DE68915584T2

DE68915584T2 - Verfahren zur Herstellung von Difruktose-Dianhydrid III.

Info

Publication number: DE68915584T2
Application number: DE68915584T
Authority: DE
Inventors: Mishio Kawamura; Kuniji Tanaka; Takao Uchiyama
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2009-03-07
Also published as: EP0332108A2; DK107589D0; US5057418A; CA1329161C; EP0332108A3; EP0332108B1; JPH01225492A; DE68915584D1; DK107589A; KR890014018A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Difruktose- Dianhydrid III, nachfolgend als "DFA III" bezeichnet.

Beschreibung des Stands der Technik

DFA III ist ein Disaccharid mit der Struktur, in der zwei Moleküle Fructose unter Dehydration über 1-2'- und 2-3'-Bindungen kondensiert sind, und welches 1931 von Jackson et al. isoliert und identifiziert worden ist, Bur. stand. J. Res., 6, 709 (1931).
DFA III kann als kalorienarmer Süßstoff angesehen werden, da er in Tieren nicht metabolisiert noch vergärt wird, und es wird angenommen, daß er in der Zukunft für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich ist, einschließlich für die Verwendung in einer diätetischen Nahrung.
Jackson et al. (siehe oben) stellte DFA III durch saure Hydrolyse aus Inulin her, welch es ein hauptsächlich aus Fructose bestehendes Polysaccharid ist. Allerdings betrug die Ausbeute nicht mehr als etwa 2%. Somit ist das von ihnen angewandte Verfahren nicht sehr effizient.
Im Jahre 1972 stellten Tanaka et al. DFA III aus Inulin mit Hilfe eines Inulin-lytischen Enzyms her, das von Arthrobacter ureafaciens gebildet wurde, Biochim. Biophys. Acta, 284, 248 (1972). Allerdings ist dieses Enzym sehr temperaturempfindlich; es wird schnell oberhalb von 60ºC inaktiviert. Somit kann dieses Enzym für die industrielle Herstellung von DFA III nicht geeignet sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder haben große Anstrengungen unternommen, diese Probleme im Stand der Technik zu lösen, und sie haben herausgefunden, daß ein Inulin-lytisches Enzym, welches von einem zu Arthrobacter ilicis gehörenden Mikroorganismus ab stammt, verwendet werden kann, um DFA III effizient herzustellen, und sie haben herausgefunden, daß dieses Enzym eine im Vergleich zu den herkömmlichen hohe Stabilität gegenüber Wärme besitzt, was die Industriell effiziente kontinuierliche Herstellung von DFA III ermöglicht. Somit wurde die vorliegende Erfindung erhalten.
Demzufolge ist es ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zu Herstellung von DFA III bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindungist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, welches die kontinuierliche Industrielle Herstellung von DFA III ermöglicht.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Inulin-lytischen Enzyms, welches in effektiver Weise bei dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung von DFA III verwendet werden kann.
Ferner ist ein Ziel der Erfindung, einen Mikroorganismenstamm bereitzustellen, der zur Herstellung des Inulin-lytischen Enzyms in der Lage ist.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der genauen Beschreibung derselben, wie sie nachfolgend dargestellt ist, offensichtlich werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Difructose-Dianhydrid III (DFA III) bereitgestellt, welches das Umsetzen von Inulin mit einem Inulin-lytischen Enzym, das von einem zu Arthrobacter ilicis gehörenden Mikroorganismen abstammt, in einer Inulin enthaltenden Lösung umfaßt.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend genauer beschrieben.
Inulin-lytische Enzyme, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind von Mikroorganismen erhältlich, welche zu Arthrobacter ilicis gehören.
Solche zu Arthrobacter ilicis gehörenden Mikroorganismen können zum Beispiel Arthrobacter ilicis MCI 2297 einschließen, welcher am 25. Februar 1988 von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter der Zugangsnummer FERM-9893 hinterlegt wurde, welcher gemäß dem "Budapest Treaty" am 9. Februar 1989 in die Hinterlegungsnummer FERM BP-2279 umgewandelt wurde.
Der Arthrobacter ilicis MCI 2297, nachfolgend als "MCI 2297" bezeichnet, wurde durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung aus normaler Erde isoliert. Die mikrobiellen Eigenschaften des Stamms sind wie folgt zusammengefaßt:

1. Mikroskopische Eigenschaften

Eigenschaften der Kolonien, welche eine Woche lang im "Herzinfusionsagar"- Medium bei 30ºC kultiviert wurden

1) Kolonienform : runde Form
2) Größe : 2-3 mm im Durchmesser
3) Erhebung der Oberfläche : konvexe Krümmung in der Oberfläche
4) Oberflächenaussehen : glatte Oberfläche
5) Glanz : milchig
6) Farbe : gelblich-grau
7) Transparenz : durchscheinend
8) Peripherie gesamt

Morphologische Eigenschaften der Zellen, die 3-24 Stunden im "Herzinfusionsagar"-Medium bei 30ºC kultiviert wurden

1) Zellmorphologle: Zellen wachsen ungleichmäßig unter Bildung von langgezogenen Stäbchen während des anfänglichen Kulturzeltraums von bis zu etwa 6 bis 8 Stunden. Ein Septum wird dann im mittleren Bereich in der Zelle ausgebildet. Die Zellkrümmung und Zellteilung wird allmählich wiederholt. Nachdem 12 Stunden verstrichen sind, haben sich die meisten Zellen in einheitliche, kurze, stäbchenartige Gebilde umgewandelt.
2) Typ der Zellteilung: Biegetyp (Bending type)
3) Beweglichkeit: Ja
4) Sporenbildung : Nein
5) Gram-Färbung : Die Zellen zeigen eine starke Gram-positive Reaktion im frühen Stadium der Kultivierung; mit Fortschreiten der Zeit werden die Zellen allmählich Gram-negativ (das heißt Gram-variabel).
6) Säurebeständigkeit : Negativ

2. Physiologische Eigenschaften

1) Wachstum unter anaeroben Bedingungen
2) Wachstum an Luft
3) Catalase-Aktivität
4) Oxidase-Aktivität
5) O-F-Test
6) Reduktion von Nitratsalzen
7) Hydrolyse von Gelantine
8) Hydrolyse von Casein
9) Hydrolyse von Stärke
10) Nutzung von Chitin 11) Nutzung von Cellulose
12) Nutzung von Tween 20
13) Nutzung von Tween 60
14) Nutzung von Tween 80
15) Nutzung von Xanthin
16) Nutzung von Tyrosin
17) Herstellung von Indol
18) Methylrot-Reaktion
19) Urease-Aktivität
20) Phosphatase-Aktivität
21) DNase
22) V.P-Test
23) Wachstum in 5%iger Kochsalzlösung 24) Wachstum in 1%iger Kochsalzlösung
25) Wachstum bei 4ºC
10ºC
20ºC
26ºC
30ºC
37ºC

Nutzung von Kohlenhydraten (Herstellung von Säuren)

Ergebnisse einer 14-Tage-Kultur

Saccharid Stamm MCI 2297 A. ilicis DSM 20138

1) L-Mabinose
2) Xylose
3) Rhamnose
4) Glucose
5) Fructose
6) Mannose
7) Galactose
8) Sorbose
9) Saccharose
10) Lactose
11) Maltose
12) Trehalose
13) Cellobiose
14) Raffinose
15) Dextrin
16) Stärke
17) Inulin
18) Glycerin
19) Erythritol
20) Adonitol
21) Mannitol
22) Dulcitol
23) Sorbitol
24) Inositol
25) Arbutin
26) Aesculin
27) Salicin
28) Alpha-Methylglucosid

Nutzung von organischen Säuren

Organische Säure Stamm MC12297 A. ilicis DSM 20138

1) Essigsäure
2) Brenztraubensäure
3) L-Milchsäure
4) Äpfelsäure
5) Bernsteinsäure
6) Fumarsäure
7) Alpha-Ketoglutarsäure
8) Zitronensäure
9) Ameisensäure
10) Propionsäure
11) Buttersäure
12) Oxalsäure
13) Malonsäure
14) Adipinsäure
15) Pimelinsäure
16) Glykolsäure
17) Hippursäure
18) Harnsäure
19) Glutarsäure 3. Biochemische Eigenschaften Eigenschaften Stamm MCI 2297 GC-Gehalt in der DNA Hauptsächliche Aminosäure in der Zellwand Lysine Peptidoglycan-Typ Lys-Ala-Thr-Ala Hauptsächlich Zucker in der Zellwand Galactose Rhamnose Mannose Glycolat-Test Acetyl Hauptsächliches Menachinon

4. Taxonomische Identifizierung

1) Einteilung: Geschlecht

Der vorliegende Stamm, MCI 2297, ist ein Obligat aerober, der ein Stäbchen/Kokken-Polymorphismus im Zellzyklus zeigt, keine Säure aus Kohlenhydraten wie Glycose bildet und Lysin als eine hauptsächliche Aminosäure in der Zellwand besitzt. Somit hat sich der Stamm als zum Geschlecht Arthrobacter zugehörig herausgestellt, mit unregelmäßigem, keine Sporen bildenden, Gram-positiven Stäbchen, wie er in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2 beschrieben ist.

2) Einteilung, Spezies

Bisher wurden etwa 18 Spezies von Bakterien als zu dem Geschlecht Arthrobacter zugehörig gefunden. Diese Spezien wurden voneinander durch ihre physiologischen und biochemischen Eigenschaften unterschieden. Insbesondere werden die Unterschiede in der Menachinon-Zusammensetzung und in der vernetzenden Peptidstruktur und Zuckerzusammensetzung in deren Zellwänden als wichtiges Grundmerkmal für die Differenzierung der Spezien angesehen, K.H. Schleifer & O. Kandler, Bacteriol. Rev., Band 36, 404-477 (1972); Bergey's Manual Systematic Bacteriology, Band 2.
Der vorliegende Stamm MCI 2297 (a) enthält MK-9(H&sub2;) als hauptsächliches Menachinon; (b) besitzt die vernetzende Peptidstruktur Lys-Ala-Thr-Ala in der Zellwand; (c) enthält Galactose, Rhamnose und Mannose als hauptsächlichen Zucker In der Zellwand; und (d) Ist beweglich. Somit stimmen diese biochemischen und morphologischen Charakteristiken gut mit denen von Arthrobacter ilicis überein, wie in Bergey's Manual Systematic Bacteriology beschrieben.
Verschiedene physiologische und biochemische Eigenschaften, wie sie ursprünglich in M.D. Collins, Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. C2, 318- 323, (1981) beschrieben wurden, für den vorliegenden Stamm MCI 2297 wurden mit denen des Stammtypus Arthrobacter ilicis, DSM 20138 verglichen. Die Ergebnisse sind vorstehend gezeigt.
Der vorliegende Stamm MCI 2297 und der Typstamm A. ilicis waren ungefähr identisch zueinander, sowohl im Nutzungsmuster von Sacchariden und organischen Säuren als auch in den biochemischen Eigenschaften. Allerdings lagen einige Unterschiede in der Nutzung von Tween 20 und 60, Fructose und Saccharose, der Hydrolyse von Stärke und dem Wachstum bei 4ºC vor.
Diese Unterschiede sind vermutlich auf beliebige Unterschiede zwischen Stämmen einer einzelnen Spezies zurückzuführen, und sie werden nicht als inhärent und als charakteristisch für die Spezies angesehen. Deshalb wurden bei der vorliegenden Erfindung die oben angegebenen biochemischen Eigenschaften als Basis für die Identifikation der Spezies genommen. Somit wurde der vorliegende Stamm MCI 2297 als zu Arthrobacter ilicis gehörend identifiziert.
Bei der vorliegenden Erfindung kann der Stamm leicht durch Kultivierung in einem Medium vermehrt werden, das Nährstoffe enthält, die durch gewöhnliche Mikroorganismen nutzbar sind. Solche Nährstoffe können Glucose, dicken Malzsirup, Dextrin, Saccharose, Stärke, Molasse, tierisches und pflanzliches Öl einschließen. Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Malseinweichflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Harnstoff können ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls können Mineralsalze, die in der Lage sind, Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Kobalt, Chlorid, Phosphat, Sulfat und andere Ionen freizusetzen, in vorteilhafter Weise hinzugefügt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Inulin-lytisches Enzym, das aus einem zu den oben erwähnten Arthrobacter ilicis gehörenden Bakterium erhältlich Ist, mit einer Lösung kontaktiert, welche als einzige Kohlenstoffquelle entweder Inulin oder einen flüssigen Extrakt aus einer Pflanze mit einem hohen Inulingehalt, wie Jerusalem-Artischocke (Hellanthus tuberosus) und "Burdock" (Arctium lappa), enthält. Ein wie oben angegebenes Bakterium kann so wie es ist angewandt werden, oder es kann in alternativer Weise ein Inulin-lytisches Enzym aus dem Bakterium extrahiert und dann in der Reaktion eingesetzt werden.
Wenn ein solches Bakterium per se angewandt wird, wird das Bakterium in einem Kulturmedium, welches etwa 1 bis 10% Inulin als Kohlenstoffquelle enthält, inokkuliert und einer Schüttelkultivierung unterzogen. Das Medium kann ebenfalls eine Stickstoffquelle, wie zum Beispiel Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Maiseinweichflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat oder Harnstoff enthalten, und es kann gegebenenfalls Mineralsalze enthalten, die zur Freisetzung von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Kobalt, Chlorid, Phosphat. Sulfat und anderen Ionen in der Lage sind. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 37ºC, und die Zeitperiode der Schüttelkultivierung liegt im Bereich von 12 bis 40 Stunden. Die resultierende Kultur wird zur Entfernung der Bakterien zentrifugiert, und der Überstand wird zur Inaktivierung des Enzyms hitzebehandelt. Nach der Konzentrierung wird das Material chromatographiert, zum Beispiel auf einer aktiven Kohlenstoffsäule. Nach der Elution von Fructose mittels destilliertem Wasser wird die Elution mittels 5%iger wäßriger ethanolischer Lösung ausgeführt. Das während dieser Fraktionierung entstandene DFA III wird dann bis zur Trockne konzentriert.
Wenn ein wie oben beschriebenes Inulin-lytisches Enzym in der Reaktion angewandt wird, wird die durch die oben beschriebenen Arbeitsvorgänge erhaltene Kultur zuerst zur Entfernung der Bakterien zentrifugiert. Dem Filtrat wird 65%ige gesättigte Ammoniumsulfatlösung zur Aussalzung hinzugesetzt, und das resultierende Präzipitat wird mittels Zentrifugation gesammelt, in einer geringen Menge Wasser suspendiert und dialysiert, wodurch eine rohe Enzympräparation gebildet wird. Diese rohe Enzympräparation kann ebenfalls mit Inulin in zum Beispiel einem 0,01 bis 0,1M Phosphatpuffer bei pH 7,0 kontaktiert werden.
Die rohe Enzympräparation kann mittels Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Toyopearl 650M- oder SP-Toyopearl 650 M-Säule gereinigt werden, was zu einer Enzympräparation mit einer einzelnen elektrophoretischen Bande führt. Diese gereinigte Enzympräparation besaß einen optimalen pH von 5,5 und zeigte eine maximale Aktivität bei 60ºC. Allerdings wäre es in einem weiten pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 und bei einer Temperatur von bis zu 70ºC bei einer dreißigminütigen Hitzebehandlung stabil. Somit zeigt diese Enzympräparation eine hohe Temperaturstabilität.
Das Inulin-lytische Enzym, das aus einem zu Arthrobacter ilicis gehörendem Bakterium gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, stellt DFA III in guter Ausbeute her, und es ist gegenüber Wärme viel stabiler als herkömmliche Enzyme. Somit kann das Enzym der vorliegenden Erfindung für die kontinuierliche Herstellung von DFA III wirksam sein.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und nicht zur Beschränkung angegeben. Es versteht sich für den Fachmann, daß viele Variationen und Modifikationen bei den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gemacht werden können, ohne daß vom Wesen und Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie in den anhängigen Ansprüchen definiert ist, abgewichen wird.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium (150 ml), das 5%iges im Handel erhältliches Inulin, 0,02% Hefeextrakt, 0,2% Natriumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid, 0,05% Kaliumdihydrogenphosphat und 0.001% Eisen(III)-chlorid enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, wurde mittels Dampf bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde im Kolben mit einer an MCI 2297-Stamm vollen Platinöse inokuliert. Die inokulierte Lösung wurde 30 Stunden lang bei 30ºC auf einem Drehschüttler bei 160 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Nach der Kultivierung wurden die Zellen mittels Zentrifugation entfernt. Das resultierende Filtrat wurde 10 Minuten lang zur Inaktivierung der Enzyme wärmebehandelt und dann unter reduziertem Druck auf etwa 10 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde auf einer Säule adsorbiert, in welche 30 g aktiver Kohlenstoff und 60 g Celite Nr. 535 mittels destilliertem Wasser eingeführt worden waren; danach wurde mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen und mit 5%igem wäßrigen Ethanol eluiert.
Die eluierten Peaks wurden gesammelt und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, was zu DFA III führte. Die Ausbeute an DFA III betrug 10%, bezogen auf das Ausgangsinulin. Die Dünnschichtchromatographle auf einer Silicagelplatte, Merck, mit n-Butanol/Ethanol/Wasser 2/1/1 (v/v/v) als Entwicklungslösung zeigte den gleichen Rf-Wert. 0,67, wie Standart-DFA III, das durch Säurezersetzung von Inulin hergestellt wurde.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 erhaltene Filtrat (1 ml) wurde 10% Inulin enthaltenden 0,05 M Phosphatpuffer (4 ml) hinzugesetzt und über Nacht bei 30ºC umgesetzt.
Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, auf einer Säule mit aktivem Kohlenstoff chromatographiert und mittels 5% Ethanol eluiert. Das Eluat wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, wodurch DFA III in einer Ausbeute von 30%, bezogen auf das Ausgangsinulin, erhalten wurde.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Difruktose-Dianhydrid III (DFA III), umfassend die Umsetzung von Inulin mit einem Inulin-lytischen Enzym, welches aus einem zu Arthrobacter ilicis gehörenden Mikroorganismus erhältlich ist, in einer Inulin enthaltenden Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Arthrobacter ilicis MCI 2297 (FERM P-9893) ist.

3. Inulin-lytisches Enzym, erhältlich aus einem zu Arthrobacter ilicis gehörenden Mikroorganismus.

4. Inulin-lytisches Enzym nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Arthrobacter ilicls MCI 2297 (FERM P-9893) ist.

5. Arthrobacter ilicis MCI 2297 (FERM P-9893).