WO2010147085A1 - ジフルクトース・ジアンヒドリドiii合成酵素 - Google Patents

ジフルクトース・ジアンヒドリドiii合成酵素 Download PDF

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WO2010147085A1
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synthase
inulin
enzyme
strain
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和田　正
紋子 山根
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フジ日本精糖株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01134—Difructose-anhydride synthase (3.2.1.134)

Definitions

  • the present invention relates to difructose dianhydride III ( ⁇ -D-fructofuranose- ⁇ -D-fructofuranose-1,2 ′; 2,3′-dianhydride, hereinafter abbreviated as DFAIII), synthase, and enzyme And a method for producing DFAIII.
  • DFAIII difructose dianhydride III
  • synthase synthase
  • enzyme enzyme
  • DFAIII is an indigestible disaccharide in which two molecules of fructose are linked by 1,2 '; 2,3'. It is a low-calorie material, a food with a physiological function that enhances absorption of minerals, or high water solubility. It is interested as a food material having excellent processing characteristics such as acidity, acid resistance and non-browning.
  • DFAIII is a substance isolated and identified by Jackson et al. (Non-Patent Document 1), and they are obtained by acid hydrolysis of inulin, a polysaccharide containing fructose as a main constituent sugar, but the yield is high. It was as low as 2%.
  • Patent Document 1 an enzyme derived from Arthrobacter globiformis is used.
  • Patent Documents 2 and 3 an enzyme derived from Pseudomonas fluorescens is used.
  • Patent Document 4 Arthrobacter fluorescens is used.
  • Non-patent document 2 reports a method for producing DFAIII using an enzyme derived from iricis (Arthrobacter ilicis) using Leifsonia sp. T88-4.
  • DFAIII synthase that is satisfactory in heat resistance and enzyme activity.
  • DFAIII synthase derived from the genus Curtobacterium is not known.
  • Inulin the raw material used in the production of DFAIII, has poor water solubility and must be used at a low concentration of several percent when used in enzyme reactions, resulting in poor reaction efficiency and high risk of microbial contamination was there.
  • inulin when using high concentrations of inulin as a raw material, it is necessary to increase the reaction temperature so that inulin does not precipitate during the enzyme reaction. If the enzyme does not have extremely high heat resistance, the enzyme will be heat-denatured. There was a risk that the reaction would not proceed.
  • an object of the present invention is to provide a DFAIII synthase excellent in heat resistance and enzyme activity.
  • the present inventors have found that microorganisms of the genus Kurtobacterium produce DFAIII synthase having higher enzyme activity and superior heat resistance than conventional DFAIII synthase.
  • the present inventors have also found that DFAIII synthase can be produced at low cost by carrying out an enzymatic reaction by adding inulin synthase and DFAIII synthase to a sucrose solution.
  • the present invention includes the following inventions.
  • DFAIII synthase derived from Curtobacterium sp. D436-1 strain (NITE BP-764), which has an activity to convert inulin into DFAIII.
  • a method for producing DFAIII which comprises contacting the DFAIII synthase according to any one of (1) to (4) with inulin.
  • a method for producing DFAIII which comprises reacting sucrose with an enzyme that converts sucrose into inulin and the DFAIII synthetase according to any one of (1) to (4). .
  • Curtobacterium sp. D436-1 strain (NITE BP-764) or a mutant thereof.
  • DFAIII synthases derived from microorganisms have too low enzyme activity or low heat resistance and are considered to be problematic for continuous use in industrial production
  • the present inventors have found inulin to be DFAIII.
  • microorganisms that produce enzymes that convert to As a result of intensive studies, it was found that microorganisms of the genus Kurtobacterium produce DFAIII synthase having high enzyme activity and excellent heat resistance.
  • the enzyme also has a novel amino acid sequence at the N-terminus.
  • the DFAIII synthase of the present invention has an activity of synthesizing DFAIII from inulin, has high enzyme activity and excellent heat resistance.
  • the DFAIII synthase of the present invention has the following physicochemical properties.
  • pH stability Stable at pH 3-11.
  • the DFAIII synthase of the present invention has an excellent enzyme activity as compared with the conventional DFAIII synthase.
  • the DFAIII synthase of the present invention usually has an enzyme activity of 95 ⁇ u / ml or more, preferably 100 ⁇ u / ml or more, and more preferably 110 ⁇ u / ml or more.
  • the enzyme activity refers to that measured by quantifying the amount of DFAIII produced from inulin by an enzyme reaction by HPLC. That is, 0.5 ml of enzyme solution was added to 0.50 ml of 20% inulin and 20 mM phosphate buffer (pH 6), reacted at 37 ° C for 60 minutes, stopped by boiling for 5 minutes, and DFAIII produced was measured by HPLC. To do.
  • 1 unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mole (micromolar) of DFAIII per minute.
  • the residual activity represents the residual activity with respect to the activity at 25 ° C. as 100%.
  • the DFAIII synthase of the present invention is excellent in heat resistance, the reaction can be carried out at a high reaction temperature. Therefore, even if a substrate inulin having poor water solubility is present at a high concentration, inulin does not precipitate, and DFAIII is efficiently produced. Can be synthesized.
  • the DFAIII synthase of the present invention has a partial amino acid sequence: N-terminal amino acid sequence: Pro-Ala-Asp-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Thr-Leu (SEQ ID NO: 1) at its N-terminus.
  • the DFAIII synthase of the present invention can be obtained, for example, by determining the base sequence encoding the partial amino acid sequence, designing and synthesizing appropriate primers based on this base sequence, and performing PCR. After the entire base sequence encoding the DFAIII synthase of the present invention has been determined, for example, the entire gene sequence is cloned and expressed using a known genetic engineering technique. Enzymes can be obtained. Or it can also extract
  • the microorganism is not particularly limited as long as it belongs to the genus Kurtobacterium which produces the DFAIII synthase of the present invention, and may be a known strain or a strain newly isolated from soil, seawater, etc. Good. Alternatively, a mutant strain in which the DFAIII-producing ability of the enzyme is improved by subjecting these strains to mutation treatment (for example, ultraviolet irradiation, nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS)), etc. .
  • mutation treatment for example, ultraviolet irradiation, nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS)
  • Kurtobacterium sp. D436-1 strain Kurtobacterium sp. D436-1 strain. Kurtobacterium sp. D436-1 is available from the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan (zip code 292-0818) Deposited as NITE BP-764 on May 26, 2009 (original deposit date).
  • This strain of Kurtobacterium sp. D436-1 was newly isolated from nature by the present inventors, and was identified as a strain belonging to the genus Kurtobacterium as follows.
  • Kurtobacterium sp. D436-1 The general properties of Kurtobacterium sp. D436-1 were as follows. Aerobic: (+), Gram staining: positive, shape: Neisseria gonorrhoeae (0.6-0.7 ⁇ 1.0-1.2 ⁇ m), colony color: yellow.
  • the base sequence of the 16S) rDNA gene (500 bp) was determined (MicroSeqNC500 16S) outsourced to NCIMB Japan Co., LTD. rDNA Bacterial Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) was used, and a molecular phylogenetic tree based on the base sequence of the 16S rDNA gene was prepared for phylogenetic analysis.
  • the determined nucleotide sequence of the 16S rDNA gene of the D436-1 strain is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the 16S rDNA base sequence was obtained, homology search was performed, and a molecular phylogenetic tree was constructed by the proximity binding method using the 16S rDNA of the top 30 homology rates and the D436-1 strain. The relationship species and attribution classification were examined.
  • the 16S rDNA partial nucleotide sequence of the D436-1 strain showed the highest homology to the 16S rDNA derived from the genus Kurtobacterium, and the homology rate was 99.6%. It showed the highest homology to the 16S rDNA of Curtobacterium recitreum.
  • the 16S DNA rDNA partial nucleotide sequence of D436-1 strain showed the highest homology to 16S rDNA derived from Kurtobacterium sp.
  • the D436-1 strain is the Kurtobacterium flaccumfaciens or Kurtobacterium pusillum, Curtobacterium citreum, Curtobacterium luteum It showed high homology of 99% or more to 16S rDNA.
  • the D436-1 strain belongs to the genus Kurtobacterium and may belong to any of the above four species, the base sequence of 16S rDNA does not completely match, The strain was considered to be a close but systematically different strain and was designated as Curtobacterium sp. Based on the above, the D436-1 strain was determined to be a novel microorganism belonging to the genus Kurtobacterium.
  • the DFAIII synthase of the present invention is collected from a microorganism culture solution, for example, it can be carried out as follows: First, a microorganism belonging to the genus Kurtobacterium that produces the DFAIII synthase of the present invention, preferably a strain of Kurtobacterium sp. D436-1, is cultured under appropriate conditions.
  • the medium used for the culture may be either a natural medium or a synthetic medium.
  • the carbon source for example, sugars such as glucose, sucrose, maltose and fructose, organic acids such as acetic acid, citric acid and fumaric acid or salts thereof, alcohols such as ethanol and glycerol can be used.
  • the nitrogen source for example, various inorganic and organic acid ammonium salts can be used in addition to general natural nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract and amino acids.
  • inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid and boric acid or salts thereof, inorganic salts containing sodium, magnesium, potassium, calcium, etc., iron, manganese, zinc, cobalt, nickel trace metal salts, vitamins as microorganism growth promoters Vitamins such as B1, B2, C, and K can be added as needed.
  • the production amount of DFAIII synthase can be increased by adding inulin as an inducer to the medium.
  • a liquid medium having a pH of 7 to 8 containing inulin 1 to 2% (w / v), peptone 1%, yeast extract 0.5%, and potassium phosphate 0.1% can be used.
  • Microorganism is usually cultured at 30 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like, and is preferably set to pH 5 to 9, particularly preferably pH 7 to 8.
  • the culture time may be a time longer than the microorganisms can grow, and is 5 to 96 hours, preferably 15 to 24 hours.
  • the collection of the DFAIII synthase of the present invention can be carried out, for example, by collecting the culture solution since the enzyme activity is mainly observed in the culture supernatant of the microorganism (cultured cells).
  • the collection of the culture solution can be carried out using a known solid-liquid separation method, for example, a method of centrifuging the culture solution or a method of separating by membrane filtration, but is not limited thereto.
  • the DFAIII synthase of the present invention collected as described above can be used as a crude enzyme solution in a liquid form such as a culture solution as it is in the method for producing DFAIII of the present invention described later, but is preferably concentrated. To use.
  • concentration method a method known to those skilled in the art, for example, a solvent precipitation method using acetone or isopropanol, an ammonium sulfate fractionation method, a membrane concentration method, or the like is used, but is not limited thereto.
  • the enzyme solution can be immobilized by a known method.
  • the immobilization method include, but are not limited to, a binding method to an ion exchanger, a covalent bond with a resin or a membrane, an adsorption method, and a comprehensive method using a polymer substance.
  • the DFAIII synthase of the present invention can be used as a crude enzyme (for example, the above crude enzyme solution) as it is, but a method known to those skilled in the art, for example, ion exchange chromatography using a commercially available resin, gel Further purification can be performed by filtration chromatography or the like.
  • microorganisms are cultured, sterilized by centrifugation, concentrated by ultrafiltration membrane, and subjected to SDS gel electrophoresis through various purification steps such as phenyl-toyopearl 650M hydrophobic chromatography and DEAE-toyopearl 650M anion exchange column chromatography.
  • SDS gel electrophoresis through various purification steps such as phenyl-toyopearl 650M hydrophobic chromatography and DEAE-toyopearl 650M anion exchange column chromatography.
  • the present invention also relates to a method for producing DFAIII.
  • the method for producing DFAIII of the present invention includes contacting the DFAIII synthase of the present invention with inulin.
  • the DFAIII synthase can be brought into contact with inulin by bringing the culture solution of the microorganism producing DFAIII synthase or the cultured cells or treated product thereof into contact with inulin.
  • contact with inulin specifically means that the DFAIII synthase of the present invention, a culture solution of microorganisms that produce the enzyme, cultured cells, or a processed product thereof are added to a reaction solution containing inulin. These means that the reaction is carried out in the reaction solution under the conditions that can produce DFAIII using inulin as a substrate.
  • the “microorganism culture solution” includes the culture solution itself (crude enzyme solution) or the DFAIII synthase concentrated, immobilized and purified.
  • “Cultivated cells” include live cells as they are, freeze-dried, and those in the form of acetone powder and the like.
  • “Processed cells of cultured cells” include, for example, crushed cells of the above cultured cells, cell-free extracts, immobilized cells, crude enzymes, purified enzymes, genetically modified microorganisms, and the like.
  • the disrupted cells and cell-free extract of cultured cells mean substances and extracts obtained by crushing the cells by known crushing methods such as ultrasonic crushing, dynomill crushing, and French press crushing. To do.
  • the immobilized microbial cells mean those obtained by immobilizing the microbial cells by a known immobilization method, for example, a comprehensive method or a carrier binding method, and cross-linking as necessary. Examples of the inclusion method include a method using a natural polymer such as carrageenan or alginic acid.
  • the appropriate concentration of inulin in the reaction solution is, for example, 1 to 35% (w / w), preferably 20 to 30% (w / w).
  • the amount of DFAIII synthase used is not particularly limited and is appropriately determined.
  • the amount of DFAIII synthase is 0.1 unit or more, preferably 200 units or more, per 1 mol of inulin as a normal raw material.
  • the enzyme reaction is usually carried out at a temperature of about 20 to 65 ° C., preferably 45 to 55 ° C., and is completed in about 24 hours under optimum conditions.
  • the pH in the enzyme reaction system is in a range where the enzyme is not inactivated, usually preferably about pH 4 to 8, more preferably about pH 5 to 7.
  • the DFAIII production method of the present invention uses the immobilized enzyme obtained by immobilizing the DFAIII synthase of the present invention according to known immobilization means, for example, ion binding method, physical adsorption method, gel inclusion method, microcapsule method. It can also be carried out continuously. According to the continuous method using the immobilized enzyme, DFAIII having a constant purity can be easily obtained.
  • the above-described method using the immobilized enzyme is usually performed by filling the immobilized enzyme in a suitable column and passing the raw sucrose solution. Thus, DFAIII can be obtained at a low cost and in large quantities.
  • DFAIII produced in the reaction solution can be purified according to a known method. Purification can be carried out, for example, by purifying the obtained reaction solution with an ion exchange resin or activated carbon, concentrating it with reduced pressure or using a reverse osmosis membrane, and then cooling to obtain DFAIII crystals. Alternatively, DFAIII can be precipitated and recovered by adding an organic solvent such as ethanol to the reaction solution, but is not limited thereto.
  • the present invention also relates to a method for producing DFAIII by using sucrose as a raw material and using the DFAIII synthase of the present invention in combination with an inulin synthase. That is, the method includes allowing inulin synthase and DFAIII synthase to act on sucrose. To make inulin synthase and DFAIII synthase act on sucrose, contact insulin synthase and DFAIII synthase with sucrose at the same time. Contacting the enzyme is included.
  • the DFAIII synthase of the present invention is as already described.
  • the inulin synthase is not particularly limited as long as it is an enzyme having an activity of converting sucrose into inulin, and may be a known one or obtained by culturing a microorganism. It is particularly desirable to use the inulin synthase described in WO 02/00865, but 1-SST (EC2.4.1.99) and 1-FFT (EC 2.4.1.100) involved in inulin synthesis in plants. May be used, and is not particularly limited as long as it produces ⁇ - (2,1) fructan from sucrose.
  • Bacillus sp. 217C-11 an enzyme produced by Bacillus sp. 217C-11 strain (FERM BP-7450) described in WO 02/00865 is preferable.
  • Bacillus sp. 217C-11 is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (former name: Ministry of Economy, Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute of Technology) -1 Deposited at Tsukuba Center Central No. 6 (zip code 305-8566) on June 14, 2000 (original deposit date) as deposit number FERM BP-7450.
  • a method for culturing the strain and a method for preparing the enzyme are described in WO 02/00865.
  • This inulin synthase derived from Bacillus sp. 217C-11 strain has the following physicochemical properties.
  • pH stability Stable at pH 6 and above.
  • the inulin synthase is Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr- Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile (SEQ ID NO: 3) The N-terminal amino acid sequence.
  • Each enzyme can be brought into contact with inulin by bringing the culture solution or cultured cells of microorganisms producing each enzyme into contact with inulin. That is, even when inulin synthase and DFAIII synthase are allowed to act on sucrose to produce DFAIII, the usage form of the enzyme is not particularly limited, and purified enzyme, crude enzyme, culture medium of microorganism that produces the enzyme, or culture DFAIII can be produced by contacting bacterial cells or treated products thereof with sucrose.
  • contacting with sucrose means adding an inulin synthase and DFAIII synthase, a culture broth of microorganisms that produce each enzyme, or cultured cells or processed products thereof to a reaction solution containing sucrose, It means to react.
  • microorganism culture solution, cultured cells, and processed products thereof are as described above.
  • a culture solution or cultured cells of microorganisms producing inulin synthase and microorganisms producing DFAIII synthase, or cultured cells thereof or processed products thereof may be added, or both inulin synthase and DFAIII synthase You may add the culture solution of the microorganism which produces, a cultured microbial cell, or its processed material.
  • a genetically modified microorganism can be used as a microorganism that produces both inulin synthase and DFAIII synthase.
  • a genetically modified microorganism is a microorganism in which a gene encoding the enzyme is incorporated into a host cell so that the enzyme can be expressed.
  • the amount of each enzyme used is not particularly limited and is appropriately determined.
  • the inulin synthase should be 0.1 units or more, preferably 200 units or more, and the DFAIII synthase should be 0.1 units or more, preferably 200 units or more, per 1 mol of sucrose as a normal raw material.
  • the enzyme reaction is usually carried out at a temperature of about 20 to 65 ° C., preferably 45 to 55 ° C., and is completed in about 24 hours under optimum conditions.
  • the pH in the enzyme reaction system is in a range where none of the enzymes to be used is inactivated, usually in the range of about 5 to 8, more preferably in the range of about 6 to 7.
  • Example 1 Preparation of DFAIII Synthase A strain of Kurtobacterium sp. D436-1 containing 1 to 2% (w / v) inulin, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.1% potassium phosphate 1%, pH 7-8 After culturing in a liquid medium, it is sterilized by centrifugation, concentrated by ultrafiltration membrane, and subjected to SDS gel electrophoresis through various purification steps such as phenyl-toyopearl 650M hydrophobic chromatography and DEAE-toyopearl 650M anion exchange column chromatography. And purified to homogeneity.
  • the enzyme activity of the obtained DFAIII synthase was measured by quantifying the amount of DFAIII produced by the enzyme reaction using inulin as a substrate by HPLC.
  • 0.5 ml of enzyme solution was added to 0.5 ml of 20% inulin, 20 mM phosphate (citrate) buffer (pH 5), reacted at 37 ° C for 60 minutes (at 55 ° C for 10 minutes), and stopped by boiling for 5 minutes.
  • the produced DFAIII was measured by HPLC.
  • 1 unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 ⁇ mole (micromole) of DFAIII per minute.
  • the quantitative HPLC conditions are as follows.
  • Example 2 Measurement of thermostability of DFAIII synthase 1 mL of DFAIII synthase solution produced by Kurtobacterium sp. D436-1 strain was placed in an Eppendorf tube, and 30 at 37, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ° C. After the minute treatment, it was cooled to water and returned to room temperature. For the heat-treated enzyme solution, the activity of the remaining enzyme was measured according to the enzyme activity measurement method shown below, and the relative activity with respect to the one not subjected to heat treatment was determined. The results are shown in FIG.
  • the DFAIII synthase produced by Kurtobacterium sp. D436-1 has very high heat resistance, no decrease in activity is observed up to 80 ° C, and the residual rate of enzyme activity (residual activity) at 90 ° C is 80%. This high heat resistance was the highest among similar enzymes known so far.
  • DFAIII was produced from sucrose Inulin synthase produced by inulin synthase that synthesizes inulin from sucrose (Bacillus sp. 217C-11 strain (FERM BP-7450 described in WO 02/00865)) DFAIII was produced from sucrose by combining DFAIII synthase (hereinafter abbreviated as “DPE”) produced by Kurtobacterium sp. D436-1 strain.
  • DPE DFAIII synthase
  • FIG. 2 shows the result of calculating each content (w / w%) from the peak area of the standard solution with reference to the specific gravity 1.2 of the 50% sucrose aqueous solution.
  • Sucrose was consumed as the reaction time passed, and DFAIII formation was observed along with it, and 16 hours after the start of the reaction, equilibrium was reached at a conversion rate of 38%.
  • the amount of glucose produced gradually increased, but reached equilibrium at about 55% after 6 hours from the start of the reaction.
  • DFAIII can be produced by allowing inulin synthase and DFAIII synthase to act on sucrose.
  • Example 4 Production of DFAIII from Sucrose Using Immobilized Enzyme DFAIII was produced by treating an inulin prepared from sucrose using IPE with immobilized DPE.
  • the composition of the obtained reaction product (final reaction solution) was as follows.
  • FIG. 3 shows the sugar composition of the intermediate reaction solution and the final reaction solution.
  • the combined use of IPE and immobilized DPE enabled enzymatic production of DFAIII using sucrose as a raw material.
  • the conversion rate of DFAIII from sucrose used as the starting material was 25%.
  • immobilizing DPE continuous production of DFAIII is possible, and it can be used repeatedly compared to disposable bioenzyme reactions, so the production cost can be reduced.

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Abstract

　耐熱性及び酵素活性に優れたDFAIII合成酵素を提供する。　本発明は、イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素に関する。

Description

ジフルクトース・ジアンヒドリドIII合成酵素
　本発明はジフルクトース・ジアンヒドリドIII（α-D-フルクトフラノース-β-D-フルクトフラノース-1,2';2,3'-ジアンヒドリド、以下、DFAIIIと略記)合成酵素、該酵素を産生する微生物、ならびにDFAIIIの製造方法に関する。
　DFAIIIは、フラクトース2分子が1,2';2,3'で結合した難消化性の2糖類であり、低カロリー素材としてまた、ミネラル類の吸収を高める生理機能を有する食品として、あるいは高い水溶性や耐酸性、非褐変性といった優れた加工特性を有する食品素材として興味が持たれている。DFAIIIは、ジャクソンらによって単離・同定された物質であり(非特許文献１)、彼らはフラクトースを主構成糖とする多糖であるイヌリンを酸加水分解することにより得ているが、収率がわずか2%と低かった。その後、イヌリンを原料として微生物酵素を利用したDFAIIIの製造方法が報告された。特許文献１においては、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）由来の酵素を、特許文献２及び３においては、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来の酵素を、特許文献４においては、アルスロバクター・イリシス（Arthrobacter ilicis）由来の酵素を、非特許文献２においては、レイフソニア（Leifsonia）sp.T88-4を用いたDFAIIIの製造方法が報告されている。
　しかし、耐熱性及び酵素活性において満足できるDFAIII合成酵素については知られていない。また、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属由来のDFAIII合成酵素についても知られていない。
特公平07-002116号公報 特開昭63-219372号公報 特開昭63-219389号公報 特開平1-225492号公報
Bur.Stand.J.Res.,3(27),1929 Carbohydrate Polymers 66, p.75-80 (2006)
　DFAIIIの製造に用いられる原料のイヌリンは、水溶性に乏しく酵素反応に用いる場合は数パーセントという薄い濃度で用いざるを得ないものであり、反応効率が悪い上に微生物汚染のリスクが高いという問題があった。また、高濃度のイヌリンを原料として用いようとする場合には酵素反応の間にイヌリンが析出しないように反応温度を高くする必要があり、酵素に極度に高い耐熱性がなければ酵素が加熱変性してしまい反応が進まなくなる危険性があった。
　従って、本発明は、耐熱性及び酵素活性に優れたDFAIII合成酵素を提供することを目的とする。
　本発明者らは、従来のDFAIII合成酵素に比べて酵素活性が高く耐熱性に優れたDFAIII合成酵素を、クルトバクテリウム属の微生物が産生することを見出した。本発明者らはまた、スクロース溶液にイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を加えて酵素反応を行うことにより、安価にDFAIII合成酵素を製造できることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素。
（２）配列番号１のN末端アミノ酸配列を有する、（１）に記載のDFAIII合成酵素。
（３）以下の理化学的性質を有する、（１）又は（２）に記載のDFAIII合成酵素：
　分子量：46,000～48,000
　至適温度：50～60℃
　熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す
　至適pH：4～6
　pH安定性：pH3～11で安定。
（４）イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有する、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）由来のDFAIII合成酵素。
（５）DFAIIIを製造する方法であって、（１）～（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む、前記方法。
（６）（１）～（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることを含む、（５）に記載の方法。
（７）DFAIII合成酵素を産生する微生物が、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）である、（６）に記載の方法。
（８）DFAIIIを製造する方法であって、スクロースに、スクロースをイヌリンに変換する酵素と、（１）～（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素とを作用させることを含む、前記方法。
（９）スクロースをイヌリンに変換する酵素が、Bacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素である、（８）に記載の方法。
（１０）クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）またはその変異株。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-142345号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明のDFAIII合成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。 本発明のDFAIII合成酵素によるDFAIII生成の経時変化を示す図である。 本発明のDFAIII合成酵素による反応で得られる反応液の糖組成を示す図である。
　従来の微生物由来のDFAIII合成酵素は、酵素活性が低すぎたり、耐熱性が低く工業生産する上で連続的に使用するのには課題があると考えられたため、本発明者らはイヌリンをDFAIIIに変換する酵素を産生する微生物の検索を行った。鋭意検討した結果、クルトバクテリウム属の微生物が、酵素活性が高く耐熱性に優れたDFAIII合成酵素を産生することを見出した。当該酵素は、N末端のアミノ酸配列も新規なものであった。
　本発明のDFAIII合成酵素は、イヌリンからDFAIIIを合成する活性を有し、酵素活性が高く耐熱性に優れる。本発明のDFAIII合成酵素は、以下の理化学的性質を有する。
　分子量：46,000～48,000、好ましくは47,000 (SDS-PAGE)
　至適温度：50～60℃、好ましくは55℃
　熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す。
　至適pH：4～6、好ましくは5（37℃）
　pH安定性：pH3～11で安定。
　本発明のDFAIII合成酵素は、従来のDFAIII合成酵素と比較した優れた酵素活性を有する。本発明のDFAIII合成酵素は、通常、95 u/ml以上、好ましくは100 u/ml以上、さらに110 u/ml以上の酵素活性を有する。ここで、酵素活性は、イヌリンから酵素反応によって生じるDFAIIIの生成量をHPLCで定量することで測定したものをさす。即ち、20%イヌリン、20mMリン酸緩衝液（pH6）0.50mlに酵素液0.5mlを加えて37℃条件下で60分間反応させ、5分間の煮沸によって反応停止後、生成したDFAIIIをHPLCにより測定する。ここで1単位（unit）の酵素活性は1分間に1μmole（マイクロモル）のDFAIIIを生成させる酵素量と定義する。また、残存活性とは、25℃での活性を100％として、これに対する残存活性を表す。
　本発明のDFAIII合成酵素は、耐熱性において優れることから、高い反応温度で反応を実施でき、従って、水溶性に乏しい基質イヌリンを高濃度で存在させてもイヌリンが析出せず、効率的にDFAIIIを合成することができる。
　さらに、本発明のDFAIII合成酵素は、そのN末端に部分アミノ酸配列：N末端アミノ酸配列：Pro-Ala-Asp-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Thr-Leu（配列番号１）を有する。
　従って、本発明のDFAIII合成酵素は、例えば、前記部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を決定し、この塩基配列を元に適当なプライマーを設計・合成してPCRを行うことにより得ることができる。また、本発明のDFAIII合成酵素をコードする全塩基配列が決定された後は、例えばその全遺伝子配列をクローニングし、これを公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させることにより本発明のDFAIII合成酵素を得ることができる。あるいは、該酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物から採取することもできる。
　前記微生物は、本発明のDFAIII合成酵素を産生するクルトバクテリウム属に属する微生物であれば特に限定されるものではなく、公知の菌株、又は新たに土壌・海水等から分離した菌株であってもよい。あるいは、それらの菌株に変異処理（例えば、紫外線照射、ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホン酸（EMS））等を施すことによりその酵素のDFAIII生成能を向上させた変異株であってもよい。
　具体的には、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp. D436-1株を挙げることができる。クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp. D436-1株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号292-0818）に、平成21年（2009年）5月26日付け（原寄託日）に、受託番号NITE BP-764として寄託されている。
　このクルトバクテリウムsp.D436-1株は、本発明者らにより新たに自然界より分離された菌株であり、以下のとおり、クルトバクテリウム属に属する菌株であると同定されたものである。
　クルトバクテリウムsp.D436-1株の一般的性質は次のとおりであった。好気性：（＋）、グラム染色：陽性、形状：桿菌（0.6-0.7×1.0-1.2μm）、コロニー色調：黄色。
　当該菌株（以下、D436-1株と称する）について、株式会社エヌシーアイエムビー・ジャパン(NCIMB Japan Co., LTD)に委託して、16S rDNA遺伝子の塩基配列（500 bp）を決定（MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA)を使用）し、さらに16S rDNA遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を作製し、系統分析を行った。決定されたD436-1株の16S rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
　得られた16S rDNAの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率上位30株とD436-1株の16S rDNAを用いて近接結合法により分子系統樹を作製し、D436-1株の近縁種及び帰属分類の検討を行った。BLASTを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、D436-1株の16S rDNA部分塩基配列はクルトバクテリウム属由来の16S rDNAに対し最も高い相同性を示し、相同率99.6%でクルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。
　GenBank(GenBank/EMBL/DDBJ 国際DNA配列データベース)に対する相同性検索も行った結果、D436-1株の16S rDNA部分塩基配列はクルトバクテリウム属由来の16S rDNAに対し最も高い相同性を示し、基準株ではD436-1株は、クルトバクテリウム・フルックムファシエンス（Curtobacterium flaccumfaciens）又はクルトバクテリウム・プシルム（Curtobacterium pusillum）、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）の16S rDNAに対し、99%以上の高い相同性を示した。
　なお、現在の細菌基準株データベースには、クルトバクテリウム・プシルム基準株由来の塩基配列の登録はないため、D436-1株の16S rDNAと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位30株の16S rDNAにクルトバクテリウム・プシルム株の16S rDNAを加えて簡易分子系統樹解析を行った結果、D436-1株は、クルトバクテリウム属の16S rDNAが形成するクラスター内に含まれたが、単独で系統枝を形成した。
　したがって、D436-1株はクルトバクテリウム属に属し、上記４種の何れかに帰属する可能性はあるものの、16S rDNAの塩基配列は完全には一致していないため、クルトバクテリウム・シトレウムに近縁であるが系統的に異なる菌株であると考え、クルトバクテリウム エスピー（Curtobacterium sp.）とした。以上のことから、D436-1株は、クルトバクテリウム属に属する新規な微生物であると判断した。
　本発明のDFAIII合成酵素を微生物の培養液から採取する場合、例えば、次のようにして実施することができる；
　まず、本発明のDFAIII合成酵素を産生するクルトバクテリウム属微生物、好ましくはクルトバクテリウムsp.D436-1株を適切な条件下で培養する。
　培養に使用する培地は、天然培地又は合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸又はその塩、あるいはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸等の無機酸又はその塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム等を含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンB1、B2、C、K等のビタミン等を必要に応じて適宜添加できる。さらに、誘導剤としてイヌリンを培地に添加することで、DFAIII合成酵素の生産量を高めることができる。具体的な培地としては、イヌリン1～2%（w/v）、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、リン酸1カリウム0.1%を含むpH7～8の液体培地を用いることができる。
　微生物の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30～40℃、好ましくは25～37℃で行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、好ましくはpH5～9、特に好ましくはpH7～8に設定する。培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であればよく、5～96時間、好ましくは15～24時間である。
　本発明のDFAIII合成酵素の採取は、その酵素活性が主として上記微生物（培養菌体）の培養上清中に認められるため、例えば、その培養液を採取することにより実施することができる。
　培養液の採取は、公知の固液分離法、例えば、培養液を遠心分離する方法、あるいは膜濾過により分離する方法などを用いて実施することができるが、これらに限定されない。上記の通りにして採取された本発明のDFAIII合成酵素は、培養液等の液状形態で粗酵素液としてそのまま後述の本発明のDFAIIIの製造方法に用いることも可能であるが、好ましくは濃縮して使用する。
　濃縮方法としては、当業者に公知の手法、例えばアセトン、イソプロパノールによる溶媒沈殿法、硫安分画法、膜濃縮法などが用いられるが、これらに限定されない。
　さらに、上記酵素液を公知の方法により固定化することもできる。固定化方法としては、例えばイオン交換体への結合法、樹脂や膜などとの共有結合・吸着法・高分子物質を用いた包括法などが用いられるがこれらに限定されない。
　また、本発明のDFAIII合成酵素は、粗酵素（例えば、上記の粗酵素液）のまま使用することもできるが、当業者に公知の方法、例えば市販の樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等によってさらに精製することもできる。
　例えば、微生物を培養後、遠心分離により除菌し、限外ろ過膜によって濃縮し、Phenyl-toyopearl 650M疎水クロマトグラフィー、DEAE-toyopearl 650M陰イオン交換カラムクロマトグラフィなどの各種精製工程を経てSDSゲル電気泳動的に均一に精製したものを酵素液として使用することができ、単に培養液を濃縮したものを用いてもよい。
　本発明はまた、DFAIIIの製造方法に関する。本発明のDFAIIIの製造方法は、前記本発明のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む。DFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることによって、DFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることもできる。
　すなわち、「イヌリンに接触させる」とは、具体的には、イヌリンを含有する反応液に本発明のDFAIII合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加し、これらが反応液中でイヌリンを基質としてDFAIIIを生成しうる条件下で反応させることを意味する。
　「微生物の培養液」には、培養液そのもの（粗酵素液）、あるいはDFAIII合成酵素が濃縮、固定化、精製された形態のものが含まれる。
　「培養菌体」には、生菌そのまま、凍結乾燥されたもの、さらにはアセトンパウダー等の形態のものが含まれる。
　「培養菌体の処理物」には、例えば、上記培養菌体の破砕物、無細胞抽出物、固定化菌体、粗酵素、精製酵素、遺伝子組換え微生物等が含まれる。培養菌体の破砕物及び無細胞抽出物とは、該菌体を公知の破砕方法、例えば超音波破砕法、ダイノミル破砕法、フレンチプレス破砕法により破砕して得られる物質及び抽出物等を意味する。また、固定化菌体とは、公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法で前記菌体を固定化し、必要に応じて架橋したものを意味する。包括法としては、例えば、カラギーナンやアルギン酸等の天然高分子を用いる方法が挙げられる。
　前記反応液中の適切なイヌリンの濃度は、例えば、1～35%(w/w)、好ましくは20～30%(w/w)とする。
　DFAIII合成酵素の使用量は特に制限されず、適宜決定される。通常原料とするイヌリン1モルに対してDFAIII合成酵素を0.1単位以上、好ましくは200単位以上とするのがよい。
　酵素反応は通常、約20～65℃、好ましくは45℃～55℃の温度下で行われるのがよく、最適条件下においては約24時間前後で完了する。また、酵素反応系におけるpHは、酵素が失活しない範囲、通常好ましくは、約pH4～8、より好ましくは約pH5～7の範囲がよい。
　本発明のDFAIII製造方法は、本発明のDFAIII合成酵素を公知の固定化手段、たとえばイオン結合法、物理的吸着法、ゲル包括法、マイクロカプセル法に従い固定化し、得られる固定化酵素を用いて連続的に実施することもできる。この固定化酵素を用いる連続的方法によれば、一定した純度のDFAIIIが容易に取得できる。上記固定化酵素を用いる方法は、通常、固定化酵素を適当なカラムに充填し、原料スクロース溶液を通過させることにより行われる。かくして安価に且つ大量にDFAIIIを取得できる。
　反応液中に生成されたDFAIIIは、公知の方法に従い精製することができる。精製は、例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂あるいは活性炭等で精製し、これを減圧濃縮あるいは逆浸透膜によって濃縮し、次いで冷却してDFAIIIの結晶を得ることにより実施することができる。あるいはまた、反応液にエタノールなどの有機溶媒を添加することにより、DFAIIIを沈殿させて回収することも可能であるが、これらに限定されない。
　本発明はまた、スクロースを原料として、本発明のDFAIII合成酵素をイヌリン合成酵素と組み合わせて用いることにより、DFAIIIを製造する方法にも関する。すなわち、該方法は、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることを含む。スクロースにイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることには、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を同時に接触させること、ならびにスクロースにイヌリン合成酵素を接触させた後、生成したイヌリンにDFAIII合成酵素を接触させることが包含される。本発明のDFAIII合成酵素については、既に記載したとおりである。イヌリン合成酵素は、スクロースをイヌリンに変換する活性を有する酵素であれば特に制限されず、既知のものでもよく、微生物を培養して得られるものでもよい。特にWO 02/00865に記載されているイヌリン合成酵素を用いることが望ましいが、植物体においてイヌリン合成に関与している1-SST(EC2.4.1.99)と1-FFT(EC 2.4.1.100)を用いてもよく、スクロースからβ-(2,1)フラクタンを生じせしめるものであれば特に限定されるものではない。
　イヌリン合成酵素としては具体的にはWO 02/00865に記載されているBacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生する酵素が好ましい。バチラス sp.217C-11株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧名称：経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所）、日本国茨城県つくば市東１－１－１つくばセンター中央第６（郵便番号305-8566）に、平成12年（2000年）6月14日付け（原寄託日）に、受託番号FERM BP-7450として寄託されている。当該菌株の培養方法及び酵素の調製方法については、WO 02/00865に記載されている。このBacillus sp.217C-11株由来のイヌリン合成酵素は、以下の理化学的性質を有する。
　分子量： 45,000 ～ 50,000
　至適温度： 40～50℃
　熱安定性： 40℃を越えると徐々に失活し始め、50℃で70%、60℃で40%の残存活性を示す。
　至適pH： 7～8 (45℃)
　pH安定性： pH6以上で安定。
　当該イヌリン合成酵素は、Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile（配列番号３）
のN末端アミノ酸配列を有する。
　各酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることによって、各酵素をイヌリンを接触させることもできる。すなわち、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させてDFAIIIを製造する場合も、酵素の使用形態は特に制限されず、精製酵素、粗酵素、酵素を産生する微生物の培養液、又は培養菌体もしくはその処理物をスクロースに接触させてDFAIIIを生成することができる。「スクロースに接触させる」とは、具体的には、スクロースを含有する反応液にイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素、各酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加し、反応させることを意味する。微生物の培養液、培養菌体、及びその処理物については、既に記載したとおりである。微生物を利用する場合は、イヌリン合成酵素を産生する微生物とDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加してもよいし、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の双方を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加してもよい。
　イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の双方を産生する微生物としては、遺伝子組換え微生物を利用できる。遺伝子組換え微生物とは、酵素を発現し得るように宿主細胞中に該酵素をコードする遺伝子が組み込まれた微生物のことであり、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の遺伝子を微生物に導入することによって、スクロースからDFAIIIを、イヌリンの蓄積を見ることなく生産するように改変したものである。
　スクロースを原料とするDFAIII製造方法において、各々の酵素の使用量は特に制限されず、適宜決定される。通常原料とするスクロース1モルに対してイヌリン合成酵素は0.1単位以上、好ましくは200単位以上、またDFAIII合成酵素も0.1単位以上、好ましくは200単位以上とするのがよい。
　酵素反応はイヌリンを基質とする場合と同様、通常、約20～65℃、好ましくは45℃～55℃の温度下で行われるのがよく、最適条件下においては約24時間前後で完了する。また、酵素反応系におけるpHは、用いる各酵素がいずれも失活しない範囲、通常好ましくは、約5～8、より好ましくは約6～7の範囲がよい。
　上記2種の酵素を各々別個に又は予め上記適当割合となるように混合後、公知の固定化手段、たとえばイオン結合法、物理的吸着法、ゲル包括法、マイクロカプセル法に従い固定化し、得られる固定化酵素を用いて連続的に実施することもできる。この固定化酵素を用いる連続的方法によれば、一定した純度のDFAIIIが容易に取得できる。上記固定化酵素を用いる方法は、これを適当なカラムに充填し、原料スクロース溶液を通過させることにより行われる。かくして安価に且つ大量にDFAIIIを取得できる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。
実施例１　DFAIII合成酵素の調製
　クルトバクテリウムsp.D436-1株をイヌリン1～2%（w/v）、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、リン酸1カリウム0.1%を含むpH7～8の液体培地で培養後、遠心分離により除菌し、限外ろ過膜によって濃縮し、Phenyl-toyopearl 650M疎水クロマトグラフィー、DEAE-toyopearl 650M陰イオン交換カラムクロマトグラフィなどの各種精製工程を経てSDSゲル電気泳動的に均一に精製した。
　得られたDFAIII合成酵素の酵素活性を、イヌリンを基質として酵素反応によって生じるDFAIIIの生成量をHPLCで定量することで測定した。即ち、20%イヌリン、20mMリン酸（クエン酸）緩衝液（pH5）0.5mlに酵素液0.5mlを加えて37℃で60分間（55℃で10分間）反応させ、5分間の煮沸によって反応停止後、生成したDFAIIIをHPLCにより測定した。ここで1単位（unit）の酵素活性は1分間に1μmole（マイクロモル）のDFAIIIを生成させる酵素量と定義した。定量HPLC条件は以下のとおりである。
　カラム：　　ULTRON PS-80N(φ8×300mm)
　溶離液：　　蒸留水
　流量：　　　0.5 ml/分
　カラム温度： 50℃
　検出器：　　示差屈折計
　注入量：　　10μL
　その結果、クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素の酵素活性は、117 u/mlであり、これまでに知られている同類の酵素と比べて非常に高いものであることがわかった。
実施例２　DFAIII合成酵素の耐熱性の測定
　クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素液1ｍLをエッペンドルフチューブに採り、37、40、50、60、70、80、90℃において30分処理した後、水冷して常温に戻した。熱処理した酵素液は以下に示す酵素活性測定法に従って残存酵素の活性を測定し、熱処理を行わなかったものに対する相対活性を求めた。結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素は、耐熱性が非常に高く、80℃までは活性の減少は認められず、90℃での酵素活性の残存率（残存活性）は80％であった。この耐熱性の高さはこれまでに知られている同類の酵素の中で最も高いものであった。
実施例３　スクロースからのDFAIIIの製造
　スクロースからイヌリンを合成するイヌリン合成酵素(WO 02/00865に記載されているBacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素、以下「IPE」と略す)、クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素(以下「DPE」と略す)を組み合わせることにより、スクロースからDFAIIIを製造した。
　0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.5)でpHを調整した50%のスクロース水溶液20gにIPE（250 u/ml）及びDPE (376 u/ml)を各0.3ml加えて55℃で酵素反応を行った。反応終了後、試料を脱塩した後、HPLCにより糖組成の分析を行った（カラム：MCI GEL(三菱化学)、溶離液：水、温度：75℃、流量：0.4mL/min、検出：示差屈折計）。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、スクロース50％水溶液の比重1.2を参考に、標準液のピーク面積から各含有量(w/w%)を計算した結果を図２に示す。
　反応時間の経過に伴いスクロースが消費され、それに伴ってDFAIIIの生成が認められ、反応開始から16時間後、転換率38％で平衡に達した。グルコース生成量は徐々に増加したが、反応開始から6時間以降は約55％で平衡に達した。
　以上から、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることにより、DFAIIIを製造できることが示された。
実施例４　固定化酵素を用いたスクロースからのDFAIIIの製造
　スクロースからIPEを用いてイヌリンを調製した溶液を、固定化DPEで処理することによってDFAIIIを製造した。
　pH7.0に調整した46%スクロース溶液にIPE(250 u/ml)を固形スクロース分に対して1%添加し、55℃、48時間の酵素反応を行うことにより、イヌリン:44%、スクロース:9.5%、グルコース:43.7%、フラクトース:1.7%という組成の反応混合物(中間反応液)が得られた。
　この反応混合物をクエン酸緩衝液でpH5.0に調整し、Bx30に希釈したうえで、引き続きDPEを固定化した樹脂を充填したカラム(4ml)に、SV=6の流量で通液を行い、カラム容積の約40倍量の回収液を得た。得られた反応物(最終反応液)の組成は以下の通りであった。また、中間反応液と最終反応液の糖組成を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上のように、IPEと固定化DPEを併用することによってスクロースを原料としたDFAIIIの酵素的生産が可能となった。初発原料として用いたスクロースからのDFAIII転換率は25%であった。DPEを固定化することによってDFAIIIの連続生産が可能となり使い捨ての生酵素反応に比べて繰り返し利用が効くため、生産コストを低減させることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
NITE BP-764
FERM BP-7450

Claims (10)

  1. 　イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素。
  2. 　配列番号１のN末端アミノ酸配列を有する、請求項１に記載のDFAIII合成酵素。
  3. 　以下の理化学的性質を有する、請求項１又は２に記載のDFAIII合成酵素：
    　分子量：46,000～48,000
    　至適温度：50～60℃
    　熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す
    　至適pH：4～6
    　pH安定性：pH3～11で安定。
  4. 　イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有する、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）由来のDFAIII合成酵素。
  5. 　DFAIIIを製造する方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む、前記方法。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　DFAIII合成酵素を産生する微生物が、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）である、請求項６に記載の方法。
  8. 　DFAIIIを製造する方法であって、スクロースに、スクロースをイヌリンに変換する酵素と、請求項１～４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素とを作用させることを含む、前記方法。
  9. 　スクロースをイヌリンに変換する酵素が、Bacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素である、請求項８に記載の方法。
  10. 　クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）またはその変異株。
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