DE1517732C3

DE1517732C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung hochaktiver Protease

Info

Publication number: DE1517732C3
Application number: DE19661517732
Authority: DE
Inventors: Kazuo Tokio Komagata; Koji Kawasaki Mitsugi; Takashi Nakase; Shinji Yokohama Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1965-06-05
Filing date: 1966-06-04
Publication date: 1975-03-27
Also published as: GB1151236A; DE1517732B2; DE1517732A1

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung hochaktiver Protease, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm der Art Candida lipolytica in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung im Temperaturbereich von etwa 15 bis 30° C 10 bis 70 Stunden lang unter aeroben Bedingungen kultiviert. Die gemäß Erfindung erhaltene Protease hat sich auf den Gebieten der Medizin, der Nahrungsmittelindustrie und der Kosmetik bei der Hydrolyse verschiedener Proteine zur Bildung von Aminosäuren sowie von partiellen Proteinhydrolysaten nützlich erwiesen.

Es ist bekannt, daß Proteasen von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, Streptomyceten und Fungi, gebildet werden und daß die industrielle Produktion mit Hilfe einiger Mikroorganismen durchgeführt worden ist, um Protease kommerziell nutzbar zu machen.

Ein charakteristisches Merkmal des Verfahrens der Erfindung besteht darin, daß die Protease von der Hefe nicht nur intracellular, sondern auch extracellular gebildet wird.

So ist aus Agr. Biol. Chem., 28 (1964), S. 774 bis 778, eine von dem Fungus Trametes sanguinea prozudierte saure Protease mit einem optimalen pH bei 2,5 bekanntgeworden, die im pH-Bereich zwischen 2 und 6 stabil ist. Diese Protease kann daher nicht im alkalischen Medium, in dem viele Arbeiten auf dem Gebiet der Nahrungs- und Futtermittel durchgeführt werden müssen, eingesetzt werden.

Aus Biochem. Biophys. Acta, 17 (1955), S. 99 bis 110, ist die von einem bestimmten Bacillus licheniformis-Stamm produzierte Damodaran-Protease bekanntgeworden, die jedoch aus einem Enzymkomplex aus einer Protease und einer oder mehreren Peptidasen besteht, was zur Folge hat, daß dieser Enzyl-Komplex bei der Digestion von Protein einen hohen Prozentsatz freier Aminosäuren und Peptide bildet. Dieser spezielle Stamm ist dort aber auch nicht mit Hinterlegung angegeben.

Die gemäß Erfindung durch Flüssigkeitskultivierung von Candida lipolytica erhaltene Protease ist dagegen im alkalischen Bereich stabil und läßt sich daher auf dem Gebiet der Nahrungs- und Futtermittelindustrie einsetzen. Sie zeichnet sich ferner durch eine gewisse Selektivwirkung aus, indem sie aus Protein hauptsächlich Peptide bildet, was z. B. bei der Käseherstellung nützlich ist.

Die für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeigneten Candida iipoiytica-Stämme sind durch Versuch zu ermitteln, ob sie bei der Kultivierung unter den beanspruchten Bedingungen extracellular die Protease liefern. Die Anmelderin hat so bei Untersuchungen an etwa 40 verschiedenen Candida lipolytica-Stämmen festgestellt, daß über 90% dieser untersuchten Stämme bei der Kultivierung extracellular die Protease bilden.

Einige Beispiele für typische Candida lipolytica-Stämme, die in dem Verfahren gemäß Erfindung benutzt werden können, sind die Stämme ATCC 16617, ATCC16618, die von den Erfindern isoliert und nach den in »The Yeast« von J. Lodder (1952 veröffentlicht von North-Holland Publishing Company Amsterdam und Interscience Publishers, Inc., New York) beschriebenen Klassifizierungsmethoden als Candida lipolytica-Stämme identifiziert wurden. Über die Isolierung einiger Stämme ist bereits in J. Gen.

appl. Microbiöl., 10 (1964), S. 323, berichtet worden.

Der'Candida-Stamm lipolytica-Originalstamm, der auch im Verfahren gemäß der Erfindung benutzt werden kann, wurde von Jacobsen aus Margarine isoliert. Die mikrobiologischen charakteristischen Eigenschaften des Stammes sind in »The Yeast«, I.e., S. 550 bis 552, beschrieben. Es besteht kein wesent-

*5 licher Unterschied zwischen den gemäß der Erfindung benutzten zwei ATCC-Stämmen und dem Originalstamm, abgesehen davon, daß diese Stämme einen geringen Unterschied in der Galactose-Assimilation zeigen. Alle Stämme bilden Pseudomycel, fermentieren keinen Zucker — Glucose ausgenommen — und zeigen hohe Aktivitäten bei der Hydrolyse von Fett. Die gleichen physiologischen Charakteristiken weist auch der Originalstamm von Jacobsen auf.

Candida lipolytica wächst leicht bei der aeroben Kultivierung in flüssigem Medium, das assimilierbare Kohlenstofflieferanten, wie Glucose, Stärkehydrolysat, organische Säuren und Kohlenwasserstoffe, organische oder anorganische Stickstofflieferanten, wie Ammoniumsulfat, Harnstoff und Ammoniumphosphat, Nährstoffe, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeexträkt, Sojabohnenproteinhydrolysat, Casaminosäuren, Fleischextrakt und Vitamine, sowie anorganische Salze enthält, wobei die Protease leicht in guter Ausbeute gebildet wird. Die Inkubation wird zweckmäßig im Temperaturbereich von etwa 15 bis 30° C durchgeführt, und die im Kulturmedium angereicherte Proteasemenge erreicht gewöhnlich 10 bis 72 Stunden nach Inkubationsbeginn das Maximum.

Es muß auf die Kultivierungszeit geachtet werden, da Tendenz besteht, daß die Aktivität der im Kulturmedium gebildeten Protease bei langer Kultivierung abnimmt. Ein Teil der gebildeten Protease befindet sich bis zu einem gewissen Grad in den Hefezellen, eine große Menge der Protease ist jedoch im Kulturmedium extracellular vorhanden.

Das Enzym hat folgende charakteristische Merkmale:
Das filtrierte oder unfiltrierte Kulturmedium hat die Eigenschaft, Protein zu hydrolysieren. Das im FiI-trat oder in der überstehenden Flüssigkeit, die von den Zellen abgetrennt ist, enthaltene Enzym läßt sich mit irgendeiner der allgemein bekannten Reinigungsmethoden zur Isolierung der Enzyme aus ihrer Lö- sung, wie Aussalzen oder Ammoniumsulfatzusatz, Chromatographie, Filtratoin mittels Gel, konzentrieren oder in den festen Zustand überführen. Dieses Enzym besitzt Proteaseaktivität, insbesondere im pH-

Bereich von 2 bis 10. Der optimale pH-Bereich liegt etwa bei 8,5 bis 9, wie F i g. 1 zeigt, wenn die Aktivität gegen Casein als Substrat getestet wird.

Reaktionsbedingungen und Analysenmethoden:

Als Protease wird die Enzymrohlösung des Beispiels 1 benutzt. Zu 5 ecm einer l,2^e/oigen Milchcaseinlösung (Hammerstein-Casein, suspendiert oder gelöst in Lactatpuffer von.pH 2,5 bis 5, in Tris-Hcl-Puffer von pH 6 bis 10) gibt man die Enzymrohlösung, deren Proteingehalt 1,2 mg beträgt, stellt die gesamte Lösung auf 6 ecm ein und läßt die Reaktionsmischung

2 Stunden bei 30° C stehen. Danach fügt man ihr 5 ecm 0,44 M Trichloressigsäure zu, läßt sie 30 Minuten bei 30° C stehen und filtriert die Mischung. Die Acylaminosäuren der in Trichloressigsäure löslichen Teile (proteinfreie Stickstoff-Fraktion) werden nach der Methode von F ο 1 i η quantitativ bestimmt und dann den Grad der Proteinhydrolyse — bezogen auf die Ausbeute an proteinfreien Stickstoffverbindungen — gemessen. Danach gibt man 0,3 ecm einer Mischung von 10% Natriumwolframat und 0,6 n-Schwefelsäure pro 1 ecm der filtrierten Trichloressigsäure löslichen Fraktionen zu, entfernt.den Niederschlag, bestimmt im Filtrat die Acrylaminosäuremenge nach der Methode von F ο 1 i η und dann die Menge an niedermolekularen Peptiden oder freien Aminosäuren — bezogen auf die Menge der in Wolframsäure löslichen Fraktion.

Die Protease weist Aktivität bei 20 bis 50° C auf, insbesondere bei der optimalen Temperatur von etwa 30° C, und verliert sie beim Erhitzen auf 60° C. Jedoch selbst im Temperaturbereich unterhalb von 20° C kann das Substrat durch Protease in einer Reaktion von langer Dauer hydrolysiert werden, da in solchem Temperaturbereich die Enzymaktivität nicht gleich Null ist. Die Protease ist außerordentlich stabil, und man kann sie — ohne daß ihre Aktivität nachläßt — 10 Tage bei 0 bis 5° C im pH-Bereich von

3 bis 9 stehen lassen. Unter optimalen Bedingungen vermag die gemäß Erfindung erhaltene Protease 70 bis 9O°/o der Gesamtmenge des zugesetzten Proteins zu dem proteinfreien, in Trichloressigsäure löslichen Stickstoffprodukts zu hydrolysieren. Die Eigenschaft dieser Protease, proteinfreie Stickstoffverbindungen zu bilden, ist in Tabelle 1 mit der der vorbekannten Proteasen des Handels verglichen, wobei jede Probe beim optimalen pH-Wert des Enzyms inkubiert wurde.

Tabelle 1
-. Vergleich mit Proteasen des Handels

/52

Reaktionsbedingungen

Milchcasein 10 mg

Enzym

Fungalprotease (Asp. satoi) 0,67 mg ,

Streptomycetenprotease ... 0,33 mg

Bakterienprotease 0,67 mg

Hefeprotease *) 0,20 mg/ccm

*) Enzymlösung wie in Beispiel 1.

	pH der	Prozent	In
	Reak tions-	satz der Protein	Wolfram
Enzymlieferant	mischung	hydrolyse	säure lösliche
			Anteile
Durch Aspergillus sai-	2,7	80
toi erzeugte Protease			45
Durch Streptomyces
griseus erzeugte Pro	7,0	60
tease	¹ >^w		42
Durch Bacillus subtilis	7,0	64
erzeugte Protease ..			40
Erfindungsgemäß erhal	9,0	90
tene Hefeprotease ..		40

Bemerkung

6 ecm der Reakionsmischung, deren pH-Wert mit Lactat oder Tris-HCl-Puffer eingestellt worden ist, läßt man 24 Stunden bei 30° C stehen.

Unter der Voraussetzung, daß das Gesamtprotein der benutzten Enzymrohlösung das Protein der Protease ist, vermag man jeweils die Fähigkeit, proteinfreie

ao Stickstoffverbindungen pro Einheit Proteaseprotein zu bilden, miteinander zu vergleichen. Es ist offensichtlich, daß der optimale pH-Bereich bei der erfindungsgemäß hergestellten Protease stärker im alkalischen Bereich als bei den Proteasen de"s Handels liegt und daß ihre Aktivität wesentlich höher ist. Jedoch mit der gemäß Erfindung erhaltenen Protease wird das Protein gewöhnlich nicht vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert, etwa 50% der proteinfreien Stickstoffverbindungen sind niedermolekulare Peptide. Mit anderen Worten: im Gegensatz zur Protease der Streptomyceten stellt die gemäß Erfindung erhaltene Protease ein sogenanntes Enzym von begrenztem Hydrolysetyp dar.

Die gemäß Erfindung erhaltene Protease vermag Proteine des Milchcaseins und Gelatine, Weizengluten, Maisgluten, Sojabohnenprotein, Globulin, Albumin usw. leicht zur proteinfreien, in Trichloressigsäure löslichen Stickstoffverbindungen zu hydrolysieren.

Bei Anwendung wird die Protease gemäß Erfindung gewöhnlich nach ihrer Bildung im Kulturmedium mit dem Protein umgesetzt, jedoch nach einem modifizierten Verfahren ist es z. B. auch möglich, Candida lipolytica in einem flüssigen Medum, das bereits Substratprotein enthält, der Inkubation zu unterwerfen, um dieses Protein zu hydrolysieren und dessen lösliche Hydrolysate im Kulturmedium zu bilden. Das Kulturmedium, das noch die Hefezellen enthält, das nach der Entfernung der Zellen erhaltene Filtrat oder das nach dem Aussalzen des Filtrats erhaltene Enzymrohpräparat können als brauchbare Proteaselieferanten benutzt werden. Da das Kulturmedium von Candida lipolytica sowie die daraus hergestellten Enzymmaterialen weder unangenehmen Geruch noch Geschmack aufweisen, können sie auch in einfacher Weise zur Herstellung von .Nahrungsmitteln benutzt werden. Es ist auch möglich, aus dem Kulturmedium in einfacher Weise ein reines Enzympräparat herzustellen, da die Protease extracellular vorliegt.

Nach dem Abtrennen der extracellular gebildeten Protease können die Zellen — je nach der in ihnen vorhandenen Proteaserestmenge — für geeignete Zwecke verwendet werden. Die Hefezellen sind als Nahrungsmittel oder Futter und in den letzten Jahren auch als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Substanzen, die das Aroma erhöhen, 5'-Ribonucleotide verwendet worden.

Das Verfahren der Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1 50 ecm eines flüssigen Mediums mit pH 7,0, das

5 °/o Glucose,

1 % Hefeextrakt,

0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,04% Magnesiumphosphat und

2 ppm Fe⁺+, Mn++

gesetzt. Die Hydrolysegeschwindigkeit ist in Tablle 2 angegeben.

Tabelle 2
Hydrolyse von Milchcasein durch die Protease

IO

enthält, werden in einen 500-cm-Schüttelkolben gegeben, die Lösung 10 Minuten bei 115° C sterilisiert, dann mit Candida lipolytica ATCC 16617 beimpft und die Kultivierung unter Schütteln 18 Stunden bei 25° C durchgeführt. Man zentrifugiert die Zellen von dem Kulturmedium ab, gibt zu 1 1 überstehender Flüssigkeit nach und nach 684 g Ammoniumsulfat und bringt seinen Sättigungsgrad auf 90%, wonach man die Mischung eine Nacht bei 5° C stehenläßt. Die in der Flüssigkeit enthaltene Protease wird gefällt, und der durch Zentrifugieren abgetrennte Niederschlag (10000 g · 15 min) wird in 500 ecm einer M/5-Tris/M/lO-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst. Die Lösung ,die so lange gegen fließendes Wasser ^a5 dialysiert wird, bis sie frei von Sulfationen ist, wird als Enzymrohpräparat benutzt. In 625 ecm Intradialyse-Lösung sind 916 mg Protein enthalten, was einer Wiedergewinnungsmenge von 38,3% entspricht.

50 ecm der Lösungsmischung, die 500 mg Milchcasein nach Hammerstein enthält, werden mit der Enzymrohlösung, die 10% Protein enthält, um-

Reaktionszeit (Stunden)	Prozentsatz der Proteinhydrolyse (Prozentsatz der Bildung protein freier Stickstoff verbindungen)	In Wolframsäure lösliche Fraktion (°/o)
2 5 9 16 • 24.	70 89 91 90 90	20 33 38 39 39

30 Nach- 24 Stunden wird die überstehende Flüssigkeit, die durch Abzentrifugieren von 25 ecm Reaktionsmischung erhalten wurde, in eine 3 · 100-cm-Kolonne von Dextrangel gegossen und. dann mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 10 ccm/7 min eluiert und zu 10 ecm des Volumens fraktioniert. Die eluierten Fraktionen werden in Übereinstimmung mit der UV-Absorption bei 280 ηΐμ gesammelt. Der Gesamtstickstoff wird mit der Mikro-Kjeldahl-Methode und der Aminostickstoffwert mit der van Slyke-Methode bestimmt. Außerdem wird die Zunahme des Aminostickstoffs nach der Hydrolyse in 6 n-HCl-Lösung 22 Stunden bei 115° C bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 enthalten.

Tabelle 2 Fraktion der Reaktionsprodukte

Fraktion	Testrohr Nr.	Gesamt stickstoff (°/o)	Prozentualer Stickstoffgehalt	« Aminostickstoff	nach HCl- Aminostickstoff	Hydrolyse Zunahme des Aminostickstoffs
I II III ....... IV V*)........	15 bis 24 25 bis 30 31 bis 43 44 bis 55 56 bis 70	5,11 9,60 14,30 15,08 Spuren	11,6 21,8 32,4 34,2	1,26 1,88 3,64 11,12	3,64 7,35 11,00 12,40	290 394 302 113

*) Keine Färbung durch Ninhydrin.

Fraktion IV enthält nur freie Aminosäuren, und in den Fraktionen I bis III ist eine Zunahme des Aminostickstoffs gefunden worden. Der Grad der Zunahme zeigt, daß in diesen Fraktionen niedermolekulare Peptide enthalten sind.

Beispiel 2

Die Kultivierung von Candida lipolytica ATCC 16618 wird in der in Beispiel 1 angegebenen Weise durchgeführt. Das Filtrat des Kulturmediums ist durch Abzentrifugieren der Zellen erhalten worden.

Zur Suspension von 1 g Milchcasein in 50 ecm M/5-Tris/M/lO-HCl-Pufierlösung (pH 9,0) gibt man 17 ecm des filtrierten Kulturmediums zu, stellt das Volumen auf 100 ecm ein und läßt die Reaktionsmischung 6 Stunden bei 30° C stehen. Danach sind 81,2% des Proteins zu proteinfreien Stickstoffverbindungen hydrolysiert.

Beispiel 3 Je 50 ecm eines flüssigen Mediums mit pH 6,8, das

5 % Glucose,

0,2% Hefeextrakt,
0,2 ecm/

100 ecm Sojabohnenproteinhydrolysat,

0,3 % Ammoniumchlorid,

1,2 % Harnstoff,

0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat und

0,04% Magnesiumsulfat

enthält, werden in zwei 500-ccm-Schüttelkolben gegossen, und nach der Sterilisierung für 10 Minuten

1 DL/

bei 115° C werden die beiden Kolben mit Candida lipolytica ATCC 16617 beimpft, das 24 Stunden bei 25⁰C einer Vorkultur auf einer Agrarschrägschnitte unterworfen worden ist, die

0,3 o/o Hefeextrakt,
0,3 % Malzextrakt,
1 °/o Glucose,
0,5 °/o Polypepton

enthielt. Danach wird die Kultivierung unter Schütteln 40 Stunden bei 25° C durchgeführt. Das Gewicht der im Kulturmedium gebildeten Zellen beträgt 0,96 g/100 ecm (Trockengewicht).

Die intakten Zellen werden vom Kulturmedium abzentrifugiert (12000 g · 10 min) und dann in 90 ecm einer 0,02%igen Kaliumchloridlösung suspendiert.

Zu 250 ecm der Phosphatpufferlösung (pH 8,0) mit 4 g Milchcasein gibt man 80 ecm der Suspension intakter Zellen und stellt das Volumen auf 400 ecm ein. Die Reaktionsmischung läßt man 9 Stunden bei 30° C stehen. Die Ausbeute an proteinfreien Stickstoffverbindungen wird in der in Beispiel 1 angegebenen Weise bestimmt, wobei es sich zeigt, daß 47% des Michcaseins hydrolysiert sind.

Zu der Milchcasein enthaltenden Phosphatpufferlösung gibt man anstelle der Suspension intakter Zellen 80 ecm des filtrierten Kulturmediums. Hierbei werden unter den gleichen Reaktionsbedingungen,

wie sie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben sind, 72% des Proteins hydrolysiert.

Beispiel 4

Zu je 50 ecm M/5-Tris/M/lO-HCl-Pufferlösung (pH 9,0), in der jeweils

0,5 g Weizengluten,
0,45 g Maisgluten oder
1,05 g Sojabohnenkuchen

suspendiert sind, werden 16,5 ecm Enzymrohlösung (wie sie in Beispiel 1 benutzt ist) zugesetzt und das Volumen auf 100 ecm eingestellt. Die Reaktionsmischung läßt man 24 Stunden bei 30° C stehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 enthalten.

. Tabelle 4

-Aktivität gegenüber verschiedenen Proteinen
als Substrat

Proteine als Substrat 25""	Konzen- ' tration (o/o)	Prozentsatz der Protein hydrolyse	Prozentsatz der in Wolfram- * säure lös lichen Teile
Weizengluten Maisgluten .. Sojabohnen- 30 kuchen	6,5 0,45 1,05	77,3 81,6 73,0	67 64 65

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung hochaktiver Protease, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Art Candida lipolytica in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung im Temperaturbereich von etwa 15 bis 30⁰C 10 bis 70 Stunden lang unter aeroben Bedingungen kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida lipolytica ATCC 16617 oder Candida lipolytica ATCC 16618 einsetzt.