DE1810277B2 - Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung einer FibrinolysokinaseInfo
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- Y10S435/886—Streptomyces
Description
Streptomyces spec. CBS 670.68
Streptomyces spec. CBS 671.68
Streptomyces spec. CBS 669.68
Streptomyces califonicus ATCC 3312 und 4(l
Streptomyces griseus ATCC 10 137
kultiviert und daß man die Fibrinolsokinase aus der erhaltenen Kultur nach an sich bekannten Methoden
gewinnt. 4r>
Es ist bekannt, daß aus menschlichem Urin eine w Fibrinolysokinase, Urokinase, gewonnen werden kann.
Dieses Gewinnungsverfahren ist jedoch wegen der Verwendung des besonderen Ausgangsmaterials aufwendig.
Außerdem ist der Gehalt an Kinasen so gering, daß mehrere 100 Liter Urin für eine therapeutische
Dosis aufgearbeitet werden müssen (Astrup und S t e r η d ο r f f, Nature, 170,981 [ 1952]).
Es ist weiterhin bekannt, daß aus hämolytischen Streptokokken eine Fibrinolysokinase gewonnen werden
kann, die als Streptokinase bezeichnet wird. Die mi Nachteile dieser Substanz für die medizinische Anwendung
liegen vor allem in ihrer hohen antigenen Wirkung und in der notwendigen aufwendigen Reinigungsoperalion,
welche den Preis außerordentlich erhöhen (Markus und Am br us, J. Biol. Chem. 235, 1673 br>
[I960]).
Weiterhin sind Fibrinolysokinasen bekannt aus Bacillus subtilis (S h i m i und K e I a d a , Arch. Mikiobiol.
50, Nr. 4, 326 [1965]) und Pasteurella pestis [Beesley et al., J. Bacleriol. 1, 19 [1967]). Auch bei
diesen ist eine praktische Anwendung aus bekannten Gründen nicht möglich.
Es is', nach Mikrobiologiya 1968, 37 (4), Seiten 719—735 bekannt, daß durch Züchten eines Stammes
der Actinomycetalen fibrinolytische und caseinolytische Enzyme gebildet werden.
Ferner ist nach Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1968, 4 (5)
549—53 bekannt, daß Saprophyt- und pathogene Mycobakterien gegebenenfalls fibrinolytische Substanzen
bilden können.
In beiden letztgenannten Veröffentlichungen werden fibrinolytische Aktivitäten mit Hilfe der Fibrinplaltcnmethode
gemessen, wie sie von S. Müllertz (Acta physiol. Scand. 25 [1952], 93—100) beschrieben wurde.
Daraus geht hervor, daß man hierbei nicht unterscheiden kann, ob die in Frage stehenden Enzyme Fibrin
direkt proteolytisch abbauen, oder ob sie Plasminogenaktivatoren sind, die infolge einer Umwandlung des
Plasminogen zu Plasmin die Fibrinolyse hervorrufen. Die sowjetischen Autoren können zwar zeigen, daß das
fibrinolytische Enzym z. B. nicht identisch mit einem Kasein abbauenden Enzym ist. Jedoch ist z. B. bekannt,
daß gewisse Aspergillus-Arten protcolytische Enzyme
produzierend, die Fibringerinnsel bei solchen Konzentrationen abbauen, bei denen nur geringe Wirkungen
auf Substrate wie Kasein zu beobachten sind (vgl. z. H. Freed man, N. J., Roschlau, W. H. E.; Can. |.
Physiol. Pharmakol. 48 [1970], 69-76). Im Gegensatz dazu kann gezeigt werden, daß die Wirkung der
erfindungsgemäß erhältlichen Fibrinolysokinase im wesentlichen darauf beruht, daß nicht das Fibrin direkt
angegriffen wird, sondern daß der Abbau über die Plasminogenaktivierung erfolgt, indem parallel erhitzte
und unerhitzte Fibrinplatten zum Nachweise der fibrinolytischen Wirkung benutzt werden. Somii wirkt
das anmeldiingsgemäße Enzym ähnlich wie Urokinase oder Streptokinase. Die Wirkungsweise ist erwünscht
und kommt dem physiologischen Geschehen sehr viel näher als die direkte Proteolyse des Fibrins.
Durch das im folgenden beschriebene erfindungsgemäße Verfahren kann man erstmalig zu einem
Verfahren gelangen, welches ermöglicht eine Plasminogen aktivierende Fibrinolysokinase im großtechnischen
Maßstabe herzustellen.
Aktinomycetalesstämme, die Fibrinolysokinase produzieren,
kann man leicht nach der in den Ansprüchen I bis 3 definierten erfindungsgemäßen Methode finden.
Sie kommen unter den Stämmen der Ordnung Aktinomycetales in großer Zahl vor.
Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Ordnung Aktinomycetales, insbesondere
solche der Familie der Streptomycetaceae, darunter ihrer leichten Kultivierbarkeit wegen besonders Stämme
der Gattung Streptomyces. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösung, die
das Wachstum dieser Stämme erlauben. Man kann z. B. die Glycerin-Glykokoll-Nährlösung nach von Plotho
mit der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Glykokoll, 0,1 % NaCI,
0,1% K2HPO4,0,01% FeSO4 ■ 7 H2O,
0,01% MgSO4-7 H2Ound0,01% CaCOi
0,1% K2HPO4,0,01% FeSO4 ■ 7 H2O,
0,01% MgSO4-7 H2Ound0,01% CaCOi
verwenden. Des schnelleren Anwachsens wegen gibt man zweckmäßigerweise in eine solche Nährlösung
noch komplexe Kohlenstoffquellen, wie /.. B. Maisquell-
wasser (bevorzugt in Konzentrationen von 0,25%) oder
Sojamehl (bevorzugt ebenfalls in Konzentrationen von 0,25%) oder beide zusammen. In diesen Fällen muß der
pH-Wert der Lösung eingestellt werden. Man bevorzugt ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und
8,0, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5.
Das Glycerin der Nährlösung kann man auch durch andere Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glucose oder
Rohrzucker, ersetzen. An Stelle des Glykokolls kann man auch andere Stickstoffquellen, wie z. B. Alanin,
Äthylamin oder Lysin, verwenden. Die Konzentralionen der Kohlenstoff-, und Sticksloffquellen, wie auch die
Konzentrationen der Salze können in weiten Grenzen schwanken. FeSO4, CaCOj und MgSO4 können auch
ganz, fehlen.
Von der Nährlösung füllt man z.B. 100 ml in I-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter
Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15 bis 35°C, vorzugsweise bei
23 bis JO"C, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach I bis 10 Tagen,
meist nach 3 bis 5 Tagen geschieht, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml, trennt in dieser Probe das
Myccl durch Filtration oder Zenirifugation ab und stellt
die Lösung mit ca. 'Au HCI auf pH 0 bis 4 ein. Danach
wird 15 Minuten auf 65°C erhitzt, sofort abgekühlt und
der pH-Wert mit ca. 1Au NaOH auf 5 bis 10 eingestellt.
Die Fibrinolysokinase-Aklivität wird in üblicher Weise auf der Müllertz-Astrup-Plattc bestimmt. Etwa restlich
verbliebene proteolytische Aktivität wird in bekannter Weise ebenfalls auf der erhitzten Müllcrtz-Astrup-Plai-Ie
bestimmt.
Nach der oben beschriebenen Methode prüften wir eine ganze Reihe von Stämmen der verschiedensten
Gattungen der Ordnung Aetinomycetales und landen in verschiedenen Gattungen, wenn auch zum Teil schwache,
so doch deutliche Lysokinase-Aktivitätcn. Am günstigsten hinsichtlich der Ausbeute und der Kultivicrbarkeit
waren die Stämme der Familie der Streptomycetaceae, besonders die der Gattung Streptomyccs. Von
32 geprüften Streptomyceten zeigten auf den nicht erhitzten Fibrinplatten bei 16 Streptomyceten die
Kulturlösungen auch dann Abbauzonen, wenn der pH-Wert der Kulturlösung auf 1,5 bis 1,8 eingestellt war.
Von diesen 16 Stämmen zeigten 6 auf der erhitzten Platte, d. h. mit denaturiertem Plasminogen, keine
Abbauzonen, enthalten also nach der vorangegangenen Behandlung keine Proteasen. Die Wirkung muß also in
diesen Fällen einer Lysokinase zugeschrieben werden.
Diese 6 Stämme (Bezeichnung: St 4, St 7, St 16, St 18,
St 21 und St 24/Beschreibung der Stämme s. Tabelle I), die alle auf Grund ihrer Sporophor-Struktur zur
Gattung Streptomyces gehören, zeigen die in Tabelle I aufgeführten wichtigen systematischen Charakteristika
(Hütter, R., »Systematik der Streptomyceten«,
Bibliotheca Microbiologica, Fase. 6, S. K a r g e r, Basel,
New York, 1967).
Die Stämme St 16, St 18 und St 24 wurden im Centraalbureau voor Schimmelcultures hinterlegt unter
den Nummern CBS 670.68,671.68 und 669.68.
Zur Gewinnung von Fibrinolysokinase werden diese Stämme wie oben beschrieben kultiviert. Nach 2 bis 3
Tagen Wachstum wird das Mycel abgetrennt und aus der Kulturbrühc in an sich üblicher Weise durch
Einengen der Lösung und Fällen mit organischen Lösungsmitteln die Lysokinase angereichert.
Die gefundene Fibrinolysokiiiase soll als Arzneimittel
für die bekannten Indikationen Verwendung finden.
Über die Anwendung und Dosierung liegt Literatur vor (I-1 e t s c h e r et al, J. Lab. und Clin. Med.65, 713[1965]).
B e i s ρ i e I 1
Man beimpft mit 1 ml einer .Sporensuspension, die
man durch Abspülen eines 10 Tage allen Schrägröhrchens des Stammes St 16 mit Glycerin-Glykokoll-Agar
nach von Plotho mit 12 ml Wasser erhält, einen ι» 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 100 ml einer Nährlösung
der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Glykokoll,
0,4% Maisquellwasser, 0,4% Sojamehl,
i> 0,1% NaCI, 0,1% K^HPO4,
0,4% Maisquellwasser, 0,4% Sojamehl,
i> 0,1% NaCI, 0,1% K^HPO4,
0,01% MgSO4 · 7H?O,
0,01% FeSO4 · 7 H >O und 0,01% CaCO1
0,01% FeSO4 · 7 H >O und 0,01% CaCO1
(Sterilisation 60 Minuten bei 12TC) enthält. Die Kultur
in bebrütet man auf einer Schüttelmaschine bei 24°C.
Nach dreitägiger Bebrütung erhält man eine Kulturlösung, die 1,9 CTA-Einheiten/ml enthält. Das nahezu
klare Zentrifugat wird auf z. B. pH 1,5 eingestellt und 15
Minuten bei 65°C gehalten. Nach sofortiger Abkühlung
Ji wird auf pH 7,5 eingestellt und erneut zentrifugiert. Das
Sediment wird verworfen. Der Überstand wird in das 4fache Volumen -200C kaltem Aceton gegeben. Es
wird 5 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung bei + 4°C über 3 Stunden ruhig gehalten. Der Überstand
in wird schließlich abdekantiert und verworfen.
Das Sediment wird erneut in kaltein trockenem Aceton aufgenommen und darin gründlich dispergiert.
Anschließend wird zentrifugiert und das entstandene Sediment im Vakuum getrocknet. Ausbeute ca. 50 bis
ii 80%. Anreicherung ca. lOfach.
Der Stamm St 16 zeigt die in Tabellen I, 2 und J aufgeführten Artcharakteristika und dürfte Streptomyccs
chrysomallus Lindenbein zuzuordnen sein (l.ind c η b e i η , W., Arch. Mikrobiol. 17,361 [1952]).
Beimpft man eine Nährlösung nach Beispiel 1 mit I ml
■Γι einer Sporensuspension, die man durch Abspülen eines
10 Tage alten Schrägröhrchens des Stammes St 24 mit 12 ml Wasser gewinnt und bebrütet nach Beispiel 1, so
erhält man nach 2tägiger Kultur eine Kulturlösung, die 0,51 CTA-Einheiten/ml enthält.
"in Das nahezu klare Zentrifuge?! wird auf z. B. pH 1,5
eingestellt und 15 Minuten bei 65"C gehalten. Nach sofortiger Abkühlung wird auf pH 7,5 eingestellt und
erneut zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen.
Der Überstand wird in das 4fache Volumen —20"C
,·> kaltem Aceton gegeben. Es wird 5 Minuten gerührt.
Dann wird die Mischung bei +40C über 3 Stunden ruhig gehalten. Der Überstand schließlich abdekantiert und
verworfen.
Das Sediment wird erneut in kaltem trockenem
bii Aceton aufgenommen und darin gründlich dispergiert.
Anschließend wird zentrifugiert und das entstandene Sediment im Vakuum getrocknet. Ausbeute ca. 50 bis
80%. Anreicherung ca. lOfach.
Der Stamm St 24 zeigt die in Tabellen 1, 2 und 3
b"i aufgeführten Artcharakteristika und dürfte Streptomyces
griseus Waksman et Hcnricci zuzuordnen sein (W a k s m a η , S. Α., »The Actinomycetes« Vol. II, The
Williams und WilkinsComp., Baltimore [1961]).
B c i s ρ i e I 3
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung, die
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung, die
3% Glycerin, 0.4% Glykokoll.
0,25% Maisqucllwasscr. 0,4% Sojamehl,
0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01 "/ti MgSCl1 ■ 7 H20,0,01%,
FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCOj
0,25% Maisqucllwasscr. 0,4% Sojamehl,
0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01 "/ti MgSCl1 ■ 7 H20,0,01%,
FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCOj
(Sterilisation 60 Minuten bei 121°C) enthält, nach Beispiel 1 mit dem Stamm St 24, so erhält man nach
3tägiger Kultur eine Nährlösung, die 10,2 CTA-Einhciten/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 3 mit 1 ml einer Sporensuspension, die man durch
Abspülen eines 10 Tage alten Schrägröhrchcns des Stammes St 18 mit Glycerin-Glykokoü-Agar nach von
Plotho, so erhält man nach 4tägiger Kultur auf einer Schütteimaschine bei 24°C eine Kulturbrühe, die 5,3
CTA-Einheiten/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel I und 2 angegeben.
Der Stamm St 18 zeigt die in Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführten Art-charakteristika und dürfte Streptomyces
chrysomallus Lindenbein zuzuordnen sein (Li η d e η b e i η , W., Arch. Mikrobiol. I 7.361 [1952]).
0,4% nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18, so erhiill
man nach 4iiigiger Kultur bei 24°C folgende Ausbeulen:
Zusatz (0,4%]
CTA-I:inheiien/ml
Alanin
1.-Tyrosin
I.-Lysin
Glykokoll
1.-Tyrosin
I.-Lysin
Glykokoll
6.2
0,31
0,39
4.S
0,31
0,39
4.S
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung der Zusam- i">
mensetzung
2% Glukose, 0,4% Glykokoll,
0.25% Maisquellwasser, 0,25% Sojamehl,
0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01% MgSO4 ■ 7H2O, ■"'
0,01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCO1
(Sterilisation 60 Minuten bei 12PC), mit einer Sporensuspension nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18
und bebrütet 4 Tage bei 24°C, so erhält man eine ·»>
Kulturlösung.die 4,2 CTA-Einheiten/ml enthält.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beimpft man Nährlösungen, die neben 2% Glycerin, 0,4% Glykokoll, 0,4% Sojamehl, 0,25% Maisquellwasser,
die in Tabelle 4 aufgeführten Salzkotiientrationen enthalten nach Beispiel 4 mit dem Stamm St 18, so erhält
man die in Tabelle 4 aufgeführten Ausbeuten.
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beispiel 7
Beimpft man Nährlösungen der Zusammensetzung
Beimpft man Nährlösungen der Zusammensetzung
2% Glycerin, 0,25% Maisquellwasser,
0,25% Sojamehl, 0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01% MgSO4 ■ 7 H2O,
0,01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCOj
0,25% Sojamehl, 0,1% NaCI,0,1% K2HPO4,
0,01% MgSO4 ■ 7 H2O,
0,01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCOj
(Sterilisation 60 Minuten bei 12PC) mit Zusätzen verschiedener Aminosäuren in Konzentrationen von
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 angegeben.
Beimpft man einen 60 Liter einer Nährlösung -" enthaltenden Fermenter mit der Nährlösung
2% Glycerin,0,4% Glykokoll.
0,25% Maisquellwasser, 0,4% Sojamehl,
0,1% NaCl,0,l%K2HPO4,
0,01% MgSO4 · 7 H2O,
0,01% FeSO4 · 7 H2O und 0,01% CaCO j
(Sterilisation 60 Minuten bei 121"C) mit 15 gut bewachsenen Erlenmeyerkolbcn mit 100 ml Nährlösung
in derselben Zusammensetzung, beimpft mit Stamm St 18
und bebrütet unter Rührung und Belüftung bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung mit folgenden CTA-Einheiten/ml:
Kulturdaucr | CTA-Einhcitcn/ml |
(Stunden) | |
36 | 1,9 |
44 | 3,2 |
52 | 3,8 |
60 | 7,0 |
68 | 7,8 |
76 | 8,4 |
Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel I und 2 angegeben.
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 8 mit einer Sporensuspension des Stammes Streptomyces
californicus ATCC 3312 und bebrütet 90 Stunden auf einer Schüttelmaschine bei 23°C, so erhält man eine
Kulturlösung mit 1,4 CTA-Einheiten/ml.
Beispiel 10
Beimpft man 100 ml einer Nährlösung nach Beispiel 8 mit einer Sporensuspension des Stammes Streplomyees
griseus ATCC 10 137 und bebrütet 65 Stunden auf einer Schütteimaschine bei 23" C, so erhält man eine
Kulturlösung mit 5,2 CTA-Einhcitcn/ml.
Beschreibung der Stämme
Stamm
Slrcptomyces chryso- St mallus Lindenbein
Typenstamm
Morphologie
des Luflmyccls
des Luflmyccls
Morphologie
der Sporen
der Sporen
I-'arbe des Luftmyccls
Chromogeniläi (s. Tabelle 2
Glukose-, Nähr-, Tyrosin-Agar,
Gclatine-Stichkultur
Glukose-, Nähr-, Tyrosin-Agar,
Gclatine-Stichkultur
St
Sympodial verzweigte Büschel mit geraden oder gewellten Sporophoren, keine
Spiralen
glatt glatt
stark verzweigte Sporophore, Enden stark spiralisiert,
meist 8—10 Windungen
Nur in jungem Zu- in reifem stand oder bei spar- Zustand licher Entwicklung mausgrau
weiß, bei üppiger Entwicklung creme mit Beimischungen von grün u. grau
kein braunes Pigment
meist glatt z.Teil mit Warzen
mausgrau
St Ib
St 18
Sl 21
Sympodial verzweigte Büschel mit geraden oder gewellten Sporophoren; keine Spiralen
glatt
glatt
glatt
Nur in jungem Zustand creme oder bei spärlicher Ent- z. Teil grau wicklung weiß, bei
üppiger Entwicklung
creme mit Beimischungen von grün u. grau
üppiger Entwicklung
creme mit Beimischungen von grün u. grau
kein | bildet | kein | braunes | Pigment | kein braunes |
braunes | braunes | Pirgment | |||
Pigment | Pigment |
Verhalten der Stämme auf den wichtigsten diagnostischen Nährböden
Nährboden | W: | ) | LM: | Streptomyces chrysomallus | St 16 | Sl 18 | Sl 24 |
Lindenbein Typenstamm | |||||||
Synth.-Agar1) | LM: | LP: | kräftig, krustig, gelb | kräftig, krustig, | krustig, farblos | mäßig, dünn, | |
gelb | krustig, farblos | ||||||
W: | staubig, dünn, weiß | kräftig mehlig, | staubig, später | fehlt | |||
LP: | weiß bis creme | schwach mehlig, | |||||
W: | LM: | weiß bis creme | |||||
blaßgelb | gelb | fehlt | fehlt | ||||
Glycerin-Glykokoll- | LP: | kräftig, krustig bis runzlig, | kräftig, krustig. | krustig, oliv bis | krustig, gelb bis | ||
Agar nach von Plotho·4 | W: | gelb bis gelborangc | gelborangc | braunoliv | gelbbraun | ||
28" | W: | angedeutet staubig, weiß | mehlig, weiß bis | staubig, creme, | mehlig, weiß bis | ||
creme | stellenweise grau | creme | |||||
LM: | goldgelb | goldgelb | blaßgelb | angedeutet gelb | |||
lichbraun | |||||||
37" | LP: | 0 | 0 | 0 | schwach krustig, | ||
farblos | |||||||
W: | teilweise mehlig | ||||||
weiß bis creme | |||||||
LM: | fehlt | ||||||
50" | LP: | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
Glucose-Asparagin- | gut, krustig bis pustelig, | krustig, gelb | krustig, blaßgelb- | krustig, blaßgclb | |||
A gar') | farblos bis blaßgelblich | lich | |||||
angedeutet staubig, weiß | staubig, weil.l | mehlig, weißlich | mehlig bis | ||||
bis creme | staubig, weiß | ||||||
blaßgelb | gelb | blaßgelb | schwach gelb | ||||
lich | |||||||
C'a-Malal-Agai·1) | mäßig, feinkrustig, farblos | mäßig, krustig, | mäßig, krustig, | schwach krustig. | |||
hlaUgclb | farblos | farblos | |||||
angedeutet, weiß | fehlt | fehlt | fehlt | ||||
0 | urtiiilifhcclb | fehlt | fehlt | ||||
9 | 18 10277 | Si Ib | bis gelborange | 10 | Sl 18 | Sl 24 | |
teilweise staubig. | |||||||
Fortsel/imti | krustig, gelblich | weiß bis creme | krustig, gelb | sehr dünn. | |||
NiihrboJen | Strcplomyces chrysomnlkis | krustig, farblos | |||||
W: | l.indenbcin Typenstamm | staubig, stellen | gelb | staubig bis mehlig, | angedeutet, | ||
Stärkeplatte1) | kräftig, krustig, gelb | weise mehlig, weiß | weiß bis creme | weißlich | |||
LM: | bis creme | Ring, farblos | |||||
angedeutet staubig, weiß | blaßgelb | fehlt | fehlt | fehlt | |||
Stärkeabbau: | Fällung, keine | Stärkeabbau: | Stärkeabbau: | ||||
LP: | mäßig | Peptonisierung | schwach | schwach | |||
fehlt | 0 | sehr kräftig, runz | 0 | 0 | |||
Stärkeabbau: müßig | mäßig, krustig, | lig, schleimig, | mäßig krustig, | schwach krustig, | |||
W: | farblos | braunoliv | !arblos | farblos | |||
Cellulosebriihe1) | W: | 0 | fehlt | fehlt | fehlt | fehlt | |
Glucose-Agar1) | kräftig, krustig bis runzlig, | fehlt | fehlt | fehlt | fehlt | ||
LM: | blaßgelb | schleimig, gelb | langsame Ver | krustig, gelblich | krustig, farblos | ||
LP: | stellenweise staubig, weiß | fehlt | flüssigung | staubig, weiß bis | angedeutet weiß | ||
W: | gelblich | wenig Kolonien, | creme | ||||
Nähragar1) | LM: | gut, krustig, gelblich | gelb | kräftig, runzlig, | gelb | fehlt | |
0 | krustig, farblos | oliv | krustig, bräunlich | schwach krustig. | |||
LP: | angedeutet | stellenweise | staubig, weiß bis | 13PDlOS stellenweise |
|||
W: | gelb | staubig, weiß | creme | grünlichgelb | |||
Tyrosin-Agar2) | LM: | krustig | gelblich | fehlt | schwachbräunlich | fehlt | |
angedeutet | kräftig, krustig, | kräftig, krustig bis | sehr kräftig. | ||||
LP: | runzlig, orange bis | runzlig, gelbgrün. | krustig, gelb | ||||
W: | schwachgelblich | oliv | später bräunlich | braun | |||
Kartoffelagar1) | sehr kräftig, runzlig, gold | teilweise vorhan | stellenweise | stark mehlig. | |||
gelb bis orangegclb später | den, dünnstaubig, | staubig, weiß bis | grünlich, creme | ||||
LM: | bräunlich | weiß | grünlichgelb | oder grau | |||
0 | gelboliv | grünlichbraun | grüngelb bis | ||||
gelbbraun | |||||||
LP: | mäßig bis gut, krustig, gelb dünnkrustig, gelb | krustig, farblos | krustig, bräun | ||||
gelblich, später gelbbraun | lich | ||||||
W: | fehlt | mehlig, weiß bis | stellenweise | ||||
Haferflockenagiir1) | gelbgrün | mehlig. | |||||
LM: | weiß bis grünlich | ||||||
gelb | fehlt | blaßgelb bis | |||||
hellbraun | |||||||
LP: | Ring, farblos | Ring | Ring | ||||
fehlt | fehlt | fehlt | |||||
W: | schwache Fällung, keine | Fällung, keine | Fällung, keine | ||||
Lackmusmilch | LM: | Peptonisierung | Peptonisierung | Peptonisierung | |||
sehr kräftig, runzlig, | sehr kräftig, runz | sehr kräftig, | |||||
schleimig, gelbbraun | lig, schleimig, | runzlig, schlei | |||||
W: | braunoliv | mig, oliv | |||||
Löfflers Serumnähr- | fehlt | fehlt | fehlt | ||||
boden | fehlt | fehlt | blaßgelb | ||||
LM: | langsame Verflüssigung | langsame Vei - | langsame Ver | ||||
LP: | flüssigling | flüssigung | |||||
kräftig, krustig, bis runz | ein/. Kolonien, | eine Kolonie, | |||||
lig, gelb bis rötlich | runzlig, braunoliv | krustig, bis | |||||
W: | runzlig, oliv | ||||||
Karottenkeile | angedeutet staubig, weiß | teilweise mehlig, | fehlt | ||||
gelblich | |||||||
LM: | fehlt | fehlt | fehlt | ||||
LP: | |||||||
12
t-'ortsct/imii
Nährboden
Nährboden
Sireptomyces chrysomallus St Ib
Linden bei π Typeiislamm
Kartol'felkcilc
W: sehr kräftig, runzlig, gold- sehr kräftig, runz
gelb
LM: fehlt
LM: fehlt
LP: fehlt
lig orange bis ziegelrot
staubfein, weiß oder gelblich fehlt
Gelatine-Stichkultur1) W: kräftig, krustig, gelbbraun krustig, gelb
LM: fohlt staubig, weiß
Pepton-Iron-Agar
(Difco)
(Difco)
LP: fehlt
Verflüssigung stark
W: kräftig, krustig
LM: 0
LP: bräunlich
fehlt
starke Verflüssigung
kräftig, krustig
gelbbraun St 1«
kräftig, runzlig, braun
einz. Stellen, dünn weiß fehlt
krustig, gelb staubig, weiß
fehlt
starke Verflüssigung
kräftig, krustig
gelblichbraun
Si
sehr kräftig, runzlig
mehlig, weiß fehlt
runzlig, bräunlich
mehlig bis staubig, creme fehlt
starke Verflüssigung
kräftig, krustig
gelblichbraun
W: Wachstum.
LM: Luftmycel.
LP: Lösliches Pigment.
LM: Luftmycel.
LP: Lösliches Pigment.
1J nach Lindenbein, W.
Glucose Agar: statt KH.'POi K2HPO4
Ca-Malat-Agar: ohne Glycerin.
-') nach H ü 11 e r, R.
') nach W a k s m a η , S. A.
-') nach H ü 11 e r, R.
') nach W a k s m a η , S. A.
Kartoffel-Agar: Potato-glucose-Agar ohne CaCOi und MgSOi.
A) nach von P I υ t h ο s. W a k s m a η . S. A.
Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen
Kohlenstoffquelle | Streplomyces chryso | St 16 | St 18 | St 24 | 4- -Ι |
mallus Lindenbein | Ο | ||||
Typenstamm | |||||
d-Xylose | 4- 4- | 4- 4- | 4-4-4- | 4- 4- -Ι | |
1-Arabinose | 4-4-4- | 4-4-4- | 4-4-4- | Ο | |
Rhamnose | 4-4-4- | 4-4-4- | 4-4-4- | O | |
d-Galaktose | 4- 4- + | 4-4-4- | 4-4-4- | 4- 4- | |
Saccharose | O | + | Q | o | |
Maltose | 4-4-4- | 4-4-4- | 4-4-4- | 4- 4- | |
Maltose/a | 4-4-4- | 4-4-4- | 4-4-4- | 4- h NaNOj statt | |
Lactose | 4- 4- | einz. KoI. 4-4-4- | ein?.. KoI. 4- 4- -Ι | ein/.. KoI. 4-4-4- | |
Raffinose | O | O | Ο | O | |
Inulin | O | O | O | O | |
d-Mannit | 4-4-4- | 4- 4- -Ι | 4-4-4- | 4-4-4- | |
ei- Sorbit | ± | Ο | + | ||
Dulcit | + | + | O | O | |
Inosit | ± | + | + | 0 | |
Na-Acetat | ± | 4- 4- | ± | ||
Na-Citrat | + | 4- 4- | 4. | 4- | |
Na-Succinat | + | 4- | 4- | ||
d-Gliieose | 4-4-4- | 4-4-4- | + 4-4- | 4-4-4- | |
d-Glucose/a | I KoI. | 4-4-4- | 4-4-4- | + NaNOi statt | |
(NHt).\SO.t | |||||
l'rtictose | 4- 4- | 4- 4- -Ι | 4- 4- -Ι | ||
CJrundnährbodeii | O | Ο | Ο |
Nährboden nach WaU in a ι\ . S. A.
l ) ^ sehr krilfliges Wachstum,
ι 4- kriiflikios Wachstum.
l ) ^ sehr krilfliges Wachstum,
ι 4- kriiflikios Wachstum.
ι mäUiges Wachsiuin.
± Wachstum /weifelhail. O kein Wachstum.
Konzcntriilion | in der Nährlösung in 0Zi | MgSO4 · 7 H2O | Cn CO ι | I-C.SO4 ■ 7 IbO | CTA-l-inhciicn/ml |
NaCI | K 2 H POt | nach 4tägiger Kultur | |||
0,01 | 0,01 | 0,01 | 2,5 | ||
0.2 | 0,1 | 0,01 | 0,01 | 0,01 | 2,3 |
0.1 | 0,2 | 0 | 0,01 | 0,01 | 2,55 |
0,1 | 0. | 0,02 | 0,01 | 0,01 | 2,7 |
0,1 | 0, | 0,01 | 0 | 0,01 | 1,6 |
0,1 | 0, | 0,01 | 0,02 | 0,01 | 3.7 |
0.1 | 0, | 0,01 | 0,01 | 0 | 2,8 |
0,1 | 0, | 0,01 | 0.01 | 0,02 | 1,95 |
0,1 | 0, | ||||
Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man ·-,
einen aus Erdproben isolierten und auf seine Bildungsfähigkeit von Fibrinolysekinase zu testenden
Stamm der Ordnung Aktinomycetales in eine in bekannter Weise sterilisierte Nährlösung impft, die
Nährlösung bei 15 bis 35° C in Kolben auf ι ο Schüttelmaschinen brütet, daß man in dem Fall, daß
die Kultur Wachstum zeigt, eine Probe entnimmt und von dieser Probe das Mycel durch Filtration
oder Zentrifugation abtrennt, daß man die Lösung mit ca. 'Λοη-HCI auf pH 0 bis 4 einstellt, sie danach π
15 Minuten auf 65°C erhitzt, sofort abkühlt und mit ca. 7io n-NaOH auf pH 5 bis 10 einstellt, daß man die
Fibrinolyseaktivität einerseits in üblicher Weise auf der Müllertz-Astrup-Platte sowie andererseits in
üblicher Weise auf der erhitzten Müllertz-Astrup- jo
Platte testet, daß man den Stamm in dem Falle, daß sich bei dem Test auf der Müllertz-Astrup-Platte
Abbauzonen und bei dem Test auf der erhitzten Müllertz-Astrup-Platte jedoch keine Abbauzonen
zeigen, kultiviert und daß man die Fibrinolsekinase 2r>
aus der erhaltenen Kultur nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Stamm der Streptomycetaceae
ausgeht. jo
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Stamm von Streptomyces
ausgeht.
4. Verfahren zur Gewinnung einer Fibrinolysokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der j->
folgenden Stämme
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