DE3806423A1

DE3806423A1 - Verfahren zur herstellung von pectin

Info

Publication number: DE3806423A1
Application number: DE3806423A
Authority: DE
Inventors: Takuo Sakai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-02-28
Filing date: 1988-02-29
Publication date: 1988-09-08
Anticipated expiration: 2008-03-01
Also published as: GB8804407D0; GB2201684A; FR2611367A1; FR2611367B1; JPS63213501A; DK93188D0; GB2201684B; US4835262A; DK93188A; DE3806423C2; JPH068322B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Pectin aus einer Pflanze, welche Pectin als einen Bestandteil enthält. Bei dem Verfahren wird ein zum Genus Bacillus gehörender Mikroorganismus verwendet. Pectin ist ein industriell nützliches Polysaccharid, welches als Rohmaterial für Nahrungsmittel, Arzneimittel oder für Kosmetika verwendet wird und welches in großen Mengen in höheren Pflanzen enthalten ist.

In der Vergangenheit erfolgte die Herstellung von Pectin durch Extraktion in der Wärme eines Pflanzengewebes, das Pectin als seinen Bestandteil enthielt, in Anwesenheit eines chelatbildenden Mittels, einer Säure oder einer ähnlichen Verbindung. Bei diesem Verfahren treten jedoch bei der Isolierung des Pectins Schwierigkeiten auf. Außerdem treten bei der Vorrichtung, die bei der Behandlung der Rückstände verwendet wird, verschiedene Probleme auf.

Zur Beseitigung der obigen Schwierigkeiten wurden Mikroorganismen entdeckt, die ein Enzym produzieren, das Pectin aus Pflanzengewebe freisetzt, die Pectin als Bestandteil enthalten. Es wurden weiterhin Verfahren zur Freisetzung von Pectin gefunden, gemäß denen man die oben erwähnten Pflanzengewebe dem Einfluß derartiger Mikroorganismen oder der Kulturbrühe bzw. des Züchtungsmediums oder vorbehandeltem Material von diesen unterwarf und das Pectin gewonnen hat (US-PS 46 86 187 und JP-OS 46 157/1980). Jedoch sind die Protopectinasen, nämlich die pectinfreisetzenden Enzyme, die von den Mikroorganismen, welche bei diesen Verfahren verwendet wird, gebildet werden, alle Enzyme, die nicht nur aus den Pflanzengeweben Pectin freisetzen, sondern die auch eine gewisse Zersetzung des einmal freigesetzten Pectins verursachen (vgl. A Japanese journal "Fermentation & Industries", Bd. 37/1979, S. 928 bis 938). Das heißt, sie besitzen alle die Wirkung, das freigesetzte Pectin zu zersetzen (Polygalacturonaseaktivität), wie auch die Wirkung, Pectin freizusetzen (Protopectinaseaktivität). Es tauchten somit die Probleme auf, daß parallel mit der Freisetzung des Pectins eine Zersetzung des freigesetzten Pectins stattfindet und daß so die Qualität des erhaltenen Pectins schlecht ist, bedingt durch die Zersetzung, wenn die Enzymreaktion vollständig durchgeführt wird, um die Ausbeute an Pectin zu erhöhen.

Die Anmelderin hat als Ergebnis von vielen Forschungsarbeiten, die zur Lösung der oben erwähnten Schwierigkeiten durchgeführt wurden, eine Gruppe von Mikroorganismen gefunden, die ein Enzym produzieren, welche auf eine Pflanze, die als einen Bestandteil Pectin enthalten, einwirken und das Pectin freisetzen, jedoch das freigesetzte Pectin nicht wesentlich zersetzen. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Pectin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Pflanzengewebe, welches Pectinsubstanzen als seine Bestandteile enthält, dem Einfluß eines Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört und Pectin aus Pflanzengewebe freisetzen kann, jedoch Pectin im wesentlichen nicht zersetzt, oder einer Kulturbrühe oder einem behandelten Material davon aussetzt, wobei Pectin aus dem Pflanzengewebe freigesetzt wird, und das Pectin gewinnt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Pectine mit hohem Molekulargewicht aus Pflanzengeweben, welche Pectin als ihren Bestandteil enthalten, auf einfache Weise und in guter Ausbeute freigesetzt werden.

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung erläutert.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, in der im Verlauf der Zeit die Menge an freigesetztem Pectin und die Pectinzersetzung dargestellt sind. Protopectin und Pectin werden mit einem Kulturüberstand, welcher Protopectinase enthält, gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung behandelt.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, wo im Verlauf der Zeit die Menge an freigesetztem Pectin und das Molekulargewicht des freigesetzten Pectins dargestellt sind. Protopectin wird der Einwirkung eines Kulturüberstands, welcher Protopectinase enthält, als ein Beispiel gemäß der vorliegenden Erfindung unterworfen.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen gehören zum Genus Bacillus. Beispiele davon sind die folgenden: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus macerans und Stämme, die diesen Stämmen ähnlich sind, und ihre Mutanten.

Der Ausdruck "Stämme, die diesen Stämmen ähnlich sind", wie er oben erwähnt wird, bedeutet solche, die eine Pectin-Freisetzungsaktivität, aber im wesentlichen keine Pectin-Zersetzungsaktivität besitzen und die bakteriologische Eigenschaften aufweisen, die ähnlich sind zu jenen dieser Stämme. Der Ausdruck "Mutanten davon" schließt irgendwelche Mutanten der spezifisch als Beispiele aufgeführten Stämme ein und der Stämme, die ähnlich dazu sind, welche künstlich durch chemische oder physikalische Maßnahmen induziert oder welche spontan induziert wurden. Künstliche Maßnahmen, welche zur Mutation verwendet werden können, sind dem Fachmann geläufig.

Mikroorganismen, die zum Genus Bacillus gehören, welche ein Enzym, das Pectin freisetzt, aber im wesentlichen Pectin nicht zersetzt, bilden, werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt, insofern sie ein solches Enzym bilden, selbst wenn es neue Stämme sind.

Bevorzugt werden bei der vorliegenden Erfindung die folgenden bekannten Mikroorganismen verwendet, die alle beim Institute for Fermentation, Osaka, hinterlegt worden sind (die Zahlen hinter IFO bedeuten die Hinterlegungsnummern):

1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117 und 14140.
2) Bacillus amyloliquefaciens IFO 14141,
3) Bacillus cereus IFO 3002 und 3132,
4) Bacillus circulans IFO 13632,
5) Bacillus coagulans IFO 12583,
6) Bacillus firmus IFO 3330,
7) Bacillus licheniformis IFO 14206,
8) Bacillus pumilus IFO 12087,
9) Bacillus macerans IFO 3490.

Von diesen Mikroorganismen sind Bacillus subtilis IFO 12113 und Bacillus subtilis IFO 13719 besonders bevorzugt.

Für die Isolierung von Pectin aus Pflanzengewebe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die obigen Mikroorganismen direkt zum Inokulieren des Pflanzengewebes verwendet werden, wobei das Pflanzengewebe bei statischen Bedingungen, Rühr- oder Schüttelbedingungen nach an sich bekannten Verfahren behandelt und gezüchtet wird. Man kann auch eine Kulturbrühe bzw. ein Züchtungsmedium (diese Ausdrücke werden synonym verwendet), welches durch Züchtung der obigen Mikroorganismen erhalten wird, oder weiterbehandeltes Material davon in Kontakt mit dem Pflanzengewebe bringen.

Medien, die zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet werden, das heißt für die Impfkultur bzw. für die Impfzüchtung, sind nicht besonders beschränkt, und man kann irgendein Medium verwenden, welches die verschiedenen Nährstoffe enthält, die normalerweise bei der bekannten Züchtung der Mikroorganismen des Genus Bacillus verwendet werden. Die üblichen Medien können geeigneterweise Pepton, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt und Glucose und, je nach Bedarf, anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Kaliumsalze etc., enthalten. Als Impfkulturmedium können auch bestimmte Arten von Pflanzengeweben ohne die Zugabe von irgendwelchen Nährstoffen, aber nach der Hitzesterilisierung verwendet werden. Die Schale oder die Segmentbedeckung von Zitrusfrüchten ist ein besonders bevorzugtes Medium.

Die Züchtungsbedingungen für die Mikroorganismen in den oben erwähnten Medien werden auf geeignete Weise ausgewählt, so daß die gebildete Menge des gewünschten Enzyms maximiert ist. Normale Bedingungen sind 20 bis 37°C während 10 bis 50 Stunden. Die Züchtung kann unter Schütteln, Stehen oder Rühren und Belüftung oder in festem Zustand bzw. im Haltezustand durchgeführt werden. Bei einer solchen Züchtung wächst Mycelium, und die Enzyme werden aus dem Mycelium heraus gebildet. Die Kulturbrühe kann als solche oder in Form von weiterbehandeltem Material, wie als Konzentrat oder als Lösung des gereinigten Enzyms, verwendet werden. Das Konzentrat kann erhalten werden, indem man die Kulturbrühe, die gegebenenfalls filtriert wird, einer Behandlung bei milden Bedingungen, beispielsweise Verdampfung bei niedriger Temperatur und niedrigem Druck und einer Konzentrierung mittels einer Ultrafiltrationsmembran, unterwirft. Das gereinigte Enzym kann aus der Brühe durch Filtration der Brühe, Konzentrierung des Filtrats und Durchführung wiederholter fraktionierter Präzipitationen durch Zugabe von Ammoniumsulfat oder durch Filtration der Brühe und Säulenchromatographie des Filtrats an CM-Sephadex und Sephadex-G-75-Gelfiltration erhalten werden.

Man nimmt an, daß der Mechanismus, der bei der vorliegenden Erfindung wirkt, der ist, in welchem ein Enzym, welches aus den oben erwähnten Mikroorganismen gebildet wird, in das Pflanzengewebe eindringt, auf die Pectinsubstanzen, insbesondere des wasserunlöslichen Protopectins, unter Bildung eines wasserlöslichen Pectins einwirkt und das wasserlösliche Pectin aus dem Pflanzengewebe freisetzt.

Das aus den Pflanzengeweben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren freigesetzte Pectin kann nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden. Beispielsweise kann die Lösung, die, wie oben erwähnt wurde, behandelt wurde, zur Entfernung von Verunreinigungen bzw. festen Stoffen filtriert werden, und das Filtrat kann man dem 3fachen seines Volumens mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol, zur Ausfällung des Pectins vermischt werden. Das Pectin wird gesammelt bzw. isoliert, mit einem Lösungsmittel, das ähnlich wie die obigen organischen Lösungsmittel ist, beispielsweise Ethanol, gewaschen und getrocknet, wobei man Pectin hoher Reinheit erhält. Das so erhaltene Pectin besitzt ein Molekulargewicht von mehr als ca. 110 000, unabhängig von der Art des für seine Isolierung verwendeten Mikroorganismus, und es unterscheidet sich von dem, welches nach den konventionellen chemischen Methoden erhalten wird, da es eine niedrigere Molekulargewichtsverteilung besitzt und dem Naturpectin sehr ähnelt. Das Pectin ist für die Verwendung als Nahrungsmittel oder Arzneimittel geeignet, da es nicht mit chemischen Substanzen verunreinigt ist. Die Eigenschaften der erhaltenen Pectine variieren mehr oder weniger, abhängig von der Art der verwendeten Rohmaterialien.

Obgleich die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pectin hoher Reinheit auf einfache Weise und in hoher Ausbeute aus Pflanzengeweben unter Verwendung von Mikroorganismen des Genus Bacillus, wie oben beschrieben, betrifft, kann das charakteristische erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls zur Entfernung von Pectin aus Pflanzengeweben oder für die Herstellung eines Extraktes aus einer Pflanze, welche Pectin enthält, verwendet werden.

Die bei der erfindungsgemäßen Behandlung verwendeten Pflanzengewebe sind bevorzugt solche, die mit niedrigem Preis verfügbar sind und einen Pectingehalt, der so hoch wie möglich ist, besitzen, obgleich dies keine besondere Beschränkung sein soll. Beispiele sind Zitrusfrüchte, wie Zitrus unshiu, Zitrus natsu-daidai, Zitrone, Grapefruit, Navel-Orangen, Orangen oder ähnliche. Als Rohmaterial können irgendwelche Schalen und Segmentbedeckungen dieser Zitrusfrüchte verwendet werden. Es ist nämlich möglich, den Rückstand zu verwenden, der beim Auspressen der Zitrusfrüchte unter Herstellung von Fruchtsaft verbleibt. Ein derartiger Rückstand ist billig, und selbstverständlich bedeutet seine Verwendung die Ausnutzung eines Abfallproduktes. Außer den oben erwähnten können ebenfalls die Schalen von früchtetragenden Gemüsesorten, wie Beetepulpe, Wassermelone, Melonen etc., und die Stämme bzw. Stengel von Gemüsen, wie Karotten, Burdock, d. h. eine Pflanze des Genus Arctium, insbesondere A. lappa, Rettich etc., bevorzugt als Rohmaterial verwendet werden.

Erfindungsgemäß kann das Enzym, welches in dem Mikroorganismus enthalten ist, auf das Pflanzengewebe, das Pectin als seinen Bestandteil enthält, in der Kulturbrühe eines solchen Mikroorganismus oder in einem weiterbehandelten Material einer solchen Kulturbrühe einwirken, und es zersetzt Pectin nicht wesentlich und unterscheidet sich von den bekannten pectinfreisetzenden Enzymen, welche Pectin selbst zersetzen. Somit ist es möglich, daß das Enzym auf das Pflanzengewebe vollständig einwirkt, Pectin vollständig freisetzt und daß Pectine mit hohem Molekulargewicht in hoher Ausbeute erhalten werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In einem Medium (pH 6,5), welches lösliche Stärke (0,5%) entfettetes Sojabohnenpulver (5%), (NH₄)₂PO₄ (1%), CaCl₂ · 2H₂O (0,01%) und Hefeextrakt (0,01%) enthält, wird jeder der in Tabelle 1 angegebenen Stämme unter Schütteln bei 37°C während 40 Stunden gezüchtet. Der Überstand, den man durch Entfernung des Myceliums erhält, kann als Enzymquelle mit einem Protopectin, welches aus der Schale und Segmentbedeckung der Zitrone (entsprechend dem Verfahren in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667) hergestellt worden ist, als Substrat bei 37°C unter Pectinfreisetzung einwirken, und dann wird die Protopectinaseaktivität bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Protopectinaseaktivität wurde gemäß dem in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667, beschriebenen Verfahren bestimmt, und die Aktivität, welche Pectin entsprechend 1 µMol Galacturonsäure pro ml in einer vorgegebenen Reaktionszeit freisetzt, wurde als 1 Einheit Protopectinase bestimmt.

Aus den Ergebnissen der Tabelle 1 ist offensichtlich, daß Mikroorganismen eines weiten Bereichs, die zum Genus Bacillus gehören, eine Pectin-Freisetzungsaktivität aufweisen.

Tabelle 1

Protopectinaseaktivitäten verschiedener zum Genus Bacillus gehörender Mikroorganismen

Als nächstes ließ man den oben erwähnten Überstand auf Protopectin und Pectin einwirken, und der Zeitverlauf wurde untersucht.

(i) Protopectin

Eine Acetat-Pufferlösung (pH 5,0), welche den Kulturüberstand mit Protopectinaseaktivität von 15 Einheiten enthält, wurde mit 1 ml wäßriger Lösung, welche 20 mg des oben erwähnten Protopectins enthält, bei 37°C umgesetzt, und die Menge an Pectin, die im Verlauf der Zeit freigesetzt wurde, wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

(ii) Pectin

Eine Acetat-Pufferlösung (pH 5,0), welche den gleichen Überstand, wie oben bei (i) erwähnt, enthält, wurde mit einer 0,5%igen wäßrigen Lösung von Pectin, hergestellt aus Zitrone (ein Produkt von Wako Pure Chemical Co., Ltd.), bei 37°C umgesetzt. Der Zeitverlauf der Pectin-Zersetzungsaktivität wird bestimmt, und er ist in Fig. 1 dargestellt. Die Pectin-Zersetzungsaktivität wurde nach dem Verfahren, wie es in Agric. Biol. Chem., Bd. 46/1982, S. 667, beschrieben wird, bestimmt.

Aus den Ergebnissen der Fig. 1 ist offensichtlich, daß die Protopectinase, die in dem oben erwähnten Überstand enthalten ist, eine Pectin-Freisetzungsaktivität, jedoch keine Pectin-Zersetzungsaktivität, aufweist.

Außerdem wurde bestätigt, daß jede Protopectinase, die auf den in Tabelle 1 angegebenen Mikroorganismen gebildet wird, keine Pectin-Zersetzungsaktivität aufweist.

Beispiel 2

In einem Medium (pH 6,5), welches lösliche Stärke (0,5%), (NH₄)₂PO₄ (1%), CaCl₂ · 2H₂O (0,01%) und Hefeextrakt (0,01%) enthält, werden Bacillus subtilis IFO 12113 und Bacillus subtilis IFO 13719 bei 30°C während 24 Stunden gezüchtet. 100 ml des Kulturfiltrats werden mit 2,5 g getrockneten Zitrus-unshiu-Schalen vermischt und bei 60°C während 24 Stunden reagieren gelassen. Der nach der Filtration erhaltene Überstand wurde mit dem 3fachen seines Volumens an Ethylalkohol vermischt, und das gebildete Pectin wurde gesammelt und getrocknet. Die Ausbeuten und Eigenschaften der so erhaltenen Pectinproben sind in Tabelle 2 angegeben. Pectine mit hohem Molekulargewicht werden durch die vollständige Umsetzung bei einer so hohen Temperatur, wie oben beschrieben, erhalten.

Tabelle 2

Eigenschaften des Pectins, das man aus der Schale von Zitrus unshiu erhält

Beispiel 3

In einem Medium, das das gleiche Kulturmedium ist, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, jedoch Dextrin anstelle der löslichen Stärke enthält, wird Bacillus subtilis IFO 12113 bei 30°C während 40 Stunden gezüchtet. Das Kulturfiltrat wird als Enzymlösung in 40 Einheiten zu 50 ml einer Lösung (pH 5,0) zugegeben, die 1 g Protopectin verschiedener Ursprünge enthält, wie es in Tabelle 3 angegeben wird. Die Reaktion kann bei 37°C während 1 Stunde ablaufen. Die dabei freigesetzten Mengen an Pectin sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Aktivität von Protopectinase-B*) auf verschiedenen Protopectinen

Beispiel 4

In einem Medium, welches das gleiche Kulturmedium ist, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, jedoch 0,5% Pepton anstelle des Ammoniumphosphats enthält, wird Bacillus subtilis IFO 12113 bei 30°C während 36 Stunden gezüchtet. Das Kulturfiltrat wird als Enzymlösung zu 100 ml einer Lösung (pH 5,0) zugegeben, die 10 g Protopectin, hergestellt aus Zitrone, enthält. Die Reaktion kann bei 37°C ablaufen, und die Menge und das Molekulargewicht des freigesetzten Pectins werden periodisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.

Aus den Ergebnissen der Fig. 2 ist offensichtlich, daß das freigesetzte Pectin nicht zersetzt wird.

Danach wird die durch Bacillus subtilis IFO 12113 gebildete Protopectinase gereinigt, und ihre Eigenschaften werden bestimmt.

Reinigungsverfahren

Der Stamm wird in dem Medium von Beispiel 1 bei 37°C während 20 Stunden gezüchtet, und das Kulturfiltrat (20 l) wird auf 2 l konzentriert. Das Konzentrat wird gegenüber 20 mM Acetat-Puffer dialysiert und dann auf eine CM-Sephadex-C-50-Säule (5×46 cm), die mit dem gleichen Puffer equilibriert ist, aufgebracht. Das Enzym wird mit NaCl-(0 bis 500 mM)-Konzentrationsgradienten eluiert. Die Enzymlösung kann durch eine DEAE-Toyopearl-650-Säule (2,1×15 cm) hindurchlaufen, und die Lösung, die durch die Säule hindurchläuft, wird gesammelt. Die Lösung wird dann auf 4 ml konzentriert und der Chromatographie mit einer Toyopearl-HW-55S-Säule (2,5×75 cm) unterworfen. Die Protopectinasefraktionen werden gesammelt und konzentriert und nach der Zugabe von pulverförmigem Ammoniumsulfat in einem Eisschrank während 1 Woche stehengelassen, wobei man 42 mg Nadeln erhält. Das so erhaltene Enzym ist eine neue Protopectinase, die als "Protopectinase-B" bezeichnet wird.

Die Eigenschaften der Enzym-Protopectinase-B sind in Tabelle 4 angegeben, und die Ergebnisse der Aminosäureanalyse der Enzym-Protopectinase-B sind in Tabelle 5 angegeben.
durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese29,0 durch Gelfiltration28,0 durch Ultrazentrifugation28,0 Sedimentationskonstante (S₂₀, w)s 3,045 Isoelektrischer Punkt9,4 Extinktionskoeffizient
(1%ige wäßrige Lösung, 280 nm)15,1 optimaler pH7,0-8,0 (37°C)
4,5-5,5 (60°C) optimale Temperatur (°C)37-60°C InhibitorBa, Ca, Ni KristallformNadeln

Tabelle 5

Aminosäureanalyse der Protopectinase-B aus Bacillus subtilis IFO 12113

Die Verfahren für die Bestimmung der Eigenschaften der Protopectinase-B und die Verfahren der Aminosäureanalyse für Protopectinase-B sind die folgenden:

Molekulargewicht:
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(das Verfahren von Weber & Osborn, welches in J. Biol. Chem., Bd. 244/1969, S. 4406, beschrieben wird, wurde verwendet),

Gelfiltration
(die Bedingungen sind die gleichen wie für die Gelfiltration bei der Reinigung der Enzyme, wie oben beschrieben. Als Standardproteine werden Cytochrom C. lysozym, α-Chymotrypsinogen A, Ovalbumin und Rinderserumalbumin verwendet),

Ultrazentrifugation
(es wird das Yphantis-Verfahren, welches in Biochemistry, Bd. 3/1964, S. 297, beschrieben wird, verwendet),

Sedimentationskonstante
(das Enzym wird in 20 mM Acetat-Puffer von pH 6,0, welcher 100 mM NaCl enthält, unter Bildung einer Enzymlösung, welche 5 mg Enzym pro ml enthält, gelöst, und die Analyse erfolgt durch Zentrifugation mit einer analytischen Ultrazentrifuge Hitachi-Modell 232 bei 60 000 UpM),

Isoelektrischer Punkt
Der optimale pH und die optimale Temperatur werden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 bestimmt.

Aminosäureanalyse
Das gereinigte Enzym (18 mg) wird in 6 n-Chlorwasserstoffsäure gelöst und in einem Rohr eingeschmolzen. Die Zersetzung erfolgte bei 110°C während 30, 48 und 72 Stunden, und die Analyse erfolgte mittels einem automatischen Aminosäureanalysegerät Hitachi-Modell LA-5.

Der Wirkungsmechanismus der oben beschriebenen Protopectinase-B auf Protopectin wurde untersucht, und es wurde bestätigt, daß das Enzym glycosidische Bindungen an den Endungsstellen von Arabinogalactan, hergestellt aus Sojabohnen, spaltet. Die anderen Mikroorganismen, die bei dieser Erfindung verwendet werden, bilden die gleiche Art von Enzymen. Die immunologische Homologie zwischen Protopectinasen, die durch die Mikroorganismen, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gebildet werden, und Protopectinase-B wurde untersucht und ist in Tabelle 6 angegeben. Die immunologischen Tests erfolgten unter Verwendung eines Antiserums, welches in Kaninchen mit gereinigter Protopectinase-B gemäß dem doppelten Immuno-Diffusionsverfahren von Ouchterlony (O. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand., Bd. 26, S. 507, 1940) hergestellt wurde. Die Enzyme von B. coagulans IFO 12583, B. licheniformis IFO 14206 und B. macerans IFO 3490 bilden Präzipitate mit Antiserum von Protopectinase-B, aber diese Enzyme sind nicht identisch mit Protopectinase-B, was aus ihrem Präzipitationsprofil geschlossen wurde, und die anderen ergaben keine Präzipitation.

Die Arabinogalactan-Zersetzungsaktivität wurde wie folgt bestimmt. Ein Reaktionsgemisch, welches 3 ml 1%iges Arabinogalactan, 1 ml Enzymlösung, 0,5 ml von 0,2 M Essigsäure/-Natriumacetat-Puffer (pH 6,0) enthält, wird bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Die durch die Einwirkung von Protopectinase-B freigesetzten reduzierenden Zucker wurden als Galactose gemäß dem Nelson-Somogyi-Verfahren (M. Somogyi, J. Biol. Chem., Bd. 195, S. 19, 1952) bestimmt.

Tabelle 6

Immunologische Homologie zwischen Protopectinasen, die aus Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, gebildet werden, und Protopectinase-B

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Pectin, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzengewebe, welches Pectinsubstanzen enthält, dem Einfluß eines Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört und eine Pectin-Freisetzungsaktivität für Pflanzengewebe, aber im wesentlichen keine Pectin-Zersetzungsaktivität besitzt, oder einer Kulturbrühe davon oder weiterbehandeltem Material davon unter Freisetzung des Pectins aus dem Pflanzengewebe unterwirft und das Pectin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mikroorganismen Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus macerans, Stämme, die diesen Stämmen ähnlich sind, oder ihre Mutanten sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt wird, die enthält:

1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117 und 14140,
2) Bacillus amyloliquefaciens IFO 14141,
3) Bacillus cereus IFO 3002 und 3132,
4) Bacillus circulans IFO 13632,
5) Bacillus coagulans IFO 12583,
6) Bacillus firmus IFO 3330,
7) Bacillus licheniformis IFO 14206,
8) Bacillus pumilus IFO 12087 und
9) Bacillus macerans IFO 3490.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus Bacillus subtilis IFO 12113 oder Bacillus subtilis IFO 13719 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schale oder Segmentbedeckung von Zitrusfrüchten als Pflanzengewebe, das Pectinsubstanzen enthält, verwendet wird.