-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Aminopeptidasen, ihre Herstellung
und ihre Verwendung für
gewerbliche Zwecke.
-
Die
Hydrolyse von Proteinen ist von großer Bedeutung, insbesondere
für die
Nahrungsmittelindustrie. Im allgemeinen handelt es sich dabei um
die Umwandlung von hochmolekularen Proteinen (z. B. Casein, Gluten,
Gelatine, Sojaprotein) in kleine Fragmente (Oligopeptide oder Aminosäuren). Diese
Transformationen können
unter stark sauren oder stark alkalischen Bedingungen durchgeführt werden,
die häufig
energieaufwändig
sind und die Verwendung von aggressiven Chemikalien erfordern.
-
Proteinabbauende
Enzyme werden bevorzugt, da sie die Umwelt weniger beeinträchtigen
und ihre Tätigkeit
unter milden Bedingungen ausüben
können,
was eine Razemisierung von Aminosäuren verhindert. Diese Enzyme
werden in Endoproteasen und Exopeptidasen eingeteilt. Endoproteasen
spalten hochmolekulare Proteine zu Oligopeptiden, während Exopeptidasen
Aminosäuren
aus hochmolekularen Proteinen oder Proteinfragmenten freisetzen.
-
Beide
Typen von Enzymen sind im allgemeinen erforderlich, um Proteinhydrolysate
zu erzeugen. Das endo/exo-Verhältnis
ist je nach Anwendungszweck zu variieren. Um eine starke Verflüssigung
eines komplexen Proteins zu erreichen, sind Endoenzyme erforderlich,
um den Hauptbeitrag für
die Hydrolyse zu erzielen. Umgekehrt werden zur Erzeugung von speziellen
Aminosäuren
oder Peptiden aus einem komplexen Protein ohne Zerstörung von
dessen physikalischen Eigenschaften (Elastizität, Schäumungsverhalten, Strukturbeschaffenheit)
Exoenzyme mit geringer Endoaktivität bevorzugt.
-
Zahlreiche
Mikroorganismen sind zur Erzeugung von Endoproteasen und Exopeptidasen
befähigt. Das
endo/exo-Verhältnis ist
hauptsächlich
von den Züchtungsbedingungen
(1-3) und der nachgeordneten
Bearbeitung (4) abhängig.
-
In
der Nahrungsmittelindustrie werden seit langem in breitem Umfang
Aspergilli verwendet, die somit in zahlreichen Ländern auf der ganzen Welt den
gesetzlichen Bestimmungen entsprechen. Unter Aspergilli stellt Aspergillus
niger die in der Nahrungsmittelindustrie am häufigsten verwendete Spezies
dar. Während
Endoprotease (5–7)
und Carboxypeptidase (8–10)
aus Aspergillus niger beschrieben wurden, ist die Erzeugung von
Aminopeptidase durch Aspergillus niger bisher nicht bekannt.
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt Aminopeptidasen ausgewählter Aspergillus
niger-Stämme
und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus entsprechenden Kulturen
von Aspergillus niger. Diese Aminopeptidasen weisen eine optimale
Aktivität
bei einem pH-wert im Bereich von 6–8 und bei einer Temperatur
im Bereich von 50–60 °C auf. Außerdem lassen
sich Aminopeptidasen, die im wesentlichen frei von Endoproteasen
sind, durch ausgewählte
Aspergillus niger-Stämme
unter geeigneten Züchtungsbedingungen
erzeugen. Unter dem Ausdruck "im
wesentlichen frei von Endoprotease" ist zu verstehen, dass keine nachweisbare
oder zumindest keine erhebliche Menge an Endoprotease vorliegt.
Somit wurde überraschenderweise
festgestellt, dass durch Züchtung
von ausgewählten
Aspergillus niger-Stämmen
ein Fermentationsbrühefiltrat
oder ein flüssiges
Konzentrat davon erhalten werden kann, das geringe Mengen an Endoprotease
enthält,
jedoch einen hohen Anteil an Aminopeptidase-Aktivität besitzt.
So weist ein zellfreies Präparat
von Aspergillus niger-Aminopeptidase eine mindestens 10-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität und vorzugsweise
eine mindestens 30-fach höhere Aminopeptidase-Aktivität im Vergleich
zur Endoprotease-Aktivität
auf, wobei Phenylalanin-aminopeptidase den Großteil der Aminopeptidase-Aktivität liefert.
-
Im
Hinblick auf kürzliche Änderungen
der Nomenklatur von schwarzen Aspergilli wird hier der Ausdruck
Aspergillus niger so definiert, dass er sämtliche (schwarzen) Aspergilli
umfasst, die in der Aspergillus niger-Gruppe gemäß der Definition von Raper
und Fennell (The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company,
Baltimore, (1965), S. 293–344)
auftreten. Gleichermaßen
nehmen wir auch für
die übrigen
Aspergillus-Spezies auf die Aspergillus-Gruppen gemäß der vorstehenden
Definition von Raper und Fenell Bezug, wobei sämtliche Spezies und Varianten,
die von diesen Autoren in einer bestimmten Gruppe aufgenommen worden
sind, umfasst werden.
-
Eine
Phenylalanin-aminopeptidase (Phe-AP) und eine Leucinaminopeptidase
(Leu-AP) wurde in derartigen Präparaten
identifiziert und charakterisiert, wobei die Phenylalaninaminopeptidase
den Großteil
der gesamten Aminopeptidase-Aktivität ausmacht.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sich die Erfindung auch auf
Präparate
von funktionellen Derivaten von Aspergillus niger-Aminopeptidasen
erstreckt, die im Vergleich zu ihrer Endoprotease-Aktivität eine mindestens
10-fach höhere
Aminopeptidase-Aktivität
aufweisen.
-
Somit
wird gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ein zellfreies Präparat von
Aspergillus niger-Aminopeptidase oder ein funktionelles Derivat
davon bereitgestellt, das im Vergleich zu seiner Endoprotease-Aktivität eine mindestens
10-fach höhere
Aminopeptidase-Aktivität
aufweist.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Herstellen eines derartigen Enzympräparats bereit, wobei das Verfahren
folgendes umfasst: ein Aspergillus niger-Stamm, der zur Bildung
einer Aminopeptidase befähigt
ist, z. B. Aspergillus niger NRRL 3112 oder Aspergillus niger CBS 115.39,
wird unter Bedingungen, bei denen in der Fermentationsbrühe Aminopeptidase
gebildet wird, gezüchtet,
die Fermentationsbrühe
wird filtriert und das Filtrat wird gegebenenfalls konzentriert,
z. B. durch Ultrafiltration (UF-Konzentration). Vorzugsweise schließt sich
an das Einengen der Fermentationsbrühe die Zugabe eines Stabilisierungsmittels,
z. B. Glycerin (z. B. in einer Menge von 50 % (Vol./Vol.)), an.
Gegebenenfalls können
eine oder mehrere Aminopeptidasen aus dem Filtrat der Fermentationsbrühe abgetrennt
werden. Die Aminopeptidase ist im wesentlichen zellfrei.
-
Ein
erfindungsgemäßes Aminopeptidase-Präparat eignet
sich für
verschiedene gewerbliche Anwendungszwecke. Beispielsweise kann ein
derartiges Präparat
in vorteilhafter Weise zur Herstellung von Backprodukten, wie Brot,
verwendet werden. 1 bis 100 Einheiten von Phe-AP und vorzugsweise
5 bis 50 Einheiten von Phe-AP pro 1 kg Teig führen zu einem verbesserten
Geschmack und Aroma der Backprodukte. Weitere Anwendungsmöglichkeiten
ergeben sich für
Nahrungs- und Futtermittel, wie die Reifung von Käse, für Proteinhydrolysate,
die Beseitigung von Bitterstoffen und die Erzeugung von Hefeextrakten.
-
Somit
werden gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung ein Nahrungsmittelprodukt oder ein
Futtermittelzwischenprodukt bereitgestellt, die ein Präparat von
Aspergillus niger-Aminopeptidase
oder ein funktionelles Derivat davon gemäß den vorstehenden Ausführungen
enthalten.
-
5
bis 500 Phe-AP und vorzugsweise 15 bis 250 Phe-AP pro 1 000 Liter
Milch führen
zu einer Verbesserung in Bezug auf Geschmack, Aroma, Konsistenz
und Struktur von Käse
in einem früheren
Stadium während
der Käsereifung.
-
Wir
haben festgestellt, dass Aminopeptidase zur Erzeugung von freien
Aminosäuren
in halbfestem Käse
befähigt
ist. Es wurde festgestellt, dass eine Enzymzusammensetzung, die
die Aminopeptidase in Verbindung mit saurer Protease, z. B. aus Mucor
miehei, enthält,
zur Bildung eines Käses
mit vermindertem Bittergeschmack befähigt ist.
-
Bei
der Käseherstellung
setzt Aminopeptidase zunächst
rasch hohe Mengen an freien Aminosäuren, die zur Bildung von Käsegeschmack
führen,
frei. Wir haben überraschenderweise
festgestellt, dass die anfängliche
Freisetzung der freien Aminosäuren
(vergl. Beispiel 5) zum Stillstand kam und nicht zur Bildung von überreifem
Käse führte. Dies
steht im Gegensatz zu einer Reihe von herkömmlichen Verfahren, bei denen durch
die Wirkung von proteolytischen Enzymen diese Freisetzung von Aminosäuren anhält und dadurch
eine übermäßige Reifung
erfolgen kann. Eine mögliche
Erklärung
für diese
anhaltende Freisetzung könnte
in einer kombinierten Wirkung von Endo- und Exoproteasen liegen.
-
Die
bei der Käseherstellung
verwendeten Koagulationsmittel üben
im allgemeinen eine entscheidende Rolle bei der Proteolyse während der
Reifung des Käses
aus, neben der von ihnen bewirkten Gerinnungsaktivität.
-
Herkömmlicherweise
handelt es sich bei sämtlichen
Koagulationsmitteln, die bei der Käseherstellung verwendet werden,
um Enzympräparate,
die eine hauptsächliche
enzymatische Aktivität
(Protease) in Verbindung mit einigen sekundären Enzymaktivitäten (im
allgemeinen ebenfalls Proteasen) besitzen, z. B. tierisches Lab,
in dem Chymosin und Pepsin vorwiegend für die Koagulationswirkung sowie
für, einen
Teil der Proteolyse in Käse
verantwortlich sind.
-
Entsprechendes
gilt für
mikrobielles Lab aus Mucor miehei und/oder Endothia parasitica.
Es ist tatsächlich
zu erwarten, dass der gleichzeitig auftretende bittere Geschmack
in Käsen,
die mit diesem Typ von Koagulationsmitteln hergestellt werden, von
deren sekundären
Enzymaktivitäten
abhängig
sein können.
-
Bei
der Käseherstellung
berücksichtigen
wissenschaftliche Versuche häufig
nicht die Qualitätsvariationen
der Milch, die gewerblichen Käseherstellungsanlagen
zugeliefert wird. Die zugelieferte Milch kann leicht mit exogenen
Enzymsystemen verunreinigt sein, die von Kühen oder von verunreinigenden
Mikroorganismen stammen. Diese Verunreinigungen werden häufig in
unzureichendem Maße
durch Pasteurisierungsbehandlungen, die zur Behandlung von Milch
für die
Käsezubereitung
herangezogen werden, inaktiviert.
-
Versuche
zur Beschleunigung der Käsereifung
in gewerblichem Maßstab,
z. B. durch einfache Erhöhung
der Reifungstemperatur, sind oft mit dem Nachteil behaftet, dass
zwar in verstärktem
Maße ein
hochwertiger Geschmack für
Käse, der
aus einwandfreien Milchchargen gebildet wird, entsteht, dass aber
mangelhafte Milchchargen häufig
zu einer Verstärkung
von unangenehmen Beigeschmacksrichtungen führen, so dass insgesamt ein
negatives Ergebnis erzielt wird.
-
Der
Einfluss der vorerwähnten
Verunreinigungen auf die Parameter der Käseherstellung wird als einer der
Gründe
für diese
Veranlagung angesehen.
-
Die
sekundären
Aktivitäten
von koagulierenden Enzymen werden als teilweise verantwortlich für die Verstärkung der
in diesen Fällen
gebildeten unangenehmen Beigeschmacksrichtungen angesehen.
-
Die
Verwendung von herkömmlichen
und vorhandenen Gemischen von Enzymen für die beschleunigte Reifung,
d. h. invariable Gemische von rohen Endo- und Exopeptidasen, führt zu einem ähnlichen
und zusätzlichen
Risiko, das vermutlich sogar von den drei Möglichkeiten am größten ist.
-
Daher
wird vorzugsweise eine Aminopeptidase mit standardisierter Aktivität verwendet,
die frei von Endopeptidase-Aktivität ist, in Kombination mit einem
standardisierten Chymosin-Derivat, das durch Fermentation erhalten
worden ist, eine standardisierte und bekannte Endopeptidase-Aktivität aufweist
und frei von Pepsin und/oder anderen verunreinigenden Proteasen
ist.
-
Vorzugsweise
wird ferner eine neutrale Protease, insbesondere eine neutrale Protease
aus Bacillus und ganz besonders aus Bacillus subtilis, die eine
standardisierte Endopeptidase-Aktivität aufweist
und frei von sekundären
und Serinprotease-Aktivitäten
ist, zugesetzt. Mögliche
Wege zur Gewinnung einer gereinigten neutralen Protease sind ein
Einengungs- und Reinigungsverfahren, das von einer Fermentationsbrühe ausgeht,
die die neutrale Protease enthält.
Eine andere Möglichkeit
besteht in der Herstellung eines transformierten Wirts, wobei dieses
System für
die selektive Erzeugung des angestrebten Enzyms konzipiert ist.
-
Diese
Enzymzusammensetzungen ermöglichen
die Entwicklung eines Käseherstellungsverfahrens, bei
dem die Beschleunigung der Käsereifung
stattfindet und eine verringerte Gefahr der Bildung von unangenehmen
Nebengeschmacksrichtungen besteht, die mit gelegentlichen Fluktuationen
der Milchqualität
und zufälligen
Variationen des Käseherstellungsverfahrens
verbunden sind.
-
Es
wurde festgestellt, dass eine Enzymzusammensetzung, die mindestens
aus der Aminopeptidase und einer neutralen Protease besteht, dazu
befähigt
ist, einen hochwertigen, harten, reibfähigen Käse, der die Geschmacksrichtung
von Schweizer Käse
aufweist, zu erzeugen.
-
Diese
Enzymzusammensetzung ermöglicht
eine Strukturierung des Käsebruches
von hartgekochten Käsetypen
in der Weise, dass die Struktureigenschaften positiv modifiziert
werden.
-
Außerdem ermöglicht diese
Enzymzusammensetzung die Entwicklung eines modifizierten Herstellungsverfahrens
für harten
reibfähigen
Käse nach
Schweizer Art unter verkürzter
Reifungszeit.
-
Diese
Enzymzusammensetzung ermöglicht
bei Zugabe eines unspezifischen Koagulans die Entwicklung eines
Käseherstellungsverfahrens
zur Bildung von harten, gekochten Quarkkäsen, wobei der Feuchtigkeitsgehalt
erhöht
wird, ohne dass gleichzeitig die Struktur beeinträchtigt wird.
-
Die
zur Herstellung von fermentierten Produkten, wie Joghurt, Käse und Wurst,
verwendeten Starterkulturen verfügen über mehrere
intra- und extrazelluläre
Enzymsysteme, die unter anderem von proteolytischer und lipolytischer
Natur sind.
-
Diese
Enzymsysteme haben mindestens zwei Aufgaben:
- a)
sie dienen der Reproduktion und dem Wachstum und
- b) sie dienen der Fermentation und der Reifung der Nahrungsmittelprodukte.
-
In
gewissem Umfang fallen diese beiden Funktionen zusammen: die Aufnahme
von Kohlenhydraten und deren Abbau dient dem Wachstum, wobei aber
Milchsäure
zu den gebildeten Nebenprodukten gehört. Diese Milchsäure ist
vorwiegend für
die Säuerung
und Konservierung der fermentierten Nahrungsmittelprodukte verantwortlich.
-
Zur
Aufnahme von Aminosäuren
und Lipiden, die beide Bausteine für das Wachstum darstellen,
bedienen sich die Bakterien ihrer extrazellulären Enzyme, um diese Bausteine
aus den Medien, auf die sie inokuliert worden sind, d. h. z. B.
Milch oder Fleisch, freizusetzen. Die auf diese Weise in den Nahrungsmittelprodukten
stattfindenden Proteolyse- und Lipolysevorgänge tragen daher hauptsächlich zur
Reifung von Nahrungsmittelprodukten, wie Käse und Wurst, bei.
-
Herkömmliche
Erkenntnisse über
die Proteolyse und Lipolyse durch Starterkulturen beziehen sich
auf das Bedürfnis
nach einem ausgewogenen Satz von extrazellulären Enzymen, Zellhüllenzymen,
membrangebundenen Enzymen und intrazellulären Enzymen. Gemäß diesen
Theorien wird das gut ausgewogene Verhältnis dieser Enzymsysteme für die Bildung
ausreichender Mengen an SN (löslicher
Stickstoff) und AN (Aminosäurestickstoff)
als verantwortlich angesehen. Im Grunde führen Endopeptidase-Aktivitäten von
Lab, Starter und exogenen Enzymen zu einem raschen Abbau von Paracasein
in Käsequark
zu kleineren Peptiden.
-
Diese
kleineren Peptide werden anschließend durch aktive Starterzellen
in Aminosäuren
umgewandelt. Geschmacks- und Aromakomponenten werden sodann durch
zahlreiche komplizierte enzymatische und chemische Reaktionen gebildet.
-
Man
weiß relativ
gut darüber
Bescheid, dass die Lysis von Starterzellen eine Voraussetzung für die Erzeugung
von freien Aminosäuren
im Käse
ist.
-
Kürzlich wurde
gezeigt, dass die Lysis vorwiegend in sehr frühen Stadien der Käsereifung
stattfindet.
-
Wir
haben festgestellt, dass hochgradig proteolytische Starterbakterien,
die hauptsächlich
wegen ihrer raschen Säuerungseigenschaften
gewählt
werden, nicht leicht zu einer Lysis in jungem Käse führen und daher leicht den bitteren
Geschmack in altem Käse
verstärken,
was auf ihre verminderte Fähigkeit
zur Umwandlung von bitteren Peptiden zu Aminosäuren und auf ihre hohe proteolytische
Aktivität
in Käse
zurückzuführen ist.
-
Bei
der Herstellung eines Inokulums werden häufig nährstoffreiche Medien zur Erzielung
einer raschen Bakterienvermehrung verwendet. Diese Medien weisen
unter anderem einen hohen Anteil an sorgfältig ausgewählten, vermischten und/oder
vorbehandelten Proteinen, Hefeextrakten, Vitaminen und Mineralien
auf.
-
Wir
haben nunmehr festgestellt, dass sich ein verbessertes Kulturmedium
und ein Verfahren zu dessen Herstellung bei Verwendung von Hefeextrakten,
die mit der vorliegenden Aminopeptidase behandelt worden sind, ergeben.
Anstelle von Hefeextrakten können
auch andere Proteinquellen oder proteinhaltige Materialien (z. B.
Molke) verwendet werden. Bei Anwendung dieses neu entwickelten Kulturmediums
lässt sich auch
eine verbesserte Starterkultur erhalten.
-
Dies
beinhaltet die Entwicklung von rasch säuernden, fermentierten Milch-
und Käsekulturen
unter Verwendung von Medien mit einem Gehalt an mit Aminopeptidase
behandelten Proteinen und Hefeextrakten, wobei die damit verbundenen
Nachteile, z. B. der Bildung eines bitteren Geschmacks im Käse, vermieden
werden.
-
Die
Vorteile liegen in einer erhöhten
Kapazität
der Milchverarbeitung oder der Dosisverringerung der verwendeten
Kulturen und in einer verminderten Gefahr eines bitteren Geschmacks.
-
Der
Bedarf an freien Aminosäuren
für ein
rasches Wachstum in der Käsemilch
wird durch Zugabe von Aminopeptidase zur Käsemilch oder durch herkömmliche
Kulturen, die möglicherweise
in Kombination mit unserer speziell entwickelten Kultur eingesetzt
werden, befriedigt.
-
Somit
wird erfindungsgemäß eine verbesserte
Käsekultur
für die
Käseherstellung
sowie ein Verfahren zur Erzeugung und Vermehrung der Käsekultur
unter Verwendung der vorliegenden Aminopeptidase bei der Bildung
des Kulturmediums bereitgestellt.
-
Eine
Zusammensetzung, die Aminopeptidase, Chymosin und neutrale Protease
in Kombination mit den vorerwähnten
Starterkulturen umfasst, führt
zu einer standardisierten Herstellung von Käse. Der Vorteil besteht darin,
dass Schwankungen der Milchqualität und der Käseherstellungsbedingungen geringere
Einflüsse
auf die Reifung des Käses
haben.
-
Figurenbeschreibung
-
1 zeigt das pH-Profil von
Leucin-aminopeptidase aus Aspergillus niger.
-
2 zeigt das pH-Profil von
Phenylalanin-aminopeptidase aus Aspergillus niger.
-
3 zeigt das Temperaturprofil
beider Aminopeptidasen.
-
Bestimmung von enzymatischen
Aktivitäten
-
1. Phenylalanin-aminopeptidase
(Phe-AP)
-
Phenylalanin-p-nitroanilid
wurde in 7,5 mM HCl in einer Konzentration von 0,9 mM gelöst. 1 ml
dieser Substratlösung
wurden mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt.
Zum Zeitpunkt t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung
bei 20 °C
belassen. 15 Minuten später
wurde 1 ml 1 N HCl zugegeben. Ein Leerwert wurde mitgeführt, wobei
1 N HCl zum Zeitpunkt t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde
zur Ermittlung des Leerwerts (ODLW) und
des Testwerts (ODTest) bei 400 nm bestimmt.
Die Aktivität
wurde folgendermaßen
berechnet:
-
-
2. Leucin-aminopeptidase
(Leu-AP)
-
Leucin-p-nitroanilid
wurde in Wasser in einer Konzentration von 9 mM gelöst. 1 ml
dieser Substratlösung
wurde mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt.
Zum Zeitpunkt t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung
bei 20 °C
belassen. 1 ml 1 N HCl wurde 15 Minuten später zugegeben. Ein Leerwert
wurde mitgeführt,
wobei 1 N HCl zum Zeitpunkt t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde
für den
Leerwert (ODLW) und für den Test (ODTest)
bei 400 nm bestimmt. Die Aktivität
wurde folgendermaßen
berechnet:
-
-
3. Valin-aminopeptidase
(Val-AP)
-
Valin-p-nitroanilid
wurde in Wasser in einer Konzentration von 9 mM gelöst. 1 ml
dieser Substratlösung wurde
mit 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 vermischt. Zum Zeitpunkt
t=0 wurden 0,5 ml Enzym zugegeben und für die Umsetzung bei 20 °C belassen.
1 ml 1 N HCl wurde 15 Minuten später
zugegeben. Ein Leerwert wurde mitgeführt, wobei 1 N HCl zum Zeitpunkt
t=0 zugegeben wurde. Die optische Dichte wurde für den Leerwert (ODLW)
und für
den Test (ODTest) bei 400 nm bestimmt. Die
Aktivität
wurde folgendermaßen
berechnet:
-
-
4. Endoprotease (PU)
-
Diese
Aktivität
wurde durch 1-stündige
Hydrolyse von Casein beim pH-Wert 6,0 und bei 4 °C gemessen. 1 PU ist die Enzymmenge,
die zur Freisetzung des Äquivalents
von 1 μmol
Tyrosin pro Minute nach Fällung
der restlichen Proteine mit Trichloressigsäure erforderlich ist.
-
Beispiel 1
-
Screening von Aspergillus
niger-Stämmen
-
200
Aspergillus niger-Stämme,
die aus verschiedenen Quellen isoliert oder von Kultursammlungen
bezogen worden waren, wurden in einem Medium mit einem Gehalt an
15 g/Liter Kartoffelmehl, 20 g/Liter Bactopepton, 7 g/Liter Hefeextrakt,
4 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/Liter Magnesiumsulfat,
0,5 g/Liter Calciumchlorid und 0,5 g/Liter Zinkchlorid gezüchtet. Der
pH-Wert betrug 4,8. Nach einer 24-stündigen
Vorzüchtung
bei 30 °C
mit 240 U/min und einer 96- stündigen Züchtung bei
30 °C mit
275 U/min wurden die Überstände gewonnen
und auf die vorstehend beschriebene Weise einem Test ihrer Aktivität an Leucin-,
Phenylalanin- und Valin-aminopeptidase unterzogen. Mehrere Aspergillus
niger-Stämme zeigten
ein starkes Bildungspotential mindestens einer dieser enzymatischen
Aktivitäten,
wie in Tabelle 1 aufgeführt
ist (die einzelnen Werte stellen Mittelwerte für vier Einzelergebnisse dar):
-
-
Unter
den vorstehenden Stämmen
wurden die Stämme
1108 und 1502 aus einer Kultursammlung bezogen. Sie hatten die Hinterlegungsnummern
NRRL 3112 bzw. CBS 115.39. Der Stamm NRRL 3112 wurde für die Herstellung
von Amyloglucosidase, α-Amylase und Glucoamylase
verwendet. Der Stamm CBS 115.39 wurde für die Herstellung von Amylase
oder Lipase verwendet.
-
Beispiel 2
-
Herstellung von Exopeptidase
im Laboratoriuansmaßstab
-
Einige
Stämme
aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Screeningvorgang wurden in Laboratoriumsfermentern
(10 Liter). fermentiert. Die mit dem Stamm 1502 erhaltenen Ergebnisse
werden in diesem Beispiel vorgestellt.
-
Sporen
von Aspergillus niger Stamm Nr. 1502 wurden auf PDA-Platten nach 7- bis
10-tägiger
Inkubation bei 30 °C
gewonnen. Eine Inokulationsstufe wurde in einem Schüttelkolben
in einem Medium aus Glucose (20 g/Liter) und Maisquellflüssigkeit
(20 g/Liter) 24 Stunden beim pH-Wert 4,8 durchgeführt.
-
Die
Hauptfermentation wurde in einem absatzweisen Verfahren durchgeführt. Die
folgenden Nährstoffe
wurden verwendet: 100 g/Liter Maltodextrine, 40 g/Liter Sojamehl,
40 g/Liter hydrolysiertes Casein, 5 g/Liter Maisquellflüssigkeit,
2 g/Liter Gelatine, 2 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 1,3 g/Liter
Natriumnitrat, 1 g/Liter Ammoniumchlorid, 0,01 g/Liter Eisensulfat
und 0,5 g/Liter Antischaummittel.
-
Zunächst wurden
sämtliche
Nährstoffe
mit Ausnahme der Maltodextrine vermischt. Der pH-Wert wurde auf
4,8 ± 0,1
eingestellt. Anschließend
wurde der Fermenter 40 Minuten bei 125 °C sterilisiert. Die Maltodextrinlösung wurde
getrennt sterilisiert und dem sterilen, jedoch abgekühlten Fermentationsmedium
zugesetzt.
-
Die
Hauptfermentation wurde in einem Laboratoriumsfermenter durchgeführt, der
mit 6 Liter des vorstehend beschriebenen Mediums gefüllt war
und mit dem Inhalt des Inokulationskolbens beimpft wurde. Der Rührvorgang
und die Luftzufuhr wurden so eingestellt, dass die Konzentration
an gelöstem
Sauerstoff so hoch wie möglich
war. Die Temperatur wurde auf 30 °C
gehalten. Die Fermentation wurde gestoppt, nachdem sämtliche
Nährstoffe
verbraucht worden waren, d. h. nach etwa 130 Stunden.
-
Die
Fermentationsbrühe
wurde zur Entfernung sämtlicher
Mikroorganismen filtriert. Die Aktivitäten an Aminopeptidase und Endoprotease
wurden im Filtrat gemessen:
0,15 | Leu-AP/ml |
1,0 | Phe-AP/ml |
<0,05 | Val-AP/ml |
<0,1 | PU/ml |
-
Sodann
wurde eine Einengung durch Ultrafiltration durchgeführt, um
eine flüssige
Aminopeptidase zuzubereiten, wobei Glycerin (50 %) als Stabilisierungsmittel
verwendet wurde. Die erhaltene Lösung
wurde als "Peptidase
L2" bezeichnet.
Sie wies die folgenden Aktivitäten
auf:
0,5 | Leu-AP/ml |
3,2 | Phe-AP/ml |
<0,05 | Val-AP/ml |
<0,1 | PU/ml |
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der ausgewählte Aspergillus niger-Stamm
bei Züchtung
unter unseren ausgewählten
Bedingungen Aminopeptidasen erzeugt, ohne dass wesentliche Mengen
an Endoprotease entstehen.
-
Beispiel 3
-
pH-Profile
der enzymatischen Aktivitäten
-
Die
Leu-AP- und Phe-AP-Aktivitäten
wurden für
Peptidase L2 (vergl. Beispiel 2) unter Verwendung verschiedener
Puffer bestimmt, um einen pH-Bereich von 2,5 bis 9,0 zu untersuchen.
-
Das
pH-Profil von Leucin-aminopeptidase aus Aspergillus niger ist in 1 dargestellt.
-
Das
pH-Profil von Phenylalanin-aminopeptidase aus Aspergillus niger
ist in 2 dargestellt.
-
Die
Figuren zeigen, dass Leu-AP im pH-Bereich von 5 bis 8, 5 aktiv ist,
während
Phe-AP im pH-Bereich von 5, 5 bis 9 aktiv ist, was eine ähnliche
Situation wie bei Aminopeptidasen aus anderen Aspergillus-Spezies
darstellt.
-
Beispiel 4
-
Temperaturprofil der enzymatischen
Aktivitäten
-
Die
Leu-AP- und Phe-AP-Aktivitäten
wurden für
Peptidase L2 (vergl. Beispiel 2) unter Anwendung verschiedener Inkubationstemperaturen
bestimmt, um einen Temperaturbereich von 5 bis 70 °C zu untersuchen.
-
Die
erhaltenen Temperaturprofile sind in 3 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die einzelnen Enzyme unterschiedliche
optimale Temperaturen aufweisen, d. h. 50 °C für Leu-AP und 60 °C für Phe-AP.
-
Beispiel 5
-
Herstellung
von halbhartem Käse
im Laboratoriumsmaßstab
Normale Käsemilch
wurde mit Starterkulturen inokuliert. Eine Lab-Behandlung erfolgte
mit einer durchschnittlichen Dosis von tierischem Lab (1:15 000 MCU;
Kontrolle 1). Dem ersten experimentellen Ansatz von Milch wurden
25 Phe-AP-Einheiten pro 1 000 Liter Milch zugesetzt.
-
In
einem zweiten Versuch wurde das tierische Lab durch mikrobielles
Lab ersetzt, nämlich
durch saure Protease aus Mucor miehei. Der experimentelle Ansatz
enthielt ebenfalls 25 Phe-AP-Einheiten Aminopeptidase pro 1 000
Liter Milch.
-
Ein
dritter Versuch wurde gemäß Versuch
1 durchgeführt,
wobei die Aminopeptidase durch ein handelsübliches Enzympräparat aus
A. oryzae ersetzt wurde. Dieses Präparat weist eine Endopeptidase/Exopeptidase-Aktivität auf.
-
Die
Parameter der Käseherstellung
wurden bei sämtlichen
vier Käsechargen
entsprechend dem Verfahren zur Herstellung von halbhartem Käse eingehalten.
-
Nach
Einsalzen wurde der Käse
einer Reifung bei 8 °C
unterzogen.
-
Beim
Versuch 1 wurde im Verlauf der Reifung ein Unterschied der Geschmacks-
und Aromaentwicklung zwischen dem Versuchskäse und dem Kontrollkäse insofern
festgestellt, dass der Versuchskäse
nach 3 Wochen den Großteil
der erforderlichen organoleptischen Eigenschaften besaß, während der
Kontrollkäse
erst nach 6 Wochen eine ähnliche
Beschaffenheit erreicht hatte.
-
Der
Anteil an freien Aminosäuren
nach 3-wöchiger
Reifung war im Kontrollkäse
doppelt so hoch. Nach 6-wöchiger
Reifung ergaben sich wieder vergleichbare Werte. Dies lässt darauf
schließen,
dass das Produkt 3 Wochen früher
verkaufsfähig
ist, ohne dass die Käsequalität sinkt.
In diesem Versuch konnten wir zeigen, dass die Reifung durch die
anfängliche
Steigerung der Freisetzung von Aminosäuren beschleunigt werden kann,
ohne dass eine übermäßige Reifung
festgestellt wurde.
-
Beim
Versuch 2 unterschieden sich die organoleptischen Eigenschaften
der Käse
insofern, als der milde Käsegeschmack
mit einer leichten Tendenz zur Bitterkeit, der beim Kontrollkäse auftrat,
bei den Versuchskäsen
in Gegenwart von Aminopeptidase verschwand. Die Struktur des Käses war
ferner etwas glatter.
-
Die
Ergebnisse von Versuch 3 zeigten sowohl einen höheren Anteil an freien Aminosäuren und
gleichzeitig eine höhere
Bitterkeitsbewertung bei der organoleptischen Prüfung, was darauf hinweist,
dass die Endopeptidase-Aktivität
den bitteren Geschmack verstärkt.
-
Beispiel 6
-
Herstellung von Käse nach
Schweizer Art im Laboratoriumsmaßstab
-
Normale
Käsemilch
wurde mit Starterkulturen inokuliert und mit Koagulationsmittel
(saure Protease aus Endothia parasitica) versetzt.
-
Die
experimentelle Milchcharge wurde mit einem Enzymgemisch aus 9 000
Einheiten Endoprotease (neutrale Protease B 500) und 1 500 Phe-AP-Einheiten
von Aminopeptidase, berechnet auf 1 000 Liter Milch, versetzt.
-
Die
Parameter der Käseherstellung
wurden während
der restlichen Versuchsdauer gleich gehalten.
-
Nach
Einsalzen der Käse
wurden sie 20 Tage bei 13 °C
vorinkubiert, um die Struktur von Käsebruch zu erzielen. Anschließend wurde
eine weitere 35-tägige
Inkubation bei 19 °C
vorgenommen, um die Propionsäure-Fermentation
zu stimulieren.
-
Diese
Ergebnisse zeigten überraschenderweise
das Fehlen eines bitteren Geschmacks, der einen bekannten Nachteil
bei der Verwendung dieser neutralen Protease bei der Käseherstellung
darstellt und das Fehlen von Löchern
(Augen), wobei sich jedoch hochwertige und typische Geschmacks-
und Aromanoten entwickelten. Man erhielt einen hochwertigen reibfähigen Käse mit hervorragenden
Schmelzeigenschaften bei einem geringeren Anteil an Trockenbestandteilen
des Käses:
60,5 % im Kontrollkäse
gegenüber
57,8 % im Versuchskäse.
-
Eine
Wiederholung dieses Versuchs wurde vorgenommen, wobei das Koagulationsmittel
durch FromaseR ersetzt wurde und die Vorinkubation
10 Tage bei 13 °C
sowie die Inkubation 20 Tage bei 19 °C vorgenommen wurden. Die gesamte
Reifungszeit wurde halbiert.
-
Die
Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind weitgehend mit denen der ersten
Versuchsreihe vergleichbar.
-
Literatur
-
- (1) HAYASHI,K.; CUFFE, A.S.; LAW, B.A. J. Jpn Soc. Food
Sci. Technol. (1990), 37 (9) 737–739
- (2) CASTANEDA R.; VASSAL L.; GRIPON, J.C.; ROUSSEAU, M. Neth.
Milk Dairy J. (1990) 44 (2) 49–64
- (3) STEVENS, L. Biochem. Soc. Trans (1985) 13 (2) 283–285
- (4) TURKOVA, J.; VALENTOVA, 0.; COUPER, J. Biochim Biophys.
Acta (1976) 424 (2) 309–315
- (5) KOAZE, Y.; GOI, H.; EZAWA. K; YAMADA, Y.; HARA, T. Agr.
Biol. Chem. (1964) 28 (4) 216–223
- (6) STEVENS, L; HULEA, S.A.; DUNCAN, D; VASU, S.; BRAD, I. Revue
roumaine de Biochimie (1981) 18 (1) 63–66
- (7) BOSMANN, H.B. Biochim, Biophys, Acta (1973) 293 476–489
- (8) DAL DEGAN, F.; RIBADEU-DUMAS, B.; BREDDAM, K. Appl. Environm.
Microb. (1992) 58, 2144–2152
- (9} KUMAGAI, I.; YAMASAKi, M. Biochim. Biophys, Acta (1981)
659. 344–350
- (10) KUMAGAI, I.; YAMASAKi, M. Biochim. Biophys, Acta (1981)
659, 334–343