DE69726194T2 - Ds11 (kctc 02311bp), neuartiger bacillus sp. stamm und neue von diesem produzierte phytase - Google Patents

Ds11 (kctc 02311bp), neuartiger bacillus sp. stamm und neue von diesem produzierte phytase Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft eine neue, von einem neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP) produzierte Phytase und etwas genauer einen neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 und ein Phytaseenzym, das die Bioverfügbarkeit von Phosphat, das in Getreiden vorhanden ist, die monogastrischen Tieren verabreicht werden, verstärkt.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Phytase ist ein Enzym zum Abbau der Phytinsäure zu Phosphat und Inositolphosphat. 50 bis 70% des Phosphats in Getreide, das als Nahrungsmittel für Vieh verwendet wird, liegt in Form von Phytinsäure vor, aber die Phytase ist nicht in monogastrischen Tieren, wie z. B. Hühnern und Schweinen, vorhanden, was zu einer geringen Phosphatbioverfügbarkeit führt.
  • Daher wurde unverdaute Phytinsäure (Phytictaine), die in Gewässer freigesetzt wurde, eine der ernsten Umweltverschmutzungsquellen, die Eutrophierung in kleinen Seen oder Flüssen verursacht. Unter Berücksichtigung des Obenstehenden komplexiert Phytinsäure mit Wasser infolge von Chelatbildung mit Spuren von Mineralien, Aminosäuren und Vitaminen, welche sehr wichtig für den Stoffwechsel des Viehs sind, weil monogastrische Tiere in ihrem Darm keine Phytinsäure verwenden können. Diese wasserunlöslich ausgebildeten, nicht verdaubaren Chelat-Komplexe, die in die Faeces abgegeben werden, verändern das Ökosystem der Umwelt, wobei eine ernsthafte Umweltverschmutzung ausgelöst wird.
  • In Anbetracht dieser Umstände wird das Einbringen von Phytase in Nahrungsmittel für Vieh den Zusatz von anorganischem Phosphat infolge der Erhöhung der Phosphatbioverfügbarkeit in Vieh reduzieren, was zu wirtschaftlichen Gewinnen führt und die Verfügbarkeit von Phosphat und anderen biologisch aktiven Verbindungen verbessert, was zu einer Verringerung der Verschmutzung der Umwelt führt.
  • Aus diesen Gründen ist die Verwendung von Phytase in Vieh sehr wichtig. Ein Gesetz zur Regulierung der Phosphatmenge in Tierabfall wurde 1996 in Korea und in europäischen Ländern erlassen, und es ist mittlerweile verpflichtend, dem Nahrungsmittel von Tieren Phytase zuzusetzen.
  • Die Zugabe von Phytase zum Nahrungsmittel kann die Produktivität von Vieh durch die Verstärkung der Verfügbarkeit von einigen biologisch aktiven Substanzen (Phosphat, Calcium und Zink etc.) stark verbessern, welche ansonsten mit Phytictainen Chelatkomplexe ausbilden und ihre Aktivität verlieren.
  • Als Ergebnis kann die Verwendung von Futter, das Phytase enthält, bei Vieh die Verfügbarkeit des Futters verstärken und die durch Phosphat verursachte Verschmutzung der Umwelt vermindern.
  • Für die vorgenannten Vorteile wurden intensive Untersuchungen über die Phytase, einschließlich der Wirkungen der Phytase auf Tiere (L. G. Young et al., 1993, X. G. Lei of al., 1994, Z. Mroz et al., 1994) hauptsächlich in Europa durchgeführt (A. H. J. Ullah et al., 1994, K. C. Ehrich, 1994, C. S. Piddington, 1993). Da die Phytase lediglich eine begrenzte Anzahl von Phosphaten spalten kann und hauptsächlich von Hefen gebildet wird, die eine lange Wachstumsphase aufweisen, ist es hinsichtlich der Massenfertigung unwirtschaftlich. Zudem ist es schwierig, die Phytinsäure als einen Zusatzstoff für monogastrische Tiere zu verwenden, da es für ihre physiologischen Mechanismen ungeeignet ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Daher haben der Erfinder of al. einen neuartigen Phytase-produzierenden Mikroorganismus unter hundert Arten von Hefen, Actinomyceten, Bakterien etc. identifiziert, die aus Böden und Scheunen aus dem ganzen Land erhalten wurden, in der Bemühung, eine Phytase herzustellen, die ausgezeichnete enzymatische Wirksamkeit aufweist, und um die Herstellungszeit im Vergleich mit herkömmlicher Phytase zu verkürzen. Aufgrund der hohen enzymatischen Wirksamkeit dieses neuartigen Mikroorganismus und seiner physiologischen Eignung zur Verwendung für monogastrische Tiere und die kurze Produktionszeit im Vergleich zu der von herkömmlichen Enzymen, haben der Erfinder et al. eingeschätzt, daß dieses Enzym Neuheit aufweist, und sie haben diese Erfindung vollendet.
  • Die Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP) und ein neues Phytaseenzym bereitzustellen, welches zur Verwendung bei monogastrischen Tieren geeignet ist, mit ausgezeichneten Eigenschaften und einer kürzeren Herstellungsdauer.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Elektronenmikroskopaufnahme (X 10.000) des Stamms Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP), einem neuartigen Stamm gemäß dieser Erfindung.
  • 2 ist eine SDS-PAGE-Elektrophoreseanalyse einer neuen, von Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP) produzierten Phytase, A: Präzipitation von Aceton, B: Quelle S, C: Superose 12 HR 10/30.
  • 3 ist ein Diagramm der Messung der neuen, von Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231BP), einem neuen Stamm, hergestellten Phytase gemäß dem EXPERIMENTELLEN BEISPIEL 2 dieser Erfindung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft eine neue, von einem neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231BP) produzierte Phytase und im besonderen einen neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 und ein Phytaseenzym, das die Bioverfügbarkeit von Phosphat, das in Getreiden vorliegt, die an monogastrische Tiere verfüttert werden, verstärkt.
  • Diese Erfindung wird im einzelnen beschrieben wie untenstehend dargelegt:
  • Diese Erfindung betrifft den neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP).
  • Darüber hinaus umfaßt diese Erfindung dessen neues Enzym Phytase, dessen N-terminale Aminosäuresequenz unter den folgenden Bedingungen durch die folgende [Sequenz-Tabelle 1] dargestellt wird:
    Optimale Temperatur: 65°C
    Optimaler pH-Wert: 7,0
    Molekulargewicht: 43.000 Dalton
    Isoelektrischer Punkt: 5,6
  • Außerdem umfaßt diese Erfindung die Verwendung des besagten Mikroorganismus als Nahrungsmittelzusatz.
  • Diese Erfindung wird nachfolgend noch ausführlicher beschrieben:
  • Diese Erfindung betrifft einen neuartigen Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231BP) und die neue, von dem besagten Stamm produzierte Phytase. Das Verfahren der Isolierung und Identifizierung des besagten neuartigen Mikroorganismus ist folgendes:
  • [Isolierung von neuartigen Mikroorganismen]
  • Aus mehreren tausend Stämmen, die aus Böden und in Scheunen im ganzen Land erhalten wurden, wurde ein Stamm isoliert, der eine außergewöhnliche Auflösung auf einer Phytase-Screening-Platte aufwies, die 15 g D-Glucose, 5 g Calciumphytat, 5 g NH4NO3, 0,5 g MgSO4·7 H2O, 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,01 g MnSO4·4H2O und 15 g Agar bei pH 7,0 pro Liter enthielt.
  • [Identifizierung des neuartigen Mikroorganismus]
  • Die morphologische Eigenschaft des nach dem obenstehenden Verfahren isolierten Stamms ist wie folgt:
  • 1) Morphologische Eigenschaft
  • Im Gram-Färbetest des Stamms, der in einem optimalen Wachstumsmedium kultiviert wurde, wurde gezeigt, daß der Stamm Gram-positiv ist. 1, die elektronenmikroskopische Aufnahme, zeigt, daß der Stamm stäbchenförmig ist und 0,8–1,8 μm Zellgröße aufweist.
  • Im Wachstumstest der thermisch inaktivierten Zellen bei 80°C hat der Stamm thermostabile Sporen ausgebildet. Des weiteren zeigt sein Katalasetest, in welchem er eine positive Antwort zeigt, daß er mit der morphologischen Eigenschaft von Bacillus sp. übereinstimmt.
  • Die physiologische Eigenschaft des besagten Stamms ist wie folgt:
  • 2) Physiologische Eigenschaft
  • Die Testergebnisse der physiologischen Eigenschaft des Stamms sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt. Wie in der Tabelle 1 gezeigt, wird angenommen, daß der Stamm ein fakultativer Mikroorganismus ist, der sowohl in aeroben wie in anaeroben Zuständen angezogen werden kann. Mit dem Unterschied von angezogenen Stämmen, die bei 50°C und pH 5,7 gefunden wurden, ist der Stamm dieser Erfindung im Vergleich mit Bacillus pantothenticus ein von Bacillus pantothenticus abgeleiteter Mutant.
  • Tabelle 1
    Figure 00040001
  • Bemerkung:
    • +
    positiv,
    –
    negativ,
    d
    von der Art verschieden.
  • Die chemische Eigenschaft des wie oben erhaltenen Stamms ist wie folgt:
  • 3) Die chemische Eigenschaft des Stamms
  • Nach dem Ernten des Stamms sind die Testergebnisse seiner verschiedenen Eigenschaften (z. B. GC-Gehalt, Fettsäurezusammensetzung, Murein-Typ und Hauptmenachinon) in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.
  • Wie in obiger Tabelle 2 gezeigt, ist festzustellen, daß der Stamm gemäß dieser Erfindung hinsichtlich GC-Gehalt, Murein-Typ und Hauptmenachinon zu Bacillus pantothenticus ähnlich ist, einschließlich der Fettsäuren des Stamms, aber es erscheint schwierig, den Schluß zu ziehen, daß beide Stämme dieselbe Art sind. Daher scheint der Stamm dieser Erfindung ein von Bacillus pantothenticus abgeleiteter Mutant zu sein.
  • Tabelle 2
    Figure 00050001
  • Stellt man die oben erwähnten morphologischen, physiologischen und chemischen Eigenschaften zusammen, läßt sich erkennen, daß der Stamm dieser Erfindung zu Bacillus sp. aus "Bergys Manual of Systemic Bacteriology" Band 2 (Williams & Wilkins Co., 1989) gehört. Daher wurde der isolierte Mikroorganismus mit Bacillus sp. DS11 benannt und am 1. Februar 1996 am Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology mit der Zugangsnummer KCTC 0231 BP hinterlegt in der Korean Collection for Type Cultures der Koreanischen Gesellschaft der Patentstammhinterlegung, die sich in Nr. 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejeon 305–333, Republik Korea befindet.
  • Diese Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele noch ausführlicher beschrieben, allerdings sind die Ansprüche nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • BEISPIEL 1: Herstellung der neuen Phytase
  • Um Phytase herzustellen, wurde ein Medium, das 6% Weizenkleie, 0,04% NH2NO3, 0,02% MgSO4·7H2O, 1,0% Caseinhydrolysat, 0,05% KH2PO4, 0,04% K2HPO4 und 0,2% CaCl2 enthielt, auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert.
  • Dann wurde 1% in einer Flasche bei 37°C für 12 Stunden kultivierte Keimkultur mit der gleichen Medienzusammensetzung in das Medium inokuliert, um das Enzym herzustellen.
  • Die Wirksamkeit des hergestellten Enzyms wurde wie folgt gemessen: Unter Verwendung eines Substrats, das 2 mM Phytinsäure-Natriumsalze und 2 mM CaCl2 in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 7,0) enthielt, wurde das Enzym bei 37°C für 30 Minuten reagieren gelassen, um die Menge der gebildeten Phosphorsäure zu messen. Eine Einheit der enzymatischen Wirksamkeit ist äquivalent zu der enzymatischen Menge, die pro Minute 1 μM anorganisches Phosphat abbaut. Als ein Ergebnis der besagten Messung weist das neue Enzym eine enzymatische Wirksamkeit von 0,3 Einheiten pro mg Protein auf. Die maximale Menge an Enzym bei der Fermentation, die 0,6 Einheiten/mg ergab, wurde erhalten, wenn 30 l der Stämme, ein Arbeitsvolumen, in einen 50 l-Fermenter gefüllt und bei 37°C für 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen kultiviert wurden: Lufteinstrom – 0,8 vvm, Rührfrequenz – 150 U. p. M. Verglichen mit der enzymatischen Herstellungsmenge von 0,3 Einheiten/mg, wenn das Phytaseenzym von für 96 Stunden kultiviertem Aspergillus ficuum abgeleitet wird [Donna M. Gibson, 1987], ist gut zu beobachten, daß der neuartige Organismus dieser Erfindung eine zweifach höhere Herstellungsmenge aufweist.
  • EXPERIMENTELLES BEISPIEL 1: Messung des Molekulargewichts der neuen Phytase
  • 2 l Lösung des gemäß dem Verfahren wie in besagtem Beispiel beschrieben kultivierten neuartigen Stamms wurden für 15 Minuten zentrifugiert. Dann wurde die überstehende Lösung mit 50% Aceton gesättigt, um Proteine zu präzipitieren, und die durch eine Dialysemembran geleitete Rohenzym-Lösung wurde auf einer Säule, die Phenyl-Sepharose CL-4B, Resource S und Superose 12 HR 10/30 enthielt (all diese wurden von Pharmacia, Schweden, hergestellt) aufgereinigt, um so nur das Phytaseenzym zu isolieren. Die analytischen Ergebnisse der besagten Säule sind in der beigefügten Abbildung 2 dargestellt. Das Phytaseenzym wurde wieder in der SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert, und die Ergebnisse zeigen, daß das Molekulargewicht der durch einen neuartigen Stamm hergestellten Phytase 43.000 Dalton ist und der isoelektrische Punkt 5,6 ist.
  • Weiterhin wurde das so isolierte Enzymprotein verwendet, um die N-terminale Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Protein/Peptid-Sequenzierers (Applied Biosystems, USA) zu bestimmen, und die Ergebnisse sind im folgenden [Sequenztabelle] dargestellt.
  • Die Sequenz Nr. 1 der [Sequenztabelle] ist die N-terminale Aminosäuresequenz der von einem neuartigen Stamm dieser Erfindung hergestellten Phytase, die Sequenz Nr. 2 ist die N-terminale Aminosäuresequenz der von E. coli produzierten Phytase [Arch. Biochem. Biophys. 303 (1993)], die Sequenz Nr. 3 ist die N-terminale Aminosäuresequenz der von Aspergillus ficuum produzierten Phytase [Prep. Biochem. 18 (1988)].
  • Aus den Ergebnissen der [Sequenztabelle] ist zu erkennen, daß das von Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP) produzierte Phytaseenzym dieser Erfindung ein neues Enzym ist.
  • EXPERIMENTELLES BEISPIEL 2: Aktivität und Stabilität der neuen Phytase bezüglich Temperatur und pH-Wert
  • Es wurde gezeigt, daß die optimale Temperatur 65°C ist, indem das nach dem gleichen Verfahren wie im experimentellen Beispiel 2 beschrieben isolierte Enzym verwendet wurde. Um die Thermostabilität zu messen, wurde das Enzym bei jeder Temperatur für 10 Minuten belassen, um so die restliche Aktivität zu beurteilen. Wie in der beigefügten Abbildung 3(3-1) dargestellt, zeigen die Ergebnisse, daß die Aktivität bei 40°C abzunehmen begann, wenn kein Ca2+ zugegeben wurde, wohingegen im Falle des Zusatzes von 5 mM Calciumionen die Aktivität bis 70°C stabil war und bei 75°C 50% der Aktivität erhalten blieben.
  • Aus den zuvor genannten Ergebnissen kann erwartet werden, daß die neue Phytase dieser Erfindung im Körper des Viehs eine höhere Aktivität aufweist. Daher scheint es bevorzugt zu sein, daß die Nahrungsmittel bei über 75°C pelletiert oder extrudiert werden sollten, um sie so als Veredelte zu verwenden.
  • Die Ergebnisse der Phytaseaktivität bei verschiedenen pH-Wert-Bedingungen sind in der beigefügten Abbildung 3(3-2) dargestellt und der optimale pH-Wert war 7,0. Um des weiteren die pH-Wert-Stabilität zu messen, wurde das Enzym bei verschiedenen pH-Bedingungen für 1 Stunde belassen, um so die verbleibende Aktivität der Phytase zu beurteilen. Sogar unter sauren Bedingungen von einem pH-Wert unter 4 wurde für das Enzym gezeigt, daß es enzymatische Aktivität aufweist, und aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß die neue Phytase der Erfindung außerordentlich stabil unter der sauren Bedingung des Magens sein kann.
  • Aufgrund der vorgenannten Temperatur- und pH-Wert-Testergebnisse ist zu bemerken, daß die neue Phytase der Erfindung als Nahrungsmittelzusatz für monogastrische Tiere anwendbar sein kann.
  • EXPERIMENTELLES BEISPIEL 3: Einfluß von Metallion und Hemmstoff auf die Enzymaktivität
  • In der folgenden Tabelle 3 ist der Einfluß von Metallion und Hemmstoff auf die Enzymaktivität dargestellt.
  • Die Ergebnisse der Tabelle 3 z eigen, daß der Zusatz von 1 mM EDTA die Enzymaktivität vollständig hemmte und daß die Enzymaktivität um etwa 50% reduziert wurde, wenn Cu2+, Zn2+ und Mg2+ in einer Konzentration von 5 mM z gegeben wurden.
  • Tabelle 3
    Figure 00070001
  • EXPERIMENTELLES BEISPIEL 4: Einfluß von dem Futter von Hähnchen zugesetzter Phytase auf die Verschmutzung der Umwelt
  • Um das Einflußverhältnis von Verfügbarkeit und freigesetzten Mengen an Phosphat zu bestimmen, wenn Phytase zugegeben wird, wurden die Hähnchen in drei Gruppen aufgeteilt, wie die Gruppe mit neuer Phytase, die Gruppe mit aus Sojabohnen extrahierter pflanzlicher Phytase und die Gruppe mit Hefe-Phytase aus dem Handel (Hersteller: Sigma). Jedes der ausgeschlüpften 200 männlichen Avaachre-Brathühnchen-Hühner wurde für dieses Experiment öffentlich bekanntgegeben. Das kultivierte Medium, das Phytase enthielt, wurde ultrafiltriert und des weiteren bei niedriger Temperatur unter Vakuum konzentriert und im Gefriertrockner getrocknet. Jeweils 500 Einheiten dieser gefriergetrockneten Phytase wurden pro kg Futter zugesetzt. Die gleiche Menge an der oben genannten Sojabohnen-Phytase oder Hefe-Phytase wurde ebenso dem Futter zugesetzt und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 dargestellt.
  • Tabelle 4
    Figure 00080001
  • Die Ergebnisse der Tabelle 4 ließen erkennen, daß die freigesetzten Phosphatgehalte geringer waren, wenn die neue Phytase an die monogastrischen Tiere verfüttert wurde, als in der Sojabohnen-Gruppe oder der Hefe-Phytase-Gruppe, da die Phosphatverfügbarkeit bei der ersteren höher war als die der letzteren; und zwar war die Aktivität von neuer Phytase unter säurebeständigen und sauren Bedingungen überlegen, und Phytictain in den Getreiden wurde im Darm der Tiere durch die neue Phytase auf wirksamere Weise abgebaut.
  • [Sequenztabelle]
  • Sequenznr.: 1
    • Sequenzlänge: 15
    • Sequenzart: Aminosäure
    • Form: unverzweigte Kette
    • Sequenztyp: Protein
    • Sequenz: Ser-Asp-Pro-Tyr-His-Phe-Thr-Val-Asn-Ala-Ala-Xaa-Glu-Thr-Glu
  • Sequenznr.: 2
    • Sequenzlänge: 11
    • Sequenzart: Aminosäure
    • Form: unverzweigte Kette
    • Sequenztyp: Protein
    • Sequenz: Ser-Glu-Pro-Glu-Leu-Lys-Leu-GIu-Ala-Val-Val
  • Sequenznr.: 3
    • Sequenzlänge: 12
    • Sequenzart: Aminosäure
    • Form: unverzweigte Kette
    • Sequenztyp: Protein
    • Sequenz: Pro-Ala-Ser-Arg-x-Gin-Ser-Ser-Cys-Asp-Thr-Val

Claims (4)

  1. Stamm Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP).
  2. Verwendung des Stammes Bacillus sp. DS11 (KCTC 0231 BP) als Nahrungsmittelzusätze.
  3. Phytase, erhältlich von Bacillus sp. DS11, wie er in Patentanspruch 1 definiert ist und mit den folgenden Merkmalen: optimale Temperatur 65°C optimaler pH-Wert 7,0 Molekulargewicht 43.000 Dalton isoelektrischer Punkt 5,6 Sequenz der N-terminalen Aminosäuren Nr. 1 der [Sequenztabelle]
  4. Verwendung einer Phytase gemäß Patentanspruch 1 als ein Nahrungsmittelzusatz.
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