DE2705878A1

DE2705878A1 - Verfahren zur foerderung der milchsekretion bei tieren

Info

Publication number: DE2705878A1
Application number: DE2705878A
Authority: DE
Inventors: Minoru Murata; Naoyuki Unno; Mutsuyuki Yoshino
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-02-12
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1977-08-25
Also published as: DE2705878C3; DK60477A; JPS5832575B2; JPS5298171A; US4144354A; AU2209977A; DE2705878B2; NZ183323A

Description

Die Erfindung betrifft ein Enzympräparat, mit dessen Hilfe die Milchsekretion und die Milchqualität bei Tieren erhöht werden kann. Tierische Milch, insbesondere von Eühen, wird als Nahrungsmittel hoch geschätzt. Euhmilch dient als Ausgangsprodukt zur Herstellung einer Reihe von Molkereiprodukten, wie Trockenmilch, Batter, Ease und dergl. Außerdem kann sie direkt als Getränk dienen. In der modernen Ernährung spielt Milch eine wichtige Bolle.

Unter genetischen, ernährungswissenschaftlichen und tiermedizinischen Gesichtspunkten wurden in der Milchviehhaltung eine Reihe von Versuchen unternommen, die Milchsekretion und die Milchqualität zu erhöhen. Bei Tierzüchtern und Herstellern von Molkereiprodukten besteht aber immer noch das Bedürfnis nach einer weiteren Steigerung der Milchsekretion und einer Erhöhung

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der Milchqualität.

Es wurde erfindungsgeinäß festgestellt, daß sich die Milchproduktion bei Tieren verbessern läßt, wenn man diesen ein Enzympräparat verabfolgt, das durch Züchten von Basidiomyceten der Gattung Irpex erhalten worden ist. Durch die Verabfolgung dieses Enzympräparats wird die Milchsekretion gefördert und die Milchqualität verbessert.

Dieses Enzympräparat weist die Aktivitäten folgender Enzyme auf: Cellulase, Laminarinase, Xylanase, Pectinase, Dextranase, Amylase und Protease.

In der modernen Tierhaltung werden Tieren mit einem Magen, wie Schweinen, Hühnern, Pferden und dergl., häufig Enzyme verabreicht, um die Futterverwertung zu verbessern und die Verdauung zu fördern. Auch bei der Milchviehhaltung ist die Verwendung von Enzymen zur Herstellung von Molkereiprodukten geläufig. Es wurde jedoch bisher noch nicht versucht, Tieren Enzyme zu verabfolgen, um die Milchsekretion zu erhöhen und die Milchqualität zu verbessern. Soweit ersichtlich, wird diese Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren erstmals gelöst.

Erfindungsgemäß kann die Menge der Milchausscheidung, der Anteil an Milchfett und festen Nichtfettbestandteilen erhöht werden, indem man den Tieren ein Enzympräparat mit den Aktivitäten der Enzyme Cellulase, Laminarinase, Xylanase, Pectinase,

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Dextranase, Amylase und Protease verabfolgt, das durch Züchtung von Basidiomyceten der Gattung Irpex erhalten worden ist.

Durch Verabfolgung des erfindungsgemäßen Enzympräparats läßt sich bei Milchtieren, wie Kühen, Ziegen, Schafen und dergl., eine starke Wirkung erzielen.

Das erfindungsgemäß verwendete Enzympräparat läßt sich durch Züchten von Stämmen der Gattung Irpex in einem festen oder
flüssigen Medium erhalten.

Beispiele für bevorzugte Stämme dieser Gattung sind Irpex lacteus FERM-P 1009, NRRL 11063 und Irpex lacteus ATCC 20123.

Irpex lacteus FERM-P 1009, NRRL 11063 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science Technology, 1-8-5, Inage Higashi, Chiba-shi, Chiba-ken, Japan und beim
Northern Regional Research Laboratory, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604-, V.St.A., hinterlegt. Der Stamm Irpex lacteus ATCC 20123 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme dieser Gattungen sind in "Genshoku Nippon Kinrui Zukan" (Enzyklopädie der japanischen Mikroorganismen), Bd. 1, 1957, Hrsg. Hoiku-sha, beschrieben.

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Das Verfahren zur Züchtung von Basidiomyceten ist "beispielsweise in Journal of Fermentation Technology, Japan, Bd. 50 (1972), S. 691 bis 697 beschrieben und dem Fachmann an sich geläufig. Dieses Verfahren wird nachstehend erläutert.

Es können synthetische oder natürliche Nährmedien verwendet werden, sofern sie eine entsprechende Hauptkohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthalten. Als Hauptkohlenstoffquelle, können sie Kohlenhydrate, wie Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose, Maltose, Rohrzuckermelassen (blackstrap molasses) und Stärkehydrolysate, sowie Materialien, wie Holzhydrolysate, Cellulose, Sägemehl und Pulpenschnitzel, enthalten. Diese Kohlenstoffquellen können entweder allein oder im Gemisch aus zwei oder mehr dieser Produkte eingesetzt werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat sowie natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Hefe, lösliche Fischprodukte, Reiskleienextrakt und lösliche Produkte, die bei der Alkoholdestillation anfallen. Beispiele für anorganische Verbindungen sind Magnesiumsulfat, Natriumpho sphat, Kai iumdihydrogenpho sphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid und Natriumchlorid. Ferner kann das Medium mit Vitaminen, wachstumsfördernden Substanzen, beispielsweise Biotin und Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, versetzt werden.

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Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von vorzugsweise 25 bis 35⁰C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird während der Züchtung im Bereich von 2 bis 7 gehalten. Im allgemeinen beträgt die Züchtungsdauer 2 bis 10 Tage.

Das Enzympräparat wird im allgemeinen aus einer Enzymlösung hergestellt, die nach dem Entfernen der Zellen von einer Gärbrühe erhalten worden ist. Dazu bedient man sich herkömmlicher Verfahren zur Reinigung von Enzymen, wie Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Eindampfen unter vermindertem Druck und Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern.

Es können aber auch die nach der Züchtung im Medium erhaltenen Zellen, das KuIturfiltrat oder ähnliche Produkte direkt als Enzymquelle ohne weitere Behandlung verwendet werden.

Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Enzympräparat weist folgende Enzymaktivitäten auf:

Enzym	Substrat	r/mg-Std.	Aktivität
Cellulase	Filterpapier u/g	r/mg-Std.	20 000 - 40 000
Xylanase	Xylan	r/mg-Std.	1600 - 3400
Dextranase	Dextrin	u/mg	10 - 120
Laminarinase	Laminarin	u/mg	2000 - 4600
Amylase	Stärke	%/O,3 mg	4-15
Protease	Casein	2-20
Pectinase	Pectin	26-81

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r: Menge an reduziertem Zucker (wie Glucose), die innerhalb 1 Stunde durch 1 mg des Enzyms gebildet wird.

Die Enzymaktivitäten werden folgendermaßen gemessen: I. Messung; der Cellulase-Aktivität Verfahren

Verdünnte Enzymlösung *1

£ 2 Stücke Filterpapier *2

L-Reagenzglas *3

Schütteln bei 40⁰C im Monod-Inkubator *4

Messung der Zeit, die zum vollständigen Zerfall des Filterpapiers erforderlich ist (min) *5

Berechnung

Die Aktivität wird in Einheiten angegeben. 10 000 Einheiten sind als die Enzymmenge definiert, die das Filterpapier . innerhalb 1 Minute vollständig zerfallen läßt. Die Aktivität wird nach nachstehender Gleichung berechnet::

Aktivität (u/g) - 25_000_ _χ 1000

durchschnittliche Erobenmenge in Zerfallszeit (min) 5 ml der verdünnten

Enzymlösung (mg)

*1 Verdünnte Enzymlösung: Eine entsprechende Menge der Probe wird in 0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5 gelöst, so daß die durchschnittliche Zerfallszeit etwa 60 Minuten beträgt. Bei der Verwendung einer Enzymlösung mit einer Konzentration von 200 u/5 ml zerfällt das Filterpapier in 50 Minuten. Die Puffer-

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lösung ohne Enzym wird als Kontrolle verwendet. •2 Toyo Roshi Nr. 51 Spezial (zum Messen der Cellulaseaktivitat mittels der Zerfallsgeschwindigkeit von Filterpapier); Abmessungen 1 cm χ 1 cm.

*3 L-Reagenzglas: Innendurchmesser 17 bis 18 π™» senkrechter Abschnitt 75 bis 76 mm hoch, horizontaler Abschnitt I50 mm lang.

*4 Monod-Inkubator: 60 Schüttelbewegungen pro Minute mit einem Ausschlag von 4 cm.

*5 Durchschnittliche Zerfallszeit: 5 Reagenzgläser mit den entsprechenden Proben werden gleichzeitig dem Versuch unterworfen. Die längste und die kürzeste Zerfallszeit werden gestrichen und aus den restlichen Zerfallszeiten wird der Mittelwert bestimmt.

Zur Bestimmung der Aktivität einer Flüssigkeit wird zur Berechnung das Volumen in ml anstelle des Gewichts in g herangezogen. Die Aktivität wird als u/ml angegeben.

II. Messung der Laminarinase-Aktivität Verfahren 2,5p ro ζ ent ige Lösung von Laminarin in V/asser: 1 ml

0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5: 3 ml

,<= verdünnte Enzymlösung: 1 ml *1

Inkubationszeit bei '+O⁰C : 60 min

Abbruch der Reaktion durch 5-minütiges Eintauchen in siedendes Wasser

Bestimmung des reduzierenden Zuckers in der Reaktionslösung 709834/0683

Zur Kontrolle wird anstelle der verdünnten Enzymlösung Puffer eingesetzt.

Berechnung

Die Enzymaktivitat wird als die Menge (r) an reduziertem Zucker wiedergegeben, der innerhalb von 60 Minuten durch Λ mg Enzym gebildet wird.

Reduzierter Zucker Reduzierter Zucker Durch das Enzym rein der Reaktions- - in der Kontroll- = duzierter Zucker in lösung lösung der Reaktionslösung

(r)

Nach Division durch die Enzymmenge in mg und durch die Zeit in Stunden, erhält man den Wert für die Enzymaktivitat.

*1 Das Enzym wird in 0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5 gelöst.

III. Messung der Dextranase-Aktivität

Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinase-Aktivität durchgeführt, wobei als Substrat eine 2,5prozentige Dextrinlösung in Wasser verwendet wird.

IV. Messung der Xylanase-Aktivität

Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinase-Aktivität durchgeführt, wobei eine 2,5prozentige Xylanlösung in Wasser als Substrat verwendet wird.

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V. Messung der Pektinase-Aktivität Viskositäts-Depressionsmethode Verfahren

Ostwald-Viskosimeter

Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5: 2 ml 2prozentige Pectinlösung: 2 ml *1

10-minütiges Vorerwärmen auf 40⁰C *2

verdünnte Enzymlösung: 1 ml *3

10-minütige Inkubation bei 40°C, anschließend Messung der Viskosität (see)

Berechnung

Die Aktivität wird wiedergegeben als die prozentuale Viskositätserniedrigung pro Einheitsmenge des verwendeten Enzyms.

—— χ 100 % / verwendete Enzymmenge; Vo - Vw

Vo: Durchlaufzeit (see) für eine Flüssigkeit, die anstelle

der Enzymlösung entmineralisiertes Wasser enthält. Vt: Durchlaufzeit für eine Lösung, 10 Minuten nach der Zugabe der Enzymlösung.

Vw: Durchlaufzeit für entmineralisiertes Wasser. *1: 2prozentige Pectinlösung in Wasser.
*2: Zur Viskositätsmessung muß großer Wert auf die Vorerwärmung

gelegt werden.
*3: Das Enzym wird in 0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4,5 gelöst,

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VI. Messung der Amylase-Aktivität

Die Messung der Amylase-Aktivität ist in Method of Enzymatic Analysis , Bd. 1 (1974), S.432, Academic Press, New York, beschrieben.

Testgemisch *1

4"

5-minütiges Erwärmen im siedenden Wasserbad

Abkühlen

'■ Zugabe von 10,00 ml destilliertem Wasser

Ablesen der Extinktion bei 546 nm (Quecksilberlinie) gegen einen Leerwert.

*1: 0,50 ml Stärkelösung (10 mg Stärke/ml in 20 milliicolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 ö^millimolar NaCl) 0,48 ml destilliertes Wasser
0,02 ml Enzymlösung in destilliertem Wasser 1,00 ml Farbreagenz (1g 3,5-Dinitrosalicylsäure in 20 ml 2 η NaOH, 30 g Kaliumnatriumtartrat, destilliertes Wasser auf 100 ml).

VII. Messung der Protease-Aktivität

Die Protease-Aktivität wird nach dem Casein-Folin-Verfahren gemäß "Koso Kenkyu Method" (Verfahren in der Enzymforschung), Bd. 2 (1956), S. 237 bis 246, gemessen.

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Driselase (Handelsprodukt der Firma Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), ein durch Züchten von Basidiomyceten der Art Irpex lacteus erhaltenenes Enzympräparat, das in Japan auf dem Markt ist, kann als erfindungsgemäße Enzymquelle und somit als erfindungsgemäßer Futterzusatz verwendet werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Enzympräparat direkt verabfolgt werden. Im allgemeinen wird es aber im Gemisch mit Futter gegeben.

Die wirksame Menge des zu verabfolgenden Enzympräparats besteht aus einer oder mehreren Einheiten, bezogen auf die Cellulase-Aktivität, pro 1 g Trockenmasse des Futters. Vorzugsweise werden 2 bis 6 Einheiten des Enzympräparats, bezogen auf die Cellulase-Aktivität, pro 1 g Futtertrockenmasse, verwendet.

2 oder 3 Tage nach Beginn der Verabreichung beginnt die Milchsekretion zu steigen. Bei fortdauernder Verabfolgung des Enzympräparats bleibt die hohe Milchsekretion erhalten. Dies gilt auch bis zu einem Zeitraum von 2 oder 3 Tagen nach dem Ende der Verabreichung. Demgemäß soll das Enzympräparat mindestens an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verabfolgt werden.

Bei Verabfolgung des erfindungsgemäßen Enzympräparats an Milchkühe steigt die Milchsekretion um 8 bis 12 Prozent, die Menge an festen Nichtfettbestandteilen um etwa 3 Prozent und die Milchfettmenge um etwa 5 Prozent.

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Die nachstehenden Beispiele erläutern die Wirkung bei der Verabfolgung des erfindungsgemäßen Enzympräparats. Versuch 1

Putter von gleichbleibender, feststehender Zusammensetzung (nachstehend als Standardfutter bezeichnet) wird während einer Vorbereitungszeit von 10 Tagen an 10 Holstein-Milchkühe gegeben. Dabei werden pro Tier und Tag etwa 15 kg Trockenbestandteile verfüttert, die sich aus 5 kg Grünfutter, 3 kg Stroh, 3 kg Heuwürfel, 2 kg Rübenbrei, 7 kg Bohnen und Bohnenabfall, 5,5 kg gepreßte Gerste, 1 kg Weizenkleie und 1,5 kg Sojabohnenmehl zusammensetzen. Die Menge an Milch, festen Nichtfettbestandteilen und Milchfett wird während dieser Zeit gemessen. Anschließend erhalten die Kühe 30 Tage lang das Standardfutter, das pro Tier und Tag mit 30 g Driselase mit einer Cellulase-Aktivität von 1000 Einheiten/ g versetzt wird. Diese Driselase weist ferner folgende Enzymaktivitäten auf: Xylanase 120 r/mg-Std., Dextranase 4 r/mg-Std., Laminarinase 100 r/mg-Std., Amylase 0,5 u/mg, Protease 0,5 u/mg und Pectinase 2,5 Prozent/0,3 mg. Auch während dieser Zeit wird die Menge an Milch, festen Nichtfettbestandteilen und Milchfett gemessen. Anschließend erhalten die Tiere 20 Tage lang nur das Standaxdfutter, wobei wieder Milch, feste Nichtfettbestandteile und Milchfett gemessen werden. Die Mittelwerte der während dieser Zeit ermittelten Werte sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle I

Tage Anzahl der durch- Gehalt an Milch-Kühe schnittliche festen Nicht- fett-Milchleistung fettbestand- gehalt teilen

Vorbereitungszeit 10

Verabfolgung von Driselase 30

restliche Beobachtungszeit 20

10

17,4 kg 19,3 kg 17,7 kg

8,40

8,60 %

8,45 %

3,20 %

3,35

3,25

• Durchschnitt aus 9 Kühen, da eine Kuh ausfiel ** Durchschnitt aus 8 Kühen, da bei einer Kuh Verdacht auf eine Erkrankung (Mastitis) bestand.

Versuch 2

15 Milchkühe mit einer unterdurchschnittlichen Milchleistung werden aus einer Gruppe von erwachsenen Holstein-Weidekühen ausgewählt und in drei Gruppen von jeweils 5 Tieren dem nachstehenden Versuch unterworfen.

Die drei Gruppen A, B und C, die aus jeweils 5 Tieren bestehen, erhalten Futter und mit Enzym angereichertes Futter nach dem in der Tabelle II angegebenen Plan.

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Tabelle II

	1.-10. Tag	11.-25. Tag	26.-40. Tag	41.-55. Tag	56.-70. Tag	71.-80. Tag
Tage	Enzym zusatz kein Enzym zusatz A, B, C	A B,C	A, H C	B,C A	C A,B "	A,B,C

Pro Tag und Tier werden etwa 1? kg Trockenbestandteile verfüttert, die sich aus 6,5 kg gepreßtem Hafer, 1,6 kg Weizenkleie, 3,9 kg Mischfutter (Zenraku Nr. 2), 2,1 kg Heuwürfel und 5 kg zerkleinertem Reisstroh zusammensetzen. Als Enzymzusatz dienen 30 g der in Versuch 1 verwendeten Driselase pro Tag und Tier.

Während des Versuchs werden die Kühe gruppenweise 2 mal täglich jeweils morgens und abdends gemolken. Die durchschnittliche Milchleistung (kg) und der durchschnittliche Milchfettgehalt (%) pro Tier wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle III

Tage

1.-10.
Tag

17,3
(2j 90)

11.-25.
Tag

19, 2*
(3,15)

26.-40.
Tag

19,5
(3, 17)

41.-55.
Tag :

19,6
(3,12)

56.-70./ ^;
Tag

19,7
(3, 17)

Tag

A

17,4
(2, 92)

Enzym-
• zusatz

17,5
(:?, oo)

A

17,5
(2, 90)

A

19,3
(3, 10)

B

19,2
(3,14)
•

C

17,4
(2,92)

B

17,6
(3,04)

kein
Enzym-'
zusatz

A

17,4
(2, 92)

E

17, 3
2,91)

B

17,4
(2, 92)

C

17,8
(2, 96)

A

17,8
(3, 08)

C

17,5
(3_; 02)

η

C

A

B

C

* Die Zahlen in der oberen Reihe geben die Milchleistung in kg und die in runde
Klammern gesetzten Zahlen in der unteren Reihe den Milchfettgehalt in % an.

^J O CJl CD -O OP

Das nachstehende Beispiel erläutert die Herstellung des erfindungsgemäßen Enzympräparats.

Beispiel 1

Als Anzuchtstamm wird Irpex lacteus Nr. 82, NRRL 11063, FERM-P 1009 verwendet. Das Nährmedium enthält 40 g/Liter Rohrzucker, 30 g/Liter lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, 3 g/Liter pulverförmiges Hefeextrakt, 1 g/Liter KH₂PO₄ und 0,2 g/Liter MgSO₄ . 7HpO. Der pH-Wert dieses ersten Nährmediums vor der Sterilisation beträgt 4,0. Der Anzuchtstamm wird mit einer Öse auf 30 ml des vorgenannten ersten Anzuchtmediums, das sich in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet, überimpft. Anschließend wird 4 Tage bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet. Sodann werden 30 ml der auf diese Weise erhaltenen ersten Anzuchtkultur auf 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums überimpft, das sich in einen 2 Liter-Kolben befindet. Das zweite Anzuchtmedium weist die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium auf. Die zweite Züchtung wird 2 Tage bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Anschließend werden 300 ml der zweiten Anzuchtkultur auf 15 ml des Hauptmediums, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter befindet, überimpft. Das Hauptmedium enthält 20 g/Liter Cellulosepulver, 30 g/Liter Sojabohnenmehl, 5 g/Liter Ebios

f ■'■ .

(Handelsbezeichnung), 5 g/Liter KH₂PO₄ und 0,5 g/Liter MgSO₄.7H₂O. Vor der Sterilisation beträgt der pH-Wert dieses Hauptmediums 4,0. Die Züchtung wird unter Belüftung und Rühren (Drehzahl U/min, Belüftungsgeschwindigkeit I5 Liter/min) 3 Tage bei 28⁰C durchgeführt.

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Nach beendeter Züchtung wird die Cellulase-Aktivität des nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltenen Kulturfiltrats zu 600 u/ml bestimmt.

10 Liter dieses Filtrats werden mit 6,5 kg Ammoniumsulfat versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Sephadex G-25 behandelt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 150 g Enzympräparat mit folgenden Enzymaktivitäten:

Cellulase 23 000 u/g Xylanase 2800 r/mg-Std.

Laminarinase 2300 r/mg-Std.

Dextranase 80 r/mg-Std.

Amylase 14 u/mg

Protease 9 u/mg Pectinase 53 %/0,3 mg

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Claims

Patentansprüche

dadurch gekennzeichnet, daß man täglich eine wirksame Menge eines Enzympräparatε verabfolgt, das die Aktivitäten der Enzyme Cellulase, Laminarinase, Xylanase, Dextranase, Pectinase, Araylase und Protease aufweist und durch Züchten von Basidiomyceten der Gattung Irpex erhalten worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Präparat verwendet, das durch Züchtung von Irpex lacteus KRRL 11063 oder Irpex lacteus ATCC 20123 erhalten worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1,dad urch gekennzeichnet, daß man eine wirksame Menge des Enzympräparats verabfolgt, die mindestens eine Cellulase-Einheit pro 1 g Trockenbostandteile dec Futters enthält.

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