DE1810277C3 - Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase

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DE1810277C3 DE1810277A DE1810277A DE1810277C3 DE 1810277 C3 DE1810277 C3 DE 1810277C3 DE 1810277 A DE1810277 A DE 1810277A DE 1810277 A DE1810277 A DE 1810277A DE 1810277 C3 DE1810277 C3 DE 1810277C3
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Description

Streptomyces spec. CBS 670.68 Streptomyces spec. CBS 671.68 Streptomyces spec. CBS 669.68 Streptomyces califonicus ATCC 3312 und Streptomyces griseus ATCC 10 137
kultiviert und daß man die Fibrinolsokinase aus der erhaltenen Kultur nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
Es ist bekannt, daß aus menschlichem Urin eine Fibrinolysokinase, Urokinase, gewonnen werden kann. Dieses Gewinnungsverfahren ist jedoch wegen der Verwendung des besonderen Ausgangsmaterials aufwendig. Außerdem ist der Gehalt an Kinasen so gering, daß mehrere 100 Liter Urin für eine therapeutische Dosis aufgearbeitet werden müssen (A stm ρ und Sterndorff. Nature, 170,981 [1952]).
Es ist weiterhin bekannt, daß aus hämolytischen Streptokokken eine Fibrinolysokinase gewonnen werden kann, die als Streptokinase bezeichnet wird. Die eo Nachteile dieser Substanz für die medizinische Anwendung liegen vor allem in ihrer hohen antigenen Wirkung und in der notwendigen aufwendigen Reinigungsoperation, welche den Preis außerordentlich erhöhen (Markus und Ambrus, ]. Biol. Chem. 235, 1673 (,■> [I960]).
Weiterhin sind Fibrinolysokinasen bekannt aus Bacillus subtilis (S h i m i und K e I a d a, Arch. Mikro biol, 50, Nr, 4, 326 [1965J und Pasteurella pestis [Beesley et al„ J. Bacteriol 1, 19 [1967]). Auch bei diesen ist eine praktische Anwendung aus bekannten Gründen nicht möglich.
Es ist nach Mikrobiologiya 1968, 37 (4), Seiten 719—735 bekannt, daß durch Züchten eines Stammes der Actinomycetalen fibrinolytische und caseinolytische Enzyme gebildet werden.
Ferner ist nach PrikL Biokhim. Mikrobiol. 1968, 4 (5) 549—53 bekannt, daß Saprophyt- und pathogene Mycobakterien gegebenenfalls fibrinolytische Substanzen bilden können.
In beiden letztgenannten Veröffentlichungen werden fibrinolytische Aktivitäten mit Hilfe der Fibrinplattenmethode gemessen, wie sie von S. M ü 11 e r t ζ (Acta physioL Scand. 25 [1952], 93—100) beschrieben wurde. Daraus geht hervor, daß man hierbei nicht unterscheiden kann, ob die in Frage stehenden Enzysie Fibrin direkt proteolytisch abbauen, oder ob sie Plasminogenaktivatoren sind, die infolge einer Umwandlung des Plasminogens zu Plasmin die Fibrinolyse hervorrufen. Die sowjetischen Autoren können zwar zeigen, daß das fibrinolytische Enzym z. B. nicht identisch mit einem Kasein abbauenden Enzym ist Jedoch ist z. B. bekannt, daß gewisse Aspergillus-Arten proteolytische Enzyme produzierend, die Fibringerinnsel bei solchen Konzentrationen abbauen, bei denen nur geringe Wirkungen auf Substrate wie Kasein zu beobachten sind (vgl. z. B. Freedman, N. J, Roschlau. W. H. E.; Can. J. Physiol. Pharmakol. 48 [1970], 69—76) Im Gegensatz dazu kann gezeigt werden, daß die Wirkung der erfindungsgemäß erhältlichen Fibrinolysokinase im wesentlichen darauf beruht, daß nicht das Fibrin direkt angegriffen wird, sondern daß der Abbau über die Plasminogenaktivierung erfolgt indem parallel erhitzte und unerhitzte Fibrinplatten zum Nachweise der fibrinolytischen Wirkung benutzt werden. Somit wirkt das anmeldungsgemäße Enzym ähnlich wie Urokinase oder Streptokinase. Die Wirkungsweise ist erwünscht und kommt dem physiologischen Geschehen sehr viel näher als die direkte Proteolyse des Fibrins.
Durch das im folgenden beschriebene erfindungsgemäße Verfahren kann man erstmalig zu einem Verfahren gelangen, welches ermöglicht eine Plasminogen aktivierende Fibrinolysokinase im großtechnischen Maßstabe herzustellen.
Aktinomycetalesstämme, die Fibrinolysokinase produzieren, kann man leicht nach der in den Ansprüchen 1 bis 3 definierten erfindungsgemäßen Methode finden Sie kommen unter den Stammet; der Ordnung Aktinomycetales in großer Zahl vor.
Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Oidnung Aktinomycetales, insbesondere solche der Familie der Streptomycetaceae, darunter ihrer leichten Kultivierbarkeit wegen besonders Stämme der Gattung Streptomyces. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösung, die das Wachstum dieser Stämme erlauben. Man kann ζ. Β die Glycerin-Glykokoll-Nährlösung nach von Plothc mit der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Glykokoll, 0,1 % NaCI, 0,1% K2HPO4,0,01% FeSO4 · 7 H2O, 0,01 % MgSO4 · 7 H2O und 0,01 % CaCOi
verwenden. Des schnelleren Anwachsens wegen gibl man zweckmäßigerweise in eine solche Nährlösung noch komplexe Kohlenstoffquellen, wie z. B. Maisquell-
wasser (bevorzugt in Konzentrationen von 0,25%) oder Sojamehl (bevorzugt ebenfalls in Konzentrationen von 0,25%) oder beide zusammen. In diesen Fällen muß der pH-Wert der lösung eingestellt werden. Man bevorzugt ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5.
Das Glycerin der Nährlösung kann man auch durch andere Kohlenstoffquellen, wie z, B, Glucose oder Rohrzucker, ersetzen. An Stelle des Glykokolls kann man auch andere Stickstoffquellen, wie z. B. Alanin, Äthylamin oder Lysin, verwenden. Die Konzentrationen der Kohlenstoff-, und Stickstoffquellen, wie auch die Konzentrationen der Salze können in weiten Grenzen schwanken. FeSO4, CaCO3 und MgSO4 können auch ganz fehlen.
Von der Nährlösung füllt man z.B. 100ml in 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15 bis 35°C, vorzugsweise bei 23 bis 300C auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1 bis 10 Tagen, meist nach 3 bis 5 Tagen geschieht, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml, trennt in dieser Probe das Mycel durch Filtration oder Zentrifugation ab und stellt die Lösung mit ca. Vi0 HCI auf pH 0 bis 4 ein. Danach wird 15 Minuten auf 65°C erhitzt sofort abgekühlt und der pH-Wert mit ca. Vi0 NaOH auf 5 bis 10 eingestellt. Die Fibrinolysokinase-Aktivität wird in üblicher Weise auf der Müllertz-Astrup-PIatte bestimmt. Etwa restlich verbliebene proteolytische Aktivität wird in bekannter Weise ebenfalls auf der erhitzten Müllertz-Astrup-PIatte bestimmt.
Nach der oben beschriebenen Me.node prüften wir eine ganze Reihe von Stämmtn der verschiedensten Gattungen der Ordnung Actinomyceta! s und fanden in verschiedenen Gattungen, wenn auch zum Teil schwache, so doch deutliche Lysokinase-Aktivitäten. Am günstigsten hinsichtlich der Ausbeute und der Kultivierbarkeit waren die Stämme der Familie der Streptomycetaceae, besonders die der Gattung Streptomyces. Von 32 geprüften Streptomyceten zeigten auf den nicht erhitzten Fibrinplatten bei 16 Streptomyceten die Kulturlösungen auch dann Abbauzonen, wenn der pH-Wert der Kulturlösung auf 1,5 bis 1,8 eingestellt war. Von diesen 16 Stämmen zeigten 6 auf der erhitzten Platte, d.h. mit denaturiertem Plasminogen, keine Abbauzonen, enthalten also nach der vorangegangenen Behandlung keine Proteasen. Die Wirkung muß also in diesen Fällen einer Lysokinase zugeschrieben werden.
Diese 6 Stämme (Bezeichnung: St 4, St 7, St 16, St 18, St 21 und St 24/Beschreibung der Stämme s. Tabelle 1), die alle auf Grund ihrer Sporophor-Struktur zur Gattung Streptomyces gehören, zeigen die in Tabelle 1 aufgeführten wichtigen systematischen Charakteristika (Hütter, R, »Systematik der Streptomyceten«, Bibliotheca Microbiologica, Fase. 6, S. K a r g e r, Basel, New York, 1967).
Die Stämme St 16, St 18 und St 24 wurden im Centraalbureau voor Schimmelcultures hinterlegt unter den Nummern CBS 670.68,671.68 und 669.68.
Zur Gewinnung von Fibrinolysokinase werden diese Stämme wie oben beschrieben kultiviert. Nach 2 bis 3 Tagen Wachstum wird das Mycel abgetrennt und aus der KulturbrUhe in an sich üblicher Weise durch Einengen der Lösung und Fällen mit organischen Lösungsmitteln die Lysokinase angereichert.
Die gefundene Fibrinolysokinase soll als Arzneimittel für die bekannten Indikationen Verwendung finden.
Über die Anwendung und Dosierung liegt Literatur vor (F I e t sch e r et al, |. Lab,und Clin. Med,65,713[1965]),
Beispiel 1
Man beimpft mit 1 ml einer Sporensuspension, die man durch Abspülen eines 10 Tage alten Schrägröhxchens des Stammes St 16 mit G|ycerin-G|ykokoll-Agar nach von Plotho mit 12 ml Wasser erhält, eijen ίο I-Liter-Erlenmeyerkolben, der 100 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Glykokoll, 0,4% Maisquellwasser, 0,4% Sojamehl, 0,1 % NaCl, 0,1 % K2HPO4,
0,01% MgSO4 · 7H2O,
0,01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCO3
(Sterilisation 60 Minuten bei 121°C) enthält. Die Kultur bebrütet man auf einer Schüttelmaschine bei 24°C. Nach dreitägiger Bebrütung erhält man eine Kulturlösung, die 1,9 CTA-Einheiten/ml enthält. Das nahezu klare Zentrifugat wird auf z. B. pH 1,5 eingestellt und 15 Minuten bei 65°C gehalten. Nach sofortiger Abkühlung wird auf pH 7,5 eingestellt und erneut zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen. Der Überstand wird in das 4fache Volumen -20T kaltem Aceton gegeben. Es wird 5 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung bei +40C über 3 Stunden ruhig gehalten. Der Überstand
jn wird schließlich abdekantiert und verworfen.
Das Sediment wird erneut in kaltem trockenem Aceton aufgenommen und darin gründlich dispergiert. Anschließend wird zentrifugiert und das entstandene Sediment im Vakuum getrocknet. Ausbeute ca. 50 bis 80%. Anreicherung ca. I Ofach.
Der Stamm St 16 zeigt die in Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführten Artcharakteristika und dürfte Streptomyces chrysomallus Lindenbein zuzuordnen sein (Li η d e η b e i η, W., Arch. Mikrobiol. 17,361Γ1952]).
Beispiel 2
Beimpft man eine Nährlösung nach Beispiel 1 mit I ml
einer Sporensuspension, die man durch Abspülen eines 10 Tage alten Schrägröhrchens des Stammes St 24 mit 12 ml Wasser gewinnt und bebrütet nach Beispiel 1, so erhält man nach 2tägiger Kultur eine Kulturlösung, die 0,51 CTA-Einheiten/ml enthält.
Das nahezu klare Zentrifugat wird auf z.B. pH 1,5 eingestellt und 15 Minuten bei 65°C gehalten. Nach
sofortiger Abkühlung wird auf pH 7,5 eingestellt und
erneut zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen.
Der Überstand wird in das 4fache Volumen -200C kaltem Aceton gegeben. Es wird 5 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung bei + 4°C über 3 Stunden ruhig gehalten. Der Überstand schließlich abdekantiert und verworfen.
Das Sediment wird erneut in kaltem trockenem Aceton aufgenommen und darin gründlich dispergiert. Anschließend wird zentrifugiert und das entstandene Sediment im Vakuum getrocknet. Ausbeute ca. 50 bis 80%. Anreicherung ca. 10fach.
Der Stamm St 24 zeigt die in Tabellen 1. 2 unrt 3
b5 aufgeführten Artcharakteristika und dürfte Streptomyces griseus Waksman et Henricci zuzuordnen sein (W a k s m a η, S. Α., »The Actinomycetes« Vol. II, The Williams und Wilkins Comp., Baltimore [ 1961 ]).
Beispiel 3
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung, die
3% Glycerin, 0,4% Glykokoll,
0,25% Maisquellwasser, 0,4% Sojamehl,
0,1% NaCI, 0,1% K2HPO4.
0,01% MgSO4 · 7 H20,0,01%.
FeSO4 . 7 H2O und 0,01% CaCO }
(Sterilisation 60 Minuten bei 121°C) enthält, nach Beispiel 2 mit dem Stamm St 24, so erhält man nach 3tägiger Kultur eine Nährlösung, die 10,2 CTA-Einheiten/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 4
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 3 mit 1 ml einer Sporensuspension, die man durch Abspulen eines 10 Tage alten Schrägröhrchens des Stammes St 18 mit Glycerin-Glykokoll-Agar nach von Plotho, so erhält man nach 4tägiger Kul'-jr auf einer Schüttelmaschine bei 24°C eine Kulturbrühe, die 5.3 CTA-Einheiten/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Der Stamm St 18 zeigt die in Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführten Art-charakteristika und dürfte Streptomyces chrysomallus Lindenbein zuzuordnen sein (Lind e η b e i η. W, Arch. Mikrobiol. 17.361 [1952]).
Beispiel 5
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung
2% Glukose, 0,4% Glykokoll,
0,25% Maisquellwasser, 0,25% Sojamehl,
0,1% NaCI, 0,1% K2HPO4,
0,01 -Yo MgSO4 · 7 H2O,
0.01 % FeSO4 ■ 7 H2O und 0,01 % CaCO3
(Sterilisation 60 Minuten bei 121°C). mit einer Sporensuspension nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18 und bebrütet 4 Tage bei 24°C, so erhält man eine KulturWsung.die 4,2 CTA-Einhek?n/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 6
Beimpft man Nährlösungen, die neben 2% Glycerin, 0,4% Glykokoll, 0,4% Sojamehl, 0,25% Maisquellwasser, die in Tabelle 4 aufgeführten Salzkonzentrationen enthalten nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18, so erhall man die in Tabelle 4 aufgeführten Ausbeuten.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 7
Beimpft man Nährlösungen der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Maisquellwasser,
0,25% Sojamehl,0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01% MgSO4 · 7H2O.
0,01% FeSOi · 7 H2O und 0,01% CaCO3
(Sterilisation 60 Minuten bei I21°C) mit Zusätzen verschiedener Aminosäuren in Konzentralionen von 0,4% nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18, so erhält man nach 4lägiger Kultur bei 24"C folgende Ausbeulen:
Zusatz (0.4%)
CTA-Einheiten/ml
Alanin 6,2
L-Tyrosin 031
L-Lysin 039
Glykokoll 4.8
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 8
Beimpft man einen 60 Liter einer Nährlösung enthaltenden Fermenter mit der Nährlösung
2% Glycerin, 0,4% Glykokoll, 0,25% Maisqueliwasser,0,4% Sojamehl, 0,1% NaCl,0,1 %K2HPO4,
0.01% MgSO4 ■ 7H2O,
ü.01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCOj
(Sterilisation 60 Minuten bei 121°C) mit 15 gut bewachsenen Erlenmeyerkolben mit 100 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit Stamm St 18 und bebrütet unter Rührung und Belüftung bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung mit folgenden CTA-Einheiten/mi:
Kulturdauer CTA-Einheiten/ml
(Stunden)
36 1,9
44 3,2
52 3,8
60 7.0
68 7»
76 8,4
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 9
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 8 mit einer Sporensuspension des Stammes Streptomyces californicus ATCC 3312 und bebrütet 9G Stunden auf einer Schüttelmaschine bei 23°C, so erhält man eine Kulturlösung mit 1.4 CTA-Einheiten/ml.
Beispiel 10
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 8 mit einer Sporer^uspension des Stammes Streptomyces griseus ATCC IO 137 und bebrütet 65 Stunden auf einer Schüttelmaschine bei 23°C, so erhält man eine Kulturlösung mit 5,2 CTA-Einheiten/ml.
Tabelle I
Beschreibung der Stämme
Stamm
Strcptomyccs chrysomallus Lindenbein Typenstamm I
Si 4
Sl 7
Morphologie
des l.iiftmycels
Morphologie
der Sporen
ι-amc ues i.uninyccls
Chromogcnität
(s. Tabelle 2
Glukose-, Nähr-Tyrosin-Agar,
Gelaline-Stichkultur
Sympodial verzweigte Büschel mit geraden oder gewellten Sporophoren, keine Spiralen
glatt
in jungem zustand oder bei spärlicher Entwicklung weiß, bei üppiger Entwicklung creme mit Beimischungen von grün u. grau
kein braunes Pigment
stark verzweigte Sporophore. Enden stark spiralisiert. meist 8— Windungen
glatt
in reiicni
Zustand
mausgrau
kein
braunes
Pigment
meist glatt z. Teil mit Warzen
mausgrau
bildet
braunes
Pigment St 16
St 18
St 21
Si 24
Sympodial verzweigte Büschel mit geraden oder gewellten Sporophoren; keine Spiraler
glatt
glatt
glatt
glatt
iNiir in jungem z.ustand
oder bei spärlicher Ent- z. Teil grau
wicklung weiß, bei
üppiger Entwicklung
creme mit Beimischungen von grün u. grau
kein braunes Pigment kein braunes
Pirgment
Tabelle 2
Verhalten der Stämme auf den wichtigsten diagnostischen Nährböden
Nährboden
Streptomyees chrysomallus Lindenbein Typenstamm
Sl St 18
St 24
Synth.-Agar1
W: kräftig, krustig, gelb LM: staubig, dünn, weiß
Glycerin-Glykokoll-Agar nach von Plotho4 28°
Glucose-Asparagin-Agar')
Ca-Maiai-Agar>)
W: LM:
LP: W:
W:
kräftig, krustig.
gelb
kräftig mehlig,
weiß bis creme
LP: blaßgeib gelb
W: kräftig, krustig bis runzlig, kräftig, krustig,
gelb bis gelborange gelborange
LM: angedeutet staubig, weiß mehlig, weiß bis
creme LP: goldgelb goldgelb
gut krustig bis pustelig, krustig, gelb farblos bis blaßgelblich LM: angedeutet staubig, weiß staubig, weiß
LP: blaßgelb
gelb
W: mäßig, feinkrusiig, farblos maßig, krustig,
blaßgelb
LM: angedeutet weiß fehlt
LP: 0 grünlichgelb
krustig, farblos mäßig, dünn.
krustig, farblos
staubig, später fehlt
schwach mehlig,
weiß bis creme
fehlt fehlt
krustig, oliv bis krustig, gelb bis
braunoliv gelbbraun
staubig, creme. mehlig, weiß bis
stellenweise grau creme
blaßgelb angedeutet gel^
lichbraun
0 schwach krustig
farblos
teilweise mehlig
weiß bis creme
fehlt
0 0
krustig, blaßgelb krustig, blaßgelt
lich
mehlig, weißlich mehlig bis
bis creme staubig, weiß
blaßgeib schwach gelb
lich
mäßig, krustig, schwach krustig
farblos farblos
fehlt fehlt
fehlt fehlt
9 18 10277 Sl Ib bis gelborange 10 Sl IK Sl 24
teilweise staubig,
l-Orlsct/uni! krustig, gelblich weiß bis creme krustig, gelb sehr dünn,
krustig, farblos
angedeutet.
Nährboden Slrcplomyces chrysoniallus staubig, stellen staubig bis mehlig. weißlich
W: l.indenbcin Typcnsianim weise mehlig, weiß gelb weiß bis creme
.Stärkeplatte1) LM: kräftig, krustig, gelb bis creme fehlt
angedeutet staubig, weiß blaßgelb Ring, farblos fehlt Siärkeabbau:
Stärkeabbau: fehlt .Stärkeabbau: schwach
LP: mäßig Fillung, keine schwach 0
fehlt 0 Peptonisierung 0 schwach krustig.
Starkeabbau: mäßig mäßig, krustig, sehr kräftig, runz mäßig krustig. farblos
W: farblos lig, schleimig, farblos fehlt
Celliilosebrühe1) W: 0 fehlt braunoliv fehlt fehlt
Glucose-Agar1) kräftig, krustig bis runzlig. fehlt fehlt Fehlt krustig, farblos
LM: blaßgelb schleimig, gelb fehlt krustig, gelblich angedeutet weiß
LP: stellenweise staubig, weiß fehlt langsame Ver staubig, weiß bis
W: gelblich flüssigung creme fehlt
Nähragar1) LM: gut, krustig, gelblich gelb wenig Kolonien, gelb schwach krustig,
0 krustig, farblos kräftig, runzlig. krustig, bräunlich IdI UIUj
stellenweise
LP: angedeutet oliv staubig, weiß bis grünlichgelb
W: gelb stellenweise creme fehlt
Tyrosin-Agar2) LM: krustig gelblich staubig, weiß schwachbräunlich sehr kräftig.
angedeutet kräftig, krustig, fehlt kräftig, krustig bis krustig, gelb
LP: runzlig, orange bis runzlig, gelbgrün. braun
W: schwachgelblich oliv später bräunlich stark mehlig.
Kartoffelagar') sehr kräftig, runzlig, gold teilweise vorhan stellenweise grünlich, creme
gelb bis orangegelb später den, dünnstaubig. staubig, weiß bis oder grau
LM: bräunlich weiß grünlichgelb grüngelb bis
gelbbraun
0 gelboliv grünlichbraun krustig, bräun
mäßig bis gut, krustig, gelb dünnkrustig, gelb krustig, farblos lich
LP: stellenweise
W: gelblich, später gelbbraun fehlt mehlig, weiß bis mehlig.
Haferflockenagar3) gelbgrün weiß bis grünlicl
LM: blaßgelb bis
gelb fehlt hellbraun
Ring
LP: Ring, farblos Ring fehlt
fehlt fehlt Fällung, keine
W: schwache Fällung, keine Fällung, keine Peptonisierung
Lackmusmilch LM: Peptonisierung Peptonisierung sehr kräftig.
sehr kräftig, runzlig. sehr kräftig, runz runzlig, schlei
schleimig, gelbbraun lig, schleimig. mig, oliv
W: braunoliv fehlt
Löfflers Serumnähr fehlt fehlt blaßgelb
boden fehlt fehlt langsame Ver
LM: langsame Verflüssigung langsame Ver flüssigung
LP: flüssigung eine Kolonie,
kräftig, krustig, bis runz einz. Kolonien, krustig, bis
lig, gelb bis rötlich runzlig, braunoliv runzlig, oliv
W: fehlt
Karottenkeile angedeutet staubig, v/eiß teilweise mehlig,
gelblich fehlt
LM: fehlt fehlt
LP:
M 18 1< 0277 12 Sl 18 St 24
Fortsetzung kräftig, runzlig,
braun
einz. Stellen,
dünn weiß
fehlt		 sehr kräftig,
runzlig
mehlig, weiß
fehlt
Nährboden Strcplomyces chrysomallus
l.indenbein Typensiamm		 St Ib krustig, gelb runzlig, bräun
lich
Kartoffelkeile W:
LM:
LP:		 sehr kräftig, runzlig, gold
gelb
fehlt
fehlt		 sehr kräftig, runz
lig orange bis zie
gelrot
staubfein, weiß
oder gelblich
fehlt		 staubig, weiß
fehlt
starke Verflüssi
gung		 mehlig bis stau
big, creme
fehlt
starke Verflüssi
gung
Gclatine-Stiehkultur1) W: kräftig, krustig, gelbbraun krusiig, gelb kräftig, krustig
0
gclblichbraun		 kräftig, krustig
0
gelblichbraun
LM:
LP:		 fehlt
fehlt
Verflüssigung stark		 staubig, weiß
fehlt
starke Verflüssi
gung
Pepton-Iron-Agar
(Difco)		 W:
LM:
LP:		 kräftig, krustig
0
bräunlich		 kräftig, krustig
0
gelbbraun
W: Wachstum.
LM: Luftmycel.
l.P: Lösliches Pigment.
nach Lindenbein, W.
Glucose Agar: statt KIhPOi KjHPC)4
Ca-Malat-Agar: ohne Glycerin.
nach H ü 11 e r, R.
nach Waksman.S. A.
Kartoffel-Agar: Potato-glucose-Agar ohne CaCOi und MgSOi.
nach von Plothos. Waksman.S. A.
Tabelle 3
Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen
Kohlenstoffquelle Streptomyces chryso- Sl 16 St 18 Sl 24 + -Ι
mallus Lindenbein Ο
Typenstamm
d-Xylose + + + + + + + + + -ι-
I-Arabinose + + + + + + + + + Ο
Rhamnose + + + + + + + + + ο
d-Galaktose + + + + + + + + -Ι + -Ι
Saccharose O + Ο Ο
Maltose + + + + + + + + + + +
Maltose/a + + + + + + + + + + + NaN03 statt
(NH4)2SO4
Lactose + + einz. KoI. + + + einz. KoI. + + + einz. KoI. + -I- -Ι
Raffinose O O O Ο
Inulin O O O O
d-Mannit + + + + + + + + + + + +
d-Sorbit + O + ±
Dulcit + ± O O
Inosit ± + ± O
Na-Acetat + + + ± ±
Na-Citrat + + + + +
Na-Succinat ± + + +
d-Glucose + + + + + + + + + + + +
d-Glucose/a 1 KoI. + + + + + + + NaNCh statt
(NH4)2SO4
Fructose + -ι- + + + + + -ι-
Grundnährboden Ο O Ο
Nährboden nach W a k s m a η , S. A. + + + sehr kräftiges Wachstum. + + kräftiges Wachstum.
+ mäßiges Wachstum. ± Wachstum zweifelhaft. O kein Wachstum.
13 MgSOi 18 10277 14 CTA-F.inhcilen/inl
nach 4täpigc Kultur
Tabelle 4 in der Nährlösung in % 0,01 2,5
Kon/enirdlion K2HPO4 0,01 FeSOi 7 IbO 2,3
NaCI 0 • 7 H2O CaCOi 2,55
0.1 0.02 0,01 2,7
0,2 0,2 0,01 0,01 0,01 1.6
0, 0,1 0,01 0,01 0,01 3,7
0. 0.1 0,01 0,01 0,01 2,8
0, 0,1 0.01 0,01 0.01 1.95
0. 0,1 0 0.01
0. 0,1 0.02 0
0, 0,1 0.01 0.02
0, 0,01

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen aus Erdproben isolierten und auf seine Bildungsfähigkeit von Fibrinolysekinase zu testenden Stamm der Ordnung Aktinomycetales in eine in bekannter Weise sterilisierte Nährlösung impft, die Nährlösung bei 15 bis 35°C in Kolben auf |0 Schüttelmaschinen brütet, daß man in dem Fall, daß die Kultur Wachstum zeigt, eine Probe entnimmt und von dieser Probe das Mycel durch Ritration oder Zentrifugation abtrennt, daß man die Lösung mit ca. Vio n-HCI auf pH 0 bis 4 einstellt, sie danach 15 Minuten auf 65° C erhitzt, sofort abkühlt und mit ca. Vio n-NaOH auf pH 5 bis 10 einstellt, daß man die Fibrinolyseaktivität einerseits in üblicher Weise auf der Müllertz-Astrup-Platte sowie andererseits in üblicher Weise auf der erhitzten Müllertz-Astrup-Platte testet, daß man den Stamm in dem Falle, daß sich bei dem Test auf der Müllertz-Astrup-Platte Abbauzonen und bei dem Test auf der erhitzten Müllertz-Astrup-Platte jedoch keine Abbauzonen zeigen, kultiviert und daß man die Fibrinolsekinase aus der erhaltenen Kultur nach an sich bekannten Methoden gewinnt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Stamm der Streptomycetaceae ausgeht
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Stamm von Streptomyces ausgeht.
4. Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der folgenden Stämme
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