JPH01225492A - ジフルクトース・ジアンヒドリド3の製造法 - Google Patents

ジフルクトース・ジアンヒドリド3の製造法

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JPH01225492A
JPH01225492A JP63053164A JP5316488A JPH01225492A JP H01225492 A JPH01225492 A JP H01225492A JP 63053164 A JP63053164 A JP 63053164A JP 5316488 A JP5316488 A JP 5316488A JP H01225492 A JPH01225492 A JP H01225492A
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inulin
arthrobacter
enzyme
dianhydride iii
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Takao Uchiyama
内山 喬夫
Kuniharu Tanaka
田中 国治
Mishio Kawamura
川村 三志夫
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    • Y10S435/83Arthrobacter

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリド■(以下、
1−DFAIという)の製造法に関するものである。
〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕DFA
lljはフルクトースユ分子が/ −2’ 。
2−3′の間で脱水縮合した構造をもつコ糖類であり、
ジャクスンらにより1931年に単離同定されている(
 Bur、 5tand、J、Res、+、?、コア、
/9コ9〕。
DFA■は、動物体内では代謝されず、非発酵性の糖で
あるため低カロリー甘味剤として着目されておシ、今後
美容食等多方面に利用されることが予想される。
ル ジャクソンらは、フククトースを主構成とする多糖であ
るイヌリンを酸加水分解することによりDFA■を得て
いるが、収率はわずか2%弱であり、効率的な方法とは
言えない。
また日中らは1971年 アルスロバクタ−・ウレアフ
ァシェンスの産生ずるイヌリン分解酵素を用いてイヌリ
ンからDFAl[を生成させている( Biochim
、 Biophys、 Acta 、 2g1l 、 
211g 。
tqq2)。
しかし本酵素は温度に対する安定性が低く、60℃を越
えると急激な失活がおき、工業化を行う際に適切な酵素
であるとは言えない。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らはこれらの点を解決すべく種々研究を重ねた
結果、アルスロバクター・イリシスに属する微生物由来
のイヌリン分解酵素が効率よ(DFAl[を生産し、し
かも従来のものに比べて熱に対する安定性が高いので、
工業的にDFAIIの連続生産を行わせる際効率的に行
わせることができることを知得し、本発明を完成するに
至った。
即ち本発明の要旨は、イヌリン含有溶液中、イヌリンを
アルスロバクター・イリシスに属する微生物由来のイヌ
リン分解酵素と反応させることを特徴とするジフルクト
ース・ジアンヒドリド■の製造法に存する。
以下本発明を説明するに、本発明で使用するイヌリン分
解酵素は、アルスロバクター・イリシスに属する微生物
由来のものである。
かかるアルスロバクター・イリシスに属する微生物とし
ては、例えばアルスロバクター・イリシスMCI 22
.97が挙げられ、かかる菌株は微工研菌寄第9g93
号(FERM P−qgq3)として寄託されている。
アルスロバクタ−・イソシスMCI229フ号菌(以下
、l’−MCI!2?7号菌」という)は、本発明者等
によシ天然土壌から分離された微生物であシ、その微生
物学的性状は以下の通シである。
八 顕微鏡学的特徴 /)外  形二円  形 2) 大   き   さ  :  2〜3m3)表面
の隆起:凸   状 ゲ)表面の形状:平   滑 S)光  沢:鈍  光 る)色  調:黄味灰色 7)透 明 度二半 透 明 g)周  縁:全  縁 /)細胞 形 態 : 培養後6〜g時間位まで細胞は
不均一に伸長し、長い桿状に なる。その後中央部に隔壁が形成され、細胞は湾曲状に
曲り、漸次分裂をくシ 返す。72時間以降は、はとんどの細 胞が短桿菌状の整一な形態に変化する。
コ)細胞分裂様式 :  Bending type3
)運 動 性:有 り胞子形成:無 5)ダラム染色 : 培養初期は強いダラム陽性を示し
、その後、培養時間が経つ につれて、ダラム染色性が減少し陰性 を呈する(ダラム不定)0 6)抗 酸 性:陰 性 λ、生理学的性質 炭水化物の資化性(酸の生成):llI日間培養後の結
果有機酸の資化性 3、生化学的性質 ダ0分類学的考察 /)属レベルの同定 本菌株(MCI 229’Z号菌)は、セル サイ2k
 (Ce1l cycle)に桿球菌(Rods−co
ccus )の多形性を有する絶対好気性菌であること
、グルコース等の糖類から酸を生成しない、さらに細胞
壁の主要アミノ酸組成としてリジンを含有する生化学的
特徴を持ち、バージエイズ マニュアル オプ システ
マチックバクテリオロジー(Bergey’s Man
ual ofSystematic Bacterio
logy)第2巻に記載されている変則(Irregu
lar) +胞子を形成しない(Nonsporing
) +  グラム陽性桿菌(Oram−positiv
e Rods)群のアルスロバクタ−(Arthoro
bacter )属の細菌に帰属することが判明した。
2)種レベルの同定 Arthrobacter属菌には、今日までに約7g
種類の細菌が含まれている。これらの種類は生理学的性
質、生化学的性状によって識別されているが、特にメナ
キノン組成の相違、細胞壁を構成している架橋ペプチド
構造及び糖組成の相違が種レベルの重要な分類基準と見
なされている( K、H,5chleifer& O,
Kandler 、 Bacteriol、 Rev、
 + vol、、?6゜’IO’1−Q7り、1qq2
;  Bergeyls  ManualSystem
atic Bacteriology + vol、 
2 )。
本菌株(MCI 22qq号菌)は、■主要メナキノン
としてMK −9(H2)を含有し、■細胞壁の架橋ペ
プチド構造としてLys−Ala−Thr−Alaを有
し、 ■細胞壁の主要糖組成としてガラクトース、ラム
ノース及びマンノースを含有する生化学的特徴を持ち、
更に■運動性を有することから、Bergey’sMa
nual Systematic Bacteriol
ogy  に記載されているアルスロバクタ−イリシス
(Arthrobacter 1licis)の特徴に
よく合致した。
そこでArthrobacter 1licis  の
代表菌株(Type 5train)としてArthr
obacterilicis DSM 20/3gを取
得して、A、 1licisの原記載(M、D、Co1
1ins + Zentralbl。
Bakteriol、 Mikrobiol、 Hyg
、 I Abt、 Orig。
C2、3ag−、)コ3./9g/)に記載されている
性状について本菌株との各種生理学的及び生化学的性状
を比較した。結果は前記の通りである。
本菌株(MCI2.z9りシス)とA、 ilicis
DSM 20 / 3 gは、糖類、有機酸の資化性パ
ターン及び生化学的性状においてほぼ一致した。しかし
ながら、Tween 20 、 Tween lyOフ
ルクトース、シークロースの資化能、デンプンの加水分
解能及び9℃における生育の有無等において不一致点が
見られた。
これらの違いは、種内菌株間の差違に起因するものと推
定され、種に固定された特徴であるとは解釈されがたい
。従って本発明においては主に上述の生化学的性状を種
の分類基準とし、本菌株(MCI 2297号菌)をア
ルスロバクターイリシス(A r throbac t
erilicis)と同定した。
本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養することにより容易に増
殖させることができる。栄養源としては、グルコース、
水あめ、デキストリン、シュクロース、澱粉、糖蜜、動
・植物油等を使用できる。また窒素源として、大豆粉、
小麦はい芽、コーンステイープ リカー、綿実粕、肉エ
キス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸
ソーダ、尿素等を使用できる。
その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びそ
の他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加す
ることは有効である。
本発明においては、イヌリン或いはキクイモ、ゴボウ等
のイヌリン含有量の高い植物の抽出液を唯一の炭素源と
して含む溶液中で、上記アルスロバクター・イリシスに
属する細菌由来のイヌリン分解酵素を作用させる。その
際、該細菌そのものを作用させてもよいし、また、該細
菌から該酵素を抽出し、それを作用させてもよい。
細菌そのものを作用させる場合、炭素源としてのイヌリ
ンを約/−10%含有し、その他、例えば窒素源として
、大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープ ゝリカー、
綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等、更に必要に応じ、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト
、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成すること
のできる無機塩類等を添加した培地に本菌を接種し振と
う培養を行う。この際培養温度は20〜37℃が、また
培養時間は/2〜aO時間が好適である。得られた培養
液を遠心分離により除菌し、その上清を加熱処理により
酵素を失活させる。そして濃縮を行い、例えばこれを活
性炭カラムクロマトグラフィーによシ活性炭カラムに吸
着させる。蒸留水でフルクトースを溶出させたあと、タ
チエタノール水溶液にて溶出を行う。この分画中にDF
AIIが得られるので、それを濃縮乾固すると所期のD
FAI[[を得ることができる。
また酵素を作用させる場合、まず前記方法により培養を
行った培養液を遠心分離によシ除菌し、得られたろ液に
硫安(xr%飽和)を加え塩析を行い、析出した沈殿物
を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させたのち透
析を行い、粗酵素液を得る。この粗酵素液を例えばpH
7,0に調整した0、07〜0.7Mのリン酸緩衝液中
でイヌリンに作用させることによっても所期のDFA■
が得られる。
本粗酵素液は、例えばDEAE−Toyopearl 
A!rOM 。
5P−Toyopearl A!rOMカラムによるイ
オン交換クロマトグラフィーにて精製を行うことにより
、電気泳動的に単一のバンドを示す酵素標品を得ること
ができ、る。本酵素標品の至適pH(dijで、また6
0℃で最大活性を示した。pHはti、。
〜//、θの広範囲で安定であシ3θ分間の熱処理では
70℃まで安定であり高い温度安定性を示した。
〔実施例〕
以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに具体的に説
明するが、その要旨を越えない限りこれらに限定される
ものではない。
実施例/ 市販イヌリンS%、酵母エキス0.02%、硝酸ナトリ
ウム0.2%、硫酸マグネシウム0.05チ、塩化カリ
ウムO,OS%、リン酸−カリウム0005%、塩化第
二鉄0.00 / %を含んだ培地1so−をpH7,
0に調整して、120℃で20分間蒸気滅菌した。この
滅菌した溶液に、MCI2291号菌を一白金シス種し
、/ 60 r、p−m。
で30℃、30時間培養した。
培養終了後遠心分離により菌体を除去し、培養ろ液を得
た。得られた培養ろ液を70分間加熱処理することによ
り酵素を失活させ、約i。
−にまで減圧濃縮した。この液は活性炭カラム(活性炭
、30j9とセライトA、t、?&  AθIの混合物
を蒸留水にて充てん)に吸着させ、蒸留水/ノを流した
のち、!チェタノール水溶液で溶出した。
溶出ピークを集めて減圧濃縮にて乾固してDFAI[I
を得た。得られたDFAl[は、原料イヌリンに対して
70%でありた。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲル
プレー) (Merck社);展開溶媒n−ブタノール
:エタノール:水= 2:/:/(v/v/v) )に
よると、イヌリンの酸分解により得られた標準のDFA
IIIとRf値(0,1,7)が−致した。
実施例a 実施例/で得られた培養ろ液l−を、70%のイヌリン
を含む0.osMリン酸緩衝液グーに加えて30℃で一
夜反応させた。
反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭カラムクロ
マトグラフィーを行い、Sチエタノールにて溶出させ、
溶出液を減圧濃縮にて乾固してDFAlを得た。
得られたDFAI[[は、原料イヌリンに対して30%
でありだ。
〔発明の効果〕
本発明のアルスロバクター・イリシスに属する細菌由来
のイヌリン分解酵素は、良好にイヌリンからDFAIを
生産し、また従来のものに比べて熱に対して高い安定性
を有するので、DFAIの連続生産を行わせる際に非常
に有効であると考えられる。
出 願 人  三菱化成工業株式会社 代 理 人 弁理士長香川  − ほか7名 手続補正書(自船 平成1年y月)−7日

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)イヌリン含有溶液中、イヌリンをアルスロバクタ
    ー・イリシスに属する微生物由来のイヌリン分解酵素と
    反応させることを特徴とするジフルクトース・ジアンヒ
    ドリドIIIの製造法。
JP63053164A 1988-03-07 1988-03-07 ジフルクトース・ジアンヒドリド3の製造法 Pending JPH01225492A (ja)

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