynthese des Begleitenzyms Clostripain durchzuführen. Diese Eigenschaft wurde sowohl aufgrund einer immunologischen Fällungsreaktion von Anticlostripain- und Antikollagenasenserum mit den Filtraten der Mutantenkultivierung als auch durch eine im folgenden Text beschriebene Analysenmethode festgestellt.
Jede gewachsene Kolonie wurde sowohl durch eine biochemische analyse als auch durch einen Immunfällungstest auf die Biosynthese des Enzyms geprüft. Die An- oder Abwesenheit von Clostripain wurde aufgrund einer zwischen dem Filtrat der Kultur Clostridium histolyticum K-26 und dem Hasen-Anticlostripainserum vorkommenden Fällungslinie ermittelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von clostripain-freier Kollagenase, wobei der angeführte neue Mutant Clostridium histolyticum K-26 cl 88 in einem flüssigen, Proteose-Pepton, enzymatisch hydrolysierte Kasein- und Sojaproteine (tryptische Sojabrühe), eine Vitaminlösung, Z.B. Riboflavin, Nikotinamid, Pyridoxin, Panthothensäure, ein Reduktionsmittel, z.B. NA-Thioglykolat und, falls erforderlich, anorganische Salze, z.B. NaHPO&sub4;, MgSO&sub4;, FeSO&sub4;, enthaltenden nährmedium von 10 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 28ºC bis 37ºC und einem pH von 7,2 bis 8,9 unter anaeroben submersen Bedingungen kultiviert wird. Während der Kultivierung wird da Enzym Kollagenase im flüssigen Medium augeschüttet. Das Produkt ist clostripain-frei.
Nach der Kultiviertung werden die Reinigung und die Isolierung durchgeführt. Die Kollagenaseausbeute ist im vergleich zu den üblichen Verfahren zur Herstellung von Kollagenase um etwa 10 bis 20% gesteigert.
Die Aktivität der erhaltenen Kollagenase wurde mittels des Verfahrens von Gasman V. un Nordwig A. (Hoppe-Seyler' Z. Phys. Chem., 322, 267, 1960) mit synthetischem Substrat ermittelt.
Die Clostripainaktivität wurde mitels eines modifizierten, im Katalog der Firma Worthington (1987,S.47) beschriebenen Verfahrens ermittelt.
Das Ermittlungsverfahren für nicht-spezifische proteolytische Aktivität wurde aus der Definition der Kaseinaktivitätseinheit gemäss dem katalog der firma Sigma (1990, S. 333) abgeleitet. Bei der Inkubation und der Fällung wurden übliche, zur Ermittlung der proteolitischen Aktivität erforderliche Bedingungen angewendet. Die Ermittlung der freigegebenen Aminogruppen wurde gemäss einer modifizierten kalorimetrischen Ninhydrinmethode nach rosen, H. (Arch. Biochem. Biophys., 67, 10, 1957) durchgeführt.
Um die Kollagenaseaktivität während der möglichen Gefrier- und Gefriertrocknungsverfahren zu aufrechtzuerhalten, wurde die flüssige Enzymzuberietung durch den Zusatz von Kohlenhydraten wie z.B. Sucrose, maltose u.dgl. bei einer Konzentration von 5x10&supmin;³ M bis 2,5x10&supmin;² M behandelt. Für die Stabilisierung der Aktivität der gefriergetrocknetem Kollagenasezuberietung wurden lösliche Proteine (enzymatisch hydrolysiertes kasein (Fluka), pulverartiges Pepton 1 (Torlak), säurehydrolysiertes kasein (Serva) usw.) im Konzentrationbereich von 10 bis mg/ml zur flüssigen Enzymzuberietung zugegeben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Sporen von Clostridium histolyticum K-26 wurden mit dem in TRIS Puffer (10 ml) gelösten N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) (3mg/ml) innerhalb von 45 und 90 Minuten behandelt. Der Mutagen MNNG wurde durch die Zentrifugierung und Dekantierung des Überstandes entfernt. Die Sporen wurden in einer physiologischen Lösung suspendiert, anschliessend auf ein Agarmedium bie einer geeignet3en Verdünnung geimpft und unter anaeroben Bedingungen bei 37ºC 3 Tage inkubiert.
Die im Festmedium gewachsenen Kolonien wurden in ein flüssiges Nährmedium geimpft und nach zweitägigem Wachstum bei 37ºC wurde die Kultur in eine Quelle mit einem Durchmesser von 8 mm pipettiert. In eine zweite, 2cm entfernte Nebenquelle von gleicher Grösse wurde hasen-Anticlostripainserum pipettiert. Die Geldiffusion von Clostripainantikörpern und Clostripain führte zu deren Kopplung und zur Bildung einer Fällungslinie. Domit wurde jeder Mutant zusätzlich zu biochemischer Analyse mehrmals kontrolliert. Die Abwesenhiet der Fällungslinie ist ein Beweis, dass die Mutantem kein Clostripain produzieren. Die erhaltenen Mutanten wurden gefriergetrocknet und für die Weiterverwendung gelagert.

Beispiel 2

Der gefriergetrocknete Mutterstamm K-26 des Bakteriums Clostridium histolyticum wurde für die Impfung des Vorfermentationsnährmediums der folgenden
Zusammensetzung verwendet:
Proteose-Pepton 50 g/l
tryptische Sojabrühe 15 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 9 g.l
MgSO&sub4; x 7H&sub2;O 0,08 g/l
FeSO&sub4; x 7H&sub2;O 0,014 g/l
Vitaminlösung 5 ml/l
Vitaminlösung:
Pantothensäure 200 mg/l
Nicotinamid 200 mg/l
Pyridoxin 200 mg/l
Thiamin HCl 200 mg/l
Riboflavin 20 mg/l
Das verwendete Medium hatte einen natürlichen pH-Wert. Die Sterilisation wurde bei 120ºC in 30 Minuten durchgeführt, während die Vitaminlösung bei 115ºC 15 Minuten sterilisiert wurde. Unmittelbar vor der Impfung des Mediums mit dem Mikroorganismus wurde die Vitaminlösung zugegeben. Der Mikroorganismus wurde bei der Tempertur 37ºC innerhalb von 20 Stunden stationär kultiviert.
Die zweite Stufe der kultivierung des Bakteriums wurde in einem Zweiliter- Glasbioreaktor (Multigene, New Brunswick, N.Y.) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 1500 ml des Mediums mit einer Zusammensetzung, die mit derjenigen des Vorfermentationsmediums identisch war, jedoch mit dem Zusatz von 10% des Impfstoffes, mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Temperatur von 30ºC. Die Fermentation wurde innerhalbe von 20 Stunden unter gelegentlicher Stickstoffblasung um anaerobische Bedingungen zu schaffen, und einem milden Rühren bei 50 U/min durchgeführt.
Enzymausbeute:
Kollagenase 1,32 E/ml
Clostripain 3,0 E/ml
nicht-spezifische Proteasen 820 E/ml

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde der Mutterstamm K-26 von Clostridium hystoliticum zur Impfung des Vorfermentationsnährmediums (wie im Beispiel 2) verwendet. Nach einer Kultivierung von 20 Stufen wurden 10% dieses Impfstoffs zur Impfung des Nährmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:
Proteose-Pepton 50 g/l
tryptische Sojabrühe 15 g/l
Vitaminlösung 5 ml/l
Na-Thioglykolat 0,57 g/l
Die Zusammensetzung der Vitaminlösung war mit derjenigen aus Beispiel 2 mit einem pH-Wert von 7,4 identisch. Das Medium wurde 30 Minuten bei 120ºC sterilisiert und die Kultivierung wurde in einem Zweiliter-Glasbioreaktor (Multigene, New Brunswick, N.Y.) mit 1500 ml des angegebenem Mediums bei einer Temperatir vpm 37ºC in 7 Stunden durchgeführt.
Enzymausbeute:
Kollagenase 1,32 E/ml
Clostripain 2,02 E/ml
nicht-spezifische proteasen 790 E/ml

Beispiel 4

Dieses Beispiel betrifft die Verwendung des gefriergetrockneten, gemäss Beispiel 1 erhaltenen Mutanten Clostridium histolyticum K-26 cl 88 zur Impfung des Vorfermentationsmediums mit identischer Zusammensetzung und unter identischen Kultivierungsbedingungen wie im Beispiel 2. Zur Impfung des flüssigen Mediums wurden 10% des Impfstoffs verwendet. Die Fermentation wurde 7 Stunden durchgeführt.
Enzymausbeute:
Kollagenase 1,2 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische Proteasen 630 E/ml

Beispiel 5

Dieses Beispiel betrifft die Verwendung des gefriergetrockneten, gemäss Beispiel 1 erhaltenen Mutanten Clostridium histolyticum K-26 cl 88, der in ein Medium mit der im Beispiel 3 angegebenen Zusammensetzung geimpft wurde. Die Kultivierung des Bakteriums wurde bei 28ºC innerhalb von 8 bis 10 Stunden durchgeführt.
Enzymausbeute:
Kollagenase 2,72 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische proteasen 466 E/ml

Beispiel 6

Der gefriergetrocknete, gemäss Beispiel 1 erhaltene Mutant Clsotridium histoyticum K-26 cl 88 wurde in diesem Beispiel als Impfstoff für das im Beispiel 2 angegebene Vorfermentationsmedium verwendet. Der kultivierte Mikroorganismus wurde als ein Impstoff für die zweite Stufe der Fermentation wie im Beispiel 3 angegeben verwendet. Der Unterschied war nur der pH-Wert von 8,7 und die Temperatur von 30ºC. Die Kultivierung wurde nach 10 Stunden unterbrochen.
Enzymausbeute:
Kollagenase 4,4 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische Proteasen 376 E/ml

Beispiel 7

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Enzymisolierung aus dem sterilen Ultrafiltrat des Fermentationsmediums des Mutanten Clostridium histolyticum K-26 cl 88, der kein Clostripain produziert, dar. Das konzentrierte, gemäss Beispielen 4, 5 und 6 erhaltene kulturfiltrat wurde mit 0,03-0,05-molarem Calciumchlorid und Aceton bei Konzentrationene von 18-33% bearbeitet. Die Fraktionsfällung wurde durch den Zusatz von Ammoniumsulfat zuerst bis zu einer 20-30%-igen und anschliessend bis zu einer 70-80%-igen Sättigung und schliesslich durch eine zweistufige Bearbeitung mit Calciumphosphat-Gel erreicht, während die Bearbeitung mit Aceton ausgelassen wurde. Es wurde eine aktive, gefriergetrocknete, clostripain-freie Kollagenasezubereitung in einer Ausbeute von 75 bis 85% erhalten.
Enzymausbeute:
Kollagenase 2,3 E/mg
Clostripain 0,0 E/mg
nicht-spezifische Proteasen 45 E/mg

Beispiel 8

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Isolierung von Kollagenase aus einem sterilen Ultrafiltrat des Fermentationsmediums des Mutanten Clostridium histolyticum K-26 cl 88 dar, das gemäss Beispielen 4, 5 und 6 erhalten und gemäss Beispiel 7 bearbeitet wurde mit der Ausnahme, dass die Bearbeitung mit Ammoniumsulfat bis zu einer 30%-igen Sättigung ausgelassen wurde. Es wurde eine weisse, aktive, gefriergetrocknete clostripain-freie Kollagenasezubereitung in einer Ausbeute zwischen 75 und 90% erhalten.
Enzymausbeute:
Kollagenase 2,5 E/mg
Clostripain 0,0 E/mg
nicht-spezifische Proteasen 45 E/mg

Beispiel 9

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Isolierung von Kollagenase aus Proben dar, die gemäss Beispielen 4, 5 und 6 erhalten und gemäss Beispielen 7 und 8 gereinigt wurden mit der Ausnahme, dass die Bearbeitung mit Calciumphosphat-Gel ausgelassen wurde. Es wurde eine weisse, gefiergetrocknete, clostripain-freie Kollagenasezubereitung in einer Ausbeute zwischen 75 und 90% erhalten.
Enzymausbeute:
Kollagenase 2,6 E/mg
Clostripain 0,0 E/mg
nicht-spezifische Proteasen 44 E/mg

Beispiel 10

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Reinigung des flüssigem Produktes dar, das durch die in Beispielen 3 und 7 beschriebene Kultivierung und Bearbeitung erhalten wurde. Das Reinigungsverfahren umfasst das Auftragen der Probe auf eine Sephadex G-75 enthaltende Säule. Das Auftragen auf die Säule und die Elution der Proteinfraktionen wurden mit 0,01 molarem TRIS HCl Puffer bei pH 7,2 und durch den Zusatz von 0,01-molarem Calciumacetat durchgeführt. Die Identifikation von drei Proteinfraktionen wurde durch ein Gelfiltrationverfahren ermöglicht. Die Analyse bestätigte die Kollagenaseaktivität in der erste Fraktion, eine verminderte Kollagenaseaktivität in der zweite Fraktion, während in der dritten Fraktion zusätzlich zu der Aktivität von nicht-spezifischen proteasen auch das braune Pigment identifiziert wurde, wie es aus folgenden
Ergebnissen ersichtlich ist:
I Fraktion Kollagenase 34,2 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische Proteasen 0,0 E/ml
II Fraktion kollagenase 10,5 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische proteasen 0,0 E/ml
III Fraktion kollagenase 0,0 E/ml
Clostripain 0,0 E/ml
nicht-spezifische Proteasen 535 E/ml

Beispiel 11

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Entsalzung der gereinigten Kollagenasefraktionproben dar. Flüssige ultrafiltrierte, gemäss Beispiel 10 erhaltene Reinenzymfraktionene wurden genommen und auf eine Sephadex G-25 enthaltende Säule aufgetragen. Die Probenauftragung und -elution wurden durch die Verwendung von destilliertem Wasser durchgeführt. Es wurde eine Fraktion des salz-freiem Reinenzyms erhalten. Die Aktivität des Reinenzyms war 38,2 E/ml.

Beispiel 12

Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Kollagenaseaktivitäterhaltung in flüssiger Zubereitung während des Gefrier- und Gefriertrocknungsverfahrens dar, wobei zur flüssigen, gemäss den Beispielen 7-11 erhalten Zubereitung Kohlenhydrate wie z.B. Sucrose, Maltose u.dgl. in Konzentrationen von 5x10&supmin;³ M bis 2,5x10&supmin;² M zugegeben wurden.

Beispiel 13

Dieses Beispiel stellt eine Verfahrenweise dar, die eine Stabilisierung der gefriergetrockneten Kollagenazezubereitung ermöglicht, wobei zur flüssigen, gemäss den Beispielen 7-11 erhaltenen Kollagenaseszubereitung verschiedene lösbare Proteine wie z.B. enzymatisch hydrolysiertes kasein (Fluka), pulverförmiges Pepton 1 (Torlak), säurehydrolysiertes Kasein (Serva) und andere in Konzentrationen von 10 bis 50 mg/ml von flüssiger Enzymzubereitung zugegeben wurden. Die auf diese Weise gefriergetrocknete Kollagenase zeigt eine unveränderte Aktivität.

Claims

1. Neuer Mutant von Bakterium Clostridium histolyticum, gekennzeichnet als Clostridium histolyticum K-26 cl 88, der

i) beim Institut für biochemische Technologie, Laboratorium für Mikrobiologie, Zagreb, Pierottijeva 6,

am 22. mai 1990, unter dem Aktenzeichen 4043, und

ii) aufgrund des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren nach Regel 6.1,

bei National Collection of Agricultural and Industrial microorganisms, Department of Microbiology and Biotechnology, University of Horticulture and Food Industry, Somloi ut 14-16, H-1118 Budapest, Ungarn,

am 4. Juni 1991 unter dem Aktenzeichen NCAIM B(P) 001145 hintergelegt wurde,

wobei sich der neue Mutant Clostridium histolyticum K-26 clo 88 vom Mutterstamm Clostridium histolyticum K-26 in zwei wesentlichen Eigenschaften unterscheidet:

i) durch das Fehlen des Motilitätsystems, das ein Grundmerkmal des Mutterstamms ist, und

ii) durch die Unfähigkeit, eine Biosynthese des Begelitenzyms clostripain auszuführen.

2. Verfahren zur herstellung von Clostripain-freier Kollagenase, dadurch gekennzeichnet, dass der neue Mutant Clostridium histolyticum K-26 cl 88 nach Anspurch 1 in einer flüssigen, Proteose-Pepton, enzymatisch hydrolysierte Kasein- und Sojaproteine (tryptische Sojabrühe), eine Vitaminlösung z.B. Riboflavin, ein Reduktionsmittel, z.B. Na-Thioglykolat, und Stickstoff enthaltenden Nährlösung einer Kultivierung von 10 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 28ºC bis 37ºC und einem pH von 7,2 bis 8,9 unter anaeroben submersen Bedingungen mit einer Kombination von Fällungsmitteln, z.B. Calciumchlorid, Aceton, Ammoniumsulfat und Calciumphosphat-Gel, unterworfen wird, danach die die Kollagenase enthaltende flüssige Phase gereinigt wird und anschliessend die Clostripain-freie Kollagenase daraus isoliert wird.