KR100380970B1

KR100380970B1 - 아스로박터 유레아휘션스로부터 분리된 레반 프룩토트랜스퍼라제 및 이를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 4를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100380970B1
Application number: KR10-1999-0045302A
Authority: KR
Inventors: 이상기; 송기방; 김철호; 유은자; 이용복
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2003-04-21
Also published as: EP1141236A4; AU1419701A; KR20010037651A; CN1340097A; US6841368B1; JP2003512045A; EP1141236A1; CN1192100C; WO2001029185A1

Abstract

본 발명은 아스로박터 유레아휘션스(Arthrobacter ureafaciense)로부터 분리되고, 활성 pH 범위가 4.0 내지 10.5이고, 활성 온도 범위가 35 내지 55℃이고, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, Hg⁺⁺에 의하여 효소활성이 저해되고 Na⁺⁺또는 Ca⁺⁺이온에 의하여 효소활성이 증강되는 이온 특이성을 가지며, SDS-PAGE상 분자량이 51,000 달톤이고 겔 여과 크로마토그라피상 분자량이 96,000 달톤인 레반 프룩토트랜스퍼라제에 관한 것으로, 이를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV(2.6':6.2' difructose dianhydride, DFA IV)를 효소적으로 대량생산할 수 있다.

Description

아스로박터 유레아휘션스로부터 분리된 레반 프룩토트랜스퍼라제 및 이를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 4를 생산하는 방법{LEVAN FRUCTOTRANSFERASE DERIVED FROM ARTHROBACTER UREAFACIENSE AND PROCESS FOR PREPARING DIFRUCTOSE DIANHIDRIDE IV FROM LEVAN BY USING SAME}

본 발명은 자연계에 존재하는 프락탄(fructan)의 일종인 레반(levan)으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV(2.6':6.2' difructose dianhydride, DFA IV)를 생산하기 위한 것으로, 보다 구체적으로는 토양 유래의 아스로박터 유레아휘션스 균주로부터 분리된 신규 레반 프룩토트랜스퍼라제(levan fructotransferase) 및 이의 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 발현된 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 생산하는 방법에 관한 것이다.

디프룩토스 디언하이드라이드는 잭슨(Jackson) 등(1929)에 의해 처음 밝혀진 화합물로서 이눌린(inulin)을 황산처리함으로써 프룩토스 시럽 제조 중에 생성되며 2개의 프룩토스의 환원형 말단이 서로 다른 프룩토스 말단의 비환원성 수산기에 결합된 환상 2당이며 현재까지 디프룩토스 디언하이드라이드는 DFA I 내지 V로 5종이 알려져 있다. 이중 디프룩토스 디언하이드라이드 IV의 구조는 하기 화학식 1과 같다.

디프룩토스 디언하이드라이드는 동물의 체내에서 분해되지 않는 비소화성, 비발효성 이당류로 저칼로리 감미료로 사용될 수 있으며 충치발생을 억제하고 비피더스(Bifidus)균 증식인자로 이용될 수 있다. 또한 생체내 미네랄 흡수 촉진인자 등으로도 사용될 수 있다(미국 특허 제 5,700,832 호, 영국 특허 공개 제 GB 2 308 547 A 호, 일본 특허출원 제 8-513790 호 및 한국 특허공개 제 96-13376 호).

디프룩토스 디언하이드라이드의 제조에 사용될 수 있는 천연 원료물질인 폴리프락탄(polyfructan, fructose homopolymer)은 이눌린과 레반(levan)이 대표적이며, 이들로부터 화학적 또는 효소적으로 디프룩토스 디언하이드라이드를 합성할 수 있다. 그러나 천연 폴리프락탄으로부터 화학 합성 방법으로 디프룩토스 디언하이드라이드를 생산하는 경우, 낮은 반응 선택성으로 인해 반응 후 복잡한 분리정제 과정을 거쳐야 하고 환경오염 유발 등의 문제점이 있어 결정적으로 경제적인 생산수단을 저해하는 요인이 되고 있다. 따라서 이의 대안으로서는 미생물이나 효소와 같은 생체촉매를 이용한 효소적 생산방법이 바람직하다.

1972년 타나카(Tanaka) 등(1972)에 의해 미생물로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 III 합성효소(이눌린 프룩토트랜스퍼라제)가 처음 발견된 후 여러 미생물에서 디프룩토스 디언하이드라이드들을 합성하는 효소가 발견되었으며 이 미생물 유래 효소가 합성하는 디프룩토스 디언하이드라이드로는 DFA I, III 및 IV가 현재밝혀져 있다. 이중 레반 유래는 디프룩토스 디언하이드라이드 IV만이 레반 프룩토트랜스퍼라제의 작용에 의해 효소적으로 생산되며, 그 밖의 미생물 아스로박터 유레아휘션스와 아스로박터 니코티노보란스 GS-9으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV가 생산된다. 그러나 미생물 자체에 의하여 생산되는 레반 프룩토트랜스퍼라제는 극히 소량으로 이를 이용하여 디프룩토스 디언하이드라이드 생산에 활용하기에는 기술면이나 경제적인 측면에서 많은 문제점이 있다. 따라서 일차적으로 미생물에서 분리한 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자를 클로닝하고, 이를 일반적인 유전자 재조합 기술을 사용하여 대장균에서 대량으로 발현하기 위한 시도가 각광을 받고 있다. 현재까지는 레반 프룩토트랜스퍼라제 생산균주 중 아스로박터 니코티노보란스 GS-9의 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자만이 클로닝되어 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 아스로박터 유레아휘션스 균주로부터 레반 프룩토트랜스퍼라제를 분리하고 이의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하여 이 유전자가 아스로박터 니코티노보란스 GS-9의 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자와 76%의 상동성이 있다는 사실을 발견하고 이를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 생산할 수 있게 됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 토양 유래의 아스로박터 유레아휘션스 균주로부터 분리된 신규 레반 프룩토트랜스퍼라제 및 이의 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 발현된 레반 프룩토트랜스퍼레이즈를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 아스로박터 유레아휘션스(Arthrobacter ureafaciense)의 배양액으로부터 정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제의 SDS-PAGE 분석결과이고,

도 2는 아스로박터 유레아휘션스의 배양액으로부터 정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제의 최적반응온도를 나타낸 그래프이고,

도 3은 레반 프룩토트랜스퍼라제를 암호하는 유전자의 염기서열과 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 4는 재조합 레반 프룩토트랜스퍼라제 발현벡터(플라스미드) pUDFA81의 구조를 나타낸 것이고,

도 5는 레반 프룩토트랜스퍼라제를 함유하는 pUDFA81로 형질전환된 재조합 대장균 JUD81(KCTC 8961P)에서 발현된 레반 프룩토트랜스퍼라제를 포함하는 대장균 단백질들의 SDS-PAGE 분석결과이고,

도 6은 재조합 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용한 레반으로부터 디프룩토스디언하이드라이드 IV의 생산량 및 레반의 잔량변화를 나타낸 것이고,

도 7은 정제된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV의 NMR(nuclear magnetic resonance) 분석결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 아스로박터 유레아휘션스 균주로부터 분리된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 레반 프룩토트랜스퍼라제, 이를 암호하는 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 레반 프룩토트랜스퍼라제의 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 레반 프룩토트랜스퍼라제의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

토양으로부터 분리된 본 발명의 아스로박터 유레아휘션스 K2032는 국내 토양으로부터 분리된 균주로서 그람 가변성이고, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 아라비노스, 만니톨, 자일로스, 리보스, 솔비톨, 셀로비오스, 글리코겐, 슈크로즈, 아세트산, 프로피온산, 살리신을 이용하는 반면, 람노스, 말로네이트, 아디프산, N-아세틸 글루탐산, L-세린은 이용하지 못하는 특성을 갖는다. 이의 세포내 지방산은 C15 안테이소/C17 안테이소/C16 이소의 비율이 51%/14.5%/3.6%이고 C16/C14의 비율은 17.8%/7.1%이며, 미생물의 화학분류학의 주요성분인 퀴논 분석결과 메나퀴논 MK-9(H₂)를 함유하고 있는 균주로 확인되었다.

상기 아스로박터 유레아휘션스 균주로부터 분리정제된, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 레반 프룩토트랜스퍼라제의 SDS-PAGE상 분자량은 51,000 달톤이고 겔 여과 크로마토그라피상 분자량은 96,000 달톤으로서 수용액에서 2량체로 존재한다. 본 발명의 효소는 pH 4.0 내지 10.5 범위에서 안정하고, 최적 활성 pH는 6.0 부근이며, 35 내지 55℃에서 안정하고 최적 반응 온도는 45℃이다. 본 발명의 효소는 열에 매우 안정하여 50℃에서 30 분간 방치후 측정한 경우에도 90% 이상의 효소활성이 보존된다. Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, Hg⁺⁺에 의하여 효소활성이 저해되고 Na⁺⁺또는 Ca⁺⁺이온에 의하여 효소활성이 증강되는 특성이 있다.

본 발명의 상기 레반 프룩토트랜스퍼라제 단백질은 상기 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자를 적절한 발현벡터에 발현가능하게 삽입하여 레반 프룩토트랜스퍼라제를 포함하는 발현벡터, 예를 들어 플라스미드 pUDFA81를 제조하고, 이를 적절한 숙주, 예를 들어 대장균 DH 5α에 형질전환시키고, 이 형질전환체를 레반 프룩토트랜스퍼라제의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 유전공학적인 방법으로 대량 제조할 수 있으며, 화학적 합성방법에 의해서도 합성할 수 있다.

본 발명의 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 제조할 수 있는데, 보다 상세하게는 레반 프룩토트랜스퍼라제를 레반 수용액에 가하고 pH 4.0 내지 10.5, 바람직하게는 pH 6.0, 온도 35 내지 55℃, 바람직하게는 45℃에서 반응시켜 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 레반 프룩토트랜스퍼라제 생산균주의 분리 및 동정

(단계 1) 레반 프룩토트랜스퍼라제 생산균주의 분리

국내 경남지방의 토양에서 채취한 토양을 시료로하여 다음과 같이 레반 프룩토트랜스퍼라제 생산균주를 선발하였다. 먼저, 0.5g의 토양시료를 9.5ml의 증류수에 현탁하고, 이 용액을 10배, 100배 및 1000배로 희석한 다음, 레반을 주요 탄소원으로 하는 선택 고형배지(0.5%(W/V) 레반, 0.3% NaNO₃, 0.05% MgSO₄, 0.02% MnCl₂, 0.1% K₂HPO₄, 1.5% 아가/L)에 토양 현탁액 200㎕씩을 도말하여 30℃ 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 이 때 레반은 해당량을 물에 용해하고 0.45㎛의 필터를 통과시킨 후 기타 영양분을 첨가하고 살균된 배지에 첨가하여 사용하였다.

이어서, 선택배지 플레이트에서 레반을 분해하여 콜로니 주위에 레반 분해환(halo)을 형성하는 균주를 1차적으로 선발하였다.

상기 1차적으로 선발된 균주를 레반을 주요 탄소원으로 하는 상기의 선택 고형배지에서 아가를 제외한 액체배지에 접종하고 30℃ 배양기에서 72 시간 동안 배양시키면서 균의 생육정도와 레반을 분해하여 생성한 분해산물을 박층 크로마토그라피법으로 조사하였다. 이에 따라 1차 선발된 250여 균주 중 디프룩토스 디언하이드라이드를 생산하는 미생물 8 균주를 분리하였으며 이중 최종적으로 디프룩토스디언하이드라이드를 안정적으로 생산하고 높은 효소활성을 보이는 균주를 선발하였다.

(단계 2) 레반 프룩토트랜스퍼라제 생산균주의 동정

상기 단계 1에서 선발된 균주의 생화학적 특성, 균체의 지방산과 퀴논(quinone) 조성 및 함량을 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

그람 반응	가변성(성장기 때는 +)
글루코스로부터 산 생성	-
질산염 환원	-
전분 가수분해	-
10% NaCl에서의 성장	-
D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, L-아라비노스, D-만니톨, D-자일로스, D-리보스, D-솔비톨, 셀로비오스, 글리코겐, 슈크로즈, 아세트산, 프로피온산, 살리신의 이용	+
L-람노스, 말로네이트, 아디프산, N-아세틸 글루탐산, L-세린의 이용	-
세포내 지방산C15 안테이소/C17 안테이소/C16 이소C16/C14	51%/14.5%/3.6%17.8%/7.1%
주요 메나퀴논	MK-9(H₂)

상기와 같은 분석결과들을 종합하여, 본 균주를 아스로박터 유레아휘션스(Arthrobactor ureafaciens)로 동정하였으며 이를 아스로박터 유레아휘션스 K2032로 명명하였다.

실시예 2 : 아스로박터 유레아휘션스 K2032로부터 레반 프룩토트랜스퍼라제의 정제 및 특성 확인

(단계 1) 레반 프룩토트랜스퍼라제의 정제

레반을 주요 탄소원으로하는 선택 액체배지에 상기 수득된 아스로박터 유레아휘션스 K2032를 접종하고 30℃ 배양기에서 72 시간 동안 배양시키며 균의 생육정도와 레반 프룩토트랜스퍼라제의 활성을 조사하였다. 배양 후 효소활성이 가장 높은 10 시간 경과시의 균배양액으로부터 효소 정제를 시도하였다. 효소의 정제는 다음과 같이 아세톤 침전, 이온 교환 크로마토그라피(DEAE 650-M 및 Mono Q), 겔 여과 크로마토그라피를 통하여 순차적으로 수행하였다. 먼저, 균배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 여기에 50%의 콜드(cold, -20℃) 아세톤을 첨가하여 2 시간 동안 4℃에서 교반한 다음 원심분리하여 침전물을 회수한 후 이를 20 mM 인산 완층용액(pH6.0)에 용해하고 DEAE-650M 이온교환수지(Toyopearl, WAKO Co.)를 이용하여 크로마토그라피하였다. 이 때 용출액으로는 최종농도 0.5M의 NaCl을 사용하였으며 레반 프룩토트랜스퍼라제는 약 0.2M의 NaCl 농도에서 용출되었다. 이어서 이를 농축한 다음 동일 완충용액에 투석한 후 강 음이온 교환수지인 모노 큐(Mono Q, Pharmacia사)를 이용하여 재차 크로마토그라피한 후 활성이 있는 분획을 수득하여 농축 및 투석하고 슈퍼로즈 12(Superose 12, Pharmacia사)를 이용하여 겔 여과법으로 정제하였다. 최종적으로 비활성이 2269 U/mg 단백질인 효소 1.1 mg을 수득하였다(수율 29.8%). 효소의 정제단계별로 시료를 취하여 분석한 결과를 하기 표2에 나타내었다.

정제단계	배양액 양(㎖)	총효소 활성(U)	전체 단백질(㎎)	효소 비활성(U/㎎ 단백질)	정제도	수율(%)
배양액	3,800	8,360	182.3	45.9	1.0	100
아세톤 침전	700	5,670	71.3	79.5	1.7	67.8
이온교환수지(DEAE 650-M)	5.5	4,821	5.0	964.2	21.1	57.7
이온교환수지(Mono Q)	3.2	3,416	2.6	1313.8	29.2	40.9
겔 여과	1.2	2,496	1.1	2269.0	49.8	29.8

(단계 2) 레반 프룩토트랜스퍼라제의 특성 측정

정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제의 특성을 조사한 결과, SDS-PAGE상 분자량은 51,000 달톤이고 겔 여과 크로마토그라피상 분자량은 96,000 달톤으로 나타났으며 수용액에서 2량체로 존재하는 것으로 확인되었다. 정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제의 SDS-PAGE 분석결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 제 1 열은 표준 분자량 단백질을 나타내는 것이고, 제 2 열은 본 발명의 정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제를 나타내는 것이다. 레반 프룩토트랜퍼라제의 N-말단 아미노산 구성은 서열번호: 4와 같다.

레반 프룩토트랜스퍼라제의 SDS-PAGE상 분자량은 51,000 달톤이고 겔 여과 크로마토그라피상 분자량은 96,000 달톤으로서 수용액에서 2량체로 존재하며, pH 4.0 내지 10.5 범위에서 안정하고, 최적 활성 pH는 6.0 부근이며, 35 내지 55℃에서 안정하고 최적 반응 온도는 45℃인 것으로 나타났다. 또한 이는 열에 매우 안정하여 50℃에서 30 분간 방치후 측정한 경우에도 90% 이상의 효소활성이 보존되며, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, Hg⁺⁺에 의하여 효소활성이 저해되고 Na⁺⁺또는 Ca⁺⁺이온에 의하여 효소활성이 증강되는 특성이 있는 것으로 나타났다. 도 2는 아스로박터 유레아휘션스 K2032의 배양액으로부터 정제된 레반 프룩토트랜스퍼라제의 최적반응온도를 나타낸 그래프이다.

실시예 3 : 아스로박터 유레아휘션스 K2032로부터 염색체 DNA의 분리

아스로박터 유레아휘션스 K2032로부터 레반 프룩토트랜스퍼라제를 암호하는 유전자의 분리는 게놈 DNA 분리 키트(G NOME^TMDNA ISOLATION KIT, Bio 101사)를 사용하여 수행하였다. 먼저, 50ml의 선택배지에 상기 실시예 1에서 분리된 아스로박터 유레아휘션스 K2032를 접종하고 24 시간 동안 배양하여 세포를 충분히 성장시킨 후 3000rpm에서 5 분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 여기에 세포 현탁용액(10mM Tris-Cl(pH 8.0), 0.1M EDTA(pH 8.0))을 가하여 1.85ml의 세포 현탁액을 제조한 다음, 50㎕의 RNase 용액과 100㎕의 세포 용해/변성 용액(0.5% SDS)을 넣어 잘 혼합한 후, 55℃에서 15 분간 배양하였다. 이어서 시료 속의 단백질을 제거하기 위하여 프로테아제 25㎕를 혼합하여 55℃에서 1 시간 동안 반응시키고 500㎕의 'SALT OUT' 완충용액(Bio 101사)을 넣어 1.5ml 튜브에 시료를 나누어 4℃에서 10 분간 냉각시켰다. 이어서 12000rpm으로 10 분간으로 원심분리하여 침전물을 분리하고 상층액을 15ml 튜브에 옮긴 다음, 2ml의 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 7.8 및 1 mM EDTA)과 100% 에탄올 8ml를 넣어 DNA를 침전시켜 15 분간 12000rpm으로 원심분리하여 상층액을 버리고 DNA를 공기중에서 건조시켰다. 건조된 DNA에 TE 완충용액을 가하여 용해시켰다.

실시예 4 : 레반 프룩토트랜스퍼라제 암호 유전자의 클로닝

상기 실시예 3에서 수득된 염색체 DNA를 여러 제한효소(restriction enzyme)로 절단하고 1%의 아가로오스 겔(agarose gel)을 사용하여 전기영동한 후, 일정 크기의 DNA 단편(3-4 Kb)을 겔로부터 용출하여 부분 절단된 아스로박터 유레아휘션스 K2032의 게놈 DNA를 얻었다. 이를 미리 제한효소BamHI로 절단된 클로닝 벡터 pBluescript KSII⁺에 삽입(ligation)하여 대장균(E.coli) DH5α에 형질전환시켰다. 이 형질전환체중 레반 프룩토트랜스퍼라제를 암호하는 유전자를 함유한 형질전환체를 선발하기 위하여 다음과 같은 선발실험을 수행하였다.

먼저, 아스로박터 유레아휘션스 K2032 균주의 레반 프록토트랜스퍼라제의 N-말단 아미노산 서열(서열번호: 5)과 레반 프룩토트랜스퍼라제의 보존서열(conserved sequence)인 아미노산 서열(서열번호: 6)을 이용하여 각 서열에 해당하는 프라이머 p1(서열번호: 7) 및 프라이머 p2(서열번호: 8)를 제조하고 이들 프라이머와 아스로박터 유레아휘션스 K2032 균주의 염색체 DNA를 이용하여 표준 PCR을 행하였다. PCR 반응 결과 생성된 600-650 bp 크기의 DNA 절편을 겔 용출한 후 대장균의 셔틀벡터 pT7blue(Novagen사)에 옮겨 각각의 벡터에 도입된 DNA 절편의 크기와 제한효소 지도를 작성한 결과 약 4종의 DNA 절편이 도입된 것을 알 수 있었다(pDA11, 17, 18, c8). 4종의 DNA의 염기서열을 결정한 결과 이중 pDA18에도입된 절편이 기존의 아스로박터 니코티노보란스 GS-9 유래 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자와 일정부위에서 85% 정도의 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 pDA18에 도입된 DNA 단편을 프로브(probe)로 하여 아스로박터 유레아휘션스로부터 제조된 염색체 DNA를 여러 제한효소(restriction enzyme)로 절단하여 서든 하이브리다이제이션을 행하였다. 서든 하이브리다이제이션 결과ClaI으로 절단된 염색체 DNA의 경우는 5.6 Kb 크기에서,PstI으로 절단된 염색체 DNA의 경우는 7.5 Kb 크기에서,BamHI으로 절단된 염색체 DNA의 경우는 >10 Kb 크기에서 시그날이 검출되었다. 따라서 염색체 DNA를ClaI과PstI으로 절단한 후 1%의 아가로오스 겔(agarose gel)을 사용하여 전기영동한 후, 일정 크기의 DNA 단편(5-10 Kb)을 각각 겔로부터 용출하여 절단된 아스로박터 유레아휘션스의 게놈 DNA를 얻고 이를 미리ClaI과PstI 제한효소로 절단한 클로닝 벡터 pBluescript KSII⁺에 각각 삽입하여 대장균(E.coli) DH5α에 형질전환시켰다. 이 형질전환체중 레반 프룩토트랜스퍼라제를 암호하는 유전자를 함유한 형질전환체를 선발하기 위하여 pDA18에 도입된 DNA 단편을 프로브(probe)로 하여 각각 서든 하이브리다이제이션을 행하였다. 서든 하이브리다이제이션 결과 최종적으로ClaI으로 절단된 5.6 Kb의 DNA가 도입된 플라스미드 pDcla와PstI으로 절단된 약 8.0 Kb DNA가 도입된 플라스미드 pDpst가 분리되었다.

실시예 5 : 재조합 플라스미드의 분리, 분석 및 서브클로닝(subcloning)

형질전환된 대장균에서 DNA의 추출은 일반적인 비등(boiling) 방법과 키트를이용한 추출방법을 사용하였으며, 분석은 제한효소로 절단한 후 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동으로 분석하였다.

pDcla와 pDpst에 도입된 DNA의 제한효소 지도와 유전자 위치 분석 결과와 그리고 pDcla와 pDpst에 도입된 DNA 단편의 각 말단의 염기서열을 결정하여 본 결과 pDcla에는 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자의 5'-말단부위가 존재하고, pDpst에는 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자의 3'-말단부위가 존재하였으며 약 200bp의 겹치는 부위가 있고 두 플라스미드를 각각 함유한 대장균에서 효소활성은 검출되지 않았다. 따라서 두 플라스미드에 공통적으로 존재하는 제한효소PstI,ApaI,NotI 및EcoRI을 이용하여 완전한 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)이 되도록 플라스미드 pDF8을 제조하였다. 우선 DNA 단편의 도입을 수월하게 하기 위하여 pDpst의 도입된 DNA에 존재하는 두 개의ApaI 제한효소 자리를 제거하였다. 플라스미드 pDpst에 도입된 DNA의NotI 제한효소 자리와 다중 클로닝 부위(multicloning site)에 존재하는NotI 제한효소 자리를 이용하여 4.5 Kb의 DNA를 제거하여 3 Kb의 도입된 DNA가 존재하는 pDpst-22N을 제조하였다. pDpst-22N과 pDcla를 이용하여 완전한 오픈 리딩 프레임이 되도록 하였다. 우선 pDcla에 도입된 DNA에 존재하는ApaI과 다중 클로닝 부위에 존재하는EcoRI으로 절단하여 1.3 Kb의 DNA를 분리하고 이를 미리ApaI과EcoRI으로 절단한 pDpst-22N에 도입하여 플라스미드 pDFpst-cla를 제조하였다. 플라스미드 pDFpst-cla를 다시PstI으로 절단하여 약 0.8 Kb의 DNA를 제거하여 플라스미드 pDF8을 제조하였다. pDF8에는 약 3.5 Kb의 DNA가 도입되어 있으며 pDF8를 함유한 대장균에서는 효소활성이 검출됨을확인할 수 있었다.

실시예 6 : 클로닝된 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자의 염기서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열

pDF8에 도입된 약 3.5 Kb의 DNA의 핵산염기배열을 분석하기 위하여 단계적으로 약 300 내지 400bp 정도의 크기를 갖는 DNA 레더(ladder)를 제조하고 염기서열 분석하여, 3345bp의 염기서열을 얻었다. 전체 3345bp 중의 ORF을 조사한 결과 1개의 ORF가 존재하는 것으로 확인되었으며, 이 ORF는 월드 와이드 웹(www)내의 BLAST 검색결과 레반 프룩토트랜스퍼라제와 높은 상동성(homology)이 있는 것으로 조사되었으며, 이를lftA로 명명하였다.

새롭게 분리한 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자(lftA)는 1566bp의 염기로 구성되어 있고 521개의 아미노산을 코드하고 있었다. 이 유전자는 99bp의 염기(33개 아미노산)로 구성된 시그날 서열(signal sequence)을 N-말단에 가지고 있어 본 유전자로부터 유추되는 완성형 단백질의 분자량은 약 56kDa이었으며 등전점은 pH 5.15였다. 이 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자는 이미 보고된 아스로박터 니코티노보란스 GS-9 유래의 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자보다 15개의 염기(5개 아미노산)가 더 존재하는 것으로 나타났으며, 두 유전자의 아미노산 서열 상동성은 81%(염기서열은 76%)였다. 따라서 아스로박터 유레아휘션스 K2032 유래 레반 프룩토트랜스퍼라제는 새로운 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 효소로 판명되었고 이의 염기서열은 미국 GenBank에 1999년 8월 28 일자로 등록되었다(Accession No.AF181254). 도 3 및 서열번호: 1에는 상기lftA를 포함하는 유전자의 염기서열과 이로부터 추정된 아미노산 서열을 나타내었다.

실시예 7 : 재조합 레반 프룩토트랜스퍼라제를 고발현하는 형질전환체의 제조

상기 실시예 6에서 수득된lftA유전자의 시그날 서열 상에 존재하는 제한효소PstI를 이용하여 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자를 절단한 후 클레나우(Klenow) 단편으로 처리하여 평활말단을 만들고NotI으로 절단하여lftA유전자를 분리하였다. 상기의 클레나우 처리한lftA를SmaI으로 절단하여 CIP(calf intestinal alkaline phosphatase) 처리한 pUC118 벡터와 연결하여 pUDFA18을 제조하였다. 이의 구조를 도 4에 나타내었으며, 여기에서 B는 제한효소BamHI, P는 제한효소PstI, N은 제한효소NcoI, S는 제한효소SalI, C는 제한효소ClaI의 인지부위를 나타내며, N/A는NcoI/AflIII을 나타내는 것이다.

상기 플라스미드를 대장균 DH5α에 형질전환시켜 형질전환된 대장균 JUD81를 수득하였다. 상기 형질전환된 대장균 JUD81은 1999년 9월 1일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8961P 호로서 기탁되어 있다.

도 5는 재조합 대장균 JUD81에서 발현된 레반 프룩토트랜스퍼라제를 포함하는 대장균 단백질의 SDS-PAGE 분석결과이고, 여기에서 제 1 열은 대장균 JUD81의 전체 단백질을 나타내는 것이고, 제 2 열은 표준 분자량 단백질을 나타내는 것이다.

실시예 8 : 재조합 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용한 디프룩토스 디언하이드라이드 IV의 생산

레반 20g을 1000ml의 온수에 용해하고 냉각시킨 후 인산 완충용액을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다. 여기에 대장균 JUD81의 파쇄액을 가하고 37℃에서 반응시켰다. 도 6은 재조합 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용한 레반으로부터의 디프룩토스 디언하이드라이드 IV의 생산량 및 레반의 잔량변화를 나타낸 것이다.

반응시작 후 40 시간 경과한 반응액 100℃의 열수에 5 분간 방치하여 잔존효소를 불활성화시키고 생성된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 포함하는 반응액을 활성탄 컬럼(charcoal column, 직경 6.5 Cm, 높이 20 Cm)을 이용하여 흡착시킨 후 증류수로 칼럼 통과액에서 당성분이 검출되지 않을 때까지 세척하였다. 컬럼을 5% 에탄올 용액 1000ml로 세척한 다음, 25% 에탄올 용액 1000ml을 통과시켜 흡착된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 용출하였다. 용출된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 회전식 증발기(rotary evaporator)로 증발시켜 고농도의 디프룩토스 디언하이드라이드 IV 용액 30ml을 얻었다. 여기에 100% 에탄올을 95% 이상의 에탄올 농도가 되도록 첨가하여 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 결정화하였다. 결정 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 순수 에탄올로 여러번 세척한 후 건조하여 정제된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV 2.5g을 수득하였다.

제조된 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 NMR, HPLC 및 산분해한 후 TLC 분석한 결과 표준품과 일치하였으며 이중 NMR 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

본 발명의 레반 프룩토트랜스퍼라제를 이용하면 자연계에 존재하는 2,6 결합된 프락토스폴리머(레반 등)로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 고효율로 생산할 수 있다.

Claims

아스로박터 유레아휘션스(Arthrobacter ureafaciense)로부터 분리된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 레반 프룩토트랜스퍼라제.
삭제
제 1 항의 레반 프룩토트랜스퍼라제를 암호하며 서열번호: 3의 염기 서열을 갖는 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자.
삭제
제 3 항의 레반 프룩토트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 5 항에 있어서,

플라스미드 pUDFA81인 발현벡터.
제 5 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물 형질전환체.
제 7 항에 있어서,

대장균 JUD81(KCTC 8961P)인 형질전환체.
제 7 항의 형질전환체의 파쇄액 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 레반 프룩토트랜스퍼라제를 레반 수용액에 가하고 pH 4.0 내지 10.5, 온도 35 내지 55℃에서 반응시켜 디프룩토스 디언하이드라이드 IV를 제조하는 방법.