DE69631731T2

DE69631731T2 - Herstellung der aminopeptidasen aus aspergillus niger

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Publication number: DE69631731T2
Application number: DE69631731T
Authority: DE
Inventors: Laurent Chevalet; Jerome Souppe; Joel De Leseleuc; Jacky Brunet; Johannes Martinus WARMERDAM
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: BR9606405A; MX9700746A; AU697604B2; EP0773990B1; US6271013B1; WO1996038549A1; AU6001896A; NZ309772A; CA2196282A1; US5914259A; AR002147A1; EP0773990A1; ATE260973T1; DE69631731D1; JPH10503659A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Aminopeptidasen, ihre Herstellung und ihre Verwendung für gewerbliche Zwecke.
Die Hydrolyse von Proteinen ist von großer Bedeutung, insbesondere für die Nahrungsmittelindustrie. Im allgemeinen handelt es sich dabei um die Umwandlung von hochmolekularen Proteinen (z. B. Casein, Gluten, Gelatine, Sojaprotein) in kleine Fragmente (Oligopeptide oder Aminosäuren). Diese Transformationen können unter stark sauren oder stark alkalischen Bedingungen durchgeführt werden, die häufig energieaufwändig sind und die Verwendung von aggressiven Chemikalien erfordern.
Proteinabbauende Enzyme werden bevorzugt, da sie die Umwelt weniger beeinträchtigen und ihre Tätigkeit unter milden Bedingungen ausüben können, was eine Razemisierung von Aminosäuren verhindert. Diese Enzyme werden in Endoproteasen und Exopeptidasen eingeteilt. Endoproteasen spalten hochmolekulare Proteine zu Oligopeptiden, während Exopeptidasen Aminosäuren aus hochmolekularen Proteinen oder Proteinfragmenten freisetzen.
Beide Typen von Enzymen sind im allgemeinen erforderlich, um Proteinhydrolysate zu erzeugen. Das endo/exo-Verhältnis ist je nach Anwendungszweck zu variieren. Um eine starke Verflüssigung eines komplexen Proteins zu erreichen, sind Endoenzyme erforderlich, um den Hauptbeitrag für die Hydrolyse zu erzielen. Umgekehrt werden zur Erzeugung von speziellen Aminosäuren oder Peptiden aus einem komplexen Protein ohne Zerstörung von dessen physikalischen Eigenschaften (Elastizität, Schäumungsverhalten, Strukturbeschaffenheit) Exoenzyme mit geringer Endoaktivität bevorzugt.
Zahlreiche Mikroorganismen sind zur Erzeugung von Endoproteasen und Exopeptidasen befähigt. Das endo/exo-Verhältnis ist hauptsächlich von den Züchtungsbedingungen (1-3) und der nachgeordneten Bearbeitung (4) abhängig.
In der Nahrungsmittelindustrie werden seit langem in breitem Umfang Aspergilli verwendet, die somit in zahlreichen Ländern auf der ganzen Welt den gesetzlichen Bestimmungen entsprechen. Unter Aspergilli stellt Aspergillus niger die in der Nahrungsmittelindustrie am häufigsten verwendete Spezies dar. Während Endoprotease (5–7) und Carboxypeptidase (8–10) aus Aspergillus niger beschrieben wurden, ist die Erzeugung von Aminopeptidase durch Aspergillus niger bisher nicht bekannt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Aminopeptidasen ausgewählter Aspergillus niger-Stämme und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus entsprechenden Kulturen von Aspergillus niger. Diese Aminopeptidasen weisen eine optimale Aktivität bei einem pH-wert im Bereich von 6–8 und bei einer Temperatur im Bereich von 50–60 °C auf. Außerdem lassen sich Aminopeptidasen, die im wesentlichen frei von Endoproteasen sind, durch ausgewählte Aspergillus niger-Stämme unter geeigneten Züchtungsbedingungen erzeugen. Unter dem Ausdruck "im wesentlichen frei von Endoprotease" ist zu verstehen, dass keine nachweisbare oder zumindest keine erhebliche Menge an Endoprotease vorliegt. Somit wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch Züchtung von ausgewählten Aspergillus niger-Stämmen ein Fermentationsbrühefiltrat oder ein flüssiges Konzentrat davon erhalten werden kann, das geringe Mengen an Endoprotease enthält, jedoch einen hohen Anteil an Aminopeptidase-Aktivität besitzt. So weist ein zellfreies Präparat von Aspergillus niger-Aminopeptidase eine mindestens 10-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität und vorzugsweise eine mindestens 30-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität im Vergleich zur Endoprotease-Aktivität auf, wobei Phenylalanin-aminopeptidase den Großteil der Aminopeptidase-Aktivität liefert.
Im Hinblick auf kürzliche Änderungen der Nomenklatur von schwarzen Aspergilli wird hier der Ausdruck Aspergillus niger so definiert, dass er sämtliche (schwarzen) Aspergilli umfasst, die in der Aspergillus niger-Gruppe gemäß der Definition von Raper und Fennell (The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, (1965), S. 293–344) auftreten. Gleichermaßen nehmen wir auch für die übrigen Aspergillus-Spezies auf die Aspergillus-Gruppen gemäß der vorstehenden Definition von Raper und Fenell Bezug, wobei sämtliche Spezies und Varianten, die von diesen Autoren in einer bestimmten Gruppe aufgenommen worden sind, umfasst werden.
Eine Phenylalanin-aminopeptidase (Phe-AP) und eine Leucinaminopeptidase (Leu-AP) wurde in derartigen Präparaten identifiziert und charakterisiert, wobei die Phenylalaninaminopeptidase den Großteil der gesamten Aminopeptidase-Aktivität ausmacht. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sich die Erfindung auch auf Präparate von funktionellen Derivaten von Aspergillus niger-Aminopeptidasen erstreckt, die im Vergleich zu ihrer Endoprotease-Aktivität eine mindestens 10-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität aufweisen.
Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein zellfreies Präparat von Aspergillus niger-Aminopeptidase oder ein funktionelles Derivat davon bereitgestellt, das im Vergleich zu seiner Endoprotease-Aktivität eine mindestens 10-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines derartigen Enzympräparats bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst: ein Aspergillus niger-Stamm, der zur Bildung einer Aminopeptidase befähigt ist, z. B. Aspergillus niger NRRL 3112 oder Aspergillus niger CBS 115.39, wird unter Bedingungen, bei denen in der Fermentationsbrühe Aminopeptidase gebildet wird, gezüchtet, die Fermentationsbrühe wird filtriert und das Filtrat wird gegebenenfalls konzentriert, z. B. durch Ultrafiltration (UF-Konzentration). Vorzugsweise schließt sich an das Einengen der Fermentationsbrühe die Zugabe eines Stabilisierungsmittels, z. B. Glycerin (z. B. in einer Menge von 50 % (Vol./Vol.)), an. Gegebenenfalls können eine oder mehrere Aminopeptidasen aus dem Filtrat der Fermentationsbrühe abgetrennt werden. Die Aminopeptidase ist im wesentlichen zellfrei.
Ein erfindungsgemäßes Aminopeptidase-Präparat eignet sich für verschiedene gewerbliche Anwendungszwecke. Beispielsweise kann ein derartiges Präparat in vorteilhafter Weise zur Herstellung von Backprodukten, wie Brot, verwendet werden. 1 bis 100 Einheiten von Phe-AP und vorzugsweise 5 bis 50 Einheiten von Phe-AP pro 1 kg Teig führen zu einem verbesserten Geschmack und Aroma der Backprodukte. Weitere Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich für Nahrungs- und Futtermittel, wie die Reifung von Käse, für Proteinhydrolysate, die Beseitigung von Bitterstoffen und die Erzeugung von Hefeextrakten.
Somit werden gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Nahrungsmittelprodukt oder ein Futtermittelzwischenprodukt bereitgestellt, die ein Präparat von Aspergillus niger-Aminopeptidase oder ein funktionelles Derivat davon gemäß den vorstehenden Ausführungen enthalten.
5 bis 500 Phe-AP und vorzugsweise 15 bis 250 Phe-AP pro 1 000 Liter Milch führen zu einer Verbesserung in Bezug auf Geschmack, Aroma, Konsistenz und Struktur von Käse in einem früheren Stadium während der Käsereifung.
Wir haben festgestellt, dass Aminopeptidase zur Erzeugung von freien Aminosäuren in halbfestem Käse befähigt ist. Es wurde festgestellt, dass eine Enzymzusammensetzung, die die Aminopeptidase in Verbindung mit saurer Protease, z. B. aus Mucor miehei, enthält, zur Bildung eines Käses mit vermindertem Bittergeschmack befähigt ist.
Bei der Käseherstellung setzt Aminopeptidase zunächst rasch hohe Mengen an freien Aminosäuren, die zur Bildung von Käsegeschmack führen, frei. Wir haben überraschenderweise festgestellt, dass die anfängliche Freisetzung der freien Aminosäuren (vergl. Beispiel 5) zum Stillstand kam und nicht zur Bildung von überreifem Käse führte. Dies steht im Gegensatz zu einer Reihe von herkömmlichen Verfahren, bei denen durch die Wirkung von proteolytischen Enzymen diese Freisetzung von Aminosäuren anhält und dadurch eine übermäßige Reifung erfolgen kann. Eine mögliche Erklärung für diese anhaltende Freisetzung könnte in einer kombinierten Wirkung von Endo- und Exoproteasen liegen.
Die bei der Käseherstellung verwendeten Koagulationsmittel üben im allgemeinen eine entscheidende Rolle bei der Proteolyse während der Reifung des Käses aus, neben der von ihnen bewirkten Gerinnungsaktivität.
Herkömmlicherweise handelt es sich bei sämtlichen Koagulationsmitteln, die bei der Käseherstellung verwendet werden, um Enzympräparate, die eine hauptsächliche enzymatische Aktivität (Protease) in Verbindung mit einigen sekundären Enzymaktivitäten (im allgemeinen ebenfalls Proteasen) besitzen, z. B. tierisches Lab, in dem Chymosin und Pepsin vorwiegend für die Koagulationswirkung sowie für, einen Teil der Proteolyse in Käse verantwortlich sind.
Entsprechendes gilt für mikrobielles Lab aus Mucor miehei und/oder Endothia parasitica. Es ist tatsächlich zu erwarten, dass der gleichzeitig auftretende bittere Geschmack in Käsen, die mit diesem Typ von Koagulationsmitteln hergestellt werden, von deren sekundären Enzymaktivitäten abhängig sein können.
Bei der Käseherstellung berücksichtigen wissenschaftliche Versuche häufig nicht die Qualitätsvariationen der Milch, die gewerblichen Käseherstellungsanlagen zugeliefert wird. Die zugelieferte Milch kann leicht mit exogenen Enzymsystemen verunreinigt sein, die von Kühen oder von verunreinigenden Mikroorganismen stammen. Diese Verunreinigungen werden häufig in unzureichendem Maße durch Pasteurisierungsbehandlungen, die zur Behandlung von Milch für die Käsezubereitung herangezogen werden, inaktiviert.
Versuche zur Beschleunigung der Käsereifung in gewerblichem Maßstab, z. B. durch einfache Erhöhung der Reifungstemperatur, sind oft mit dem Nachteil behaftet, dass zwar in verstärktem Maße ein hochwertiger Geschmack für Käse, der aus einwandfreien Milchchargen gebildet wird, entsteht, dass aber mangelhafte Milchchargen häufig zu einer Verstärkung von unangenehmen Beigeschmacksrichtungen führen, so dass insgesamt ein negatives Ergebnis erzielt wird.
Der Einfluss der vorerwähnten Verunreinigungen auf die Parameter der Käseherstellung wird als einer der Gründe für diese Veranlagung angesehen.
Die sekundären Aktivitäten von koagulierenden Enzymen werden als teilweise verantwortlich für die Verstärkung der in diesen Fällen gebildeten unangenehmen Beigeschmacksrichtungen angesehen.
Die Verwendung von herkömmlichen und vorhandenen Gemischen von Enzymen für die beschleunigte Reifung, d. h. invariable Gemische von rohen Endo- und Exopeptidasen, führt zu einem ähnlichen und zusätzlichen Risiko, das vermutlich sogar von den drei Möglichkeiten am größten ist.
Daher wird vorzugsweise eine Aminopeptidase mit standardisierter Aktivität verwendet, die frei von Endopeptidase-Aktivität ist, in Kombination mit einem standardisierten Chymosin-Derivat, das durch Fermentation erhalten worden ist, eine standardisierte und bekannte Endopeptidase-Aktivität aufweist und frei von Pepsin und/oder anderen verunreinigenden Proteasen ist.
Vorzugsweise wird ferner eine neutrale Protease, insbesondere eine neutrale Protease aus Bacillus und ganz besonders aus Bacillus subtilis, die eine standardisierte Endopeptidase-Aktivität aufweist und frei von sekundären und Serinprotease-Aktivitäten ist, zugesetzt. Mögliche Wege zur Gewinnung einer gereinigten neutralen Protease sind ein Einengungs- und Reinigungsverfahren, das von einer Fermentationsbrühe ausgeht, die die neutrale Protease enthält. Eine andere Möglichkeit besteht in der Herstellung eines transformierten Wirts, wobei dieses System für die selektive Erzeugung des angestrebten Enzyms konzipiert ist.
Diese Enzymzusammensetzungen ermöglichen die Entwicklung eines Käseherstellungsverfahrens, bei dem die Beschleunigung der Käsereifung stattfindet und eine verringerte Gefahr der Bildung von unangenehmen Nebengeschmacksrichtungen besteht, die mit gelegentlichen Fluktuationen der Milchqualität und zufälligen Variationen des Käseherstellungsverfahrens verbunden sind.
Es wurde festgestellt, dass eine Enzymzusammensetzung, die mindestens aus der Aminopeptidase und einer neutralen Protease besteht, dazu befähigt ist, einen hochwertigen, harten, reibfähigen Käse, der die Geschmacksrichtung von Schweizer Käse aufweist, zu erzeugen.
Diese Enzymzusammensetzung ermöglicht eine Strukturierung des Käsebruches von hartgekochten Käsetypen in der Weise, dass die Struktureigenschaften positiv modifiziert werden.
Außerdem ermöglicht diese Enzymzusammensetzung die Entwicklung eines modifizierten Herstellungsverfahrens für harten reibfähigen Käse nach Schweizer Art unter verkürzter Reifungszeit.
Diese Enzymzusammensetzung ermöglicht bei Zugabe eines unspezifischen Koagulans die Entwicklung eines Käseherstellungsverfahrens zur Bildung von harten, gekochten Quarkkäsen, wobei der Feuchtigkeitsgehalt erhöht wird, ohne dass gleichzeitig die Struktur beeinträchtigt wird.
Die zur Herstellung von fermentierten Produkten, wie Joghurt, Käse und Wurst, verwendeten Starterkulturen verfügen über mehrere intra- und extrazelluläre Enzymsysteme, die unter anderem von proteolytischer und lipolytischer Natur sind.
Diese Enzymsysteme haben mindestens zwei Aufgaben:

a) sie dienen der Reproduktion und dem Wachstum und
b) sie dienen der Fermentation und der Reifung der Nahrungsmittelprodukte.

In gewissem Umfang fallen diese beiden Funktionen zusammen: die Aufnahme von Kohlenhydraten und deren Abbau dient dem Wachstum, wobei aber Milchsäure zu den gebildeten Nebenprodukten gehört. Diese Milchsäure ist vorwiegend für die Säuerung und Konservierung der fermentierten Nahrungsmittelprodukte verantwortlich.
Zur Aufnahme von Aminosäuren und Lipiden, die beide Bausteine für das Wachstum darstellen, bedienen sich die Bakterien ihrer extrazellulären Enzyme, um diese Bausteine aus den Medien, auf die sie inokuliert worden sind, d. h. z. B. Milch oder Fleisch, freizusetzen. Die auf diese Weise in den Nahrungsmittelprodukten stattfindenden Proteolyse- und Lipolysevorgänge tragen daher hauptsächlich zur Reifung von Nahrungsmittelprodukten, wie Käse und Wurst, bei.
Herkömmliche Erkenntnisse über die Proteolyse und Lipolyse durch Starterkulturen beziehen sich auf das Bedürfnis nach einem ausgewogenen Satz von extrazellulären Enzymen, Zellhüllenzymen, membrangebundenen Enzymen und intrazellulären Enzymen. Gemäß diesen Theorien wird das gut ausgewogene Verhältnis dieser Enzymsysteme für die Bildung ausreichender Mengen an SN (löslicher Stickstoff) und AN (Aminosäurestickstoff) als verantwortlich angesehen. Im Grunde führen Endopeptidase-Aktivitäten von Lab, Starter und exogenen Enzymen zu einem raschen Abbau von Paracasein in Käsequark zu kleineren Peptiden.
Diese kleineren Peptide werden anschließend durch aktive Starterzellen in Aminosäuren umgewandelt. Geschmacks- und Aromakomponenten werden sodann durch zahlreiche komplizierte enzymatische und chemische Reaktionen gebildet.
Man weiß relativ gut darüber Bescheid, dass die Lysis von Starterzellen eine Voraussetzung für die Erzeugung von freien Aminosäuren im Käse ist.
Kürzlich wurde gezeigt, dass die Lysis vorwiegend in sehr frühen Stadien der Käsereifung stattfindet.
Wir haben festgestellt, dass hochgradig proteolytische Starterbakterien, die hauptsächlich wegen ihrer raschen Säuerungseigenschaften gewählt werden, nicht leicht zu einer Lysis in jungem Käse führen und daher leicht den bitteren Geschmack in altem Käse verstärken, was auf ihre verminderte Fähigkeit zur Umwandlung von bitteren Peptiden zu Aminosäuren und auf ihre hohe proteolytische Aktivität in Käse zurückzuführen ist.
Bei der Herstellung eines Inokulums werden häufig nährstoffreiche Medien zur Erzielung einer raschen Bakterienvermehrung verwendet. Diese Medien weisen unter anderem einen hohen Anteil an sorgfältig ausgewählten, vermischten und/oder vorbehandelten Proteinen, Hefeextrakten, Vitaminen und Mineralien auf.
Wir haben nunmehr festgestellt, dass sich ein verbessertes Kulturmedium und ein Verfahren zu dessen Herstellung bei Verwendung von Hefeextrakten, die mit der vorliegenden Aminopeptidase behandelt worden sind, ergeben. Anstelle von Hefeextrakten können auch andere Proteinquellen oder proteinhaltige Materialien (z. B. Molke) verwendet werden. Bei Anwendung dieses neu entwickelten Kulturmediums lässt sich auch eine verbesserte Starterkultur erhalten.
Dies beinhaltet die Entwicklung von rasch säuernden, fermentierten Milch- und Käsekulturen unter Verwendung von Medien mit einem Gehalt an mit Aminopeptidase behandelten Proteinen und Hefeextrakten, wobei die damit verbundenen Nachteile, z. B. der Bildung eines bitteren Geschmacks im Käse, vermieden werden.
Die Vorteile liegen in einer erhöhten Kapazität der Milchverarbeitung oder der Dosisverringerung der verwendeten Kulturen und in einer verminderten Gefahr eines bitteren Geschmacks.
Der Bedarf an freien Aminosäuren für ein rasches Wachstum in der Käsemilch wird durch Zugabe von Aminopeptidase zur Käsemilch oder durch herkömmliche Kulturen, die möglicherweise in Kombination mit unserer speziell entwickelten Kultur eingesetzt werden, befriedigt.
Somit wird erfindungsgemäß eine verbesserte Käsekultur für die Käseherstellung sowie ein Verfahren zur Erzeugung und Vermehrung der Käsekultur unter Verwendung der vorliegenden Aminopeptidase bei der Bildung des Kulturmediums bereitgestellt.
Eine Zusammensetzung, die Aminopeptidase, Chymosin und neutrale Protease in Kombination mit den vorerwähnten Starterkulturen umfasst, führt zu einer standardisierten Herstellung von Käse. Der Vorteil besteht darin, dass Schwankungen der Milchqualität und der Käseherstellungsbedingungen geringere Einflüsse auf die Reifung des Käses haben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt das pH-Profil von Leucin-aminopeptidase aus Aspergillus niger.
2 zeigt das pH-Profil von Phenylalanin-aminopeptidase aus Aspergillus niger.
3 zeigt das Temperaturprofil beider Aminopeptidasen.
Bestimmung von enzymatischen Aktivitäten
1. Phenylalanin-aminopeptidase (Phe-AP)
Phenylalanin-p-nitroanilid wurde in 7,5 mM HCl in einer Konzentration von 0,9 mM gelöst. 1 ml dieser Substratlösung wurden mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt. Zum Zeitpunkt t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung bei 20 °C belassen. 15 Minuten später wurde 1 ml 1 N HCl zugegeben. Ein Leerwert wurde mitgeführt, wobei 1 N HCl zum Zeitpunkt t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde zur Ermittlung des Leerwerts (OD_LW) und des Testwerts (OD_Test) bei 400 nm bestimmt. Die Aktivität wurde folgendermaßen berechnet:
2. Leucin-aminopeptidase (Leu-AP)
Leucin-p-nitroanilid wurde in Wasser in einer Konzentration von 9 mM gelöst. 1 ml dieser Substratlösung wurde mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt. Zum Zeitpunkt t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung bei 20 °C belassen. 1 ml 1 N HCl wurde 15 Minuten später zugegeben. Ein Leerwert wurde mitgeführt, wobei 1 N HCl zum Zeitpunkt t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde für den Leerwert (OD_LW) und für den Test (OD_Test) bei 400 nm bestimmt. Die Aktivität wurde folgendermaßen berechnet:
3. Valin-aminopeptidase (Val-AP)
Valin-p-nitroanilid wurde in Wasser in einer Konzentration von 9 mM gelöst. 1 ml dieser Substratlösung wurde mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt. Zum Zeitpunkt t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung bei 20 °C belassen. 1 ml 1 N HCl wurde 15 Minuten später zugegeben. Ein Leerwert wurde mitgeführt, wobei 1 N HCl zum Zeitpunkt t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde für den Leerwert (OD_LW) und für den Test (OD_Test) bei 400 nm bestimmt. Die Aktivität wurde folgendermaßen berechnet:
4. Endoprotease (PU)
Diese Aktivität wurde durch 1-stündige Hydrolyse von Casein beim pH-Wert 6,0 und bei 4 °C gemessen. 1 PU ist die Enzymmenge, die zur Freisetzung des Äquivalents von 1 μmol Tyrosin pro Minute nach Fällung der restlichen Proteine mit Trichloressigsäure erforderlich ist.
Beispiel 1
Screening von Aspergillus niger-Stämmen
200 Aspergillus niger-Stämme, die aus verschiedenen Quellen isoliert oder von Kultursammlungen bezogen worden waren, wurden in einem Medium mit einem Gehalt an 15 g/Liter Kartoffelmehl, 20 g/Liter Bactopepton, 7 g/Liter Hefeextrakt, 4 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/Liter Magnesiumsulfat, 0,5 g/Liter Calciumchlorid und 0,5 g/Liter Zinkchlorid gezüchtet. Der pH-Wert betrug 4,8. Nach einer 24-stündigen Vorzüchtung bei 30 °C mit 240 U/min und einer 96- stündigen Züchtung bei 30 °C mit 275 U/min wurden die Überstände gewonnen und auf die vorstehend beschriebene Weise einem Test ihrer Aktivität an Leucin-, Phenylalanin- und Valin-aminopeptidase unterzogen. Mehrere Aspergillus niger-Stämme zeigten ein starkes Bildungspotential mindestens einer dieser enzymatischen Aktivitäten, wie in Tabelle 1 aufgeführt ist (die einzelnen Werte stellen Mittelwerte für vier Einzelergebnisse dar):
Tabelle 1
Unter den vorstehenden Stämmen wurden die Stämme 1108 und 1502 aus einer Kultursammlung bezogen. Sie hatten die Hinterlegungsnummern NRRL 3112 bzw. CBS 115.39. Der Stamm NRRL 3112 wurde für die Herstellung von Amyloglucosidase, α-Amylase und Glucoamylase verwendet. Der Stamm CBS 115.39 wurde für die Herstellung von Amylase oder Lipase verwendet.
Beispiel 2
Herstellung von Exopeptidase im Laboratoriuansmaßstab
Einige Stämme aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Screeningvorgang wurden in Laboratoriumsfermentern (10 Liter). fermentiert. Die mit dem Stamm 1502 erhaltenen Ergebnisse werden in diesem Beispiel vorgestellt.
Sporen von Aspergillus niger Stamm Nr. 1502 wurden auf PDA-Platten nach 7- bis 10-tägiger Inkubation bei 30 °C gewonnen. Eine Inokulationsstufe wurde in einem Schüttelkolben in einem Medium aus Glucose (20 g/Liter) und Maisquellflüssigkeit (20 g/Liter) 24 Stunden beim pH-Wert 4,8 durchgeführt.
Die Hauptfermentation wurde in einem absatzweisen Verfahren durchgeführt. Die folgenden Nährstoffe wurden verwendet: 100 g/Liter Maltodextrine, 40 g/Liter Sojamehl, 40 g/Liter hydrolysiertes Casein, 5 g/Liter Maisquellflüssigkeit, 2 g/Liter Gelatine, 2 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 1,3 g/Liter Natriumnitrat, 1 g/Liter Ammoniumchlorid, 0,01 g/Liter Eisensulfat und 0,5 g/Liter Antischaummittel.
Zunächst wurden sämtliche Nährstoffe mit Ausnahme der Maltodextrine vermischt. Der pH-Wert wurde auf 4,8 ± 0,1 eingestellt. Anschließend wurde der Fermenter 40 Minuten bei 125 °C sterilisiert. Die Maltodextrinlösung wurde getrennt sterilisiert und dem sterilen, jedoch abgekühlten Fermentationsmedium zugesetzt.
Die Hauptfermentation wurde in einem Laboratoriumsfermenter durchgeführt, der mit 6 Liter des vorstehend beschriebenen Mediums gefüllt war und mit dem Inhalt des Inokulationskolbens beimpft wurde. Der Rührvorgang und die Luftzufuhr wurden so eingestellt, dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff so hoch wie möglich war. Die Temperatur wurde auf 30 °C gehalten. Die Fermentation wurde gestoppt, nachdem sämtliche Nährstoffe verbraucht worden waren, d. h. nach etwa 130 Stunden.
Die Fermentationsbrühe wurde zur Entfernung sämtlicher Mikroorganismen filtriert. Die Aktivitäten an Aminopeptidase und Endoprotease wurden im Filtrat gemessen:

0,15 Leu-AP/ml

1,0 Phe-AP/ml

<0,05 Val-AP/ml

<0,1 PU/ml
Sodann wurde eine Einengung durch Ultrafiltration durchgeführt, um eine flüssige Aminopeptidase zuzubereiten, wobei Glycerin (50 %) als Stabilisierungsmittel verwendet wurde. Die erhaltene Lösung wurde als "Peptidase L2" bezeichnet. Sie wies die folgenden Aktivitäten auf:

0,5 Leu-AP/ml

3,2 Phe-AP/ml

<0,05 Val-AP/ml

<0,1 PU/ml
Diese Ergebnisse zeigen, dass der ausgewählte Aspergillus niger-Stamm bei Züchtung unter unseren ausgewählten Bedingungen Aminopeptidasen erzeugt, ohne dass wesentliche Mengen an Endoprotease entstehen.
Beispiel 3
pH-Profile der enzymatischen Aktivitäten
Die Leu-AP- und Phe-AP-Aktivitäten wurden für Peptidase L2 (vergl. Beispiel 2) unter Verwendung verschiedener Puffer bestimmt, um einen pH-Bereich von 2,5 bis 9,0 zu untersuchen.
Das pH-Profil von Leucin-aminopeptidase aus Aspergillus niger ist in 1 dargestellt.
Das pH-Profil von Phenylalanin-aminopeptidase aus Aspergillus niger ist in 2 dargestellt.
Die Figuren zeigen, dass Leu-AP im pH-Bereich von 5 bis 8, 5 aktiv ist, während Phe-AP im pH-Bereich von 5, 5 bis 9 aktiv ist, was eine ähnliche Situation wie bei Aminopeptidasen aus anderen Aspergillus-Spezies darstellt.
Beispiel 4
Temperaturprofil der enzymatischen Aktivitäten
Die Leu-AP- und Phe-AP-Aktivitäten wurden für Peptidase L2 (vergl. Beispiel 2) unter Anwendung verschiedener Inkubationstemperaturen bestimmt, um einen Temperaturbereich von 5 bis 70 °C zu untersuchen.
Die erhaltenen Temperaturprofile sind in 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die einzelnen Enzyme unterschiedliche optimale Temperaturen aufweisen, d. h. 50 °C für Leu-AP und 60 °C für Phe-AP.
Beispiel 5
Herstellung von halbhartem Käse im Laboratoriumsmaßstab Normale Käsemilch wurde mit Starterkulturen inokuliert. Eine Lab-Behandlung erfolgte mit einer durchschnittlichen Dosis von tierischem Lab (1:15 000 MCU; Kontrolle 1). Dem ersten experimentellen Ansatz von Milch wurden 25 Phe-AP-Einheiten pro 1 000 Liter Milch zugesetzt.
In einem zweiten Versuch wurde das tierische Lab durch mikrobielles Lab ersetzt, nämlich durch saure Protease aus Mucor miehei. Der experimentelle Ansatz enthielt ebenfalls 25 Phe-AP-Einheiten Aminopeptidase pro 1 000 Liter Milch.
Ein dritter Versuch wurde gemäß Versuch 1 durchgeführt, wobei die Aminopeptidase durch ein handelsübliches Enzympräparat aus A. oryzae ersetzt wurde. Dieses Präparat weist eine Endopeptidase/Exopeptidase-Aktivität auf.
Die Parameter der Käseherstellung wurden bei sämtlichen vier Käsechargen entsprechend dem Verfahren zur Herstellung von halbhartem Käse eingehalten.
Nach Einsalzen wurde der Käse einer Reifung bei 8 °C unterzogen.
Beim Versuch 1 wurde im Verlauf der Reifung ein Unterschied der Geschmacks- und Aromaentwicklung zwischen dem Versuchskäse und dem Kontrollkäse insofern festgestellt, dass der Versuchskäse nach 3 Wochen den Großteil der erforderlichen organoleptischen Eigenschaften besaß, während der Kontrollkäse erst nach 6 Wochen eine ähnliche Beschaffenheit erreicht hatte.
Der Anteil an freien Aminosäuren nach 3-wöchiger Reifung war im Kontrollkäse doppelt so hoch. Nach 6-wöchiger Reifung ergaben sich wieder vergleichbare Werte. Dies lässt darauf schließen, dass das Produkt 3 Wochen früher verkaufsfähig ist, ohne dass die Käsequalität sinkt. In diesem Versuch konnten wir zeigen, dass die Reifung durch die anfängliche Steigerung der Freisetzung von Aminosäuren beschleunigt werden kann, ohne dass eine übermäßige Reifung festgestellt wurde.
Beim Versuch 2 unterschieden sich die organoleptischen Eigenschaften der Käse insofern, als der milde Käsegeschmack mit einer leichten Tendenz zur Bitterkeit, der beim Kontrollkäse auftrat, bei den Versuchskäsen in Gegenwart von Aminopeptidase verschwand. Die Struktur des Käses war ferner etwas glatter.
Die Ergebnisse von Versuch 3 zeigten sowohl einen höheren Anteil an freien Aminosäuren und gleichzeitig eine höhere Bitterkeitsbewertung bei der organoleptischen Prüfung, was darauf hinweist, dass die Endopeptidase-Aktivität den bitteren Geschmack verstärkt.
Beispiel 6
Herstellung von Käse nach Schweizer Art im Laboratoriumsmaßstab
Normale Käsemilch wurde mit Starterkulturen inokuliert und mit Koagulationsmittel (saure Protease aus Endothia parasitica) versetzt.
Die experimentelle Milchcharge wurde mit einem Enzymgemisch aus 9 000 Einheiten Endoprotease (neutrale Protease B 500) und 1 500 Phe-AP-Einheiten von Aminopeptidase, berechnet auf 1 000 Liter Milch, versetzt.
Die Parameter der Käseherstellung wurden während der restlichen Versuchsdauer gleich gehalten.
Nach Einsalzen der Käse wurden sie 20 Tage bei 13 °C vorinkubiert, um die Struktur von Käsebruch zu erzielen. Anschließend wurde eine weitere 35-tägige Inkubation bei 19 °C vorgenommen, um die Propionsäure-Fermentation zu stimulieren.
Diese Ergebnisse zeigten überraschenderweise das Fehlen eines bitteren Geschmacks, der einen bekannten Nachteil bei der Verwendung dieser neutralen Protease bei der Käseherstellung darstellt und das Fehlen von Löchern (Augen), wobei sich jedoch hochwertige und typische Geschmacks- und Aromanoten entwickelten. Man erhielt einen hochwertigen reibfähigen Käse mit hervorragenden Schmelzeigenschaften bei einem geringeren Anteil an Trockenbestandteilen des Käses: 60,5 % im Kontrollkäse gegenüber 57,8 % im Versuchskäse.
Eine Wiederholung dieses Versuchs wurde vorgenommen, wobei das Koagulationsmittel durch Fromase^R ersetzt wurde und die Vorinkubation 10 Tage bei 13 °C sowie die Inkubation 20 Tage bei 19 °C vorgenommen wurden. Die gesamte Reifungszeit wurde halbiert.
Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind weitgehend mit denen der ersten Versuchsreihe vergleichbar.
Literatur

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Claims

Verfahren zum Herstellen eines Präparats mit Aspergillus-niger-Aminopeptidaseaktivität, wobei ein Aspergillus-niger-Stamm unter Bedingungen gezüchtet wird, bei denen in der Fermentationsbrühe Aminopeptidase gebildet wird, die Fermentationsbrühe filtriert und gegebenenfalls das Filtrat konzentriert wird, wobei der Aspergillus-niger-Stamm in der Lage ist, eine Fermentationsbrühe zu erzeugen, die nach dem Filtrieren zum Entfernen der Zellen ein Präparat ergibt, das mindestens zehn mal mehr Aminopeptidaseaktivität als Endoproteaseaktivität aufweist und worin die Phenylalaninaminopeptidase den Hauptteil der Aminopeptidaseaktivität bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filtrat der Fermentationsbrühe konzentriert und Glycerin als Stabilisierungsmittel zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin eine oder mehrere Aminopeptidasen aus dem Fermentationsbrühenfiltrat abgetrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der eingesetzte Aspergillus-niger-Stamm NRRL 3112 oder CBS 115.39 ist.
Enzympräparat mit einem Gehalt an Aspergillus-niger-Aminopeptidaseaktivität, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Aminopeptidaseaktivität mindestens das Zehnfache der Endoproteaseaktivität beträgt sowie die Phenylalaninaminopeptidaseaktivität den Hauptteil der Aminopeptidaseaktivität bereitstellt.
Präparat nach Anspruch 5, das ein Fermentationsbrühenfiltrat oder ein flüssiges Konzentrat hiervon ist, gegebenenfalls mit einem Zusatz von Glycerin als Stabilisierungsmittel.
Präparat nach Anspruch 5 oder 6, worin die Aminopeptidaseaktivität mindestens das 30fache der Endoproteaseaktivität beträgt.
Zusammensetzung, enthaltend das Enzympräparat nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und ein Koagulierungsmittel in Form einer Protease, vorzugsweise einer Säureprotease, insbesondere einer mikrobiellen Säureprotease, zum Beispiel abgeleitet von Mucor oder Endothia, eine tierische Protease, eine pflanzliche Protease oder eine aus einer Fermentation stammende Protease, zum Beispiel Chymosin, ist.
Zusammensetzung, enthaltend das Enzympräparat nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und eine neutrale Protease, die vorzugsweise von einem Bacillus, insbesondere von Bacillus subtilis, stammt.
Medium zum Herstellen einer Starterkultur für den Einsatz bei der Herstellung von fermentierten Nahrungsmittelprodukten, wie Joghurt, Käse und Wurst, mit einem Gehalt an dem Enzympräparat nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Verfahren zum Herstellen eines Kulturmediums für die mikrobiologische Vermehrung, wobei ein Hefeextrakt oder ein anderes Proteinmaterial mit dem Präparat nach einem der Ansprüche 5 bis 7 behandelt und das Kulturmedium durch Zusammenbringen des behandelten Hefeextrakts oder des anderen Proteinmaterials und anderer normaler Bestandteile eines Kulturmediums gebildet wird.
Verfahren zum Herstellen einer Starterkultur, welches das Wachstum einer ausgewählten Kultur auf einem Kulturmedium beinhaltet, das gemäß dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellt worden ist.
Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung von Nahrungsmittel- oder Futtermittelprodukten oder zur Herstellung von Produkten für den Einsatz bei der Herstellung von Nahrungsmittel- und Futtermittelprodukten oder zur Behandlung von Hefeextrakten oder anderen Proteinmaterialien.
Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9 oder eines Mediums zum Herstellen einer Starterkultur nach Anspruch 10 oder des Verfahrens zum Herstellen eines Kulturmediums nach Anspruch 11 für die Herstellung von Käse.
Verfahren zum Herstellen von Käse, vorzugsweise von Hartkäse der Schweizer Art, wobei ein Präparat nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9 eingesetzt wird.
Nahrungsmittelprodukt oder Zwischenprodukt für die Nahrungsmittelherstellung mit einem Gehalt an einem Präparat mit Aspergillus-niger-Aminopeptidaseaktivität nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Backwarenteig mit einem Gehalt an einem Präparat mit Aspergillus-niger-Aminopeptidaseaktivität nach einem der Ansprüche 5 bis 7.