CN114717213A - 一种葡聚糖蔗糖酶的n端截短突变酶及其制备方法 - Google Patents

一种葡聚糖蔗糖酶的n端截短突变酶及其制备方法 Download PDF

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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01005—Dextransucrase (2.4.1.5)

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶及其制备方法。本发明将已知葡聚糖蔗糖酶基因序列的N端截短，得到截短突变体酶，通过诱导表达及其活力筛选，发现获得的突变酶的酶活比原基因酶提高约20倍。选该突变酶进行酶学性质分析，发现其在酸性条件下稳定性较好且最适诱导表达温度和反应温度接近室温。本发明为理性设计和实际应用以及酶工程生产右旋糖酐奠定了基础。

Description

一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶及其制备方法。
背景技术
葡聚糖蔗糖酶(Glucansuerased)是一类α-转糖苷酶，以蔗糖为底物，将蔗糖中葡萄糖基聚合成高分子量的葡聚糖，同时释放出果糖。在有受体存在的情况下，形成低分子量寡聚糖。因葡聚糖蔗糖酶反应的特异性，产物的多样性以及对于产物合成的可操作性而使其成为生物催化合成中一种重要的工具酶，在饲料食品医药等工业领域有着广泛的应用前景。
通常蔗糖转糖苷酶(Sucrose-utlizingtransglucosidases)可以分为糖苷水解酶70和13两个家族，除淀粉蔗糖酶(Amylosucrases)属于GH13家族外，大多数葡聚糖蔗糖酶都属于GH70家族，淀粉蔗糖酶主要是一类酶促转化合成淀粉的催化剂，它并非降解淀粉，而是将蔗糖合成与淀粉类似的多聚糖。葡聚糖蔗糖酶的主要反应是产生胞外多聚糖，这些α-葡聚糖以不同类型的糖苷键相连，他们的结构和分子量大小是由酶的特异性和产酶菌株决定的。根据产生不同多聚糖的类型，葡聚糖蔗糖酶可以分为5类，这些不同的多聚糖特征一是分子量达到106以上，另一个是D-葡糖基单位以不同的共价键连接，如α-1，6、α-1，3、α-1，4、α-1，2糖苷键等。主要以α-1，6键连接的多聚糖称为Dextrans(右旋糖苷)，生产此类的酶称为Dextransucrases(右旋糖酐蔗糖酶DSR)，主要发现在明串珠球菌属；Mutansucrases主要分离自链球菌属，合成α-1，3键型葡聚糖，称为Mutan，通过加强链球菌在牙齿表面的定植和吸附而在龋齿的形成中扮演重要角色；Reuteransucrases，主要发现在乳酸菌属，产生葡聚糖主要是α-1，4和α-1，6键；Alternansucrases主要由明串珠球菌属产生，合成非典型的α-1，3与α-1，6交替的葡聚糖，称为Alternan；Amylosucrases(淀粉蔗糖酶)，来自于GH13家族，主要发现于奈瑟氏菌属、异常球菌属和交替单胞菌属，产生一个由α-1，4键构成的与淀粉高度相似的多聚糖。葡聚糖蔗糖酶可由不同的菌种产生，这些菌属包括：明串珠菌属、乳酸菌属、魏斯氏菌属、链球菌属、异常球菌属、奈瑟氏菌属、交替单胞菌属、假单胞菌属和双歧杆菌属。
当天然的葡聚糖蔗糖酶用于大规模的工业合成来生产各种低聚糖或糖基化产物时，往往会因为酶的底物特异性稳定性或催化效率等因素而受到限制。要想更深入在分子水平了解葡聚糖蔗糖酶的特性，必须在能够为工程酶的理性设计提供更多必要信息方面做最大的努力。如何提高酶的表达效率稳定性和专一性，也即如何改造出理想的葡聚糖蔗糖酶为更好的生物催化所利用，对葡聚糖蔗糖酶的应用具有重大意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶，所述N端截短突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌，所述重组菌的命名为：大肠埃希氏菌，拉丁文名称为：Escherichia coli，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年1月10日，保藏编号为：CGMCC No.24272。
本发明还提供了葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)于35～40℃的条件下培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌10～14h后，传代转接继续培养至菌液的OD600达到0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，然后24～26℃，200～250r/min培养3～5h，离心收集菌体，用醋酸钠缓冲液重悬破胞，离心，得到的上清液即为粗酶液；
(2)将所得粗酶液过镍柱进行分离纯化，得葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶。
优选的，步骤(1)中培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌采用包含卡纳霉素的LB培养基，所述卡纳霉素的质量浓度为45～55μg/mL。
优选的，步骤(1)中所述的醋酸钠缓冲液的pH为5～6。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明将已知葡聚糖蔗糖酶基因序列的N端截短，得到截短突变体酶，通过诱导表达及其活力筛选，发现获得的突变酶的酶活比原基因酶提高约20倍。对该突变酶进行酶学性质分析，发现其在酸性条件下稳定性较好且最适诱导表达温度和反应温度接近室温。本发明为理性设计和实际应用以及酶工程生产右旋糖酐奠定了基础。
附图说明
图1为葡聚糖蔗糖酶原基因酶和截短突变酶的诱导表达结果图及其酶活力图(注：P0表示原葡聚糖蔗糖酶基因；P20AA、P34AA、P59AA、P89AA、P148AA表示5个截短突变酶)；
图2为P148AA突变酶的纯化分离SDS-PAGE图(注：M表示Marker；1表示突变酶粗酶液；2表示过柱后突变酶酶液；4表示纯化后的突变酶)；
图3为P148AA突变酶的诱导条件分析图；
图4为P148AA突变酶的酶学性质分析图。
保藏说明
大肠埃希氏菌，拉丁文名称为：Escherichia coli，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年1月10日，保藏编号为：CGMCC No.24272。
具体实施方式
本发明提供了一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶，所述N端截短突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌，所述重组菌的命名为：大肠埃希氏菌，拉丁文名称为：Escherichia coli，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年1月10日，保藏编号为：CGMCC No.24272。
本发明还提供了葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)于35～40℃的条件下培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌10～14h后，传代转接继续培养至菌液的OD600达到0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，然后24～26℃，200～250r/min培养3～5h，离心收集菌体，用醋酸钠缓冲液重悬破胞，离心，得到的上清液即为粗酶液；
(2)将所得粗酶液过镍柱进行分离纯化，得葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶。
在本发明中，步骤(1)中所述于35～40℃的条件下培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌10～14h，进一步优选为于37℃的条件下培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌12h。
在本发明中，步骤(1)中所述传代转接继续培养至菌液的OD600达到0.5～0.7，进一步优选为传代转接继续培养至菌液的OD600达到0.6。
在本发明中，步骤(1)中所述加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，进一步优选为加入IPTG至终浓度为1mM。
在本发明中，步骤(1)中所述24～26℃，200～250r/min培养3～5h，进一步优选为25℃，220r/min培养4h。
在本发明中，步骤(1)中培养携带编码葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因的重组菌优选采用包含卡纳霉素的LB培养基，所述卡纳霉素的质量浓度优选为45～55μg/mL，进一步优选为50μg/mL。
在本发明中，步骤(1)中所述的醋酸钠缓冲液的pH优选为5～6，进一步优选为5.6。
下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验例1
(1)葡聚糖蔗糖酶基因克隆：本发明所述葡聚糖蔗糖酶基因dsrD来源于膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，以所述菌的全序列(AY017384.1)设计引物P1和P2扩增。所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，引物中引入了PagI(PagI-qNcoI为同尾酶)和SacI酶切位点方便连接到pET-30(a)载体上。将扩增得到的片段进行克隆得到本发明葡聚糖蔗糖酶基因。其中，葡聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)N端截短突变酶诱导表达及其活力测定：
通过N端不同位置对步骤(1)所得葡聚糖蔗糖酶基因截短获得5个突变酶，截短突变体扩增用的引物如表1所示。
表1截短突变体扩增用引物
Figure BDA0003626779450000051
葡聚糖蔗糖酶活力测定方法：
在葡聚糖蔗糖酶的作用下，蔗糖中的葡萄糖基被聚合成葡聚糖，同时释放出果糖，在总体积为1ml的反应体系中加入10μL的粗酶液和990μL的反应底物缓冲液(200mmol/L蔗糖；pH 5.6醋酸-醋酸钠缓冲液)，30℃水浴反应30min，然后加入750μL的3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴5min，用紫外分光光度法测定吸光值。
将葡聚糖蔗糖酶基因原基因和5个突变酶进行诱导表达，具体步骤如下：
将酶切和PCR验证正确的重组质粒PET-30a-dsrD转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中，从平板上挑选单菌落接种于2ml LB(含卡纳霉素50ug/mL)，37℃培养过夜，转1mL过夜菌液至250ml三角瓶中，37℃振荡培养。2.5h后取1ml菌液测OD600，当OD600到0.6时加入IPTG至终浓度为1.0mM，在25℃，220r/min的摇床中振荡培养4h，然后离心收集菌体，用pH5.6的醋酸钠缓冲液重悬破胞，离心得到上清即为粗酶液，将具有高表达高活力的突变酶过镍柱进行分离纯化，纯化后的酶液进行酶学性质分析。结果如图1所示。由图1可知，截短148个氨基酸的突变酶(P148AA)有明显的蛋白条带，其余无明显蛋白条带(条带不明显，说明基因蛋白相对表达量较低)，蛋白质的分子量大小约170kD。由图1还可知，具有明显蛋白表达的P148AA突变酶酶活力是原基因和其他突变酶的20倍。可见5个突变酶都成功在大肠杆菌中表达，也获得了酶活力更高的反应酶。
(3)P148AA突变酶的分离纯化及其酶学性质：
聚糖蔗糖酶重组酶的N端含有一组六个组氨酸的标签，而分子量太大组氨酸容易被基团覆盖，不利于纯化分析。本发明将具有高表达高活力的P148AA突变酶过镍柱进行分离纯化，结果如图2所示。由图2可知，P148AA突变酶能够结合到柱子上。说明N端截短精简后获得分子量更小的突变酶，可用亲和层析的方法纯化葡聚糖蔗糖酶。这为酶工程生产右旋糖酐奠定了基础。
P148AA突变酶的诱导条件分析图及酶学性质分析图分别如图3和图4所示。由图3和图4可知，P148AA突变酶的最佳诱导表达策略为：0.8mM IPTG、在20-25℃下诱导4h；最适反应pH为5.6，反应温度为30℃，底物浓度为400mmol/L，另外，pH值酸性的条件下4℃保存24h酶活力的变化不大，诱导时间短。这说明本发明的P148AA突变酶在酸性条件下稳定性较好且最适诱导表达温度和反应温度接近室温。这为理性设计和实际应用奠定了基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
南宁中诺生物工程有限责任公司
<120> 一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶及其制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1520
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Lys Lys Leu Tyr Lys Val Gly Lys Ser Trp Val Val Gly Gly
1 5 10 15
Val Cys Ala Phe Ala Leu Thr Ala Ser Phe Ala Leu Ala Thr Pro Ser
20 25 30
Val Leu Gly Asp Ser Ser Val Pro Asp Val Ser Ala Asn Asn Val Gln
35 40 45
Ser Ala Ser Asp Asn Thr Thr Asp Thr Gln Gln Asn Thr Thr Val Thr
50 55 60
Glu Glu Asn Asp Lys Val Gln Ser Ala Ala Thr Asn Asp Asn Val Thr
65 70 75 80
Thr Ala Ala Ser Asp Thr Thr Gln Ser Ala Asp Asn Asn Val Thr Glu
85 90 95
Lys Gln Ser Asp Asp His Ala Leu Asp Asn Glu Lys Val Asp Asn Lys
100 105 110
Gln Asp Ala Val Ala Gln Thr Asn Val Thr Ser Lys Asn Glu Glu Ser
115 120 125
Ala Val Ala Ser Thr Asp Thr Asp Pro Ala Glu Thr Thr Thr Asp Glu
130 135 140
Thr Gln Gln Val Ser Gly Lys Tyr Val Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr
145 150 155 160
Tyr Tyr Phe Asp Asp Gly Lys Asn Ala Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp
165 170 175
Asn Asn Ile Gln Tyr Phe Asp Glu Ser Gly Lys Gln Val Lys Gly Gln
180 185 190
Tyr Val Thr Ile Asp Asn Gln Thr Tyr Tyr Phe Asp Lys Asp Ser Gly
195 200 205
Asp Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ser Ile Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe
210 215 220
Asn Asp Glu Gly Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr Tyr Gln Ser Glu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Asp Lys Gly His Ala Ala Thr Gly Ile
245 250 255
Lys Asn Ile Glu Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Asp Asn Leu Gly Gln Leu
260 265 270
Lys Lys Gly Phe Ser Gly Val Ile Asp Gly Gln Ile Met Thr Phe Asp
275 280 285
Gln Glu Thr Gly Gln Glu Val Ser Asn Thr Thr Ser Glu Ile Lys Glu
290 295 300
Gly Leu Thr Thr Gln Asn Thr Asp Tyr Ser Glu His Asn Ala Ala His
305 310 315 320
Gly Thr Asp Ala Glu Asp Phe Glu Asn Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala
325 330 335
Ser Ser Trp Tyr Arg Pro Thr Asp Ile Leu Arg Asn Gly Thr Asp Trp
340 345 350
Glu Pro Ser Thr Asp Thr Asp Phe Arg Pro Ile Leu Ser Val Trp Trp
355 360 365
Pro Asp Lys Asn Thr Gln Val Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ala Asp Leu
370 375 380
Gly Phe Ile Ser Asn Ala Asp Ser Phe Glu Thr Gly Asp Ser Gln Ser
385 390 395 400
Leu Leu Asn Glu Ala Ser Asn Tyr Val Gln Lys Ser Ile Glu Met Lys
405 410 415
Ile Ser Ala Gln Gln Ser Thr Glu Trp Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala
420 425 430
Phe Ile Val Thr Gln Pro Gln Trp Asn Glu Thr Ser Glu Asp Met Ser
435 440 445
Asn Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Leu Thr Tyr Val Asn Ser Pro Leu
450 455 460
Thr Pro Asp Ala Asn Ser Asn Phe Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr
465 470 475 480
Asn Gln Thr Gly Glu Gln Ala Tyr Asn Leu Asp Asn Ser Lys Gly Gly
485 490 495
Phe Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val
500 505 510
Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu Tyr Tyr Leu Met Asn Phe Gly Thr
515 520 525
Ile Thr Ala Asn Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp
530 535 540
Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr
545 550 555 560
Phe Lys Leu Ala Tyr Gly Val Asp Gln Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln
565 570 575
His Leu Ser Ile Leu Glu Asp Trp Ser His Asn Asp Pro Leu Tyr Val
580 585 590
Thr Asp Gln Gly Ser Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Val His Thr
595 600 605
Gln Leu Ile Trp Ser Leu Thr Lys Ser Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met
610 615 620
Gln Arg Phe Val Asp Tyr Tyr Met Val Asp Arg Ser Asn Asp Ser Thr
625 630 635 640
Glu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Tyr Ser Phe Val Arg Ala His Asp Ser
645 650 655
Glu Val Gln Thr Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu Tyr Pro Asp
660 665 670
Val Glu Asn Ser Leu Ala Pro Thr Thr Glu Gln Leu Ala Ala Ala Phe
675 680 685
Lys Val Tyr Asn Glu Asp Glu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln
690 695 700
Tyr Asn Met Ala Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr
705 710 715 720
Val Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr
725 730 735
Met Ala Thr Lys Ser Pro Tyr Tyr Asp Ala Ile Asn Thr Leu Leu Lys
740 745 750
Ala Arg Val Gln Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Val Asp Ser
755 760 765
Asn Asp Val Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Asp Ala Met Thr Ala
770 775 780
Ser Asp Thr Gly Thr Ser Glu Thr Arg Thr Glu Gly Ile Gly Val Ile
785 790 795 800
Val Ser Asn Asn Ala Glu Leu Gln Leu Glu Asp Gly His Ser Val Thr
805 810 815
Leu His Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Leu
820 825 830
Ser Thr Thr Ala Asp Gly Leu Ala Tyr Tyr Asp Thr Asp Glu Asn Ala
835 840 845
Pro Val Ala Tyr Thr Asp Ala Asn Gly Asp Leu Ile Phe Thr Asn Glu
850 855 860
Ser Ile Tyr Gly Val Gln Asn Ala Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val
865 870 875 880
Trp Val Pro Ile Gly Ala Gln Gln Asp Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser
885 890 895
Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ser Asp Lys Val Phe His Ser Asn Ala Ala
900 905 910
Leu Asp Ser Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe
915 920 925
Ala Thr Asp Ser Ser Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Ala
930 935 940
Asp Gln Phe Lys Gln Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln
945 950 955 960
Tyr Arg Ser Ser Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn
965 970 975
Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Thr Pro Thr
980 985 990
Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His
995 1000 1005
Ala Ser Gly Ile Gln Ala Ile Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr
1010 1015 1020
Asn Leu Pro Glu Gln Glu Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Gly Glu Asp Asp Thr Asp Ser Asp Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Val Val
1045 1050 1055
Gln Ser Arg Gly Gly Gly Gln Tyr Gln Glu Met Tyr Gly Gly Ala Phe
1060 1065 1070
Leu Glu Glu Leu Gln Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Phe Lys Val Asn Gln
1075 1080 1085
Ile Ser Thr Gly Val Pro Ile Asp Gly Ser Val Lys Ile Thr Glu Trp
1090 1095 1100
Ala Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Lys Gly Ala Gly
1105 1110 1115 1120
Tyr Val Leu Lys Asp Met Gly Ser Asn Lys Tyr Phe Lys Val Val Ser
1125 1130 1135
Asn Thr Glu Asp Gly Asp Tyr Leu Pro Lys Gln Leu Thr Asn Asp Leu
1140 1145 1150
Ser Glu Thr Gly Phe Thr His Asp Asp Lys Gly Ile Ile Tyr Tyr Thr
1155 1160 1165
Leu Ser Gly Tyr Arg Ala Gln Asn Ala Phe Ile Gln Asp Asp Asp Asn
1170 1175 1180
Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Lys Thr Gly His Leu Val Thr Gly Leu Gln
1185 1190 1195 1200
Lys Ile Asn Asn His Thr Tyr Phe Phe Leu Pro Asn Gly Ile Glu Leu
1205 1210 1215
Val Lys Ser Phe Leu Gln Asn Glu Asp Gly Thr Ile Val Tyr Phe Asp
1220 1225 1230
Lys Lys Gly His Gln Val Phe Asp Gln Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Gly
1235 1240 1245
Asn Ala Tyr Tyr Phe Asp Asp Ala Gly Val Met Leu Lys Ser Gly Leu
1250 1255 1260
Ala Thr Ile Asp Gly His Gln Gln Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Val Gln
1265 1270 1275 1280
Val Lys Asp Lys Phe Val Ile Gly Thr Asp Gly Tyr Lys Tyr Tyr Phe
1285 1290 1295
Glu Pro Gly Ser Gly Asn Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Val Gln Asn Ser
1300 1305 1310
Lys Asn Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Gly Asn Gly His Ala Val Thr Gly
1315 1320 1325
Phe Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Gln Tyr Phe Tyr Asn Asp Gly His
1330 1335 1340
Gln Ser Lys Gly Glu Phe Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Thr
1345 1350 1355 1360
Ser Ala Thr Asp Gly Arg Leu Val Thr Gly Val Gln Lys Ile Asn Gly
1365 1370 1375
Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Asn Thr Gly Asn Leu Ile Thr Asn Gln Tyr
1380 1385 1390
Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met Leu Leu Asp Asp Ser Gly Arg
1395 1400 1405
Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp Gly Val Leu Arg Tyr Phe Asp
1410 1415 1420
Gln Asn Gly Glu Gln Val Lys Asp Ala Ile Ile Val Asp Pro Asp Thr
1425 1430 1435 1440
Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr Gln Gly Val Ala Val Lys Asn
1445 1450 1455
Asp Tyr Phe Glu Tyr Gln Asp Asn Trp Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Tyr
1460 1465 1470
Gln Leu Ile Lys Gly Phe Lys Ala Val Asp Asp Ser Leu Gln His Phe
1475 1480 1485
Asp Glu Val Thr Gly Val Gln Thr Lys Asp Ser Ala Leu Ile Ser Ala
1490 1495 1500
Gln Gly Lys Val Tyr Gln Phe Asp Asn Asn Gly Asn Ala Val Ser Ala
1505 1510 1515 1520
<210> 2
<211> 4700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttacagaa aaagtaatgc ggaaaaagct ttataaagtt gggaaaagtt gggtagttgg 60
tggggtttgt gcttttgcat taaccgcctc atttgcttta gcaacaccaa gtgttttggg 120
agacagtagt gtacctgatg tgagtgcgaa taacgttcaa tctgcttcag ataatacaac 180
ggatacgcag cagaacacta cggttaccga agaaaatgat aaagtacagt ctgcagctac 240
taatgacaat gtaacaacag ctgcaagcga cacaacgcaa tctgctgata ataatgtgac 300
agaaaaacag tcagatgatc atgcacttga taatgaaaaa gtcgataaca aacaagatgc 360
agtcgctcaa actaatgtta ctagcaaaaa tgaggaatca gcagttgctt caactgacac 420
tgatcctgct gaaacgacaa ctgacgaaac acaacaagtt agcggcaagt acgttgaaaa 480
agacggtagt tggtattatt attttgatga tggcaaaaat gctaaaggtt tatcaacgat 540
agacaacaat attcaatatt ttgacgagag tggtaaacaa gtcaaaggac agtatgtcac 600
aattgataat caaacatatt attttgataa ggactcaggt gatgagttaa ctggtctgca 660
aagcattgat gggaacatag ttgcttttaa cgatgaaggg caacaaattt ttaatcaata 720
ttaccaatct gaaaatggta caacatacta ctttgatgat aaaggacacg ctgctaccgg 780
tattaagaat atcgagggca aaaattatta ttttgataat cttgggcaac taaaaaaagg 840
cttctctggt gtgattgatg gtcaaataat gacatttgat caggaaacag ggcaagaagt 900
ttctaacaca acttctgaaa taaaagaagg tttgacgaca caaaacacgg attatagcga 960
acataatgca gcccacggta cggatgctga ggactttgaa aatattgacg gctatttaac 1020
agctagttca tggtatcgtc caacagatat tttacgtaac ggaacagact gggaaccttc 1080
tacagataca gatttcagac caatattgtc agtgtggtgg ccagataaga acacccaggt 1140
caattattta aattacatgg ctgatttagg gtttatcagt aatgcggaca gttttgaaac 1200
tggggatagc caaagcttat taaatgaagc aagtaactat gttcaaaaat caattgaaat 1260
gaaaattagt gcgcaacaaa gtacagagtg gttaaaggat gcaatggcgg ccttcattgt 1320
cacgcaacca cagtggaatg aaactagtga agatatgagc aatgaccatt tacaaaatgg 1380
cgcattaact tatgtcaaca gtccactgac acctgatgct aattcaaact ttagactact 1440
taatcggaca ccaacaaacc agactggtga acaagcgtat aatttagata attcaaaagg 1500
tggttttgaa ttgttgttag ccaatgacgt tgataattca aaccctgtag tacaagcaga 1560
acaattgaat tggttatatt atttaatgaa ttttggtacg attacggcca acgacgcgga 1620
tgctaatttt gatggtattc gtgtagatgc agtcgacaat gtggatgctg atttgttaca 1680
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tcagcatctt tcaattttgg aagattggag tcacaatgat cctttgtatg taacagatca 1800
aggaagcaat caattaacca tggatgatta tgtgcacaca caattaatct ggtctctaac 1860
aaaatcatct gacatacgag gtacaatgca gcgcttcgtg gattattata tggttgatcg 1920
atctaatgat agtacagaaa acgaagccat tcctaattac agctttgtac gcgcacacga 1980
cagcgaagtg caaacggtta ttgcccaaat tgtttccgat ttgtatcctg atgttgaaaa 2040
tagtttagca ccaacaacag aacaattggc agctgctttc aaagtataca atgaagatga 2100
aaaattagca gacaaaaagt acacacaata taatatggct agtgcttatg cgatgttgct 2160
aaccaataag gatactgttc ctcgtgtcta ttatggcgat ttatatacag atgatggtca 2220
atatatggca acaaagtcac catactatga tgcgattaac actttgctga aagctagagt 2280
tcagtatgtt gctggtggcc aatcgatgtc cgttgatagt aatgacgtgt taacaagtgt 2340
tcgctatggt aaagatgcca tgacagcttc tgacactgga acatctgaga cgcgtactga 2400
aggtattgga gtcatcgtca gcaacaacgc ggagctacaa ttagaggatg ggcatagtgt 2460
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tgcagatgga ttagcttatt atgatactga tgaaaatgca cctgtggcgt acacagatgc 2580
taacggcgat ttgattttta cgaatgaatc aatttatggt gtacaaaatg cacaagtttc 2640
tggttacttg gcagtttggg ttccgatagg tgcgcaacaa gatcaagatg cacgaacggc 2700
ctctgataca acaacaaaca cgagtgataa agtgttccat tcaaacgctg ctcttgattc 2760
tcaagtcatc tacgaaggtt tctcaaactt ccaagcattt gctacagaca gcagtgaata 2820
tacaaacgta gtcatcgctc agaatgcgga ccaatttaag caatggggtg tgacaagctt 2880
ccaattggca ccacaatatc gttcaagtac agatacaagt ttcttggatt caattattca 2940
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aactgctgat cagttgcgcg atgctattaa agccttacat gctagcggta ttcaagccat 3060
tgccgattgg gtgccggacc aaatttataa tttgccagag caagaattag ctactgtcac 3120
aagaacaaat tcatttggag aggacgatac agattctgat attgacaatg ccttatatgt 3180
tgtacaaagt cgtggtggtg gtcaatatca agaaatgtat ggtggtgcct tcttagaaga 3240
gttacaggaa ctctatccat ccctatttaa agtgaatcaa atctcaacgg gcgttccaat 3300
tgatggcagt gtaaagatta ctgagtgggc ggctaagtac ttcaatggct ctaacatcca 3360
aggtaaaggt gctggatacg tattgaaaga tatgggttct aataagtact ttaaggtcgt 3420
ttcgaacact gaggatggtg actacttacc aaaacagtta actaatgatc tgtcagaaac 3480
tggctttaca cacgatgata aaggaatcat ctattataca ttaagtggtt atcgtgccca 3540
aaatgcattt attcaagatg atgataataa ctattactat tttgataaaa caggtcattt 3600
agtaacaggt ttgcaaaaga ttaataacca tacctacttc ttcttaccta atggtatcga 3660
actggtcaag agcttcttac aaaacgaaga tggtacaatt gtttatttcg ataagaaagg 3720
tcatcaagtt tttgaccaat atataactga tcaaaatgga aatgcatatt actttgatga 3780
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tcaaaatggt gtgcaggtta aggataagtt tgtgattggc actgatggtt ataagtatta 3900
ctttgaacca ggtagtggta acttagctat cctacgttat gtgcaaaaca gtaagaatca 3960
atggttctat tttgatggta atggccatgc tgtcactggt ttccaaacaa ttaatggtaa 4020
aaaacaatat ttctataatg atggtcatca aagtaaaggt gaattcattg atgcagacgg 4080
tgatactttc tatacgagtg ccactgatgg tcgcctagta actggtgttc agaagattaa 4140
tggtattacc tatgcgtttg ataacacagg aaatttgatc acaaatcagt attatcaatt 4200
agcagatggt aaatatatgt tgttagatga tagtggtcgt gcgaaaacag ggtttgtatt 4260
gcaagatggt gtactaagat acttcgatca aaacggtgag caagtgaaag atgctatcat 4320
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aaatgctgtg tcagcataag ctttctgtat atatagtgaa aagccaaagg tccttttgac 4620
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tttattcatt tctttttcgg 4700
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<211> 1373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Ser Gly Lys Tyr Val Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr Tyr Tyr Phe
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Asp Asp Gly Lys Asn Ala Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp Asn Asn Ile
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Gln Tyr Phe Asp Glu Ser Gly Lys Gln Val Lys Gly Gln Tyr Val Thr
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Ile Asp Asn Gln Thr Tyr Tyr Phe Asp Lys Asp Ser Gly Asp Glu Leu
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Thr Gly Leu Gln Ser Ile Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe Asn Asp Glu
65 70 75 80
Gly Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr Tyr Gln Ser Glu Asn Gly Thr Thr
85 90 95
Tyr Tyr Phe Asp Asp Lys Gly His Ala Ala Thr Gly Ile Lys Asn Ile
100 105 110
Glu Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Asp Asn Leu Gly Gln Leu Lys Lys Gly
115 120 125
Phe Ser Gly Val Ile Asp Gly Gln Ile Met Thr Phe Asp Gln Glu Thr
130 135 140
Gly Gln Glu Val Ser Asn Thr Thr Ser Glu Ile Lys Glu Gly Leu Thr
145 150 155 160
Thr Gln Asn Thr Asp Tyr Ser Glu His Asn Ala Ala His Gly Thr Asp
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180 185 190
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195 200 205
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Asn Thr Gln Val Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ala Asp Leu Gly Phe Ile
225 230 235 240
Ser Asn Ala Asp Ser Phe Glu Thr Gly Asp Ser Gln Ser Leu Leu Asn
245 250 255
Glu Ala Ser Asn Tyr Val Gln Lys Ser Ile Glu Met Lys Ile Ser Ala
260 265 270
Gln Gln Ser Thr Glu Trp Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala Phe Ile Val
275 280 285
Thr Gln Pro Gln Trp Asn Glu Thr Ser Glu Asp Met Ser Asn Asp His
290 295 300
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Ala Asn Ser Asn Phe Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr Asn Gln Thr
325 330 335
Gly Glu Gln Ala Tyr Asn Leu Asp Asn Ser Lys Gly Gly Phe Glu Leu
340 345 350
Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu
355 360 365
Gln Leu Asn Trp Leu Tyr Tyr Leu Met Asn Phe Gly Thr Ile Thr Ala
370 375 380
Asn Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asp
385 390 395 400
Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr Phe Lys Leu
405 410 415
Ala Tyr Gly Val Asp Gln Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln His Leu Ser
420 425 430
Ile Leu Glu Asp Trp Ser His Asn Asp Pro Leu Tyr Val Thr Asp Gln
435 440 445
Gly Ser Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Val His Thr Gln Leu Ile
450 455 460
Trp Ser Leu Thr Lys Ser Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met Gln Arg Phe
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Val Asp Tyr Tyr Met Val Asp Arg Ser Asn Asp Ser Thr Glu Asn Glu
485 490 495
Ala Ile Pro Asn Tyr Ser Phe Val Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln
500 505 510
Thr Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Val Glu Asn
515 520 525
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530 535 540
Asn Glu Asp Glu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Met
545 550 555 560
Ala Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Arg
565 570 575
Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Thr
580 585 590
Lys Ser Pro Tyr Tyr Asp Ala Ile Asn Thr Leu Leu Lys Ala Arg Val
595 600 605
Gln Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Val Asp Ser Asn Asp Val
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645 650 655
Asn Ala Glu Leu Gln Leu Glu Asp Gly His Ser Val Thr Leu His Met
660 665 670
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675 680 685
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Tyr Thr Asp Ala Asn Gly Asp Leu Ile Phe Thr Asn Glu Ser Ile Tyr
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725 730 735
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740 745 750
Thr Asn Thr Ser Asp Lys Val Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser
755 760 765
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770 775 780
Ser Ser Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Ala Asp Gln Phe
785 790 795 800
Lys Gln Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser
805 810 815
Ser Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn Gly Tyr Ala
820 825 830
Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Thr Pro Thr Lys Tyr Gly
835 840 845
Thr Ala Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Ser Gly
850 855 860
Ile Gln Ala Ile Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr Asn Leu Pro
865 870 875 880
Glu Gln Glu Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Phe Gly Glu Asp
885 890 895
Asp Thr Asp Ser Asp Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Val Val Gln Ser Arg
900 905 910
Gly Gly Gly Gln Tyr Gln Glu Met Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Glu Glu
915 920 925
Leu Gln Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Phe Lys Val Asn Gln Ile Ser Thr
930 935 940
Gly Val Pro Ile Asp Gly Ser Val Lys Ile Thr Glu Trp Ala Ala Lys
945 950 955 960
Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Lys Gly Ala Gly Tyr Val Leu
965 970 975
Lys Asp Met Gly Ser Asn Lys Tyr Phe Lys Val Val Ser Asn Thr Glu
980 985 990
Asp Gly Asp Tyr Leu Pro Lys Gln Leu Thr Asn Asp Leu Ser Glu Thr
995 1000 1005
Gly Phe Thr His Asp Asp Lys Gly Ile Ile Tyr Tyr Thr Leu Ser Gly
1010 1015 1020
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1025 1030 1035 1040
Tyr Phe Asp Lys Thr Gly His Leu Val Thr Gly Leu Gln Lys Ile Asn
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Phe Leu Gln Asn Glu Asp Gly Thr Ile Val Tyr Phe Asp Lys Lys Gly
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Gly Glu Phe Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Thr Ser Ala Thr
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
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Gly Phe Val Leu Gln Asp Gly Val Leu Arg Tyr Phe Asp Gln Asn Gly
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Glu Gln Val Lys Asp Ala Ile Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser
1285 1290 1295
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1330 1335 1340
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1345 1350 1355 1360
Val Tyr Gln Phe Asp Asn Asn Gly Asn Ala Val Ser Ala
1365 1370
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ggcaacaaat ttttaatcaa tattaccaat ctgaaaatgg tacaacatac tactttgatg 300
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cacaaaacac ggattatagc gaacataatg cagcccacgg tacggatgct gaggactttg 540
aaaatattga cggctattta acagctagtt catggtatcg tccaacagat attttacgta 600
acggaacaga ctgggaacct tctacagata cagatttcag accaatattg tcagtgtggt 660
ggccagataa gaacacccag gtcaattatt taaattacat ggctgattta gggtttatca 720
gtaatgcgga cagttttgaa actggggata gccaaagctt attaaatgaa gcaagtaact 780
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ctaattcaaa ctttagacta cttaatcgga caccaacaaa ccagactggt gaacaagcgt 1020
ataatttaga taattcaaaa ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac gttgataatt 1080
caaaccctgt agtacaagca gaacaattga attggttata ttatttaatg aattttggta 1140
cgattacggc caacgacgcg gatgctaatt ttgatggtat tcgtgtagat gcagtcgaca 1200
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tcaaagtata caatgaagat gaaaaattag cagacaaaaa gtacacacaa tataatatgg 1680
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atttatatac agatgatggt caatatatgg caacaaagtc accatactat gatgcgatta 1800
acactttgct gaaagctaga gttcagtatg ttgctggtgg ccaatcgatg tccgttgata 1860
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gcactgatgg ttataagtat tactttgaac caggtagtgg taacttagct atcctacgtt 3480
atgtgcaaaa cagtaagaat caatggttct attttgatgg taatggccat gctgtcactg 3540
gtttccaaac aattaatggt aaaaaacaat atttctataa tgatggtcat caaagtaaag 3600
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caacacaagg tgtcgctgta aaaaatgatt atttcgagta tcaagataat tggtatttaa 3960
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ttgatgaagt cactggtgta caaacaaaag atagtgcttt aataagtgct cagggtaagg 4080
tttaccaatt tgataataat ggaaatgctg tgtcagcata agctttctgt atatatagtg 4140
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tgatgatatc ggctaattta attttattca tttctttttc gg 4242
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagtcatgag cttttgcatt aaccgcctc 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtcatgac agaacactac ggttaccga 29
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cagtcatgaa tttacagaaa aagtaatgcg g 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggagctcc cgaaaaagaa atgaataaa 29

Claims (6)

1.一种葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶，其特征在于，所述N端截短突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种携带权利要求2所述基因的重组菌，其特征在于，所述重组菌的命名为：大肠埃希氏菌，拉丁文名称为：Escherichia coli，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2022年1月10日，保藏编号为：CGMCC No.24272。
4.如权利要求1所述葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)于35～40℃的条件下培养权利要求3所述重组菌10～14h后，传代转接继续培养至菌液的OD600达到0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，然后24～26℃，200～250r/min培养3～5h，离心收集菌体，用醋酸钠缓冲液重悬破胞，离心，得到的上清液即为粗酶液；
(2)将所得粗酶液过镍柱进行分离纯化，得葡聚糖蔗糖酶的N端截短突变酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中培养权利要求5所述重组菌采用包含卡纳霉素的LB培养基，所述卡纳霉素的质量浓度为45～55μg/mL。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的醋酸钠缓冲液的pH为5～6。
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