CN106661599A - 可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 - Google Patents

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成 Download PDF

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Abstract

本发明提供酶促制备的可溶性α‑葡聚糖纤维组合物，其适用于用作食品和饲料应用中的耐消化纤维。所述可溶性α‑葡聚糖纤维组合物可与一种或多种附加的食品成分共混以制备包含纤维的组合物。本发明还提供了包含所述可溶性α‑葡聚糖纤维的组合物的制备和使用方法。

Description

可溶性葡聚糖纤维的酶促合成
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2014年5月29日提交的，标题为“Enzymatic Synthesis ofSoluble Glucan Fiber(可溶性葡聚糖纤维的酶促合成)”的美国临时专利申请号62/004290的优先权，其公开内容以引用方式全文并入本文。
以引用方式并入的序列表
在2015年5月6日形成并且与本文一起提交的，以大小为1,026,328字节的名称为“20150515_CL5833WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”文件提供的序列表以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及可溶性α-葡聚糖纤维、包含可溶性纤维的组合物、以及制备和使用所述可溶性α-葡聚糖纤维的方法。可溶性α-葡聚糖纤维是在上胃肠道中高度耐消化的，在下胃肠道中表现出可接受的产气率，作为膳食纤维具有良好的耐受性，并且具有一种或多种通常与可溶性膳食纤维相关联的有益特性。
背景技术
膳食纤维(可溶性和不可溶性两者)是对于健康、消化和预防病症诸如心脏病、糖尿病、肥胖症、憩室炎和便秘而言重要的营养物质。然而，大多数人不食用每日推荐摄入的膳食纤维。2010年美国人膳食纤维指南(美国农业部和美国卫生和人类服务部，Dietary Guidelines for Americans，2010，第7版，Washington,DC：美国政府印刷局，2010年12月)报道了膳食纤维摄入不足是成人和儿童的公共健康问题。因此，仍然需要增加每日膳食纤维摄入量，尤其是适用于多种食品应用的可溶性膳食纤维。
历史上，膳食纤维被定义为植物中固有的和完整的非消化性碳水化合物和木质素。该定义已经扩展为包括具有三个或更多个单体单元的碳水化合物聚合物，该单体单元不被人类上胃肠道中的内源性酶显著水解并通过普遍接受的科学证据证明具有有益生理效应。可溶性低聚糖纤维产品(诸如果糖、葡聚糖的低聚物等)当前用于多种食品应用中。然而，许多可商购获得的可溶性纤维具有不可取的特性诸如低耐受性(造成不可取的效应诸如腹部胃气胀或气体、痢疾等)、缺乏耐消化性、在低pH(例如pH 4或更低)下的不稳定性、高成本或制备方法需要至少一个酸催化的热处理步骤以将更易消化的糖苷键(例如葡聚糖中的α-(1,4)键)随机重排为具有更耐消化性的键的更高度支化的化合物。仅使用天然存在的酶以由安全和容易获得的底物，诸如蔗糖合成适宜的葡聚糖纤维的方法可能对消费者更具吸引力。
各种菌种具有由蔗糖合成右旋糖酐低聚物的能力。Jeanes等人(JACS(1954)76:5041-5052)描述了由96种细菌菌株制备的右旋糖酐。右旋糖酐被报道包含显著百分比(50％-97％)的α-(1,6)糖苷键与不同量的α-(1,3)和α-(1,4)糖苷键。未报道存在于单独菌株内的酶(数量和类型两者)，并且在某些菌株中的右旋糖酐特征表现出可变性，其中由每种菌种产生的右旋糖酐可以是由每种菌种产生的多于一种酶的产物。
属于葡糖苷水解酶家族70的葡糖基转移酶(葡聚糖蔗糖酶；GTF)能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡聚糖蔗糖酶通过形成的糖低聚物的类型进一步分类。例如，右旋糖酐蔗糖酶是产生主要具有α-(1,6)糖苷键的糖低聚物(“右旋糖酐”)的那些，并且变聚糖蔗糖酶是趋于产生具有富含α-(1,3)糖苷键的主链的不溶性糖低聚物的那些。变聚糖蔗糖酶由常见氨基酸来表征。例如，A.Shimamura等人(J.Bacteriology，(1994)176：4845-4850)研究了GTF与变异链球菌(Streptococcus mutans)GS5的结构-功能关系，并且识别了影响由GTF合成的葡聚糖产物的性质的多个氨基酸位置，其中产生α-(1,3)-和α-(1,6)-异头键的相对量的变化。罗伊糖蔗糖酶(Reuteransucrases)趋于产生富含α-(1,4)、α-(1,6)和α-(1,4,6)糖苷键的糖低聚物，并且交替糖蔗糖酶是趋于产生具有由交替的α-(1,3)和α-(1,6)糖苷键组成的线性主链的糖低聚物的那些。这些酶中的一些能够在不同程度上引入其它糖苷键，常常作为支化点。V.Monchois等人(FEMSMicrobiol Rev.，(1999)23:131-151)讨论了提出的多种葡聚糖蔗糖酶的作用机制和结构-功能关系。H.Leemhuis等人(J.Biotechnol.，(2013)163:250-272)描述了葡聚糖蔗糖酶的特征性三维结构、反应、机制和α-葡聚糖分析。
描述使用葡聚糖蔗糖酶(野生型、截短型或其变体)制备糖低聚物的专利和公布的专利申请的非限制性列表已被报道用于右旋糖酐(美国专利4,649,058和7,897,373；以及美国专利申请公布2011-0178289A1)、罗伊糖(reuteran)(美国专利申请公布2009-0297663A1和美国专利6,867,026)、交替糖和/或麦芽交替糖低聚物(“MAO”)(美国专利7,402,420和7,524,645；美国专利申请公布2010-0122378A1；和欧洲专利EP1151085B1)、α-(1,2)支链右旋糖酐(美国专利7,439,049)、和包含α-(1,3)、α-(1,6)和α-(1,3,6)键的混合物的混合键糖低聚物(缺乏交替糖样主链)(美国专利申请公布2005-0059633A1)。授予Kol-Jakon等人的美国专利申请公布2009-0300798A1公开了表达产生改性淀粉的变聚糖蔗糖酶的基因改性的植物细胞。
已经报道了使用葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶的组合来酶促制备异麦芽糖、异麦芽低聚糖和右旋糖酐。美国专利2,776,925描述了用于酶促制备中间分子量的右旋糖酐的方法，该方法包括右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的同时作用。美国专利4,861,381A描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的组合酶促制备包含39％-80％异麦芽糖的组合物。Goulas等人(Enz.Microb.Tech(2004)35:327-338)描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶由蔗糖批量合成异麦芽低聚糖(IMO)。美国专利8,192,956公开了使用重组表达的杂交基因酶促制备用于临床应用的异麦芽低聚糖(IMO)和低分子量右旋糖酐，所述杂交基因包含融合在一起的编码α-葡聚糖酶的基因和编码右旋糖酐蔗糖酶的基因，其中葡聚糖酶基因是来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)的基因，其中右旋糖酐蔗糖酶基因是来自明串珠菌属(Leuconostoc sp.)的基因。
Hayacibara等人(Carb.Res.(2004)339：2127-2137)描述了突变酶和右旋糖酐酶对由来自牙斑中蔗糖的糖基转移酶形成的葡聚糖的产生和结构的影响。报道的研究目的在于评估在突变酶和右旋糖酐酶存在下(单独的或组合的)由GTF合成的葡聚糖的产生和结构，试图阐明在牙斑形成期间可发生一些相互作用。
突变酶(葡聚糖内切-1,3-α-葡聚糖水解酶)由一些真菌(包括木霉属、曲霉属、青霉属和枝孢菌属(Cladosporium))以及一些细菌(包括链霉菌属、黄杆菌属、拟杆菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属)产生。W.Suyotha等人(Biosci，Biotechnol.Biochem.，(2013)77：639-647)描述了结构域结构和结构域缺失对来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)KA-304的α-1,3-葡聚糖水解酶的活性的影响。Y.Hakamada等人(Biochimie，(2008)90：525-533)描述了多种突变酶的结构域结构分析，并且提出了突变酶的系统发育树。I.Shimotsuura等人(Appl.Environ.Microbiol.，(2008)74：2759-2765)报道了来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)菌株RM1的突变酶的生物化学和分子特征，其中N-端结构域具有强突变结合活性但不具有突变酶活性，然而C端结构域负责突变酶活性但具有显著低于完整蛋白的突变结合活性。C.C.Fuglsang等人(J.Biol.Chem.，(2000)275：2009-2018)描述了重组真菌突变酶(内切葡聚糖酶)的生物化学分析，其中所述真菌突变酶由NH2-端催化结构域和假定的COOH-端多糖结合结构域构成。
右旋糖酐酶(α-1,6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)是水解右旋糖酐的α-1,6-键的酶。N.Suzuki等人(J.Biol.Chem.(2012)287:19916–19926)描述了变异链球菌(Streptococcusmutans)右旋糖酐酶的晶体结构，并且识别了三个结构域，包括含有酶的催化模块的结构域A，和右旋糖酐结合结构域C；还相对于酶结构描述了催化机制。A.M.Larsson等人(Structure，(2003)11:1111-1121)报道了来自朱黄青霉(Penicillium minioluteum)的右旋糖酐酶的晶体结构，其中所述结构用于限定反应机制。H-K Kang等人(Yeast，(2005)22：1239-1248)描述了来自斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的右旋糖酐酶的特征。T.Igarashi等人(Microbiol.Immunol.，(2004)48：155-162)描述了来自大鼠链球菌(Streptococcus rattus)的右旋糖酐酶的分子特征，其中氨基酸序列的保守区包含两个功能结构域，催化位点和右旋糖酐结合位点。
本领域中已经报道了各种糖低聚物组合物。例如，美国专利6,486,314公开了α-葡聚糖，其包含至少20个，至多达约100,000个α-葡糖酐单元，其中38％-48％为4-连接的葡糖酐单元，17％-28％为6-连接的葡糖酐单元，并且7％-20％为4,6-连接的葡糖酐单元，和/或葡萄糖-低聚糖，其包含至少两个4-连接的葡糖酐单元、至少一个6-连接的葡糖酐单元和至少一个4,6-连接的葡糖酐单元。美国专利申请公布2010-0284972A1公开了用于改善受试者的健康的组合物，该组合物包含α-(1,2)-支化的α-(1,6)低聚右旋糖酐。美国专利申请公布2011-0020496A1公开了支链糊精，所述糊精具有以下结构，其中葡萄糖或异麦芽低聚糖通过α-(1,6)糖苷键连接至糊精的非还原端，并且具有10至52的DE。美国专利6,630,586公开了支链麦芽糖糊精组合物，其包含22％-35％(1,6)糖苷键；还原糖含量为<20％；高分散性指数(Mp/Mn)<5；并且数均分子量(Mn)为4500g/mol或更小。美国专利7,612,198公开了可溶性、高度支化的葡萄糖聚合物，其具有小于1％的还原糖含量，介于13％和17％之间的α-(1,6)糖苷键的含量和具有介于0.9×105和1.5×105道尔顿之间的值的分子量，其中所述可溶性高度支化的葡萄糖聚合物具有以下支链长度分布曲线：70％至85％的聚合度(DP)小于15，10％至14％的DP介于15和25之间，并且8％至13％的DP大于25。
糖低聚物和/或包含所述低聚物的碳水化合物组合物已经被描述为适用于用作食品应用中的可溶性纤维的来源(美国专利8,057,840和美国专利申请公布2010-0047432A1和2011-0081474A1)。美国专利申请公布2012-0034366A1公开了低糖、包含纤维的碳水化合物组合物，其被报道为适用于用作食物产品中的传统玉米糖浆、高果糖玉米糖浆和其它甜味剂的替代物。
仍然需要开发新的可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其耐消化，表现出下胃肠道中气体形成的相对较低含量和/或较慢速率、耐受良好、具有低粘度、并且适用于食品和其它应用中。优选地，α-葡聚糖纤维组合物可使用已经与在人类中安全使用相关联的酶由蔗糖酶促制备。
发明内容
本发明提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其适用于多种应用，包括但不限于，食品应用、改善胃肠健康的组合物和个人护理组合物。可溶性纤维组合物可直接用作食品中的成分或可掺入适用于食品应用的碳水化合物组合物中。
本发明还提供了用于制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。
本发明还提供了在食品应用中使用可溶性纤维组合物或包含所述可溶性纤维组合物的碳水化合物组合物的方法。在某些方面，提供了用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量将本发明的可溶性纤维组合物施用于受试者，以有效发挥通常与可溶性膳食纤维相关联的至少一种健康有益效果，诸如改变食品的含热量、降低食品的血糖指数、改变粪便重量和支持肠功能、改变胆固醇代谢、通过结肠发酵提供能量生成代谢物、并且可提供益生元效应。
本发明提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，基于干固体，其包含以下物质：
a.至少75％的α-(1,3)糖苷键；
b.少于25％的α-(1,6)糖苷键；
c.少于10％的α-(1,3,6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，在水中至少20％(w/w)的溶解度；和
i.小于5的多分散指数。
在另一个实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii.至少一种葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，该α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产物分离。
在另一个实施方案中，提供了一种制备上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii.至少一种葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，该α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将如上所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供了一种制备如上所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii.至少一种葡糖基转移酶，该葡糖基转移酶能够催化具有一个或多个α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，其中所述反应条件包括大于45℃并且小于55℃的反应温度，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与一种或多种下列物质合并：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供制备食物产品的方法，所述方法包括将一种或多种可食用食品成分与如上所述本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物、或包含本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供减小食品或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食品或饮料中。
在另一个实施方案中，提供抑制血糖含量升高的方法，所述方法包括将可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供降低活体中脂质的方法，所述方法包括将可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供治疗便秘的方法，所述方法包括将可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，提供改变哺乳动物结肠中脂肪酸产生的方法，所述方法包括将有效量的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤；优选地其中短链脂肪酸产生增加，支链脂肪酸产生减少，或上述两者。
在另一个实施方案中，提供包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的化妆品组合物。
在另一个实施方案中，提供包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的药物组合物。
在另一个实施方案中，提供包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇的低生龋性组合物。
在另一个实施方案中，提供了可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适用于被人类和动物食用的食品组合物中的用途。
在另一个实施方案中，提供一种组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物以及以下成分中的至少一种：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供了由上述方法中任一个制备的产品。
生物序列简述
下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(2009)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政规程的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1为终止子序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为接头序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：3为唾液链球菌(Streptococcus salivarius)Gtf-J葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：47527中的。
SEQ ID NO:4为编码唾液链球菌成熟Gtf-J葡糖基转移酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5为唾液链球菌(Streptococcus salivarius)Gtf-J成熟葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“7527葡糖基转移酶”或“GTF7527”)。
SEQ ID NO：6为唾液链球菌(Streptococcus salivarius)Gtf-L葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：662379中的。
SEQ ID NO:7为编码截短的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)Gtf-L(gi：662379)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：8为截短的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)Gtf-L葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“2379葡糖基转移酶”或“GTF2379”)。
SEQ ID NO：9为变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：290580544中的。
SEQ ID NO:10为编码截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B(gi：290580544)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：11为截短的变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025 Gtf-B葡糖基转移酶(本文中也称为“0544葡糖基转移酶”或“GTF0544”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12-13是引物的核酸序列。
SEQ ID NO：14为远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)Gtf-I葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：450874中的。
SEQ ID NO:15为编码截短的远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)Gtf-I(gi：450874)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：16为截短的远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)Gtf-I葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“0874葡糖基转移酶”或“GTF0874”)。
SEQ ID NO：17为链球菌属(Streptococcus sp.)C150 Gtf-S葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：495810459中的(先前称为gi:.322373279)
SEQ ID NO：18为编码截短的链球菌属(Streptococcus sp.)C150 Gtf-S(gi：495810459)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：19为截短的链球菌属(Streptococcus sp.)C150 Gtf-S葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“0459葡糖基转移酶”、“GTF0459”、“3279葡糖基转移酶”或“GTF3279”)。
SEQ ID NO：20为编码用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的实施例12中的腐殖质类芽孢杆菌突变酶(gi:257153265，其中gi:257153264为对应的多核苷酸序列)的核酸序列。
SEQ ID NO：21为用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的实施例12中的成熟腐殖质类芽孢杆菌突变酶(gi：257153264；本文称为“3264突变酶”或“MUT3264”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22为腐殖质类芽孢杆菌突变酶的氨基酸序列，如存在于gi：257153264)中。
SEQ ID NO:23为编码用于在枯草芽孢杆菌宿主BG6006中表达的实施例13中的腐殖质类芽孢杆菌突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：24为用于在枯草芽孢杆菌宿主BG6006中表达的实施例13中的成熟腐殖质类芽孢杆菌突变酶的氨基酸序列。如本文所用，该突变酶还可在本文中称为“MUT3264”。
SEQ ID NO：25为用于表达载体中的枯草芽孢杆菌AprE信号肽的氨基酸序列，所述表达载体连接到各种酶以在枯草芽孢杆菌中表达。
SEQ ID NO：26为编码马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)18224TM突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：27为编码马尔尼菲青霉18224TM突变酶(gi：212533325；本文中也称为“3325突变酶”或“MUT3325”)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28为编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：29为编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4突变酶的氨基酸序列(gi：259486505；本文中也称为“6505突变酶”或“MUT6505”)。
SEQ ID NO：30-52为用于实施例17中的各种引物的核酸序列。
SEQ ID NO：53为编码Hypocrea tawa突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：54为如美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的琼楠木霉(Hypocrea tawa)突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“琼楠木霉突变酶”)。
SEQ ID NO：55为编码长枝康宁木霉(Trichoderma konilangbra)突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：56为美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的长枝康宁木霉(Trichoderma konilangbra)突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“长枝康宁木霉(T.konilangbra)突变酶”)。
SEQ ID NO：57为编码里氏木霉RL-P37突变酶的核酸序列。
SEQ ID NO：58为美国专利申请公布2011-0223117A1中所公开的里氏木霉RL-P37突变酶的氨基酸序列(本文中也称为“里氏木霉592突变酶”)。
SEQ ID NO：59是质粒pTrex3的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：60为编码截短的口腔链球菌(Streptococcus oralis)葡糖基转移酶(gi：7684297)的核酸序列。
SEQ ID NO：61为由SEQ ID NO：60编码的截短的口腔链球菌(Streptococcusoralis)葡糖基转移酶的氨基酸序列，并且其在本文中被称为“GTF4297”。
SEQ ID NO：62为编码变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的截短型式(gi:3130088)的核酸序列。
SEQ ID NO：63为由SEQ ID NO：62编码的截短的变异链球菌(Streptococcusmutans)葡糖基转移酶的氨基酸序列，其在本文中被称为“GTF0088”。
SEQ ID NO：64为编码变异链球菌(Streptococcus mutans)葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列(gi:24379358)。
SEQ ID NO：65为由SEQ ID NO：64编码的截短的变异链球菌(Streptococcusmutans)葡糖基转移酶的氨基酸序列，其在本文中被称为“GTF9358”。
SEQ ID NO：66为编码解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列(gi:32597842)。
SEQ ID NO：67为由SEQ ID NO：66编码的截短的解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)葡糖基转移酶的氨基酸序列，其在本文中被称为“GTF7842”。
SEQ ID NO：68为罗伊氏乳杆菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi:51574154中。
SEQ ID NO：69是编码罗伊氏乳杆菌葡糖基转移酶的截短型式的核酸序列(gi:51574154)。
SEQ ID NO：70为由SEQ ID NO：69编码的截短的罗伊氏乳杆菌葡糖基转移酶的氨基酸序列，其在本文中被称为“GTF4154”。
SEQ ID NO：71为汗毛链球菌(Streptococcus downei)GTF-S葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：121729中(具有天然信号序列的前体)，本文中也称为“GTF1729”。
SEQ ID NO：72为仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)HS-6 GTF-S葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：357235604中(具有天然信号序列的前体)，本文中也称为“GTF5604”。来自仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)的葡糖基转移酶的相同的氨基酸序列以gi:4691428报道。因此，该特定氨基酸序列在本文中也称为“GTF1428”。
SEQ ID NO：73为衍生自gi：357236477的仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)HS-6葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF6477”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换。
SEQ ID NO：74为衍生自gi：357236477的仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)HS-6葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF6477-V1”或“357236477-V1”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换并且包含单个氨基酸置换。
SEQ ID NO：75为衍生自gi：345526831的唾液链球菌M18葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF6831”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换。
SEQ ID NO：76为衍生自gi：335358117的动物乳杆菌KCTC 3501葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF8117”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换。
SEQ ID NO：77为衍生自gi：1054877的格登链球菌(Streptococcusgordonii)葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF4877”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换。
SEQ ID NO：78为衍生自gi：22138845的远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“GTF8845”)，其中天然信号序列由用于在枯草芽孢杆菌中表达的AprE信号序列置换。
SEQ ID NO：79为汗毛链球菌(Streptococcus downei)葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：121724中的。
SEQ ID NO:80为编码截短的汗毛链球菌(Streptococcus downei)(gi：121724)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：81为由SEQ ID NO：80编码的截短的汗毛链球菌(Streptococcusdownei)葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“1724葡糖基转移酶”或“GTF1724”)。
SEQ ID NO：82为Streptococcus dentirousetti葡糖基转移酶的氨基酸序列，如存在于gi：167735926中的。
SEQ ID NO:83为编码截短的Streptococcus dentirousetti(gi：167735926)葡糖基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：84为由SEQ ID NO：83编码的截短的Streptococcus dentirousetti葡糖基转移酶的氨基酸序列(本文中也称为“5926葡糖基转移酶”或“GTF5926”)。
SEQ ID NO：85为由氧化葡糖杆菌的菌株表达的右旋糖酐糊精酶(本文中称为“DD酶”)的氨基酸序列(EC 2.4.1.2)(参见JP2007181452(A))。
SEQ ID NO：86为编码SEQ ID NO:19的GTF0459氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO:87为编码GTF0470(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：88为由SEQ ID NO：87编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89为编码GTF07317(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：90为由SEQ ID NO：89编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91为编码GTF1645(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：92为由SEQ ID NO：91编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93为编码GTF6099(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：94为由SEQ ID NO：93编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:95为编码GTF8467(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：96为由SEQ ID NO：95编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97为编码GTF8487(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：98为由SEQ ID NO：97编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99为编码GTF06549(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：100为由SEQ ID NO：99编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:101为编码GTF3879(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：102为由SEQ ID NO：101编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:103为编码GTF4336(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：104为由SEQ ID NO：103编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:105为编码GTF4491(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：106为由SEQ ID NO：105编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107为编码GTF3808(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：108为由SEQ ID NO：107编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109为编码GTF0974(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：110为由SEQ ID NO：109编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:111为编码GTF0060(GTF0459同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：112为由SEQ ID NO：111编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113为编码GTF0487(GTF0459非同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：114为由SEQ ID NO：113编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:115为编码GTF5360(GTF0459非同系物)的截短形式的核酸序列。
SEQ ID NO：116为由SEQ ID NO：115编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：117、119、121和123为分别编码GTF0974、GTF4336、GTF4491和GTF3808的T5 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：118、120、122和124分别为GTF0974、GTF4336、GTF4491和GTF3808的T5C-端截短形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO：125为编码GTF0459的T5 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：126是由SEQ ID NO：125的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:127为编码GTF0974的T4 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：128是由SEQ ID NO：127的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:129为编码GTF4336的T4 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：130是由SEQ ID NO：129的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:131为编码GTF4491的T4 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：132是由SEQ ID NO：131的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:133为编码GTF0459的T6 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：134为由SEQ ID NO：133编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:135为编码GTF0974的T1 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：136为由SEQ ID NO：135编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:137为编码GTF0974的T2 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：138为由SEQ ID NO：137编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:139为编码GTF0974的T6 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：140为由SEQ ID NO：139编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:141为编码GTF4336的T1 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：142为由SEQ ID NO：141编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:143为编码GTF4336的T2 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：144为由SEQ ID NO：143编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：145为编码GTF4336的T6 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：146为由SEQ ID NO：145编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:147为编码GTF4991的T1 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：148为由SEQ ID NO：147编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:149为编码GTF4991的T2 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：150为由SEQ ID NO：149编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:151为编码GTF4991的T6 C-端截短形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：152为由SEQ ID NO：151编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:153为基于GTF0459与其识别的同系物的比对的氨基酸共有序列。
具体实施方式
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另外特别说明，应用下述定义。
如本文所用，在本发明的元件或组分之前的冠词“一个”、“一种”和“所述”旨在表明元件或组分的实例数量(即发生率)为非限制性的。因此，应将“一个”、“一种”和“所述”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰所用成分或反应物的数量时是指数值量的变化，该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理过程中；这些过程中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有的范围均包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2&4-5”、“1-3&5”等等。
如本文所用，术语“可得自”应当是指源材料(例如，蔗糖)，其能够得自特定来源，但不必须限于所述特定来源。
如本文所用，术语“有效量”将是指适于实现期望效应的所用的或所施用的物质量。物质的有效量可根据应用变化。本领域技术人员将通常能够在不进行实验的情况下确定特定应用或受试者的有效量。
如本文所用，术语“分离的”是指物质呈自然界中不存在的形式或环境。分离的物质的非限制性示例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)从一种或多种或所有所述物质在自然界中与之缔合的天然存在的成分中至少部分地去除的任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于存在于自然界中的物质，通过人工改性的任何物质；或者(4)通过相对于与所述物质天然缔合的其它组分，增加所述物质的量来改性的任何物质。
如本文所用，术语“非常低至没有可消化性”、“很少或没有可消化性”、和“低至无可消化性”将是指如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”，McCleary等人，(2010)J.AOAC Int.,93(1),221–233)所测量的可溶性葡聚糖纤维的可消化性的相对水平；其中很少或没有可消化性将是指基于干固体(d.s.b.)，少于12％的可溶性葡聚糖纤维组合物是可消化的，优选地小于5％可消化，更优选地小于1％可消化。在另一方面，可消化性的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维测定，IntegratedTotal Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012,J.AOAC Int.,95(3),824-844)测定。
如本文所用，术语“水溶性”将是指由在25℃下在pH 7的水中以20重量％或更高可溶解的纤维构成的本发明的葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“可溶性纤维”、“可溶性葡聚糖纤维”、“α-葡聚糖纤维”、“甘蔗糖纤维”、“葡萄糖纤维”、“甜菜糖纤维”、“可溶性膳食纤维”和“可溶性葡聚糖纤维组合物”是指由水溶性葡萄糖低聚物构成的本发明纤维组合物，所述葡萄糖低聚物具有3或更大的葡萄糖聚合度，其为耐消化的(即表现出非常低至没有可消化性)，在人小肠中具有很少或没有吸收，并且在下胃肠道中至少部分地可发酵。可溶性葡聚糖纤维组合物的可消化性使用AOAC方法2009.01测量。本发明可溶性葡聚糖纤维组合物由可得自例如甘蔗和/或糖用甜菜的蔗糖(α-D-吡喃葡糖基β-D-呋喃果糖苷；CAS#57-50-1)酶促合成。在一个实施方案中，本发明的可溶性α-葡聚糖纤维组合物不是交替糖或麦芽交替低聚糖。
如本文所用，“重均分子量”或“Mw”计算为
Mw＝ΣNiMi 2/ΣNiMi；其中Mi为链的分子量并且Ni为该分子量的链的数量。重均分子量可通过诸如静态光散射、小角中子散射、X射线散射和沉降速度的技术来测定。
如本文所用，“数均分子量”或“Mn”是指样品中所有聚合物链的统计平均分子量。数均分子量计算为Mn＝ΣNiMi/ΣNi；其中Mi为链的分子量并且Ni为该分子量的链的数目。聚合物的数均分子量可通过如下技术来测定：诸如凝胶渗透色谱法，通过(Mark-Houwink方程)测定粘度，和依数法诸如蒸气压渗透压、端基测定或质子NMR。
如本文所用，“多分散指数”、“PDI”、“不均匀性指数”、和“分散性”是指给定聚合物(诸如葡萄糖低聚物)样品中分子质量分布的量度，并且可通过将重均分子量除以数均分子量来计算(PDI＝Mw/Mn)来计算。
应当注意，如本文所用，术语“葡萄糖”和“吡喃葡萄糖”被认为是同义词并可互换使用。类似的，用于本文的术语“葡糖基”和“吡喃葡糖基”被认为是同义词并可互换使用。
如本文所用，“糖苷键(glycosidic linkage)”或“糖苷键(glycosidic bond)”是指连接糖低聚物(低聚糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。糖苷键的示例可包括具有以下键的α-连接的葡萄糖低聚物：1,6-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1,6)键或简称为“α-(1,6)”键)；1,3-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1,3)键或简称为“α-(1,3)”键)；1,4-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1,4)键或简称为“α-(1,4)”键)；1,2-α-D-糖苷键(本文中也称为α-D-(1,2)键或简称为“α-(1,2)”键)；以及通常与支链糖低聚物缔合的此类键的组合。
如本文所用，术语“葡聚糖蔗糖酶”、“葡糖基转移酶”、“葡糖苷水解酶70型”、“GTF”和“GS”是指分类为通常存在于乳酸菌诸如链球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属或乳杆菌属中的糖苷-水解酶家族70的转葡糖苷酶(参见，Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37:D233-238)。GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。葡糖基转移酶可通过特征性结构特征识别，诸如Leemhuis等人(J.Biotechnology(2013)162:250-272)和Monchois等人(FEMSMicro.Revs.(1999)23：131-151)中所述的那些。取决于GTF酶的特异性，可形成包含各种糖苷键诸如α-(1,2)、α-(1,3)、α-(1,4)和α-(1,6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。特异性受体还可包括麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。所得的葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。葡糖基转移酶序列的非限制性列表以氨基酸SEQ ID NO：3、5、6、8、9、11、14、16、17、19、61、63、65、67、68、70、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、84、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110和112提供。在一个方面，葡糖基转移酶以截短形式和/或成熟形式表达。截短的葡糖基转移酶氨基酸序列的非限制性示例包括SEQ IDNO：118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150和152。
如本文所用，术语“异麦芽低聚糖”或“IMO”是指基本上由通常具有DP 2至20平均大小的α-D-(1,6)糖苷键构成的葡萄糖低聚物。异麦芽低聚糖商业上可由α-淀粉酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶和α-葡糖苷酶对玉米淀粉或淀粉衍生物产物的酶促反应制成。可商购获得的产品包括异麦芽低聚糖(DP的范围是从3到8，例如异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、异麦芽八糖)的混合物，并且还可包括潘糖。
如本文所用，术语“右旋糖酐”是指包含至少95％的α-D-(1,6)糖苷键(通常具有在支化点处的高达5％的α-D-(1,3)糖苷键)的水溶性α-葡聚糖，如通过国际官方分析化学家协会(AOAC)方法2009.01(“AOAC 2009.01”)所测量的，其多于10％是可消化的。右旋糖酐常常具有大于1000kDa的平均分子量。如本文所用，能够由蔗糖合成右旋糖酐的酶可被描述为“右旋糖酐蔗糖酶”(EC 2.4.1.5)。
如本文所用，术语“变聚糖”是指水不溶性α-葡聚糖，其主要包含(存在50％或更多的糖苷键)1,3-α-D糖苷键并且通常具有常常大于9的聚合度(DP)。能够由蔗糖合成包含大于50％的1,3-α-D糖苷键的变聚糖或α-葡聚糖低聚物的酶可被描述为“变聚糖蔗糖酶”(EC2.4.1.-)，前提条件是所述酶不产生交替糖。
如本文所用，术语“交替糖”是指在至少50％的直链低聚糖主链内具有交替的1,3-α-D糖苷键和1,6-α-D糖苷键的α-葡聚糖。能够由蔗糖合成交替糖的酶可被描述为“交替糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.140)。
如本文所用，术语“罗伊糖”是指在支化点处包含1,4-α-D-糖苷键(通常>50％)；1,6-α-D-糖苷键；以及4,6-二取代的α-葡糖基单元的可溶性α-葡聚糖。能够由蔗糖合成罗伊糖的酶可被描述为“罗伊糖蔗糖酶”(EC 2.4.1.-)。
如本文所用，术语“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”将是指能够水解α-葡聚糖低聚物的酶。如本文所用，葡聚糖水解酶可由针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性来定义。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11；能够内切水解α-(1,6)-连接的糖苷键)、突变酶(EC 3.2.1.59；能够内切水解α-(1,3)-连接的糖苷键)和交替糖酶(alternanases)(EC 3.2.1.-；能够内切水解裂解交替糖)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
如本文所用，术语“右旋糖酐酶”(α-1,6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.11)是指能够内切水解1,6-α-D-糖苷键(主要存在于右旋糖酐中的键)的酶。已知右旋糖酐酶可用于多种应用中，包括用作用于预防龋齿、牙斑和/或牙垢的牙粉中的成分和用于水解原糖果汁或甘蔗和糖用甜菜的糖浆。已知多种微生物能够产生右旋糖酐酶，其中为青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢霉属、穗孢属、轮枝孢属、蠕孢菌属和毛壳霉属的真菌；乳酸菌属、链球菌属、纤维弧菌属、噬细胞菌属、枯草芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属的细菌，以及酵母诸如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)。食品级右旋糖酐酶是可商购获得的。食品级糊精酶的示例为Plus L，由Novozymes A/S(Bagsvaerd，Denmark)出售的来自毛壳菌(Chaetomium erraticum)的酶。
如本文所用，术语“突变酶”(葡聚糖内切-1,3-α-葡糖苷酶；EC 3.2.1.59)是指水解裂解1,3-α-D-糖苷键(主要存在于变聚糖中的键)的酶。突变酶可得自多种细菌和真菌源。突变酶的非限制性列表以氨基酸序列21、22、24、27、29、54、56和58提供。
如本文所用，术语“交替糖酶”(EC 3.2.1.-)是指内切水解裂解交替糖的酶(授予Cote等人的U.S.5,786,196)。
如本文所用，术语“野生型酶”将是指包含氨基酸序列的酶(其全长和活性截短形式)，如在获得和/或注释的生物体中存在的。所述酶(其全长或催化活性截短形式)可在微生物宿主细胞中重组产生。所述酶通常在用作制备本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物中的加工助剂之前纯化。在一个方面，使用同时存在于反应体系中的至少两种野生型酶的组合以便获得本发明的可溶性葡聚糖纤维组合物。在另一方面，在某些反应条件(例如，47℃至50℃左右的反应温度)下，可能使用单个野生型葡糖基转移酶来制备本文所公开的可溶性葡聚糖纤维(参见，实施例38、44和45)。在另一方面，本发明方法包括单个反应室，其包括至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够形成包含50％或更多α-(1,3)糖苷键的可溶性α-葡聚糖纤维组合物(诸如变聚糖蔗糖酶)，和至少一种α-葡聚糖水解酶，其具有对由存在于反应体系中的一种或多种葡糖基转移酶合成α-葡聚糖的内切水解活性。
如本文所用，术语“底物”或“合适的底物”将是指包含蔗糖的组合物。在一个实施方案中，底物组合物还包含一个或多个合适的受体，举例来说，诸如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。在一个实施方案中，能够形成葡萄糖低聚物的至少一种葡糖基转移酶的组合与至少一种α-葡聚糖水解酶组合用于相同反应混合物中(即，它们同时存在并且在反应混合物中是活性的)。因此，α-葡聚糖水解酶的“底物”是由蔗糖通过葡糖基转移酶在反应混合物中同时合成的葡萄糖低聚物。在一个方面，其中酶不在反应混合物中同时使用的双酶法(即，至少一种葡糖基转移酶(GTF)和至少一种α-葡聚糖水解酶)通过前提条件从本文所公开的方法中排除。
如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物与一种或多种酶在其中发生接触的材料(一种或多种合适的物质)和水。合适的反应组分可由多种酶构成。在一个方面，合适的反应组分包含至少一种葡聚糖蔗糖酶。在一个方面，合适的反应组分包含至少一种葡聚糖蔗糖酶和至少一种α-葡聚糖水解酶。
如本文所用，“一个单位的葡聚糖蔗糖酶活性”或“一个单位的葡糖基转移酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与200g/L蔗糖温育时，转换1μmol蔗糖/分钟所需的酶量。蔗糖浓度使用HPLC测定。
如本文所用，“一个单位的右旋糖酐酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL右旋糖酐底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定法测定(Lever M.，(1972)，A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates，Anal.Biochem.47，273-279)。
如本文所用，“一个单位的突变酶糖酶活性”定义为当在pH 5.5和37℃下与0.5mg/mL变聚糖底物温育时，形成1μmol还原糖/分钟的酶量。所述还原糖使用PAHBAH测定法测定(Lever M.，同上)。
如本文所用，术语“酶催化剂”是指包含酶或酶的组合的催化剂，其具有获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物的必要活性。在某些实施方案中，可需要酶催化剂的组合以获得期望的可溶性葡聚糖纤维组合物。一种或多种酶催化剂可以呈完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶的形式。在某些实施方案中，酶催化剂还可以是化学改性的(诸如通过聚乙二醇化或通过与交联剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将酶催化剂固定到可溶性或不溶性支撑体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。
如本文所用，“药学上可接受的”是指所考虑的化合物或组合物适用于与人和其它动物的组织接触，但不具有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等，与合理的有益效果/风险比相称。
如本文所用，术语“低聚糖”是指包含介于3和约30个由α-糖苷键连接的单糖单元的均聚物。
如本文所用，术语“多糖”是指包含大于30个由α-糖苷键连接的单糖单元的均聚物。
如本文所用，术语“食品”广义地用于本文以包括多种物质，所述物质可被人类消化，其包括但不限于，饮料、乳制品、烘焙食品、能量棒、果冻、果酱、谷物、膳食补充剂和药用胶囊或片剂。
如本文所用，术语“宠物食品”或“动物饲料”广义地用于本文以包括多种物质，其可被非人类动物消化，并且可包括例如狗粮、猫粮和牲畜饲料。
“受试者”一般是指人类，虽然如将由本领域技术人员理解的，受试者可以为非人类动物。因此，其它受试者可包括哺乳动物，诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、牛、马、山羊、绵羊、猪和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
如本文所用，术语“胆固醇相关疾病”包括但不限于涉及胆固醇，具体地讲血浆中的非高密度脂质(非HDL)胆固醇的含量升高的病症，例如LDL胆固醇的含量升高和HDL/LDL比率升高，高胆固醇血症和高甘油三酯血症等。在具有高胆固醇血症的患者中，降低LDL胆固醇是治疗的主要目标之一。在具有高甘油三酯血症的患者中，降低高血清甘油三酯浓度是治疗的主要目标之一。具体地，如本文所定义的治疗胆固醇相关的疾病包括通过施用本发明的葡聚糖纤维或包含本发明葡聚糖纤维的组合物来控制血液胆固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰岛素敏感性。
如本文所用，“个人护理产品”是指用于美容护理毛发、皮肤、头皮和牙齿的产品，其包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部治疗物。在一些特别优选的实施方案中，这些产品用于人体，而在其它实施方案中，这些产品用于由非人类动物美容使用(例如在某些兽医应用中)。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：
本领域普通技术人员将认识到，可以进行本文公开的氨基酸序列的改性，同时保留与所公开的氨基酸序列相关联的功能。例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但可不影响编码蛋白的功能性质的基因改变。例如，本文所公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸可以置换另一功能等同的氨基酸。为了本发明目的，将置换定义为在以下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族、非极性或弱极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(诸如甘氨酸)或疏水性较强的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，导致一个带负电荷的残基置换为另一个带负电荷的残基(诸如，天冬氨酸置换谷氨酸)或一个带正电荷的残基置换为另一个带正电荷的残基(诸如，赖氨酸置换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。所提出的修饰中的每一者均完全在本领域常规技术内，由所编码的产物的生物活性的保留决定。
如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物典型的密码子使用情况。
如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些基本单位进行连接并退火以形成基因区段，该基因区段随后在酶促作用下组装而构建成完整的基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”是指体外组装组分核苷酸。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器中的一种来完成自动化学合成。因此，基于优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员能预期成功的基因表达的可能。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。
如本文所用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5'非编码序列)和编码序列后的调控序列(3'非编码序列)。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不同时天然可见的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是它通过基因转移引入到宿主生物中。外来基因可包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组的基因。
如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的缔合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即，该编码序列处于该启动子的转录控制下时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物的基因组中，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”、“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Accelrys Software Corp.，San Diego，CA)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))以及并入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，开会日期1992，111-20，编辑：Suhai、Sandor.出版社：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的结构和功能特性
人胃肠酶容易识别和消化具有大量α-(1,4)糖苷键的直链α-葡聚糖低聚物。用交替的键诸如α-(1,2)、α-(1,3)和α-(1,6)替代这些键通常减小α-葡聚糖低聚物的可消化性。增加支化度(使用交替键)也可降低相对的可消化性水平。
本发明可溶性α-葡聚糖纤维组合物使用一种或多种酶促加工助剂由甘蔗糖(蔗糖)制备，所述酶促加工助剂具有来自微生物的基本上与存在于自然界中的氨基酸序列相同的氨基酸序列(或其活性截短形式)，所述微生物具有长期暴露于人类的历史(天然存在于口腔中或存在于食品诸如啤酒、发酵的大豆等中的微生物等)。可溶性纤维具有低可消化性至没有可消化性，表现出高耐受性(即，如由可接受的气体形成量所测量的)、低粘度(能够在宽范围食品应用中使用)、和至少部分地可被肠道菌群发酵，提供可能的益生元效应(例如，增加据报道与提供潜在的益生元效应相关的双歧杆菌和乳酸菌的数量和/或活性)。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特征在于以下参数的组合：
a.至少75％的α-(1,3)糖苷键；
b.少于25％的α-(1,6)糖苷键；
c.少于10％的α-(1,3,6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量(Mw)；
e.在20℃水中在12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下，pH 7水中至少20％(w/w)的溶解度；和
i.小于5的多分散指数(PDI)。
本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、并且最优选地至少95％的α-(1,3)糖苷键。
在某些实施方案中，除了上述α-(1,3)糖苷键实施方案之外，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含少于25％、优选地少于10％、更优选地5％或更少、并且甚至更优选地少于1％的α-(1,6)糖苷键。
在某些实施方案中，除了上述α-(1,3)和α-(1,6)糖苷键含量之外，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含少于10％，优选地少于5％，并且最优选地少于2.5％的α-(1,3,6)糖苷键。
在一个优选的实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含93％至97％的α-(1,3)糖苷键和少于3％的α-(1,6)糖苷键，并且具有对应于DP为3至7的混合物的重均分子量。在另一个优选的实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含约95％的α-(1,3)糖苷键和约1％的α-(1,6)糖苷键，并且具有对应于DP为3至7的混合物的重均分子量。在某些其它实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含1％至3％的α-(1,3,6)键，优选地约2％的α-(1,3,6)键。
在某些实施方案中，除了上文提及的α-(1,3)、α-(1,6)、和/或α-(1,3,6)糖苷键含量之外，可溶性α-葡聚糖纤维组合物还包含少于5％，优选地少于1％，并且最优选地少于0.5％的α-(1,4)糖苷键。
在另一个实施方案中，除了以上提及的糖苷键含量之外，α-葡聚糖纤维组合物包括小于5000道尔顿、优选地小于2500道尔顿、更优选介于500道尔顿和2500道尔顿之间，并且最优选地约500道尔顿至约2000道尔顿的重均分子量(Mw)。
在另一个实施方案中，除了以上特征的任意组合之外，在20℃下和水中12重量％下，α-葡聚糖纤维组合物还包括小于250厘泊(0.25帕斯卡秒(Pa·s))、优选地小于10厘泊(cP)(0.01帕斯卡秒(Pa·s))、优选地小于7cP(0.007Pa·s)、更优选地小于5cP(0.005Pa·s)、更优选地小于4cP(0.004Pa·s)、并且最优选地小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。
如由分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量，可溶性α-葡聚糖组合物具有小于10％的可消化性，优选地小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的可消化性。在另一方面，可消化性的相对水平可另选地使用AOAC 2011.25(综合总膳食纤维测定，Integrated Total Dietary Fiber Assay)(McCleary等人，2012,J.AOAC Int.,95(3),824-844)测定。
除了上述实施方案中任一个之外，在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物在25℃下pH 7水中具有至少20％(w/w)、优选地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。
在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含的还原糖的含量小于10重量％、优选地小于5重量％、并且最优选地1重量％或更少。
在某些实施方案中，可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含少于4kcal/g、优选地少于3kcal/g、更优选地少于2.5kcal/g、并且最优选地约2kcal/g或更少的含热量。
包含葡聚糖纤维的组合物
取决于期望的应用，可溶性α-葡聚糖纤维/纤维组合物可与适用于食品、个人护理产品和/或药物的一种或多种其它材料一起配制(例如，共混、混合、掺入等)。因此，本公开包括含有可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物。在该上下文中，术语“包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物”可包括例如，营养或食品组合物，诸如食物产品、食品补充剂、膳食补充剂(例如，呈粉末、液体、凝胶、胶囊、香囊或片剂的形式)或功能性食品。在某些实施方案中，“包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物”包括个人护理产品、化妆品和药物。
可直接包括本发明可溶性α-葡聚糖纤维/纤维组合物作为期望的产品(例如食品、个人护理产品等)中的成分，或可以与一种或多种附加的食品级材料共混以形成用于期望的产品(例如食品、个人护理产品等)中的碳水化合物组合物。掺入碳水化合物组合物中的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量可根据应用改变。因此，本发明包括含有可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。在某些实施方案中，提供一种碳水化合物组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)，优选地0.1重量％至90重量％，更优选地1重量％至90重量％，并且最优选地5重量％至80重量％的上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
如本文所用，术语“食品”旨在涵盖人类食用以及动物食用的食品。所谓“功能性食品”，是指声称具有除供应营养物的基础营养功能之外的健康促进和/或疾病预防和/或疾病(风险)降低特性的任何新鲜的或经加工的食品。功能性食品可包括例如，经加工的食品或利用健康促进添加剂强化的食品。功能性食品的示例为利用维生素强化的食品，或具有活的培养物的发酵食品。
包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物可包含本领域已知的营养组合物中包括的某些其它材料，诸如水或其它含水溶液、脂肪、糖、淀粉、粘结剂、增稠剂、着色剂、风味剂、增味剂、酸化剂(诸如乳酸或苹果酸等)、稳定剂、或高强度甜味剂或矿物质等。
适宜的食物产品的示例包括面包、早餐谷类食物、饼干、蛋糕、曲奇、梳打饼、酸乳、开菲尔、味噌、纳豆、豆豉、泡菜、酸菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精饮料、小吃、汤、冷冻甜点、油炸食品、比萨、意面制品、土豆制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、谷物、生面团、加工肉类和奶酪、酸奶、冰淇淋甜点、基于牛奶的饮料、沙拉酱、酱汁、浇头、甜点、糖果产品、基于谷物的干棒小吃、制备的菜肴等。包含本发明α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物可以呈液体、粉末、片剂、立方体、颗粒、凝胶或糖浆的形式。
在某些实施方案中，根据本发明的碳水化合物组合物包含至少两种纤维源(即，可溶性α-葡聚糖纤维组合物之外的至少一种附加的纤维源)。在某些实施方案中，一种纤维源为可溶性α-葡聚糖纤维并且第二纤维源为低聚糖或多糖，其选自抗性/支链麦芽糖糊精/纤维糊精(诸如得自Roquette Freres(Lestrem，France)的得自ADM-MatsutaniLLC(Decatur，Illinois)的)，聚右旋糖(得自Danisco-DuPontNutrition&Health(Wilmington，DE)的)，可溶性玉米纤维(例如，得自Tate&Lyle(London，UK)的)，异麦芽低聚糖(IMO)、交替糖和/或麦芽交替低聚糖(MAO)(例如，得自Aevotis GmbH(Potsdam，Germany)的FIBERMALTTM；SUCROMALTTM(得自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、普鲁兰多糖、抗性淀粉、菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素和果糖低聚物糖浆。
可溶性α-葡聚糖纤维可作为常规碳水化合物的替代品或补充剂加入食品中。因此，在某些实施方案中，本发明是包含本发明可溶性α-葡聚糖纤维的食物产品。在某些实施方案中，食物产品中的可溶性α-葡聚糖纤维组合物由本文所公开的方法来制备。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用于碳水化合物组合物和/或食物产品中，所述组合物和/或食物产品包含一种或多种高强度人造甜味剂，包括但不限于甜菊糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰磺胺酸钾、糖精、以及它们的组合。可溶性α-葡聚糖纤维可与糖替代物共混，所述糖替代物诸如甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤藓醇、甘油、甘草甜素、氢化淀粉水解物、菊粉、异麦芽、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、麦芽低聚糖、麦芽交替低聚糖(诸如，SUCROMALTTM，购自Cargill Inc.(Minneapolis，MN)、甘露醇、神奇蛋白、罗汉果苷混合物、莫纳甜、莫内林、osladin、五聚糖、山梨醇、甜菊糖、塔格糖、奇异果甜蛋白、木糖醇以及它们的任意组合。
在某些实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品将具有比其中使用常规碳水化合物的类似食物产品更低的血糖应答、更低的血糖指数、和更低的血糖负载。另外，因为可溶性α-葡聚糖纤维的特征在于人类胃或小肠中具有非常低的可消化性至没有可消化性，所以在某些实施方案中，降低了食物产品的含热量。可溶性α-葡聚糖纤维可以粉末的形式使用，共混入具有其它合适的食品成分的干粉末中，或可以包含膳食纤维的液体糖浆(本文中也称为“可溶性纤维糖浆”、“纤维糖浆”或简称“糖浆”)的形式共混或使用。“糖浆”可作为可溶性纤维源加入食物产品中。其可增加食物产品的纤维含量，但对风味、口感、或质感不具有负面影响。
纤维糖浆可单独地或与增量剂诸如糖醇或麦芽糖糊精组合地用于食物产品中，以减少含热量和/或增强产品的营养特征。纤维糖浆还可用作食物产品中脂肪的部分替代品。
纤维糖浆可作为嫩化剂或调质剂用于食物产品中，以增加脆性或折断性、改善视觉吸引力、和/或改善生面团、奶蛋糊或其它食品组合物的流变性。纤维糖浆还可作为湿润剂用于食物产品中，以增加产品的架藏寿命、和/或产生更柔软、更湿润的质地。其还可用于食物产品中以降低水活度或固定和管理水。纤维糖浆的附加用途可包括：替代涂蛋液和或增强食物产品的表面光泽、改变面粉淀粉糊化温度、改性产品的质地、以及增强产品的褐变。
纤维糖浆可用于各种类型的食物产品中。其中本发明糖浆可非常有用的一种食物产品类型是烘焙产品(即烘焙食品)，诸如蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团。常规的烘焙产品可具有相对高的糖和高的总碳水化合物。纤维糖浆用作烘焙产品中的成分可有助于降低糖和碳水化合物含量，以及降低总卡路里，同时增加烘焙产品的纤维含量。
存在烘焙产品的两种主要类型：酵母发酵和化学发酵。在酵母发酵的产品，如甜甜圈、甜面团和面包中，含纤维的糖浆可用于替代糖，但少量糖仍然是期望的，这是由于酵母或外壳褐变需要发酵底物。纤维糖浆可作为包含非纤维的糖浆或液体甜味剂的直接替代品与其它液体一起添加。然后，生面团可在烘焙行业中常用的条件下加工，包括混合、发酵、分开、成形或挤出为长面包或挤出成型、发面、和烘焙或油炸。可使用类似于传统产品的条件，将产品烘焙或油炸。面包可通常在420℉至520℉(216-271℃)范围内的温度下烘焙20分钟至23分钟，并且甜甜圈可在400-415℉(204-213℃)范围内的温度下油炸，但还可使用其它温度和时间。
化学发酵的产品通常具有更多的糖，并且可包含更高含量的包含可溶性α-葡聚糖纤维的碳水化合物组合物和/或可食用糖浆。成品曲奇可包含30％糖，其可完全地或部分地用包含本发明葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物和/或糖浆替代。这些产品可具有例如4-9.5的pH。水分含量可例如介于2％-40％之间。
在膏化步骤期间开始混合时，或在类似于糖浆或干甜味剂正在被用于替代的任何方法中，碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆可容易地掺入并可加入脂肪中。可将产品混合并且然后例如通过成片、旋转切割、线切割或通过另一成形工艺成形。然后可在典型的烘焙条件下，例如在200-450℉(93-232℃)下，烘焙产品。
其中可使用碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是早餐谷类食物。例如，包含纤维的糖浆可用于替代在挤出的谷物片中和/或那些片的外部涂层中的全部或部分的糖。所述涂层通常为成品谷物片的总重量的30％-60％。糖浆可以例如喷雾或洒落形式施用。
其中可使用(任选地以碳水化合物组合物和/或包含纤维的糖浆的形式)可溶性α-葡聚糖纤维组合物的另一食物产品类型是乳制品。其中其可使用的乳制品的示例包括酸乳、酸乳饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、和乳制品甜点，诸如脱脂凝乳和打发的慕斯型产品。这可包括旨在直接食用的乳制品(诸如包装好的冰沙)以及旨在与其它成分共混的那些(诸如共混的冰沙)。其可用于巴氏灭菌乳制品，诸如在160℉至285℉(71-141℃)的温度下巴氏灭菌的乳制品。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是糖果。其中其可使用的糖果的示例包括硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖或胶糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果小吃。在水果小吃中，包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可与果汁组合使用。所述果汁可提供大部分甜味，并且包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可减少总糖含量并增加纤维。可将包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物加入最初的糖果浆液中并且加热至最终固含量。所述浆液可从200-305℉(93-152℃)加热以实现最终固含量。可在加热之前或之后加入酸以产生2-7的最终pH。可将包含葡聚糖纤维的组合物用作存在的0-100％的糖和1-100％的玉米糖浆或其它甜味剂的替代物。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是果酱和果冻。果酱和果冻由水果制成。果酱包含水果片，然而果冻由果汁制成。包含本发明纤维的组合物可如下代替糖或其它甜味剂使用：将水果和果汁称入罐中；将糖、含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物和果胶预混；将干组合物加入液体中并煮至214-220℉(101-104℃)的温度；热填充到广口瓶中并干馏5-30分钟。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是饮料。其中其可使用的饮料的示例包括碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物(例如玛格丽特混合物)、清水、和饮料干混物。使用可溶性α-葡聚糖纤维可克服当将其它类型的纤维加入饮料中时产生的透明度问题。糖的完全替代是可能的(其可以为例如高达总配方的12％或更多)。
另一食物产品类型是高固体填充物。高固体填充物的示例包括干棒小吃、烤酥饼、甜甜圈和曲奇中的填充物。高固体填充物可以为例如酸/水果填充物或有香味的填充物。可溶性α-葡聚糖纤维组合物可加入原样食用的产品中，或加入可通过食品加工机(附加的烘焙)或通过消费者(烘焙稳定填充)经历进一步加工的产品中。在某些实施方案中，高固体填充物可具有介于67％-90％之间的固体浓度。所述固体可被包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物完全替代，或其可用于存在的其它甜味剂固体的部分替代(例如，替代5％-100％的现有固体)。通常水果填充物可具有2-6的pH，然而有香味的填充物可介于4-8pH之间。填充物可冷却制备或在高达250℉(121℃)下加热以蒸发至期望的最终固含量。
其中可使用可溶性α-葡聚糖纤维组合物或(包含α-葡聚糖纤维组合物)的碳水化合物组合物的另一食物产品类型是挤出和成片的小吃。其可使用的挤出和成片小吃的示例包括膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片。在制备挤出片时，包含本发明葡聚糖纤维的组合物可与干产品一起直接添加。可在挤出机中添加少量水，并且然后，其可通过在100℉至300℉(38-149℃)范围内的各个区。所述干产品可以干产品混合物的0％-50％的含量添加。包含可溶性α-葡聚糖纤维的糖浆还可沿挤出机在液体端口之一处添加。产品可以低水分含量(5％)制出，并且然后烘焙以去除过量水分，或以略高水分含量(10％)制出，并且然后油炸以去除水分并煮出产品。烘焙可以在高达500℉(260℃)的温度下持续20分钟。烘焙可更典型地在350℉(177℃)下持续10分钟。油炸可通常在350℉(177℃)下持续2-5分钟。在片状小吃中，包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可用作其它干燥成分(例如，面粉)的部分替代品。可溶性α-葡聚糖纤维可以为干重的0-50％。可将产品干混，并且然后加入水以形成粘着面团。产物混合物可具有5至8的pH。然后可将生面团成片并切割，并且然后烘焙或油炸。烘焙可以在高达500℉(260℃)的温度下持续20分钟。油炸可通常在350℉(177℃)下持续2-5分钟。来自使用包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物的另一潜在有益效果是当其作为内部成分添加或作为油炸食品的外部上的涂层添加时，油炸小吃中的脂肪含量减少多达15％。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是明胶状点心。明胶状点心的成分常常作为干混物出售，其中明胶作为胶凝剂。糖固体可利用干混物中包含本发明葡聚糖纤维的组合物部分或完全地替代。然后可将干混物与水混合并加热至212℉(100℃)以溶解明胶，并且然后可加入更多水和/或水果以完成明胶状点心。然后使明胶冷却并固化。明胶还可以架藏稳定的包装出售。在该情况下，稳定剂通常是基于角叉菜胶的。如上所述，包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可用于替代高达100％的其它甜味剂固体。可将干燥成分混入液体中并且然后巴氏灭菌并放入杯中，并使其冷却和固化。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是干棒小吃。其中其可使用的干棒小吃的示例包括早餐替代棒和代餐棒、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒。其可用于干棒小吃的任一部分中，诸如在高固体填充物、结合糖浆、或颗粒部分中。完全或部分替代结合糖浆中的糖是可能的。结合糖浆通常为50％-90％固体，并且以在10％结合糖浆与90％颗粒，至70％结合糖浆与30％颗粒范围内的比率施用。结合糖浆通过将甜味剂、增量剂、和其它粘结剂(如淀粉)的溶液加热至160-230℉(71-110℃)来制备(取决于糖浆中所需的最终固体)。然后将糖浆与颗粒混合以涂覆颗粒，从而提供遍布基质的涂层。包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物还可用于颗粒本身。这可以为直接膨胀或枪式膨化的挤出片。其可以与另一种谷物成分、玉米粗粉、米粉或其它类似成分组合使用。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维糖浆的另一食物产品类型是奶酪、奶酪酱和其它奶酪产品。其中其可使用的奶酪、奶酪酱和其它奶酪产品的示例包括低乳固体奶酪、低脂奶酪、和低卡路里奶酪。在块状奶酪中，其可有助于改善熔融特性，或减小通过其它成分诸如淀粉增加的熔融限制效应。其还可用于奶酪酱中，例如作为增量剂，来替代脂肪、乳固体或其它典型的增量剂。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物的另一食物产品类型是可食用和/或水溶性的膜。其中其可使用的膜的示例包括用于包封旨在溶解于水中的各种食品和饮料的干混物的膜，或者用于递送着色剂或风味剂的膜，诸如在烹饪之后但仍然热时加入食品中的香料膜。其它膜应用包括但不限于，水果和植物鞣皮，以及其它柔性膜。
在另一个实施方案中，可使用的包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物为汤、糖浆、酱汁、和调味品。典型的调味品可以为0％-50％油，其pH范围为2-7。其可冷加工或热加工。可将其混合，并且然后可添加稳定剂。根据需要，包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。调味品组合物可需要加热以活化稳定剂。典型的加热条件可以为170-200℉(77-93℃)并持续1-30分钟。在冷却之后，加入油以制备预乳液。然后，使用匀化器、胶体磨或其它高剪切工艺将产品乳化。
酱汁可具有0％-10％油和10％-50％总固体，并且可具有2-8的pH。酱汁可冷加工或热加工。将成分混合并且然后热加工。根据需要，包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可容易地以液体形式或干燥形式与其它成分一起添加。典型的加热可以为170-200℉(77-93℃)并持续1-30分钟。
汤更典型地为20％-50％固体并且处于更中性的pH范围(4-8)。它们可以为干混合物，可向其中添加包含可溶性α-葡聚糖纤维的干燥组合物，或者为液体汤，该液体汤罐装并且然后干馏。在汤中，可使用高达50％固体的抗性玉米糖浆，但更典型的用途是可以递送5g纤维/份。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物的另一食物产品类型是咖啡奶精。其中其可使用的咖啡奶精的示例包括液体奶精和干奶精两者。干共混的咖啡奶精可与以下脂肪类型的商业奶精粉末共混：大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油、或乳脂。这些脂肪可以为非氢化的或氢化的。包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物可作为纤维源，任选地与果糖低聚糖、聚右旋糖、菊粉、麦芽糖糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常规玉米糖浆固体一起添加。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、或它们的组合。可将这些成分干共混以制备期望的组合物。
喷雾干燥的奶精粉末为脂肪、蛋白质和碳水化合物、乳化剂、乳化盐、甜味剂和抗结块剂的组合。脂肪源可以为大豆油、椰子油、棕榈油、葵花油或卡诺拉油或乳脂中的一种或多种。蛋白质可以为酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙、乳蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白或大豆蛋白。碳水化合物可以为单独包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物的组合物，或包含本发明的α-葡聚糖纤维组合物与低聚果糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、玉米糖浆或它们的任意组合的组合的组合物。乳化剂可以为甘油单酯和甘油二酯、乙酰化甘油单酯和甘油二酯、或丙二醇单酯。所述盐可以为柠檬酸三钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠、焦磷酸四钠、磷酸二氢钾、和/或磷酸二钾。所述组合物还可包含高强度甜味剂，诸如上述那些。适宜的抗结块剂包括硅铝酸钠或二氧化硅。产品可合并于浆液中，任选地均化，并且以颗粒状或附聚形式喷雾干燥。
液体咖啡奶精仅是脂肪(乳脂或氢化植物油)、一些乳固体或酪蛋白酸盐、玉米糖浆和香草风味剂或其它风味剂的经匀化和巴氏灭菌的乳液，以及稳定化共混物。产品通常在185℉(85℃)下经由HTST(高温短时)巴氏灭菌30秒，或在285℉(141℃)下UHT(超高温)巴氏灭菌4秒，并且在两塔板均化器中以第一塔板500-3000psi(3.45–20.7MPa)，和第二塔板200-1000psi(1.38–6.89MPa)均化。通常将咖啡奶精稳定化使得其在加入咖啡中时不分解。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如包含纤维的糖浆)的另一食物产品类型是食品涂层诸如糖衣、糖霜、和蛋浆。在糖衣和糖霜中，包含纤维的糖浆可用作甜味剂替代品(完全或部分的)以降低含热量并增加纤维含量。蛋浆通常为约70％-90％的糖，其中剩余的大部分为水，并且包含纤维的糖浆可用于完全或部分替代糖.糖霜通常包含约2％-40％的液体/固体脂肪组合、约20％-75％甜味剂固体、着色剂、风味剂和水。包含纤维的糖浆可用于替代全部或部分的甜味剂固体，或作为低脂肪体系中的增量剂。
其中可使用包含纤维的糖浆的另一食物产品类型是宠物食品，诸如干或湿的狗粮。宠物食品以各种方式制备，诸如挤出、成形、和配制成肉汁。包含纤维的糖浆可以0％-50％的含量用于这些类型的每一种中。
其中可使用包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物(诸如糖浆)的另一食物产品类型是鱼和肉。在一些肉中已经使用了常规的玉米糖浆，所以包含纤维的糖浆可用作部分或完全的替代物。例如，糖浆可在其真空翻滚或注入肉中之前，加入盐水中。其可与盐和磷酸盐，以及任选地与水结合成分诸如淀粉、角叉菜胶或大豆蛋白一起添加。这可用于增加纤维，典型的含量可以为5g/次，这可满足对优异纤维源的要求。
包含本发明可溶性纤维的个人护理和/或药物组合物
可溶性α-葡聚糖纤维和/或包含可溶性α-葡聚糖纤维的组合物可用于个人护理产品中。例如，可能够使用此类材料作为湿润剂、水性胶体或可能的增稠剂。如果需要，本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物可与一种或多种其它类型的增稠剂结合使用，诸如在美国专利8,541,041中所公开的那些，该专利的公开内容以引用方式全文并入本文。
本文个人护理产品包括但不限于，例如护肤组合物、化妆品组合物、抗真菌组合物、和抗菌组合物。本文的个人护理产品可为例如洗剂、霜膏、糊剂、油膏、膏剂、润发油、凝胶、液体以及它们的组合等的形式。本文公开的个人护理产品可包含至少一种活性成分。活性成分通常被视为产生预期药理效应的成分。
在某些实施方案中，可将皮肤护理产品施用于皮肤，以解决与缺乏水分相关的皮肤损伤。皮肤护理产品也可用于改善皮肤的视觉外观(例如减少片状、破裂和/或红皮肤的外观)和/或皮肤的触感(例如，降低皮肤的粗糙度和/或干燥度，同时增加皮肤的柔滑度和细腻度)。皮肤护理产品通常可包含至少一种活性成分以治疗或预防皮肤疾病，提供美容效应，或向皮肤提供保湿有益效果，所述活性成分如氧化锌、凡士林、白凡士林、矿物油、鱼肝油、羊毛脂、聚二甲基硅氧烷、硬脂肪、维生素A、尿囊素、炉甘石、高岭土、甘油、或胶状燕麦、以及这些的组合。例如，皮肤护理产品可包含一种或多种天然保湿因子，诸如神经酰胺、透明质酸、甘油、角鲨烷、氨基酸、胆固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亚油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸钠或吡咯烷酮羧酸钠。可包含在皮肤护理产品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、卡诺拉油、角鲨烷、角鲨烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蜡、卵磷脂、橄榄油、红花油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶树油、牛油树脂、棕榈油、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯、脂肪酸和橙油。
如本文所用，个人护理产品还可以是化妆品或其它产品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红、眼线膏、唇线笔、唇彩、其它化妆品、防晒霜、防晒剂(sunblock)、指/趾甲油、摩丝、喷发剂、定型凝胶、指/趾甲调理剂、洗浴凝胶、淋浴凝胶、身体洗涤剂、洗脸剂、洗发剂、毛发调理剂(免洗型或洗去型)、营养发水、毛发染料、毛发着色产品、亮发产品、护发精华素、头发防卷曲产品、头发分叉端修复产品、唇香膏、皮肤调理剂、冷霜、保湿剂、身体喷剂、肥皂、身体擦洗剂、剥脱剂、收敛剂、紧肤洗剂、脱毛剂、烫发液、去屑制剂、止汗剂组合物、除臭剂、剃刮产品、剃刮前产品、剃刮后产品、清洁剂、皮肤凝胶、漂洗剂、牙膏或漱口剂。
如本文所用，药学产品可例如呈乳液、液体、酏剂、凝胶、混悬液、溶液、霜膏、胶囊、片剂、香囊或膏剂的形式。此外，本文的药物产品可以是本文所公开的任意个人护理产品的形式。药物产品还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或药学上可接受的盐。本发明纤维和/或包含本发明纤维的组合物还可用于胶囊、包封材料、片剂包衣中，并作为赋形剂用于药剂和药物。
可溶性α-葡聚糖纤维组合物的酶促合成
提供酶促制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用至少一种重组产生的葡糖基转移酶，其属于葡糖苷水解酶70型家族(E.C.2.4.1.-)，并且其能够催化使用蔗糖作为底物的耐消化可溶性α-葡聚糖纤维组合物的合成。葡糖苷水解酶家族70酶是由乳酸菌诸如链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌或乳杆菌属产生的转葡糖苷酶(参见Carbohydrate Active Enzymes database；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)Nucleic Acids Res 37：D233-238)。重组表达的葡糖基转移酶优选具有与天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，与存在于源生物体的全长序列或其催化活性截短形式相同)。
GTF酶能够聚合蔗糖的D-葡糖基单元以形成同寡糖或同多糖。取决于GTF酶的特异性，形成包含各种糖苷键诸如α-(1,2)、α-(1,3)、α-(1,4)和α-(1,6)的直链和/或支链葡聚糖。葡糖基转移酶还可将D-葡糖基单元转移到羟基受体基团上。受体的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇或类黄酮。所得的葡糖基化产物的结构取决于酶特异性。
在本发明中，D-吡喃葡糖基供体是蔗糖。因此，反应为：
主要形成的糖苷键类型用于命名/分类葡糖基转移酶。示例包括右旋糖酐蔗糖酶(α-(1,6)键；EC 2.4.1.5)、变聚糖蔗糖酶(α-(1,3)键；EC 2.4.1.-)、交替糖蔗糖酶(交替的α(1,3)-α(1,6)主链；EC 2.4.1.140)和罗伊糖蔗糖酶(α-(1,4)和α-(1,6)键的混合物；EC2.4.1.-)。
在一个方面，葡糖基转移酶(GTF)能够形成具有50％或更多的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖，前提条件是葡聚糖产物不是交替糖(即所述酶不是交替糖蔗糖酶)。在一个优选的方面，葡糖基转移酶为变聚糖蔗糖酶(EC 2.4.1.-)。如上所述，影响变聚糖蔗糖酶功能的氨基酸残基先前已被表征。参见，A.Shimamura等人(J.Bacteriology，(1994)176：4845-4850)。
葡糖基转移酶优选是能够产生具有至少75％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖的葡糖基转移酶。在某些实施方案中，葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：153具有至少90％序列同一性，包括至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：153相同。在某些实施方案中，包含与SEQ ID NO：153具有90％或更大序列同一性的氨基酸序列的葡糖基转移酶为GTF-S、其同系物、其截短形式、或其同系物的截短形式。在某些实施方案中，葡糖基转移酶包含选自SEQ ID NO:3、5、17、19、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112以及它们的任意组合的氨基酸序列。然而，应当注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一个实施方案中，适用的葡糖基转移酶可以为野生型序列的截短形式。在另一个实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含衍生自全长野生型氨基酸序列的序列，所述全长野生型氨基酸序列选自SEQ ID NO：3和17。在另一个实施方案中，所述葡糖基转移酶可以是截短的并且将具有选自SEQ ID NO：5和19的氨基酸序列。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶包含SEQ ID NO：5。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶是截短的，并且衍生自SEQ ID NO：19。在某些其它实施方案中，截短的葡糖基转移酶包含选自SEQ ID NO:118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150和152的氨基酸序列。
含水反应制剂中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。每种催化剂反应的重量(单一葡糖基转移酶或独立地葡糖基转移酶和α-葡聚糖水解酶)通常在0.0001mg/mL至20mg/mL总反应体积，优选0.001mg/mL至10mg/ml范围内。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性支撑体上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编辑；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中回收和重复使用催化剂。酶催化剂可为下列形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶以及它们的混合物。
最终反应制剂的pH值为约3至约8，优选地约4至约8，更优选地约5至约8，甚至更优选地约5.5至约7.5，甚至更优选地约5.5至约6.5。可任选地通过添加合适的缓冲液，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应的pH值。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选地1mM至300mM，最优选地10mM至100mM。
当将反应组分合并时，最初存在的蔗糖浓度为至少50g/L，优选地50g/L至600g/L，更优选地100g/L至500g/L，更优选地150g/L至450g/L，并且最优选地250g/L至450g/L。α-葡聚糖水解酶(当存在时)的底物将为由葡糖基转移酶形成的葡萄糖低聚物群体的成员。因为存在于反应体系中的葡萄糖低聚物可充当受体，所以存在于反应体系中的每种物质的确切浓度将变化。此外，可将其它受体(即，外部受体)加入初始反应混合物中，诸如举例来说麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
反应的长度可变化并且可通常通过使用所有可获得的蔗糖底物所花费的时间量来测定。在一个实施方案中，进行反应直至消耗至少90％，优选地至少95％，并且最优选地至少99％的最初存在于反应混合物中的蔗糖。在另一个实施方案中，反应时间为1小时至168小时，优选地1小时至72小时，并且最优选地1小时至24小时。
使用升高的反应温度的单一酶方法(葡糖基转移酶)
许多GH70家族葡糖基转移酶的最佳温度通常介于25℃和35℃之间，其中通常在超过55℃-60℃的温度下观察到快速失活。然而，已经发现当反应在升高的温度下(本文定义为至少45℃的温度，但低于酶在所用反应条件下的失活温度)进行时，某些葡糖基转移酶可以能够由蔗糖产生期望的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在一个方面，当反应在至少45℃，但低于其中酶在所用反应条件下热失活的温度下进行时，葡糖基转移酶能够由蔗糖产生可溶性α-葡聚糖纤维。在另一方面，用于运行葡糖基转移酶反应的温度在至少47℃但小于特异性酶在所用反应条件下的失活温度的温度下进行。在一个方面，反应温度的上限等于或小于55℃。在另一个实施方案中，反应温度为47℃至52℃。在另一个方面，用于单一酶方法的葡糖基转移酶包含衍生自多肽的氨基酸序列，所述多肽具有选自SEQ ID NO：3和5的氨基酸序列。在一个优选的方面，葡糖基转移酶衍生自唾液链球菌GtfJ葡糖基转移酶(gi：47527；SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶为SEQ ID NO:3或保留其葡糖基转移酶活性的催化活性截短形式。
可溶性葡聚糖纤维合成-包含葡糖基转移酶(Gtf)和α-葡聚糖水解酶的反应体系
本发明提供使用至少一种α-葡聚糖水解酶与至少一种上述葡糖基转移酶的组合(即，同时在反应混合物中)，酶促制备可溶性α-葡聚糖纤维的方法。当与相同酶的顺序施用相比时(即，首先使用葡糖基转移酶由蔗糖合成葡聚糖聚合物并且随后利用α-葡聚糖水解酶处理葡聚糖聚合物)，同时使用两种酶产生不同产物特征(即，可溶性纤维组合物的特征)。在一个实施方案中，特别排除了基于葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的顺序施用的葡聚糖纤维合成方法。
类似于葡糖基转移酶，α-葡聚糖水解酶可通过针对某些α-D-糖苷键的内切水解活性定义。可用于本文所公开的方法的α-葡聚糖水解酶可通过其特征结构域结构来识别，例如那些识别为上述突变酶和右旋糖酐酶的结构域结构。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(能够水解α-(1,6)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.11)、突变酶(能够水解α-(1,3)-连接的糖苷键；E.C.3.2.1.59)、霉菌右旋糖酐酶(mycodextranases)(能够内切水解包含(1→3)-和(1→4)-键两者的α-D-葡聚糖中的(1→4)-α-D-糖苷键；EC 3.2.1.61)、葡聚糖1,6-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.70)和交替糖酶(能够内切水解裂解交替糖；E.C.3.2.1.-；参见U.S.5,786,196)。各种因素包括但不限于某些α-葡聚糖内的支化程度、支化类型和相对分支长度，可不利地影响α-葡聚糖水解酶内切水解一些糖苷键的能力。
在一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11)、突变酶(EC3.1.1.59)或它们的组合。在一个实施方案中，右旋糖酐酶是来自毛壳菌(Chaetomiumerraticum)的食品级右旋糖酐酶。在另一个实施方案中，来自毛壳菌(Chaetomiumerraticum)的右旋糖酐酶为PLUS L，购自Novozymes A/S(Denmark)。
在另一个实施方案中，α-葡聚糖水解酶为至少一种突变酶(EC 3.1.1.59)。可用于本文所公开的方法的突变酶可通过其特征性结构来识别。参见例如，Y.Hakamada等人，(Biochimie，(2008)90：525-533)。在一个实施方案中，突变酶为可得自青霉菌属(Penicillium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)的突变酶。在另一个实施方案中，突变酶来自马尔尼菲青霉ATCC 18224或Paenibacillus Humicus。在一个实施方案中，突变酶包含选自SEQID NO:21、22、24、27、29、54、56、58以及它们的任意组合的氨基酸序列。在另一个实施方案中，突变酶包含选自SEQ ID NO:21、22、24、27以及它们的任意组合的氨基酸序列。在另一个实施方案中，上述突变酶可以为催化活性的截短形式，只要保留突变酶活性即可。
可对包括同时使用至少一种葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶的酶促反应体系的温度进行选择，来控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约60℃，优选的范围为5℃至约55℃，更优选的反应温度范围为约20℃至约47℃。
葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(v/v)可根据选择的酶变化。在一个实施方案中，葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(v/v)的范围是从1:0.01至0.01:1.0。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(活性单元/活性单元)可根据选择的酶变化。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(活性单元/活性单元)的范围是从1:0.01至0.01:1.0。
在一个实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，该方法包括：
1.提供反应组分的系列，其包括：
a.蔗糖；
b.至少一种葡糖基转移酶，其能够催化具有至少75％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
c.至少一种α-葡聚糖水解酶，其能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
d.任选地一种或多种受体；以及
2.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在一个优选的实施方案中，至少一种葡糖基转移酶和至少一种α-葡聚糖水解酶同时存在于反应中以制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在一个实施方案中，至少一种能够催化具有一个或多个α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成的葡糖基转移酶为变聚糖蔗糖酶。
在另一个实施方案中，至少一种能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物的α-葡聚糖水解酶为内切突变酶。
在一个优选的实施方案中，反应组分的系列包含变聚糖蔗糖酶和突变酶的同时使用。
制备可溶性α-葡聚糖纤维的方法还可包括获得可溶性α-葡聚糖纤维组合物的一个或多个附加步骤。因此，并且在另一个实施方案中，提供一种方法，所述方法包括：
1.提供反应组分的系列，其包括：
a)蔗糖；
b)至少一种葡糖基转移酶，其能够催化具有至少75％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
c)至少一种α-葡聚糖水解酶，其能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
d)任选地一种或多种受体；
2.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物混合物；
3.将可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤2的产物混合物分离；以及
4.任选地，将可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
识别具有期望活性的基本上相似的酶的方法
本领域技术人员认识到，基本上相似的酶序列也可以用于本发明的组合物和方法中，只要保留期望的活性(即，能够形成具有期望的糖苷键的葡聚糖的葡糖基转移酶活性或α-葡聚糖水解酶具有针对一个或多个目标糖苷键的内切水解酶活性)即可。例如，已经展示了可制备和使用催化活性截短形式，只要保留期望的活性(或甚至在特定活性方面改善)即可。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行定义。在另一个实施方案中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。
如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其它分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子诸如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中度相似的分子(诸如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(诸如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高度严格的杂交条件是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％SDS洗涤，之后是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃的最终洗涤。
杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook,J.和Russell,D.,T.，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地至少约20个核苷酸，甚至更优选地至少30个核苷酸，甚至更优选地至少300个核苷酸，最优选地至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
如本文所用，术语“百分比同一性”为两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的核苷酸或氨基酸的匹配数确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.，编辑)，Oxford University出版社，NY(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编辑)，Academic出版社，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana出版社，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.编辑)Academic出版社(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton出版社，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends inGenetics 16，(6):276-277(2000))进行。可使用CLUSTAL比对方法(诸如CLUSTALW；例如版本1.83)利用默认参数来进行序列的多重比对(Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22:4673-4680(1994)以及Chenna等人，NucleicAcids Res 31(13):3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自European Molecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAPExistence penalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1，protein GAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。另选地，可将使用CLUSTALW方法(例如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、WINDOW＝5、以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在一个方面，合适的分离的核酸分子编码具有下述氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约20％，优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。在另一方面，合适的分离的核酸分子编码具有下述氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约20％，优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性；前提条件是所述多肽保留了相应活性(即葡糖基转移酶或α-葡聚糖水解酶活性)。在某些实施方案中，保留活性的葡糖基转移酶包括含有与SEQ ID NO:153具有至少90％同一性的氨基酸序列的那些葡糖基转移酶。
气体产生
在下胃肠道中的快速气体产生速率引起胃肠道不适，诸如肠胃气胀和胃气胀，然而如果气体产生是渐进的和低的，则身体可以更容易地应付。例如，当在当量剂量(可溶性纤维克数)下与公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物相比时，菊粉产生快速且高的气体产生增加，然而在当量剂量下公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物优选具有低于菊粉的气体释放速率。
在一个实施方案中，包含公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的食物产品的食用产生对于食品应用而言良好耐受的气体产生速率。在一个实施方案中，在当量剂量下，气体产生的相对速率不大于在类似条件下对于菊粉所观察到的速率，优选地与菊粉相同或小于菊粉，更优选地小于菊粉，并且最优选地远小于菊粉。在另一个实施方案中，使用本文所述的方法，经过3小时或24小时，测量气体形成的相对速率。在优选的方面，在相同反应条件下，气体形成速率比对于菊粉所观察到的速率小至少1％，优选地2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或至少30％。
有益的生理特性
短链脂肪酸产生
使用根据本发明的化合物可有利于通过结肠发酵产生产能代谢物。使用根据本发明的化合物可有利于产生短链脂肪酸(SCFA)，诸如丙酸盐和/或丁酸盐。已知SCFA降低胆固醇。因此，本发明的化合物可降低形成高胆固醇的风险。在发酵研究中，本发明公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物可以促进SCFA，尤其是丙酸盐和/或丁酸盐的产生。因为SCFA的产生或SCFA与乙酸盐的比例的增加有利于在对其有需要的哺乳动物中控制胆固醇含量，所以本发明所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物对营养学家和消费者用于预防和/或治疗心血管风险可以是特别有意义的。因此，在另一方面，本公开提供用于改善受试者的健康的方法，所述方法包括以有效量将包含本发明所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物施用于受试者以对所述受试者的健康施加有益效果，诸如用于治疗胆固醇相关的疾病。此外，通常已知SCFA降低肠道中的pH，并且这有助于钙吸收。因此，根据本公开的化合物还可影响矿物质吸收。这是指通过由于肠道中SCFA增加而降低pH，它们还可改善骨骼健康，或预防或治疗骨质疏松症。SCFA的产生可增加小肠中的粘度，这减少了胆汁酸的再吸收；增加由胆固醇合成胆汁酸并减少了低密度脂蛋白(LDL)胆固醇循环。
如本文所定义的，化合物或组合物的“有效量”是指在各种剂量下并对于必要的时间段而言，有效实现期望的有益生理效应，诸如降低血液胆固醇、增加短链脂肪酸产生或者预防或治疗胃肠道疾病的量。例如，施用于受试者的组合物的量将根据各种因素而变化，诸如受试者的病症、受试者的体重、受试者的年龄、以及组合物是否是唯一营养来源。有效量可由执业医师或营养师容易地设定。一般来讲，施用足量的组合物以向受试者提供高达约50g的膳食纤维(不溶性和可溶性)/天；例如约25g至约35g的膳食纤维/天。受试者接收的本发明所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的量优选在约0.1g/天至约50g/天的范围内，更优选地以0.5g/天至20g/天，最优选地1g/天至10g/天的量。如本文所定义的化合物或组合物可以多剂量摄取，例如1至5次，分散于一天中或急性地，或可以单剂量摄取。如本文所定义的化合物或组合物还可在期望的时间段内连续喂食。在某些实施方案中，期望的时间段为至少一周或至少两周或至少三周或至少一个月或至少六个月。
在优选的实施方案中，本公开提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来降低对其有需要的受试者中血液甘油三酯水平的方法。在另一优选的实施方案中，本发明提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来降低对其有需要的受试者中的低密度脂蛋白水平的方法。在另一优选的实施方案中，本公开提供通过将如本文定义的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来增加对其有需要的受试者中高密度脂蛋白水平的方法。
餐后血糖浓度/血糖应答的减弱
在本发明所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物中存在不是α-(1,4)主链键的键，提供改善的耐消化性，因为人类消化道中的酶可难以水解此类键和/或支化键。支链的存在向葡聚糖纤维提供部分或完全的不消化性，并且因此实质上没有葡聚糖吸收到体内或葡聚糖更慢地吸收到体内，这导致较低的血糖应答。因此，本公开提供用于制造导致较低血糖应答的食品和饮料组合物的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。例如，这些化合物可用于替代糖或其它可快速消化的碳水化合物，从而降低食品的血糖负荷、减少卡路里、和/或减低食品的能量密度。因此，具有这些类型的键的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的稳定性使得它们容易地通过而进入大肠中，其中它们可用作对结肠微生物菌群具有特异性的底物。
改善肠道健康
在另一个实施方案中，如本文所公开的化合物可用于治疗和/或改善肠道健康。可溶性α-葡聚糖纤维组合物优选在肠道中通过肠道微生物群缓慢发酵。优选地，本发明化合物表现出在体外肠道模型中不差于菊粉或其它可商购获得的纤维诸如(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、或(耐消化麦芽糖糊精，Archer Daniels Midland Company&MatsutaniChemical)的耐受性，(即相似的气体产生水平)，优选地优于一种或多种可商购获得的纤维的改善的耐受性，即本发明葡聚糖纤维的发酵导致在3小时或24小时内比菊粉少的气体产生，从而减少由于气体形成导致的不适，诸如肠胃气胀和胃气胀。在一个方面，本公开还涉及用于通过将如本文所公开的化合物或组合物施用于对其有需要的受试者来缓解受试者胃肠道中气体形成的方法，以便减少由于肠胃气胀和胃气胀导致的肠道疼痛或肠道不适。在另一个实施方案中，如本文所公开的组合物向受试者提供对食品发酵的改善的耐受性，并且可与纤维，诸如菊粉或FOS、GOS、或乳果糖组合以通过减少气体产生来改善耐受性。
在另一个实施方案中，可施用本文所公开的化合物以通过增加粪便体积来改善排便或改善排便规律。
益生元和益生菌
一种或多种可溶性α-葡聚糖纤维组合物可用作益生元，或当益生菌组合使用时用作“合生素”，如下所述。所谓“益生元”，是指通过选择性地刺激胃肠道，特别是结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性，从而改善宿主的健康来有益地影响受试者的食品成分。益生元的示例包括低聚果糖、菊粉、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纤维、低聚葡萄糖和低聚半乳糖、阿拉伯木寡糖、乳糖醇和乳果糖。
在另一个实施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的组合物还包含至少一种益生菌生物。所谓“益生菌生物”是指通过它们在消化道中的功能向受试者提供有益效果的活微生物膳食补充剂。为了有效，益生菌微生物必须能够在消化条件下存活，并且它们必须能够至少暂时移植于胃肠道而对受试者没有任何伤害。仅微生物的某些菌株具有这些特性。优选地，益生菌微生物选自：乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和酵母属(Saccharomyces spp.)。特定微生物包括但不限于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、双歧杆菌(Bifidobacterium bificum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、屎链球菌(Streptococcusfaecium)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、球拟酵母(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和链霉菌(Streptomyces)等，包括它们的营养孢子、非营养孢子(芽孢杆菌)和合成衍生物。更优选的益生菌微生物包括但不限于三种细菌属的成员：乳杆菌属、双歧杆菌属和酵母属。在优选的实施方案中，益生菌微生物是乳杆菌属、双歧杆菌属、以及它们的组合。
可将益生菌微生物作为在益生菌保持存活的水或其它液体或半固体培养基中的培养物掺入组合物中。在另一种技术中，可通过混合或共混将包含益生菌生物的冻干粉末掺入特定材料或液体或半固体材料中。
在优选的实施方案中，组合物包含益生菌生物，其含量足以递送至少10亿至2000亿活益生菌生物，优选地10亿至1000亿，并且最优选地10亿至500亿活益生菌生物。如上所述益生菌生物递送量可按剂量和/或按天计，其中多剂量/天可适用于一些应用。可将两种或更多种益生菌生物用于一种组合物中。
获得酶促制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法
可将任何数量的常用纯化技术用于从反应体系中获得可溶性α-葡聚糖纤维组合物，纯化技术包括但不限于离心、过滤、分馏、色谱分离、渗析、蒸发、沉淀、稀释或它们的任意组合，优选地通过渗析或色谱分离，最优选地通过渗析(超滤)。
重组微生物表达
本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是可存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。一种或多种酶可在细胞内、细胞外或者细胞内和细胞外的组合表达，其中相比于用于回收通过细胞内表达产生的蛋白的方法，细胞外表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的示例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种诸如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，真菌宿主细胞是木霉属，优选地里氏木霉菌株。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，诸如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能量源)来影响生长速率的调节。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因的转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管此类控制区无需来源于此。
可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实质上能够驱动这些基因的任何启动子均适用于本发明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达)、以及amy、apr、npr启动子和可用于在芽孢杆菌属中表达的各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产
多种培养方法可用来制备一种或多种酶。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且示例可见于Wulf Crueger和AnnelieseCrueger(作者)的Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(Sinauer Associates,Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和JulianE.Davis(编辑)，(ASM出版社，Washington，DC(2010))。
所需酶的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞保持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。另选地，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，且连续从细胞群中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支撑体进行，所述固体支撑体由天然材料和/或合成材料组成。
从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内产生酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆悬浮液匀化，以产生出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂诸如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞碎片，然后进行热处理步骤，以将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞碎片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过另外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。另选地，可通过加入多元醇诸如麦芽糖糊精、山梨醇或丙二醇，任选向其中加入防腐剂诸如山梨酸、山梨酸钠或苯甲酸钠，将所得的部分纯化的酶催化剂溶液稳定为液体制剂。
可溶性α-葡聚糖纤维的制备可以通过在任何合适的含水反应条件下将所得的一种或多种酶合并来进行，所述反应条件导致可溶性α-葡聚糖纤维的产生，诸如本文所公开的条件。反应可在水溶液中进行，或者在某些实施方案中，反应可在食物产品内原位进行。使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法是本领域所熟知的。在某些实施方案中，将酶催化剂加入包含蔗糖的液体食物产品中。酶催化剂可减少液体食物产品中蔗糖的量，同时增加可溶性α-葡聚糖纤维和果糖的量。适用于使用多肽材料(即酶催化剂)在食物产品内原位产生纤维的方法可见于WO2013/182686，其内容以引用方式并入本文，用于对使用酶催化剂在食物产品中原位产生纤维的方法的公开。
当含量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值中的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点以及在该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。
特定实施方案的描述
在第一实施方案中(“第一实施方案”)，提供一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含：
a.至少75％α-(1,3)糖苷键，优选地至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，并且最优选地至少95％的α-(1,3)糖苷键；
b.小于25％α-(1,6)糖苷键；优选地小于10％，更优选地5％或更小，并且甚至更优选地小于1％的α-(1,6)糖苷键；
c.小于10％α-(1,3,6)糖苷键，优选地小于5％，并且更优选地小于2.5％α-(1,3,6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿，优选地小于2500道尔顿，更优选地介于500道尔顿和2500道尔顿之间，并且最优选地约500道尔顿至约2000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下和水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)、优选地小于0.01帕斯卡秒(Pa·s)、优选地小于7cP(0.007Pa·s)、更优选地小于5cP(0.005Pa·s)、更优选地小于4cP(0.004Pa·s)、并且最优选地小于3cP(0.003Pa·s)的粘度；
f.在4至40、优选地10至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％，优选地小于11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)方法2009.01所测量；
h.在25℃下在水中，至少20％(w/w)，优选地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数。
在第二实施方案中，提供一种碳水化合物组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)，优选地10重量％至90重量％的上述可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
在第三实施方案中，提供食物产品、个人护理产品或药学产品，其包含根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或含有根据第二实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的碳水化合物组合物。
在另一个实施方案中，提供低生龋性组合物，其包含根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物和至少一种多元醇。
在另一个实施方案中，提供了一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
a)蔗糖；
b)至少一种葡糖基转移酶，其能够催化具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、并且最优选地至少95％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
c)至少一种α-葡聚糖水解酶，其能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
d)任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的产品分离；以及
d.任选地，将步骤(c)的分离的可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，通过上述方法制备的可溶性α-葡聚糖纤维组合物包括：
a.20℃下，在水中12重量％下，小于0.01帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
b.小于10％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量；
c.在25℃下，在水中至少20％(w/w)的溶解度；以及
d.小于5的多分散指数。
在另一个实施方案中，提供了一种制备根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
a)蔗糖；
b)至少一种葡糖基转移酶，其能够催化具有至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、并且最优选地至少95％的α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
c)至少一种α-葡聚糖水解酶，其能够水解具有一个或多个α-(1,3)糖苷键或者一个或多个α-(1,6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
d)任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与一种或多种下列物质合并：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中，提供制备食物产品、个人护理产品或药学产品的方法，所述方法包括，将一种或多种可食用食品成分、美容上可接受的成分或药学上可接受的成分分别与根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物、根据第二实施方案所述的碳水化合物组合物、或它们的组合混合。
在另一个实施方案中，提供一种减小食品或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食品或饮料中。
在另一个实施方案中，提供一种抑制血糖水平升高、降低活体中脂质、治疗便秘、或减少通过肠胃时间的方法，所述方法包括将根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，还提供根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适用于由人类和动物食用的食品组合物中的用途。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于10重量％，优选地小于5重量％，并且最优选地小于1重量％或更小的还原糖含量。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中可溶性α-葡聚糖纤维组合物包含小于5％，或小于3％，优选地小于1％，并且最优选地小于0.5％的α-(1,4)糖苷键。
本发明还根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中碳水化合物组合物还包含下列中的至少一种：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中所述碳水化合物组合物呈液体、糖浆、粉末、颗粒、成形球、成形棒，成形板、成形立方体、片剂、粉末、胶囊、香囊或它们的任意组合的形式。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中所述食物产品为：
a.烘焙产品，其选自：蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松饼、面包和甜面团、挤出谷物片和涂层谷物片(coated cereal pieces)；
b.乳制品，其选自：酸乳、酸乳饮料、乳饮料、调味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脱脂乳酸干酪、脱脂乳酸干酪调味品、脱脂凝乳和打发的慕斯型产品；
c.糖果，其选自：硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖、焦糖、果冻、巧克力、甘草、口香糖、焦糖、太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片状糖果和水果小吃；
d.饮料，其选自：碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物、清水、以及饮料干混合物；
e.干棒小吃、烤酥饼、甜甜圈或曲奇的高固体填充物；
f.挤出和成片的小吃，其选自：膨化小吃、梳打饼、未经发酵的玉米片和玉米薄片；
g.干棒小吃、营养棒、granola棒、蛋白质棒、和谷物棒；
h.奶酪、奶酪酱和其它可食用的奶酪制品；
i.可食用膜；
j.水溶性汤、糖浆、酱汁、调味品、或咖啡奶精；或者
k.膳食补充剂；优选地呈片剂、粉末、胶囊或香囊的形式。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的组合物或方法，其中α-葡聚糖水解酶为内切突变酶并且葡糖基转移酶为变聚糖蔗糖酶。
本发明还提供组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的本发明所公开的可溶性α-葡聚糖纤维组合物以及以下成分中的至少一种：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的方法，其中分离步骤包括离心、过滤、分馏、色谱分离、渗析、蒸发、稀释、或它们的任意组合中的至少一种。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的方法，其中在将反应组分的系列合并时，单一反应混合物中的蔗糖浓度初始为至少200g/L。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的方法，其中葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(v/v)的范围是从0.01:1至1:0.01。在另一个实施方案中，葡糖基转移酶与α-葡聚糖水解酶的比率(单元/单元)的范围是从0.01:1至1:0.01。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的方法，其中合适的反应条件包括介于0℃和55℃之间的反应温度。
本发明还提供根据实施方案中任一项所述的方法，其中合适的反应条件包括4至8的pH范围。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中在合适的含水反应条件下合并反应组分的系列包括将反应组分在水中合并。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中在合适的含水反应条件下合并反应组分的系列包括将反应组分在食物产品中合并。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中合适的反应条件包括缓冲液，其选自磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐和柠檬酸盐。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：3、5、17、19、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112或它们的组合。在其它实施方案中，至少一种葡糖基转移酶为GTF-S、它们的截短形式、它们的同系物、或它们的同系物的截短形式。在另一个实施方案中，所述葡糖基转移酶为GTF-S的截短形式并且包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列。在其它实施方案中，葡糖基转移酶为GTF-S的同系物的截短形式并且包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：118、120、122、124、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、146、148、150、152或它们的组合。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种α-葡糖基转移酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：21、22、24、27、54、56、58或它们的组合。
本发明还提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶和所述至少一种α-葡聚糖水解酶包含氨基酸序列以及它们的截短形式，所述氨基酸序列与选自以下序列的组合的序列具有至少90％的同一性：
1)葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO:3、5或它们的组合)和突变酶MUT3325(SEQID NO：27)
2)葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO:3、5或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQID NO：21、22、24或它们的任意组合)。
3)葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO:17、19或它们的组合)或GTF0459的同系物(SEQ ID NO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110和112)和突变酶MUT3325(SEQID NO:27)；以及
4)葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO:17、19或它们的组合)或GTF0459的同系物(SEQ ID NO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110和112)和突变酶MUT3264(SEQID NO:21、22、24或它们的任意组合)。
在另一个实施方案中，提供了一种制备根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii.至少一种葡糖基转移酶，其能够催化具有一个或多个α-(1,3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将(a)的反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，其中所述反应条件包括大于45℃并且小于55℃，优选地47℃至53℃的反应温度，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
在另一个实施方案中，提供根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述葡糖基转移酶得自唾液链球菌，优选地具有选自SEQ ID NO：3、5以及它们的组合的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，提供通过上述方法实施方案中任一项制备的产品；优选地，其中所述制备的产品为根据第一实施方案所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
实施例
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D编辑，John Wiley和Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial,N.Y.(1991)为本领域技术人员提供了用于本发明的许多术语的通用字典。
本发明在以下实施例中进一步限定。应当理解，当示出本发明的优选实施方案时，这些实施例仅以举例说明的方式给出，并且不应当被认为限制了权利要求的范围。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写的含义如下：“sec”或“s”表示秒，“ms”表示毫秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mL/min”是毫升每分钟，“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是Luria肉汤；“μm”是微米，“nm”是纳米；“OD”是光学密度；“IPTG”是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是重力；“mM”是毫摩尔；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是标称；“w/v”是重量/体积；“DTT”是二硫苏糖醇；“BCA”是二喹啉甲酸；“DMAc”是N,N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化锂，“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亚砜；“SEC”是尺寸排阻色谱；“GI”或“gi”表示GenInfo标识符，由和其它序列数据库使用的系统，用于以唯一地识别相应数据库内的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指在长度内具有“x”个单元的葡聚糖聚合度；“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“DSMZ”和“DSM”将是指莱布尼茨研究所-德国微生物菌种保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures，Braunschweig，Germany)；“EELA”是芬兰食品安全局(Helsinki，Finland)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大学文化收藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；并且“Rxn”是指反应。
一般方法
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域中是所熟知的，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY(2001)；以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Cold Press Spring Harbor,NY(1984)；以及Ausubel,F.M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols and John Wiley andSons，Inc.，N.Y.，2002。
适于细菌培养物维持及生长的材料和方法在本领域中也是已知的。适用于如下实施例的技术可见于如下文献列出的内容中：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society forMicrobiology出版社，Washington，DC.(1994))，Wulf Crueger和Anneliese Crueger(作者)，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(SinauerAssociates,Inc.，Sunderland，MA(1990))和Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第三版，Richard H.Baltz、Arnold L.Demain和Julian E.Davis(编辑)，(American Society of Microbiology出版社，Washington，DC(2010))。
除非另外说明，所有用于使细菌细胞生长并维持的试剂、限制性酶和材料均得自BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)，Invitrogen/Life Technologies Corp.(Carlsbad，CA)，Life Technologies(Rockville，MD)，QIAGEN(Valencia，CA)，Sigma-AldrichChemical Company(St.Louis，MO)或Pierce Chemical Co.(Thermo Fisher ScientificInc.的分公司(Rockford，IL)。IPTG(目录号I6758)和三苯基四唑氯化物得自Sigma Co.(St.Louis，MO)。BELLCO旋转烧瓶得自Bellco Co.(Vineland,NJ)。LB培养基得自Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,New Jersey)。BCA蛋白质测定得自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。
用于生产GTF酶的重组大肠杆菌菌株的生长
在37℃和220rpm下，使用具有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基，使表达功能性GTF酶的大肠杆菌菌株在摇瓶中生长至OD600nm＝0.4-0.5，此时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.5mM，并且在37℃下继续温育2-4小时。通过在5,000xg下离心15分钟收获细胞并且重新悬浮于pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液中(20％-25％湿细胞重量/体积)。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLM Instruments,Rochester,NY)以确保>95％的细胞裂解。细胞裂解物在12,000xg和4℃下离心30分钟。通过BCA蛋白质测定和SDS-PAGE分析所得的上清液(细胞提取物)以确认GTF酶的表达，并将细胞提取物在-80℃下储存。
pHYT载体
pHYT载体主链是包含枯草芽孢杆菌aprE启动子的复制性枯草芽孢杆菌表达质粒。其衍生自大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY320PLK(登录号D00946，并且可从Takara Bio Inc.(Otsu，Japan)商购获得)。大肠杆菌和氨苄青霉素抗性基因的复制起点是从pACYC177(X06402，并且可从New England Biolabs Inc.(Ipswich，MA)商购获得)枯草芽孢杆菌和四环素抗性基因的复制起点是从pAMalpha-1(Francia等人，JBacteriol.2002年9月；184(18):5187-93)。
为构建pHYT，在四环素抗性基因之后插入来自噬菌体λ的终止子序列：5’-ATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO：1)。使用破坏HindIII位点的BamHI-HindIII接头，将包含aprE启动子–编码感兴趣的酶的编码序列(例如，编码各种GTF的序列)的AprE信号肽序列-BPN’终止子的整个表达盒(EcoRI-BamHI片段)克隆到pHYT的EcoRI和HindIII位点中。接头序列为5’-GGATCCTGACTGCCTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：2)。aprE启动子和AprE信号肽序列(SEQ ID NO：25)对于枯草芽孢杆菌是天然的。BPN'终止子来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的枯草杆菌蛋白酶。在使用天然信号肽的情况下，用经表达的基因的天然信号肽替代AprE信号肽。
里氏木霉的基因枪转化
将里氏木霉孢子悬浮液涂布到直径为的乙酰胺酶转化平板(150μL的5×107-5×108个孢子/mL悬浮液)的中心上。然后将板在生物罩中风干。将停止屏(BioRad 165-2336)和大载体支架(BioRad 1652322)浸泡在70％乙醇中并风干。将干燥剂(硫酸钙干燥剂；W.A.HammondCompany(Xenia，OH))置于小皮氏培养皿(6cmPyrex)中并用Whatman滤纸(GE Healthcare Bio-Sciences(Pittsburgh，PA))覆盖。将包含大载体(BioRad 165-2335；Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA))的大载体支架平放在滤纸的顶部上并替代皮氏培养皿盖。通过将60mg钨M-10颗粒(微载体，0.7微米，BioRad#1652266，Bio-Rad Laboratories)加入到Eppendorf管中来制备钨颗粒悬浮液。加入乙醇(1mL)(100％)。将钨在乙醇溶液中涡旋并使其浸泡15分钟。将Eppendorf管以最大速度短暂地微离心以使钨成粒状。滗出乙醇并利用无菌蒸馏水洗涤三次。在第三次滗出洗涤水之后，将钨重新悬浮于1mL的无菌50％甘油中。通过向1.5mL-Eppendorf管中加入25μL悬浮的钨来制备转化反应用于每个转化。后续添加按如下顺序进行：2μL DNA pTrex3表达载体(参见美国专利6,426,410)、25μL 2.5M CaCl2、10μL 0.1M亚精胺。将反应连续涡旋5-10分钟，从而保持钨悬浮。然后将Eppendorf管短暂微离心并且滗出。将钨丸粒利用200μL的70％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗出。所述丸粒用200μL的100％乙醇洗涤，短暂微离心成粒状并滗出。将钨丸粒重新悬浮于24μL100％乙醇中。将Eppendorf管置于超声水浴中并持续15秒，并将8μL等分试样转移到经干燥的大载体的中心上。将大载体保留在经干燥的皮氏培养皿中干燥。
将氦气罐打开至1500psi(～10.3MPa)。将1100psi(～7.58MPa)破裂盘(BioRad165-2329)用于型号PDS-1000/HeTM 颗粒递送体系(BioRad)中。当将钨溶液干燥时，将停止屏和大载体支架插入PDS-1000中。将包含目标里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板放置在停止屏下6cm处。对室抽29英寸Hg(～98.2kPa)的真空并保持。将He颗粒递送体系焙烧。将所述室放气，取出乙酰胺酶平板以在28℃下温育，直至出现菌落(5天)。
改性的amdS Biolistic琼脂(MABA)/升
第I部分，在500mL蒸馏水(dH2O)中制备
1000x盐1mL
Noble琼脂20g
pH至6.0，高压釜
第II部分，在500mL dH2O中制备
乙酰胺 0.6g
CsCl 1.68g
葡萄糖 20g
KH2PO4 15g
MgSO4·7H2O 0.6g
CaCl2·2H2O 0.6g
pH至4.5，0.2微米过滤灭菌；置于50℃烘箱中加热，加入琼脂，混合，倾注平板。在室温下储存(～21℃)
1000x盐/升
FeSO4·7H2O 5g
MnSO4·H2O 1.6g
ZnSO4·7H2O 1.4g
CoCl2·6H2O 1g
达到1L dH2O。
0.2微米过滤灭菌
测定葡糖基转移酶活性
葡糖基转移酶活性测定通过以下过程进行：在存在或不存在25g/L右旋糖酐(MW～1500，Sigma-Aldrich，目录号31394)的情况下，在37℃和125rpm轨道振荡下，用含200g/L蔗糖的25mM或50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5下)温育包含GTF酶的1-10％(v/v)粗蛋白提取物。在1h、2h和3h时取出一份反应混合物的等分试样并在90℃加热5min以使GTF失活。通过在13,000xg下离心5分钟来去除不溶性材料，之后使其过滤通过0.2μm RC(再生纤维素)膜。在85℃下采用两个串联Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)通过HPLC分析所得的滤液来定量蔗糖浓度。相对于反应时间绘出各个时间点的蔗糖浓度并由线性曲线的斜率确定初始反应速率。一个GTF活性单位定义为在测定条件下每分钟消耗一微摩尔的蔗糖所需的酶量。
测定α-葡聚糖水解酶活性
使用由远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)33478TM产生的分泌的酶来制备用于测定突变酶活性所需的不溶性变聚糖聚合物。具体地，将远缘链球菌33478TM的甘油原液的一个环在BHI琼脂板(Brain Heart Infusion agar，Teknova(Hollister，CA)上划线，并且将板在37℃下温育2天；使用环挑取几个菌落以接种来自Teknova的原始培养基瓶中的2X 100mL BHI液体培养基，并且将培养物在37℃下温育，静置24h。通过离心去除所得的细胞并且通过0.2μm无菌过滤器将所得的上清液过滤；收集2X101mL的滤液。向滤液中添加2X 11.2mL的200g/L蔗糖(最终蔗糖20g/L)。在未搅拌情况下，使反应于37℃温育67h。通过在5000xg下离心10min来收集所得的多糖聚合物。小心地滗出上清液。用40mL的无菌水将不溶性聚合物洗涤4次。使所得的变聚糖聚合物冻干48h。使变聚糖聚合物(390mg)悬浮于39mL的无菌水中以制备10mg/mL悬浮液。通过超声处理(40％幅值直至较大团块消失，总计～10min)均化变聚糖悬浮液。将匀化的悬浮液分成等份并在4℃下储存。
通过在pH 5.5和37℃下用含有0.5mg/mL变聚糖聚合物(如上所述制备的)的25mMKOAc缓冲液温育合适量的酶，开始突变酶测定。在各个时间点，取出等分试样的反应混合物并用等体积的100mM甘氨酸缓冲液(pH 10)淬灭。通过在14,000xg下离心5min去除各个经淬灭样品中的不溶性材料。通过对羟基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(Lever M.,Anal.Biochem.,(1972)47:273-279)测定对各个时间点产生的低聚糖和多糖聚合物的还原端进行定量，并且初始速率由时间过程中最初三个或四个时间点的线性曲线图的斜率来确定。通过将10μL的反应样品上清液添加至100μL的PAHBAH工作溶液中进行PAHBAH测定并在95℃加热5min。通过混合一份试剂A(0.05g/mL对羟基苯甲酸酰肼和5体积％的浓盐酸)与四份试剂B(0.05g/mL NaOH、0.2g/mL酒石酸钾钠)来制备工作溶液。记录410nm处的吸光度，并且通过减去适当的背景吸收并使用各种浓度的葡萄糖(作为标准物)产生的标准曲线来计算还原端的浓度。突变酶活性的单位定义为在pH 5.5和37℃下，1微摩尔/min的变聚糖聚合物的转化率，如上所述，通过测量还原端的增加来测定。
测定糖苷键
在使用高灵敏度冷冻探针以500MHz操作的Varian Unity Inova系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)上采集一维1H NMR数据。通过将观测发射器频率小心地置于“普氏(presat)”实验的残余水信号的共振处，并然后使用具有完整相位循环(32多次)和10ms的混合时间的“tnnoesy”实验获得水抑制。
通常，将干燥的样品溶解在1.0mL的D2O中并超声波处理30分钟。从样品的可溶部分中，将100μL连同350μL D2O和包含15.3mM DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸钠盐)作为内标和0.29％NaN3作为杀菌剂的100μLD2O一起添加至5mm NMR管中。通过将相应的化学位移处的峰面积积分来测量每种类型的异头键的丰度。每种类型的异头键的百分比由特定键的丰度和来自低聚糖的异头键总丰度计算。
甲基化分析
葡聚糖中糖苷键的分布通过通常称为“甲基化分析”或“部分甲基化分析”的熟知技术来测定(参见：F.A.Pettolino等人，Nature Protocols，(2012)7(9)：1590-1607)。所述技术具有多个细微变化但常常包括：1.将葡萄糖单元的所有游离羟基基团甲基化，2.将甲基化的葡聚糖水解成独立的单体单元；3.还原开环以消除异头物并形成甲基化的葡萄糖醇；异头碳通常用氘原子标记以形成不同的质谱；4.游离羟基基团乙酰化(通过水解和开环形成)以产生部分甲基化的乙酸葡萄糖醇酯，也被称为部分甲基化产物，5.通过与质谱法和/或火焰离子化检测偶联的气相色谱分析所得的部分甲基化产物。
部分甲基化产物包括非还原性末端葡萄糖单元、连接单元和支化点。单独的产物通过保留时间和质谱来识别。部分甲基化产物的分布是每种产物占所有部分甲基化产物的总峰面积的百分比(面积％)。气相色谱条件如下：RTx-225柱(30m×250μm ID×0.1μm膜厚度，Restek Corporation(Bellefonte,PA,USA)，氦载气(0.9mL/min恒定流量)，烘箱温度程序在80℃下起始(保持2分钟)，然后30℃/min至170℃(保持0分钟)，然后4℃/min至240℃(保持25分钟)，1μL进样体积(分成5:1)，使用电子轰击质谱(全扫描模式)检测。
粘度测量
使用配备有锥体和板状几何形状的TA Instruments AR-G2受控应力旋转流变仪(TA Instruments–Waters，LLC(New Castle，DE)测量可溶性纤维的12重量％水性溶液的粘度。该几何形状由两者均具有光滑表面的40mm2°的上锥体和peltier下板组成。在测试期间，配备有经水饱和海绵的环境室用于使溶剂(水)蒸发最小化。在20℃下测量粘度。将peltier设置为期望的温度，并使用Eppendorf移液管(Eppendorf North America，Hauppauge，NY)将0.65mL的样品加载到板上。将锥体降低至锥体底部和板之间50μm的间隙。将样品热平衡3分钟。在500-10s-1的剪切速率范围内进行剪切速率扫描。通过在测试结束时运行重复剪切速率点来确认样品稳定性。
测定蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的浓度
通过利用两个串联的Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)的HPLC定量蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖。所用的色谱条件为在柱和检测器隔室处85℃，在样品和注射器隔室处40℃，流量为0.6mL/min，并且进样体积为10μL。用于数据还原的软件包是来自Waters(Waters Corp.，Milford，MA)的EMPOWERTM版本3。用各种浓度的标准品对每种单独的糖进行校准。
测定低聚糖的浓度
可溶性低聚糖通过利用两个串联Aminex HPX-42A柱(Bio-Rad)的HPLC来定量。所用的色谱条件为85℃柱温和40℃检测器温度，水作为移动相(流量为0.6mL/min)，并且进样体积为10μL。用于数据还原的软件包为来自Waters Corp.的EMPOWERTM版本3。DP2至DP7的低聚糖样品得自Sigma-Aldrich：麦芽七糖(DP7，目录号47872)、麦芽六糖(DP6，目录号47873)、麦芽五糖(DP5，目录号47876)、麦芽四糖(DP4，目录号47877)、麦芽三糖(DP3，目录号47884)和麦芽糖(DP2，目录号47288)。利用各种浓度的标准品对每种单独的低聚糖进行校准。
测定可消化性
可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL，而不是由初始规程建议的40mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。详细过程描述如下：
通过将来自综合总膳食纤维测定盒的20mg纯化的猪胰腺α-淀粉酶(150,000单位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的马来酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0加2mM CaCl2)中并搅动5分钟，随后添加来自相同试剂盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300单位/mL)来制备酶原液。然后在玻璃小瓶中将0.5mL酶原液与0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，将消化反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h。对于每种纤维样品平行进行重复反应。通过将0.5mL马来酸盐缓冲液(50m，pH6.0加上2mM CaCl2)和0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，并且反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h，一式两份进行对照反应。在16h之后，从培养箱中移除所有样品并且立即加入75μL的0.75M碱性溶液以终止反应。将小瓶立即置于95℃-100℃的加热块中，并且温育20分钟，偶尔振荡(用手)。淬灭之后，每种反应混合物的总体积为1.075mL。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每种反应中释放的葡萄糖量。将麦芽糖糊精(DE4-7，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)用作酶的阳性对照。为计算可消化性，使用下式：
可消化性＝100％*[用酶处理后释放的葡萄糖量(mg)-酶不存在时释放的葡萄糖量(mg)]/1.1*总纤维量(mg)”
可溶性低聚糖纤维的纯化
通过尺寸排阻柱层析(SEC)纯化和分离存在于产物混合物中的可溶性低聚糖纤维，所述产物混合物通过在具有或不具有添加的突变酶的情况下使用葡糖基转移酶转化蔗糖制备，如以下实施例中所述。在典型的过程中，将产物混合物在60℃至90℃下热处理15分钟至30分钟，并且然后在4000rpm下离心10分钟。将所得的上清液注入纯化系统(SEC；GE Healthcare Life Sciences)(10mL–50mL注入体积)中，所述纯化系统连接至装填有1.1L的Bio-Gel P2凝胶(Bio-Rad，细，45-90μm)的GE HK 50/60柱，其使用水作为洗脱剂以0.7mL/min洗脱。使用Bio-Rad HPX-47A柱，通过HPLC分析低聚糖的SEC级分(～5mL/管)。将包含>DP2低聚糖的级分合并，并通过旋转蒸发合并的级分来分离可溶性纤维，以产生包含3％至6％(w/w)固体的溶液，其中将所得的溶液冻干以产生可溶性纤维作为固体产物。
纯培养物在特定碳源上的生长
为测试微生物在特定碳源(低聚糖或多糖可溶性纤维)上生长的能力，选择的微生物在不含除了研究下的碳源之外的碳源的适当培养基中生长。通过在无氧环境(80％N2、10％CO2、10％H2)中在600nm下定期(每30分钟)测量光学密度来评估生长。生长表示为曲线下面积并且与阳性对照(葡萄糖)和阴性对照(不添加碳源)比较。
低聚糖可溶性纤维的原液(10％(w/w))在脱矿质水中制备。所述溶液通过UV辐射或过滤(0.2μm)来灭菌。将原液冷冻储存直至使用。适当的不含碳源培养基由单一成分制备。测试生物体在具有标准碳源的测试培养基中厌氧预生长。将20μL原液移入蜂窝孔中，并加入180μL不含碳源的培养基与1％测试微生物。作为阳性对照，将葡萄糖用作碳源，并且作为阴性对照，不使用碳源。为确认原液的无菌性，使用未接种的孔。每次运行使用至少三个平行孔。
将蜂窝板置于Bioscreen中，通过测量600nm下的吸光度来测定生长。每30分钟进行测量，并且在测量之前，将板振荡以确保微生物的均匀悬浮。允许生长24小时。结果计算为曲线下面积(即，OD600/24h)。测试的生物体(以及它们的相应生长培养基)为：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)3626TM(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自Oxoid Microbiology Products，ThermoScientific)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)DSM 1296(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and ZellkulturenDSMZ，Braunschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厌氧强化梭菌培养基(得自OxoidMicrobiology Products，Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham，MA))、大肠杆菌(Escherichia coli)11775TM(不具有葡萄糖的厌氧胰酶解酪蛋白大豆肉汤)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)EELA(购自DSMZ(Brauchschweig，Germany))(不具有葡萄糖的厌氧胰酶解酪蛋白大豆肉汤)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM145(不具有葡萄糖的厌氧de Man、Rogosa和Sharpe培养基(得自DSMZ))、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)Bi-07(厌氧的Deutsche Sammlung vomMikroorgnismen und Zellkulturen培养基58(得自DSMZ)，不具有葡萄糖)。
体外气体产生
为了测量由肠道微生物群形成气体，将预调理的粪便浆液与测试益生元(低聚糖或多糖可溶性纤维)一起温育，并测量形成的气体体积。新鲜粪便材料通过用3份(重量/体积)厌氧模拟培养基稀释，在厌氧条件下搅动1小时并通过0.3-mm金属网过滤，此后将其在37℃厌氧温育24小时来预调理。
所用的模拟培养基如G.T.Macfarlane等人所述组成(Microb.Ecol.35(2):180-7(1998))，其包含在蒸馏水中的以下成分(g/L)：淀粉(BDH Ltd.)，5.0；蛋白胨，0.05；胰蛋白胨，5.0；酵母提取物，5.0；NaCl，4.5；KCl，4.5；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；酪蛋白(BDHLtd.)，3.0；果胶(柑橘)，2.0；木聚糖(oatspelt)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(落叶松木)，2.0；NaHCO3，1.5；MgSO4，1.25；瓜耳胶，1.0；菊粉，1.0；半胱氨酸，0.8；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；胆汁盐3号，0.4；CaCl2×6H2O，0.15；FeSO4×7H2O，0.005；血红素，0.05；和Tween 80，1.0；半胱氨酸盐酸盐，6.3；Na2S×9H2O和作为持续厌氧条件的指示的0.1％刃天青。将模拟培养基通过0.3mm金属网过滤，并分入密封的血清瓶中。
将测试益生元从10％(w/w)原液添加至最终浓度为1％。在37℃下进行温育，同时维持厌氧条件。在使用带刻度的气密玻璃注射器，在24小时温育后手动测量由于微生物活性导致的气体产生，从而也从模拟单元释放过压。
实施例1
葡糖基转移酶(GTF-J)表达菌株大肠杆菌MG1655/pMP52的构建
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0，Menlo Park，CA)合成编码来自唾液链球菌(25975TM)的成熟葡糖基转移酶的多核苷酸序列(gtf-J；EC2.4.1.5；SEQ ID NO:3)，如(登录号M64111.1；gi:47527)中所记录的。将编码成熟酶(即，去除信号肽并加入起始密码子；SEQ ID NO：5)的核酸产品(SEQ ID NO：4)亚克隆到(DNA 2.0，Menlo Park CA)中以生成识别为pMP52的质粒。质粒pMP52用于转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)以生成识别为MG1655/pMP52的菌株。用于构建葡糖基转移酶表达菌株的所有方法是本领域熟知的，并且可由相关领域的技术人员实施，无需过度实验。
实施例2
在发酵中制备重组的GTF-J
在发酵罐中产生重组成熟葡糖基转移酶Gtf-J起始于制备表达成熟Gtf-J酶(GI:47527；“GTF7527”；SEQ ID NO：5)的大肠杆菌菌株MG1655/pMP52的前种子培养物，如实施例1中所述进行构建。将种子培养基的10mL等分试样加入125mL一次性带挡板烧瓶中并用1.0mL在20％甘油中的大肠杆菌MG1655/pMP52培养物接种。使该培养物在37℃、300rpm振荡条件下生长3小时。
发酵罐中起始的种子培养物通过将0.5L种子培养基装入到2-L振荡烧瓶中进行制备。将1.0mL的前种子培养物无菌转移到烧瓶中的0.5L种子培养基中，并在37℃和300rpm下培养5小时。在37℃下，以光密度>2(OD550)将种子培养物转移到包含8L的上述发酵罐培养基的14-L发酵罐(Braun，Perth Amboy，NJ)中。
使大肠杆菌MG1655/pMP52的细胞在发酵罐中生长并当培养基中的葡萄糖浓度降至0.5g/L时开始葡萄糖进料(包含1％w/w MgSO4·7H2O的50％w/w葡萄糖溶液)。以0.36克进料每分钟(g进料/min)开始进料并且每小时分别渐进式增大至0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、1.63、1.92、2.2g进料/min。之后速率保持恒定。使用YSI葡萄糖分析仪(YSI，Yellow Springs，Ohio)监测培养基中的葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度超过0.1g/L时，进料速率下降或暂时中止进料。当细胞达到OD550为70时，通过加入9mL 0.5MIPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)开始诱导葡糖基转移酶活性。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速率(400rpm至1200rpm)并且随后通过通风速率(2标准升/分钟至10标准升/分钟，slpm)控制DO。将pH控制在6.8。NH4OH(14.5％重量/体积，w/v)和H2SO4(20％w/v)用于pH控制。将背压保持在0.5巴。在不同的间隔(20小时、25小时和30小时)下，将5mL的Suppressor 7153消泡剂(Cognis Corporation，Cincinnati，OH)添加到发酵罐中以抑制发泡。在添加IPTG后通过离心8小时收获细胞并将其在-80℃下储存作为细胞浆。
实施例3
由细胞浆制备GTF-J粗蛋白提取物
将如实施例2中所述获得的细胞浆，以150g/L悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中以制备浆液。在12,000psi(～82.7MPa；Rannie型机器，APV-1000或APV 16.56；SPXCorp.，Charlotte，North Carolina)下将浆液匀化并且将匀浆冷却至4℃。伴随着适中的有力搅动，每升细胞匀浆加入50g絮凝物溶液(Aldrich no.409138，在pH 7.0的5％的50mM磷酸钠缓冲液中)。将搅拌降低至轻度搅动，保持15分钟。随后通过在5-10℃，在4500rpm下离心3小时澄清细胞匀浆。包含粗蛋白提取物中的Gtf-J酶的上清液用30千道尔顿(kDa)的截留膜进行浓缩(大约5X)。Gft-J粗蛋白提取物中的总可溶性蛋白质浓度使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定法(Sigma Aldrich)测定为4-8g/L。
实施例4
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-J GI:47527
质粒pMP52(实施例1)用于转化大肠杆菌TOP10(Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA)以生成识别为TOP10/pMP52的菌株。表达成熟Gtf-J酶“GTF7527”(以SEQ IDNO：5提供)的大肠杆菌菌株TOP10/pMP52的生长和GTF活性的测定按照上述方法。
实施例5
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-L GI:662379
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0，Menlo Park CA)合成编码在中识别为GI:662379的葡糖基转移酶(Gft)(SEQ ID NO：6；来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)的Gtf-L)的截短型式的多核苷酸。将编码蛋白质“GTF2379”(SEQ ID NO:8)的核酸产物(SEQ ID NO：7)亚克隆到(DNA 2.0)中以生成识别为pMP65的质粒。质粒pMP65用于转化大肠杆菌TOP10(Life Technologies Corp.)以生成识别为TOP10/pMP65的菌株。表达gtf酶“2379”(所用的相应GI号的最后4位数)的大肠杆菌菌株TOP10/pMP65的生长和Gtf活性的测定遵循上述方法。
实施例6
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-B GI:290580544
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0)合成编码在中识别为GI:290580544的葡糖基转移酶的截短型式(SEQ ID NO：9；来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025)的Gtf-B)的多核苷酸。将编码蛋白质“GTF0544”(SEQ IDNO:11)的核酸产物(SEQ ID NO：10)亚克隆到中以生成识别为pMP67的质粒。质粒pMP67用于转化大肠杆菌TOP10以生成识别为TOP10/pMP67的菌株。表达Gtf-B酶“GTF0544”(SEQ ID NO：11)的大肠杆菌菌株TOP10/pMP67的生长和GTF0544活性的测定遵循上述方法。
实施例7
在大肠杆菌BL21 DE3中制备GTF-I GI:450874
使用本领域中熟知的聚合酶链反应(PCR)方法分离编码来自远缘链球菌(27351TM)的葡糖基转移酶的多核苷酸。PCR引物基于保藏号BAA14241中所述的基因序列并由Abo等人(J.Bacteriol.，(1991)173：998-996)设计。5’-端引物5’-GGGAATTCCCAGGTTGACGGTAAATATTATTACT-3’(SEQ ID NO：12)设计成编码对应于gtf-I基因的碱基466至491的序列。另外，引物包含用于克隆目的的EcoRI限制酶位点的序列。
3’-端引物
5’-AGATCTAGTCTTAGTTCCAGCCACGGTACATA-3’(SEQ ID NO：13)被设计成编码对应于远缘链球菌基因的碱基4749至4774的反向互补的序列。反向PCR引物还包括用于克隆目的的XbaI位点的序列。所得的4.31Kb DNA片段由EcoRI和Xba I限制酶消化并且使用Promega PCR Clean-up试剂盒(A9281，Promega Corp.，Madison，WI)纯化，如由制造商所推荐的。将DNA片段连接到大肠杆菌蛋白表达载体(pET24a，Novagen，Merck KGaA的分部(Darmstadt，Germany)。将连接的反应转化到BL21 DE3细胞系(New England Biolabs，Ipswich，MA)中并铺板在固体LB培养基(10g/L，胰蛋白胨；5g/L酵母提取物；10g/L NaCl；14％琼脂；100μg/mL氨苄青霉素)上，用于选择单个菌落。
转化的大肠杆菌BL21 DE3细胞接种至LB培养基中的0.025的初始光密度(600nm下的OD)，并且允许在培养箱中在37℃下生长，同时以250rpm振荡。当培养物达到0.8-1.0的OD时，通过通过添加1mM IPTG来诱导编码截短的Gtf-I酶(SEQ ID NO：16)的基因(SEQ ID NO：15)。将诱导的培养物保留在摇动器上并在诱导3小时后收获。使用Eppendorf离心机，通过离心(25℃，16,000rpm)收获细胞。以0.01体积将细胞沉淀物悬浮于5.0mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，并且在冰上冷却至4℃。使用具有0.1毫米(mm)二氧化硅珠的珠粒打浆机破碎细胞。通过离心(在4℃下16,000rpm持续10分钟)去除细胞碎片。将粗蛋白质提取物(包含可溶性Gtf-I(“GTF0874”)酶)分成等份并且在-80℃下储存。
实施例8
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-I酶GI:450874
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0)合成编码在中识别为GI:450874(SEQ ID NO：14；来自唾液链球菌(Streptococcus sobrinus)的Gtf-I)的葡糖基转移酶的截短型式的基因。将编码截短的葡糖基转移酶(“GTF0874”；SEQ ID NO：16)的核酸产物(SEQ ID NO：15)亚克隆到中以生成识别为pMP53的质粒。将质粒pMP53用于转化大肠杆菌TOP10以生成识别为TOP10/pMP53的菌株。表达Gtf-I酶“GTF0874”的大肠杆菌菌株TOP10/pMP53的生长和Gtf活性的测定遵循上述方法。
实施例9
在大肠杆菌TOP10中制备GTF-S酶GI：495810459
使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子(DNA 2.0)合成编码在中识别为GI:495810459(SEQ ID NO：17；来自链球菌属(Streptococcus sp.)C150的Gtf-S)的葡糖基转移酶的截短形式的基因。将编码截短的葡糖基转移酶(“GTF0459”；SEQ ID NO：19)的核酸产物(SEQ ID NO：18)亚克隆到中以生成识别为pMP79的质粒。质粒pMP79用于转化大肠杆菌TOP10以生成识别为TOP10/pMP79的菌株。表达Gtf-S酶的大肠杆菌菌株TOP10/pMP79的生长和Gtf活性的测定遵循上述方法。
实施例10
在枯草芽孢杆菌BG6006中制备GTF-S酶GI：495810459
SG1067-2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达菌株，其表达链球菌属(Streptococcus sp.)C150(GI:495810459)的葡糖基转移酶Gtf-S(“GTF0459”)的截短型式。枯草芽孢杆菌宿主BG6006菌株包含9个蛋白酶缺失(amyE::xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)。全长Gtf-A具有1570个氨基酸。具有1393个氨基酸的N端截短的型式为最初对大肠杆菌表达进行优化的密码子，并由DNA2.0合成。在aprE启动子下将该N端截短的Gtf-S(SEQ ID NO：19)亚克隆到复制性芽孢杆菌表达pHYT载体的NheI和HindIII位点中，并且在载体上与枯草芽孢杆菌AprE信号肽融合。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上进行选择。然后将确认的表达Gtf的构建体pDCQ967转化到枯草芽孢杆菌BG6006中，并在具有四环素(12.5μg/mL)的LB平板上选择。将所得的枯草芽孢杆菌表达菌株SG1067纯化并将分离的培养物中的一种，SG1067-2用作Gtf-S酶的来源。SG1067-2菌株首先在包含10μg/mL四环素的LB培养基中生长，并且然后传代培养到包含12.5μg/mL四环素的GrantsII培养基中，在37℃下生长2-3天。在15,000g和4℃下使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22μm过滤器。然后将包含GTF0459的经过滤上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
实施例11
发酵枯草芽孢杆菌SG1067-2以产生GTF-S GI：495810459
表达GTF0459(SEQ ID NO：19)的枯草芽孢杆菌SG1067-2菌株(实施例10)通过常规分批补料发酵在有氧浸没条件下生长。营养培养基包含0-15％HY-SOYTM(高度可溶的，大豆粉的多功能酶促水解物；Kerry Inc.(Beloit，WI))、5-25g/L磷酸钠和磷酸钾，0.5-4g/L硫酸镁、和柠檬酸、硫酸亚铁和硫酸锰。添加3-5mL/L的消泡剂，FOAM882(食品级聚醚多元醇消泡剂助剂；Emerald Performance Materials，LLC，Cuyahoga Falls，OH)以控制发泡。当检测不到批量中的初始葡糖糖时，用50％(w/w)葡萄糖进料补加2-L发酵。葡萄糖进料速率在几小时内上升。使发酵控制于37℃和20％DO，并且在400rpm的初始搅拌下引发。用50％v/v氢氧化铵将pH控制于7.2。在贯穿整个2-天的发酵运行中，监测发酵参数诸如pH、温度、空气流量、DO％。在运行结束时收获得到培养物肉汤并在5℃下离心以获得上清液。然后将包含GTF0459的上清液冷冻并在-80℃下储存。
实施例11A
构建表达GTF0459的同源基因的枯草芽胞杆菌菌株
进行研究以识别与GTF0459同源的序列。由GTF0459序列开始，同源序列通过针对2014年9月8日的非冗余NCBI蛋白质数据库进行BLAST搜索来识别。使用1e-10的e值截止值，BLAST运行识别约1100个推定的同系物。在过滤以比对长度为至少1000个的氨基酸并基于氨基酸序列同一性的百分比排序之后，发现密切相关的13个同系物，即与GTF0459具有大于90％的氨基酸序列同一性。然后通过使用CLUSTALW(用于比对高度相关的序列的标准序列比对包)，将识别的同系物与GTF0459序列进行比对。在1570个残基的比对区中，同源序列与GTF0459的氨基酸序列大约96％-97％相同。比对区从GTF0459中的氨基酸位置1延伸至1570，并且从GTF0459同系物中的位置1延伸至1581。在13个经识别的GTF0459同系物之外，下一个最接近的蛋白质在与GTF0459或13个经识别的同系物中任一个的比对区中仅共享约55％氨基酸序列同一性。通过Genscript合成编码GTF0459和同系物(SEQ ID NO.86和介于87和111之间的奇数SEQ ID NO)以及两个非同系物(<54％aa序列同一性)(SEQ ID NO.113，115)的N端可变区截短的蛋白质的DNA序列，如下表1中所提供的。在aprE启动子下将合成基因克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的NheI和HindIII位点中，并且在载体上与枯草芽孢杆菌AprE信号肽融合。在一些情况下，在没有信号肽的情况下，在aprE启动子下将它们克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的SpeI和HindIII位点中。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上进行选择。然后将经确认的表达特定GTF的构建体转化到包含九个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌宿主中(amyE::xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(5ug/ml)的LB平板上选择。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生长的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上划线接种几次。使所得的枯草芽孢杆菌表达菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培养基上生长并然后传代培养到GrantsII培养基中，在30℃下生长2-3天。在4℃下以15,000g使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22um过滤器。将过滤后的上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
表1：在同源搜索期间识别的GTF0459和序列(GTF编号基于GI号的最后四位)
实施例11B
构建表达GTF0459的同源基因的C端截短形式的枯草芽孢杆菌菌株
葡糖基转移酶通常包含N端可变结构域、中间催化结构域、和包含多个葡聚糖结合结构域的C端结构域。实施例11A中识别和表达的GTF0459同系物全部包含N端可变区截短形式。该实施例描述了构建表达GTF0459和GTF0459同系物(如由上表1中GI编号中的最后四位识别)的各个C-端截短形式的枯草芽孢杆菌菌株。
T1(从氨基酸位置179-1086延伸)，T2(从氨基酸位置179-1125延伸)，T4(从氨基酸位置179-1182延伸)，T5(从氨基酸位置179-1183延伸)，和T6(从氨基酸位置179-1191延伸)C-端截短形式由包含如实施例11A中的表1中所列的N-端截短形式的GTF0974、GTF4336和GTF4491葡糖基转移酶制成。还制备GTF0459(GTF3279)的T5和T6截短形式。T5截短形式还由GTF3808制备。如序列表中提供的截短形式的序列的DNA和蛋白质SEQ ID NO列于下表2中。编码GTF0459、N-端截短同系物和C-端截短形式的DNA片段为通过Genscript从合成基因质粒扩增的PCR并且在不具有信号肽的情况下在aprE启动子下克隆到枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的SpeI和HindIII位点中。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上进行选择。然后将经确认的表达特定GTF的构建体转化到包含9个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌宿主中(amyE::xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(CM，5ug/ml)的LB平板上选择。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生长的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上划线接种几次。使所得的枯草芽孢杆菌表达菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培养基中生长并然后传代培养到GrantsII培养基中，在30℃下生长2-3天。在4℃下以15,000g使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22um过滤器。将过滤后的上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
菌株的GTF活性在三个独立实验中通过PAHBAH测定进行分析。由于实验之间的微小变化，表2列出了在枯草芽孢杆菌宿主中的截短的酶的活性连同测量活性的实验。大部分T1、T2和T6截短形式减小酶的活性，然而T4和T5 C-端截短形式保留相对于对应的仅N端截短形式(NT)的相似活性。同系物和同系物的C-端截短形式保留活性并产生与GTF0459相似的可溶性α-葡聚糖纤维(参见实施例39A和39B)，表明保留在截短形式中的催化结构域内的残基可以为能够产生纤维的酶的特征。为识别可能参与产生可溶性α-葡聚糖纤维的催化结构域内的特异性氨基酸残基，分析三种葡糖基转移酶的催化结构域的晶体结构(PDB标识符：3AIB、3AIC和3HZ3)以识别结合配体的8埃内的残基。57个残基满足所述标准。基序基于GTF0459和每个识别的同系物中的对应的57个氨基酸产生。然后基序用于产生共有序列以捕获GTF0459和识别的同系物的催化结构域中的可变性。共有序列以SEQ ID NO:153提供。
表2：菌株的GTF活性。
实施例11C
使用大豆水解物培养基发酵表达GTF0459的同系物或GTF0459同系物的C端截短形 式的枯草芽孢杆菌菌株
通过常规的分批补料发酵使表达每种GTF的枯草芽孢杆菌菌株在有氧浸没条件下生长。营养培养基包含1.75％-7％大豆水解物(Sensient或BD)、5-25g/L磷酸钠和磷酸钾、0.5-4g/L硫酸镁和3-10g/L柠檬酸、硫酸亚铁和锰的溶液。以2-4mL/L添加消泡剂Foamblast882来控制发泡。当检测不到批料中的初始葡糖糖时，用50％(w/w)葡萄糖进料补加2-L或10-L发酵。葡萄糖进料速率在几小时内上升。使发酵控制于20％DO和30℃的温度，并且在400rpm的初始搅拌下引发。用50％(v/v)氢氧化铵将pH控制于7.2。在贯穿整个2-3天的发酵运行中，监测发酵参数诸如pH、温度、空气流量、DO％。在运行结束时收获培养物肉汤并对其进行离心以获得包含GTF的上清液。然后将上清液冷冻储存在-80℃。
实施例11D
使用固体玉米浆培养基发酵表达GTF0459的同系物或GTF0459同系物的C端截短形 式的枯草芽孢杆菌菌株
通过常规的分批补料发酵使表达每种GTF的枯草芽孢杆菌菌株在有氧浸没条件下生长。营养培养基包含0.5％-2.5％固体玉米浆(Roquette)、5g/L-25g/L磷酸钠和磷酸钾、0.3M-0.6M硫酸亚铁、氯化锰和氯化钙的溶液、0.5g/L-4g/L硫酸镁、和0.01g/L-3.7g/L硫酸锌、硫酸亚铜、硼酸和柠檬酸的溶液。添加2mL/L-4mL/L的消泡剂Foamblast 882来控制发泡。当检测不到批料中的初始葡糖糖时，用50％(w/w)葡萄糖进料补加2-L发酵。葡萄糖进料速率在几小时内上升。使发酵控制于20％DO和30℃或37℃的温度，并且在400rpm的初始搅拌下引发。用50％(v/v)氢氧化铵将pH控制于7.2。在贯穿整个2-3天的发酵运行中，监测发酵参数诸如pH、温度、空气流量、DO％。在运行结束时收获培养物肉汤并对其进行离心以获得包含GTF的上清液。然后将上清液冷冻储存在-80℃。
实施例12
在大肠杆菌BL21(DE3)中产生突变酶MUT3264 GI:257153264
编码在中识别为GI:257153264(SEQ ID NO：22)的来自腐殖质类芽孢杆菌NA1123的突变酶的基因由GenScript(GenScript USA Inc.，Piscataway，NJ)合成。将编码蛋白质序列(“MUT3264”，SEQ ID NO：21)的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)亚克隆到pET24a中(Novagen；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)。将所得的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中以产生识别为SGZY6的菌株。在以220rpm振荡的情况下，使菌株在37℃下生长至OD600为～0.7，然后使温度降低至18℃并添加IPTG至0.4mM的最终浓度。在通过在4000g下离心收获之前，使培养物生长过夜。将来自600mL培养物的细胞沉淀物悬浮在22mL 50mM KPi缓冲液(pH7.0)中。通过French细胞压碎器(2通道@15,000psi(103.4MPa))破碎细胞；通过离心(SORVALLTMSS34转子，@13,000rpm；Thermo Fisher Scientific,Inc.(Waltham，MA))40分钟去除细胞碎片。通过SDS-PAGE分析上清液以确认“mut3264”突变酶的表达并且将粗提取物用于活性测定。不具有突变酶基因的对照菌株通过利用pET24a载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞产生。
实施例13
在枯草芽孢杆菌菌株BG6006菌株SG1021-1中产生突变酶MUT3264 GI：257153264
枯草芽孢杆菌菌株BG6006菌株SG1021-1
SG1021-1为枯草芽孢杆菌突变酶表达菌株，其表达来自从发酵的大豆纳豆分离的Paenibacillus humicus NA1123的突变酶。就枯草芽孢杆菌中的重组表达而言，用芽孢杆菌属AprE信号肽(登录号AFG28208；SEQ ID NO：25)替代天然信号肽。将编码MUT3264(SEQ ID NO:23)的多核苷酸可操作地连接在编码芽孢杆菌属表达的MUT3264(如以SEQ ID NO：24提供的)的AprE信号肽(SEQ ID NO：25)的下游。缺失C-端赖氨酸以在编码聚组氨酸标签的序列之前提供终止密码子。
枯草芽孢杆菌宿主BG6006菌株包含9个蛋白酶缺失(amyE::xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、spoIIE3501、aprE、nprE、epr、ispA、bpr、vpr、wprA、mpr-ybfJ、nprB)。野生型mut3264(如以GI:257153264存在)具有1146个氨基酸，其中N端33个氨基酸由SignalP 4.0程序(Nordahl等人，(2011)Nature Methods，8：785-786)推导为天然信号肽。不具有天然信号肽的成熟mut3264由GenScript合成并且可在aprE启动子下克隆到复制性芽孢杆菌pHYT表达载体的NheI和HindIII位点中，并与载体上的枯草芽孢杆菌AprE信号肽融合(SEQ ID NO：25)融合。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB平板上进行选择。然后将确认的构建体pDCQ931转化到枯草芽孢杆菌BG6006中，并在具有四环素(12.5μg/mL)的LB平板上选择。将所得的枯草芽孢杆菌表达菌株SG1021纯化并将单菌落分离物SG1021-1用作突变酶mut3264的来源。SG1021-1菌株首先在包含10ug/mL四环素的LB中生长，然后传代培养到包含12.5μg/mL四环素的GrantsII培养基中，在37℃下生长2-3天。在15,000g和4℃下使培养物离心30分钟并使上清液过滤通过0.22μm过滤器。将包含MUT3264的经过滤上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
实施例14
制备突变酶MUT3325 GI:212533325
编码马尔内菲青霉(Penicillium marneffei)18224TM突变酶(中识别为GI:212533325)的基因由GenScript(Piscataway,NJ)合成。将编码蛋白质序列(MUT3325；SEQ ID NO：27)的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)在SacII和AscI限制性位点处亚克隆到质粒pTrex3(SEQ ID NO:59)中，被设计成在CBHI启动子和终止子的控制下，用黑曲霉乙酰胺酶进行选择，在里氏木霉中表达感兴趣的基因的载体。如上文一般方法部分所述，通过基因枪注射将所得的质粒转化到里氏木霉中。基因枪转化的具体方法描述于国际PCT专利申请公布WO2009/126773A1中。使用具有来自稳定克隆的孢子的1cm2琼脂棒TRM05-3来接种制备培养基(以下所述)。在28℃和220rpm下，使培养物在摇瓶中生长4-5天。为了收获分泌的蛋白质，首先通过在4000g下离心10分钟去除细胞群，并使上清液过滤通过0.2μM无菌过滤器。突变酶MUT3325的表达通过SDS-PAGE确认。
以下列出了制备培养基组分。
限定的NREL-Trich乳糖
里氏木霉痕量元素
实施例15
通过发酵制备MUT3325
通过在2-L带挡板的烧瓶中用1.0mL的MUT3325表达菌株TRM05-3(实施例14)的冷冻孢子悬浮液接种0.5L的基本培养基来制备发酵种子培养物(基本培养基由5g/L硫酸铵、4.5g/L磷酸二氢钾、1.0g/L七水硫酸镁、14.4g/L无水柠檬酸、1g/L二水氯化钙、25g/L葡萄糖，以及痕量元素(包括0.4375g/L柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.008g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰和0.002g/L硼酸)组成。pH为5.5)。在转移到14-L发酵罐中的8L制备培养基之前，使培养物在32℃和170rpm下生长48小时。制备培养基由75g/L葡萄糖、4.5g/L磷酸二氢钾、0.6g/L二水合氯化钙、1.0g/L七水硫酸镁、7.0g/L硫酸铵、0.5g/L无水柠檬酸、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.04g/L七水硫酸锌、0.00175g/L五水硫酸铜、0.0035g/L一水合硫酸锰、0.002g/L硼酸和0.3mL/L foam blast 882组成。
对于在34℃和500rpm下于葡萄糖上生长24h的批次，首先运行发酵。在24h结束时，使温度降低至28℃并使搅拌速度增大至1000rpm。然后在0.030g葡萄糖－槐糖固体/g生物质/小时的特定进料速率下，用葡萄糖和槐糖的混合物(62％w/w)进料发酵罐。在运行结束时，通过离心去除生物质，并且使用10-kD分子量截留超滤芯(UFP-10-E-35；GEHealthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)通过超滤将含有突变酶的上清液浓缩约10倍。使浓缩蛋白质在-80℃下储存。
实施例16
制备突变酶MUT6505(GI:259486505)
编码构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4突变酶(在中识别为GI:259486505)的多核苷酸由GenScript(Piscataway,NJ)合成。将编码蛋白质序列(MUT6505；SEQ ID NO：29)的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)亚克隆到质粒pTrex3中，被设计成在CBHI启动子和终止子的控制下，用黑曲霉乙酰胺酶进行选择，在里氏木霉属中表达感兴趣的基因的载体。通过基因枪注入将所得的质粒转化到里氏木霉中。使用来自稳定克隆的具有孢子的1cm2琼脂塞来接种制备培养基(硫酸铵5g/L、PIPPS 33g/L；BD Bacto酪蛋白氨基酸9g/L、KH2PO4 4.5g/L、CaCl2.2H2O 1.32g/L、MgSO4.7H2O 1g/L、NaOH丸粒4.25g/L、乳糖1.6g/L、消泡剂204 0.01％、柠檬酸.H2O 0.48g/L、FeSO4.7H2O 0.5g/L、ZnSO4.7H2O 0.04g/L、CuSO4.5H2O 0.008g/L、MnSO4.H2O 0.0036g/L和硼酸0.002g/L，在pH 5.5下)。在28℃和220rpm下，使培养物在摇瓶中生长4-5天。为了收获分泌的蛋白质，首先通过在4000g下离心10分钟去除细胞群，并使上清液过滤通过0.2μM无菌过滤器。MUT6505的表达通过SDS-PAGE确认。将包含MUT6505的粗蛋白提取物储存在-80℃下。
实施例17
制备琼楠木霉(H.TAWA)、长枝康宁木霉(T.KONILANGBRA)和里氏木霉突变酶
以下描述了用于获得来自琼楠木霉(SEQ ID NO：53和54)、长枝康宁木霉(SEQ IDNO：55和56)、和里氏木霉(SEQ ID NO：57和58)的突变酶的相应多核苷酸和氨基酸序列的方法。
基因组DNA的分离
通过在生物罩中向三个250mL带挡板的锥形摇瓶中加入30mL无菌YEG肉汤来制备里氏木霉592、长枝康宁木霉和琼楠木霉的真菌培养物(参见EP2644187A1和授予Kim等人的对应的美国专利申请公布2011-0223117A1)。使用无菌塑料环从每个相应的真菌培养板上切下并取出131英寸的正方形，并置于合适的培养烧瓶中。然后，将接种的烧瓶置于28℃振荡培养箱中生长过夜。
从振荡培养箱中去除里氏木霉、长枝康宁木霉和琼楠木霉培养物并且将每个烧瓶的内容物倒入独立的无菌50mL Sarstedt管中。将Sarstedt管置于台式离心机中并以4500rpm离心10分钟以使真菌菌丝体沉淀。抛弃上清液并且将大环量的每个菌丝体样品转移到包含赖氨酸基质(FASTDNATM)的独立的管中。根据用于藻类、真菌和酵母的制造商规程，使用FASTDNATM试剂盒(Qbiogene，现在MP Biomedicals Inc.，Santa Ana，CA)从收获的菌丝体中提取基因组DNA。匀化时间为25秒。通过凝胶电泳测定提取的基因组DNA的量和质量。
通过PCR获得α-葡聚糖酶多肽
里氏木霉
由同源性在里氏木霉基因组(JGI)中识别推定的α-1,3葡聚糖酶基因。里氏木霉的PCR引物基于推定的同源DNA序列来设计。基于推定的里氏木霉蛋白质序列和其它公开的α-1,3葡聚糖酶蛋白质序列，对于长枝康宁木霉和琼楠木霉设计简并PCR引物。
里氏木霉特异性PCR引物：
SK592：5’-CACCATGTTTGGTCTTGTCCGC-3’(SEQ ID NO：30)
SK593：5’-TCAGCAGTACTGGCATGCTG-3’(SEQ ID NO：31)
用于从由里氏木霉菌株RL-P37(美国专利4,797,361A；NRRL-15709，AgriculturalResearch Service s，USDA，Peoria，Illinois)提取的基因组DNA扩增推定的α-1,3葡聚糖酶的PCR条件如下：
1. 94℃下2分钟，
2. 94℃下30秒，
3. 56℃下30秒，
4. 72℃下3分钟，
5. 返回到步骤2并持续24个循环，
6. 保持在4℃。
反应样品包含2mL的里氏木霉RL-P37基因组DNA、10mL的10X缓冲液、2mL 10mM dNTPs混合物、1mL的20mM引物SK592和SK593、1mL的PfuUltra高保真DNA聚合酶(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)以及83mL蒸馏水。
长枝康宁木霉和琼楠木霉
初始PCR反应使用由多个同源序列的蛋白质比对设计的简并引物。将设计成靠近5’和3’端退火的主要简并引物系列用于第一PCR反应以将相似的序列扩增为α-1,3葡聚糖酶的序列。用于初始克隆的简并引物：
琼楠木霉和长枝康宁木霉：
MA1F：5’-GTNTTYTGYCAYTTYATGAT-3’(SEQ ID NO：32)
MA2F：5’-GTNTTYTGYACAYTTYATGATHGGNAT-3’(SEQ ID NO：33)
MA4F：5’-GAYTAYGAYGAYGAYATGCARCG-3’(SEQ ID NO：34)
MA5F：5’-GTRCAYTTRCAIGGICCIGGIGGRCARTANCC-3’(SEQ ID NO：35)
MA6R：5’-YTCICCIGGNAGNGGRCANCCRTT-3’(SEQ ID NO：36)
MA7R：5’-RCARTAYTGRCAIGCYGTYGGYGGRCARTA-3’(SEQ ID NO：37)
然后在相同的扩增条件下，使用设计成附接在初始PCR片段的产物内的引物，将这些PCR反应的产物用于巢式PCR中，用于初始克隆的特异性引物：
长枝康宁木霉：
TP1S：5’-CCCCCTGGCCAAGTATGTGT-3’(SEQ ID NO：38)
TP2A：5’-GTACGCAAAGTTGAGCTGCT-3’(SEQ ID NO：39)
TP3S：5’-AGCACATCGCTGATGGATAT-3’(SEQ ID NO：40)
TP3A：5’-AAGTATACGTTGCTTCCGGC-3’(SEQ ID NO：41)
TP4S：5’-CTGACGATCGGACTRCACGT-3’(SEQ ID NO：42)
TP4A：5’-CGTTGTCGACGTAGAGCTGT-3’(SEQ ID NO：43)
琼楠木霉：
HP2A：5’-ACGATCGGCAGAGTCATAGG-3’(SEQ ID NO：44)
HP3S：5’-ATCGGATTGCATGTCACGAC-3’(SEQ ID NO：45)
HP3A：5’-TACATCCAGACCGTCACCAG-3’(SEQ ID NO：46)
HP4S：5’-ACGTTTGCTCTTGCGGTATC-3’(SEQ ID NO：47)
HP4A：5’-TCATTATCCCAGGCCTAAAA-3’(SEQ ID NO：48)
使用PCR产物的凝胶电泳来确定是否扩增了预期大小的片段。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化预期尺寸的单巢PCR产物。此外，从包含多个产品带的琼脂糖凝胶中切割并提取预期尺寸的产品，并使用QlAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。
转化/分离筛选/质粒提取
根据制造商的规格(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)，使用Invitrogen ZEROPCR克隆试剂盒，将PCR产品插入克隆载体中。然后根据制造商的推荐，将载体转化到ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞中，并且然后扩散到包含50ppm Kanamycin的LB板上。这些板在37℃培养箱中温育过夜。
为了选择包含载体和DNA插入物的转化体，从板中选择菌落用于粗质粒提取。将50mL的DNA提取溶液(100mM NaCl，10mM EDTA，2mM Tris pH 7)添加到干净的1.5mLEppendorf管中。在生物罩中，将每种转化克隆的7-10个独立的菌落进行编号、挑取并重悬于提取溶液中。在化学罩中，将50mL的苯酚：氯仿：异戊醇添加到每种样品中并完全涡旋。将管以最大速度微离心5分钟，此后，去除20mL的顶层含水层并且置于干净的PCR管中。然后添加1mL的RNase(2mg/mL)，并将样品混合并在37℃下温育30分钟。然后将整个样品体积在凝胶上运行以基于与空载体的尺寸差异来测定载体中插入物的存在。一旦已经识别了转化菌落，就从板上刮下那些克隆体并用于接种包含5mL的LB/卡那霉素培养基(0.0001％)的独立的15mL管。将培养物置于37℃振荡培养箱中过夜。
从培养箱中去除样品并且使用Sorval离心机以6,000rpm离心6分钟。QIAprepSpin Miniprep试剂盒(QIAGEN)和规程用于分离质粒DNA，然后将其消化以确认插入物的存在。所用的限制性酶依赖于插入序列中和周围存在的位点。凝胶电泳用于测定片段大小。提交适当的DNA样品用于测序(Sequetech，Mountain View，CA)。
克隆3’和5’端
将所有DNA片段排序。使用和(Vectorsuite，Life Sciences Corp.，Carlsbad，CA)，将序列进行比对并且比较以确定核苷酸和氨基酸同一性。将特异性引物设计成通过从已知序列向外延伸扩增来自琼楠木霉和长枝康宁木霉的每种不完整片段的3’和5’部分。对于每个模板设计至少三种特异性引物，所述特异性引物各自在先前引物系列的扩增产物中成巢。使用巢式引物组与LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)进行5’和3’序列的扩增。
制备新鲜的基因组DNA用于该扩增。通过用250mL的带挡板锥形瓶中的适当形成孢子的真菌板培养物的1平方英寸部分接种30mL YEG肉汤来制备长枝康宁木霉和琼楠木霉的培养物。将烧瓶在28℃振荡培养箱中温育过夜。通过以4,500rpm在50mL Sarstedt管中离心10分钟来收获培养物。丢弃上清液并且将菌丝体在-80℃冷冻机中保存过夜。然后将冷冻的菌丝体连同几片干冰一起放入咖啡研磨机中。运行研磨机直至整个混合物具有粉状稠度。然后，将粉末风干并转移到包含10mL的EASY-DNATM试剂盒溶液A(Life Sciences Corp.)的无菌50mL Sarstedt管中，并且遵循制造商的规程。使用NanoDrop分光光度计测量从提取物收集的基因组DNA的浓度。LA PCR体外克隆试剂盒基于已知DNA序列内不存在特定限制性位点进行选择，并遵循制造商的说明。对于第一次PCR运行而言，将1mL的连接DNA样品稀释于33.5mL的蒸馏去离子水中。根据样品和期望的端部片段使用不同引物。就5’端而言，将引物HP4A和TP3A分别用于琼楠木霉和长枝康宁木霉，同时就3’端而言，将引物HP4S和TP3S用于琼楠木霉和长枝康宁木霉。通过添加34.5mL稀释的连接DNA溶液、5mL的10X LA缓冲液II(Mg2+)，8mL dNTP混合物、1mL盒式引物I、1mL特异性引物I(取决于样品和端部片段)、和0.5mL Takara LA Taq聚合酶来制备PCR混合物。然后，按照所列规程，将PCR管置于热循环仪中：
1. 94℃下10分钟，
2. 94℃下30s，
3. 55℃下30s，
4. 72℃下4分钟，回到步骤2并进行30次，
5. 保持在4℃下。
通过获取1mL的第一PCR反应物并将在蒸馏去离子水中将样品稀释至1:10,000的稀释因子来制备第二PCR反应物。将在第一扩增区内成巢的第二系列引物用于扩增在第一PCR反应中分离的片段。将引物HP3A和TP4A分别用于针对琼楠木霉和长枝康宁木霉的5’端扩增，同时将引物HP3S和TP4S用于朝向3’端扩增。将稀释的DNA添加到包含33.5mL蒸馏的无菌水、5mL10X LA缓冲液II(Mg2+)、8mL dNTPs混合物、1mL的盒式引物2、1mL的特异性引物2(取决于样品和片段、端部)、0.5mL Takara LA Taq的PCR反应物中，并且充分混合，然后运行PCR。PCR规程与第一反应相同，但初始不在94℃下持续10分钟。在完成反应之后，通过凝胶电泳运行样品以确定尺寸和分离的片段的数量。如果存在单条带，则样品被纯化并且送去测序。如果没有片段被分离，则使用先前用于巢式PCR反应的规程进行第三PCR反应。在通过凝胶电泳运行扩增片段之后，切下最亮的条带、纯化、并且送去测序。
序列比对分析
使用包括和的Vector NTI套盒，获得并分析序列。将每个对应端片段序列与先前获得的琼楠木霉和长枝康宁木霉的片段比对以获得整个基因序列。与哈茨木霉和里氏木霉序列的核苷酸比对揭示了感兴趣的基因在琼楠木霉和长枝康宁木霉两者中的翻译起点和终点。在识别整个基因序列之后，将特异性引物设计成从基因组DNA扩增整个基因。如前所述设计引物，不同的是对于克隆(LifeSciences Corp.)而言，在翻译起点之前添加CACC核苷酸序列。
用于最终克隆的引物：
长枝康宁木霉：
T1FS：caccatgctaggcattctccg(SEQ ID NO：49)
T1FA：tcagcagtattggcatgccg(SEQ ID NO：50)
琼楠木霉：
H1FS：CACCATGTTGGGCGTTTTTCG(SEQ ID NO：51)
H1FA：CTAGCAGTATTGRCATGCCG(SEQ ID NO：52)
如前所述遵循PCR规程，不同的是将退火温度改变为55℃。在分离单条带并通过凝胶电泳观察后，如先前所述纯化扩增的片段，并根据制造商的说明书用于pENTR/D(Life Sciences Corp.)转化中。然后如前所述转化化学感受态大肠杆菌细胞，并且转移到包含50ppm卡那霉素的LB平板。在37℃温育过夜之后，如前所述，在粗DNA提取和质粒大小分析之后，选择包含质粒和插入物的转化体。从板上刮下选择的转化体并用于接种包含5mL的LB/卡那霉素培养基(0.0001％)的新鲜15mL管。将培养物置于37℃振荡培养箱中过夜。通过离心收获细胞并且如前所述提取质粒DNA。消化质粒DNA以确认插入序列的存在，并且然后提交用于测序。根据制造商的说明书，使用LR Clonase反应(Gateway Cloning，Invitrogen(Life Sciences Corp.))以将插入物从pENTRTM/D载体定向转移到目的载体中。目的载体设计用于在CBH1启动子和终止子的控制下，利用黑曲霉乙酰胺酶进行选择，在里氏木霉中表达感兴趣的基因。
基因枪转化(参见一般方法)
通过里氏木霉转化来表达α-1,3葡聚糖酶
将1cm2琼脂塞用于接种Proflo种子培养基。在28℃下，在200rpm下温育培养基。改性的amdS基因枪琼脂(MABA)/升振荡物。在第二天，10％转化物无菌制成制备培养基。在200rpm振荡下，将培养物在28℃下温育。在第三天，通过离心收获培养物。将上清液无菌过滤(0.2mm聚醚砜过滤器；PES)并在4℃下储存。通过SDS-PAGE分析识别表达相应α-葡聚糖酶基因的克隆体。里氏木霉转化体的生长条件遵循用于实施例14中的那些。
实施例18
在同时或顺序添加突变酶的情况下，使用葡糖基转移酶GTF-J(GI：47527)产生可 溶性低聚糖
在35℃下，利用100g/L蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)运行反应(10mL总体积)，其中混合由磁力搅拌棒供应。向每种反应物中添加0.3％(v/v)浓缩的大肠杆菌粗蛋白提取物，所述提取物包含唾液链球菌GTF-J(GI：47527，GTF7527；实施例3)。以10％(v/v)的最终反应体积将包含长枝康宁木霉突变酶或里氏木霉592突变酶的里氏木霉粗蛋白提取物(实施例17)添加到反应中，其与包含GTF-J的粗蛋白提取物同时添加，或者在添加包含GTF-J的粗蛋白提取物之后24小时添加。在不添加突变酶的情况下运行对照反应。在4小时和22小时或24小时取出等分试样，并通过在60℃下加热30分钟淬灭。通过离心从经热处理样品中除去不溶性物质。通过HPLC分析所得的上清液以测定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表3和表4)；基于蔗糖转化率计算DP3-DP7收率。
实施例19
在同时或顺序添加突变酶的情况下，使用葡糖基转移酶GTF-J(GI：47527)产生可 溶性低聚糖
在30℃下，利用100g/L蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)运行反应(10mL总体积)，其中混合由磁力搅拌棒供应。向每种反应物中添加0.3％(v/v)浓缩的大肠杆菌粗蛋白提取物，所述提取物包含唾液链球GTF-J(GI：47527，GTF7527；实施例3)。以10％(v/v)的最终反应体积将包含腐殖质类芽孢杆菌突变酶(GI:257153264，mut3264；实施例12)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物添加到反应中，其与包含GTF-J的粗蛋白提取物同时添加，或者在包含GTF-J的粗蛋白提取物的添加之后24小时添加。在不添加突变酶的情况下运行对照反应。在4小时或5小时和20小时或21小时取出等分试样，并通过在60℃加热30分钟淬灭。通过离心从经热处理样品中除去不溶性物质。通过HPLC分析所得的上清液以测定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表5和表6)；基于蔗糖转化率计算DP3-DP7收率。
实施例20
使用葡糖基转移酶GTF-J(GI:47527)和突变酶的组合制备可溶性低聚糖
反应物1包含蔗糖(100g/L)、含有来自唾液链球菌的GTF-J(GI:47527，GTF7527；实施例3)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(0.3％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0。反应物2和4包含蔗糖(100g/L)、含有来自唾液链球菌的GTF-J(实施例3)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(0.3％v/v)和来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(GI:212533325，mut3325；实施例14)的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或者含有来自腐殖质类芽孢杆菌的突变酶(GI:257153264，mut3264；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0。对照反应物3和5分别使用不包含突变酶的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)。每种反应物的总体积为10mL并且所有反应均在40℃下进行，同时以125rpm振荡。在5小时和24小时取出等分试样，并通过在95℃加热5分钟淬灭。通过离心和过滤除去不溶性物质。通过HPLC分析可溶性产物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表7)。在24h时，还通过1H NMR谱分析来自每种反应物的可溶性产物以确定低聚糖的异头键(表8)。
表8：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键分析。
当存在突变酶时，在反应的前5小时消耗更多蔗糖。不表达突变酶的来自里氏木霉和大肠杆菌菌株的粗提取物对蔗糖消耗速率不具有协同效应。在突变酶存在的情况下，明串珠菌二糖与果糖的比率显著降低。在突变酶存在的情况下，可溶性低聚糖的收率显著增加。可溶性低聚糖中α-(1,3)键的百分比由于突变酶的存在而显著增加。
实施例21
通过GTF-L和突变酶制备可溶性低聚糖
反应物1包含蔗糖(100g/L)和含有来自唾液链球菌(GI:662379，GTF2379；实施例5)的GTF-L的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0。反应物2和4包含蔗糖(100g/L)、含有来自唾液链球菌的GTF-L(实施例5)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)和含有琼楠木霉突变酶(实施例17)的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或者含有来自腐殖质类芽孢杆菌(GI:257153264，mut3264；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0。对照反应物3和5分别使用不包含突变酶的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)。每种反应物的总体积为10mL并且所有反应均在40℃下进行同时以125rpm振荡。在5小时和24小时取出等分试样，并通过在95℃加热5分钟淬灭反应。通过离心和过滤除去不溶性物质。通过HPLC分析可溶性产物混合物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表9)。在24h时，还通过1H NMR谱分析来自每种反应物的可溶性产物以确定低聚糖中存在的键(表10)。
表10：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键分析。
当存在突变酶时，在前5小时消耗更多蔗糖。不表达突变酶的来自里氏木霉和大肠杆菌菌株的粗提取物对蔗糖消耗速率不具有协同效应。当蔗糖消耗几乎完成时的24小时之后，在突变酶存在的情况下，产生较少的明串珠菌二糖。在突变酶存在的情况下，明串珠菌二糖与果糖的比率显著降低。在mut3264存在的情况下，可溶性低聚糖DP3至DP7的量显著增加。在具有琼楠木霉突变酶的反应中产生比其它反应中更多的葡萄糖。可溶性低聚糖中α-(1,3)键的百分比由于突变酶的存在而显著增加。
实施例22
由GTF-B和突变酶产生可溶性低聚糖
反应物1包含蔗糖(100g/L)和含有来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025(GI:290580544，GTF0544；实施例6)的GTF-B的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液溶液，pH 6.0。以下反应物2和4包含蔗糖(100g/L)、含有来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025(GI:290580544，GTF0544；实施例6)的GTF-B的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)和含有琼楠木霉突变酶(实施例17)的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或者含有来自腐殖质类芽孢杆菌突变酶(GI:257153264，mut3264；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0。对照反应物3和5分别使用不包含突变酶的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)或大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)。每种反应物的总体积为10mL并且所有反应均在40℃下进行同时以125rpm振荡。在5小时和24小时取出等分试样，并且通过在95℃下加热等分试样样品5分钟来淬灭反应。通过离心和过滤除去不溶性物质，并通过HPLC分析所得的滤液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表11)。还通过1H NMR谱分析24小时时来自每种反应物的可溶性产物以确定低聚糖的键(表12)。
表12：通过 1 H NMR谱对每个反应中的可溶性低聚糖进行键分析。
当存在突变酶时，在前5小时消耗更多蔗糖。不表达突变酶的来自里氏木霉的粗蛋白提取物不具有对蔗糖消耗速率的协同效应。在mut3264的存在下，而不是琼楠木霉突变酶或不具有突变酶的两种蛋白质提取物的存在下，产生更多的DP3-DP7的低聚糖。当蔗糖消耗几乎完成时的24小时之后，在突变酶存在的情况下，产生较少的明串珠菌二糖。在突变酶存在的情况下，明串珠菌二糖与果糖的比率显著降低。在琼楠木霉突变酶的存在下产生高浓度的葡萄糖。
可溶性低聚糖中α-(1,3)键的百分比由于mut3264的存在而显著增加。
实施例23
由GTF-I和MUT3264突变酶产生可溶性低聚糖
反应物1包含蔗糖(100g/L)和含有来自远缘链球菌(GI:450874，GTF0874；实施例8)的GTF-I的大肠杆菌粗蛋白提取物(3％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.0)。反应物2包含蔗糖(100g/L)、含有来自远缘链球菌的GTF-I(实施例8)的大肠杆菌粗蛋白提取物(3％v/v)、和含有腐殖质类芽孢杆菌突变酶(mut3264，GI:257153264，实施例13)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提物(10％，v/v)的50mM磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.8)。每种反应物的总体积为10mL并且所有反应均在30℃下进行同时通过磁力搅拌棒搅动。在5小时、24小时和48小时取出等分试样，并且通过在60℃下加热等分试样样品30分钟来淬灭反应。通过离心除去不溶性物质，并通过HPLC分析所得的上清液以测定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表13)。
实施例24
GTF-I葡糖基转移酶和MUT3325突变酶比率对低聚糖制备的效应
反应物1-4包含蔗糖(100g/L)、含有马尔尼菲青霉18224突变酶(mut3325；实施例14)的里氏木霉粗蛋白提取物(10％v/v)、以及含有来自远缘链球菌的GTF-I(GI:450874，GTF0874；实施例8)的大肠杆菌粗蛋白提取物的50mM磷酸钾缓冲液溶液，pH5.4，含量为0.5％、2.5％、5％或10％(v/v)之一。反应物6-9包含蔗糖(100g/L)、没有添加的MUT3325，以及含有来自远缘链球菌的GTF-I(GI:450874；实施例4)的大肠杆菌粗蛋白提取物的50mM磷酸钾缓冲液溶液，pH5.4，含量为0.5％、2.5％、5％或10％(v/v)之一。反应物5仅包含蔗糖(100g/L)的相同缓冲液溶液。所有反应均在37℃下进行同时以125rpm振荡。在1小时、5小时和25小时下从每种反应物中提取等分试样(500μL)，并且在90℃下加热5分钟以停止反应。通过离心和过滤去除不溶性物质。由HPLC分析所得的滤液以测定蔗糖(Suc.)、葡萄糖(Gluc.)、果糖(Fruc.)、明串珠菌二糖(Leuc.)和低聚糖(DP3-7)的浓度(表14-16)。
表14、15和16中的数据比较示出在mut3325存在下，在所有浓度的GTF-I下，蔗糖转换较快。DP3至DP7的总量和收率在mut3325存在下在反应中显著增加。较高的mut3325与GTF-I比率导致DP3-DP7低聚糖的较高收率。
实施例25
GTF-J葡糖基转移酶和MUT3325突变酶比率对低聚糖产生的效应
下文反应物1-3包含200g/L蔗糖、不同浓度的GTF-J(来自唾液链球菌的GTF-J；GI:47527，实施例3)(0.6％和1％v/v)和不同浓度的mut3325(马尔尼菲青霉18224突变酶；实施例14)(10％和20％)，如表17中所示。所有反应均在37℃下并以125rpm倾斜振荡进行。在16-19小时后，通过在90℃加热5分钟淬灭反应。通过离心和过滤除去不溶性物质。由HPLC分析可溶性产物混合物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表17)。表17中的数量示出mut3325与GTF-J的较高比率产生较高收率的可溶性DP3至DP7低聚糖。
实施例26
pH对低聚糖产生的效应
下文反应物1-3由下列构成：蔗糖(100g/L)、gtf-J(0.3体积％，实施例3)和含有mut3264突变酶的大肠杆菌粗蛋白提取物(10体积％，实施例12)，在pH 5.0、6.0和6.8下。用于各种pH的缓冲液为：50mM柠檬酸缓冲液，pH 5.0；50mM磷酸盐，pH6.0和50mM磷酸盐，pH6.8。反应在30℃下进行同时以125rpm振荡。在5小时、24小时、48小时和72小时时从每种反应物取出等分试样，并通过在90℃加热5分钟淬灭。通过离心和过滤除去不溶性物质。通过HPLC分析可溶性产物混合物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表18)。表18中的数据示出在延长温育的情况下，在pH 5.0和pH 6.8下产生的DP4低聚糖通过突变酶进一步降解成更小的DP，然而在pH 6.0下没有观察到进一步降解。
实施例27
温度对低聚糖产生的效应
下文反应物1-4由下列构成：蔗糖(100g/L)、磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.0)、GTF-J(0.3体积％，实施例3)和mut3264突变酶的大肠杆菌粗蛋白提取物(10体积％，实施例12)。如表19中所规定的，在30℃、40℃、50℃和60℃下进行反应，同时以125rpm振荡。在24小时后，通过在90℃加热5分钟淬灭反应。通过离心和过滤除去不溶性物质。通过HPLC分析可溶性产物混合物以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表19)。DP3至DP7的低聚糖总量在40℃下最高。
实施例28
MUT6505突变酶对由GTF-J进行的蔗糖消耗的效应
将如下文表20中所指示的各种浓度的包含mut6505(构巢曲霉(Aspergillusnidulans)FGSC A4突变酶GI：259486505；实施例16)的里氏木霉粗蛋白提取物与100g/L蔗糖、和0.3％(v/v)的包含GTF-J(实施例3)的大肠杆菌粗蛋白提取物的1mL最终体积溶液一起温育。反应物在37℃下温育3小时，同时在150rpm下振荡。通过在90℃下加热3分钟将反应淬灭。通过离心和过滤通过0.2μm无菌过滤器去除不溶性物质。如一般方法中所述，在HPLC上分析滤液。数据(表20)示出较快的蔗糖消耗与增加的突变酶浓度相关。
表20：mut6505突变酶对由gtf-J进行的蔗糖转化的效应
实施例29
由GTF和突变酶的组合产生的低聚糖的可消化性
如一般方法中所述，在SEC柱上纯化来自葡糖基转移酶和突变酶反应的DP3-DP7低聚糖。
可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量释放的葡萄糖量。将麦芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照(表21)。
表21：由葡糖基转移酶(GTF)和突变酶的组合产生的低聚糖的可消化性结果。
实施例30
由GTF-S和MUT3264产生低聚糖
反应物包含蔗糖(100g/L)、含有GTF-S(链球菌属(Streptococcus sp.)C150 GI：495810459，GTF0459；实施例9)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)的50mM磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.0)，或者包含蔗糖(100g/L)、含有GTF-S(链球菌属(Streptococcus sp.)C150 GI：495810459，GTF0459；实施例9)(10％v/v)的大肠杆菌粗蛋白提取物和含有mut3264(10％(v/v)；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物的50mM磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.0)。每种反应物的总体积为10mL并且所有反应均在37℃下进行同时以125rpm振荡。在3小时、6小时、23小时和26小时取出等分试样，并通过在95℃加热5分钟淬灭反应。通过离心和过滤除去不溶性物质。通过HPLC分析滤液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖的浓度(表22)。
实施例31
分离通过GTF-J和MUT3264的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的200mL反应物在30℃下搅动20小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：200g/L蔗糖，含有来自唾液链球菌(S.salivarius)的GTF-J(GI:47527，GTF7527；实施例3)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(1.0％v/v)，以及含有腐殖质类芽孢杆菌突变酶(MUT3264，GI：257153264；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化88mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表23)。
表23：由GTF-J/mut3264产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例32
分离由GTF-L和MUT3264的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的100mL反应物在37℃下搅动24小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：210g/L蔗糖，含有来自唾液链球菌(S.salivarius)的GTF-L(GI#662379；实施例5)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(10％v/v)，以及含有腐殖质类芽孢杆菌突变酶(MUT3264，GI：257153264；实施例12)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化88mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表24)。
表24：由GTF-L/mut3264突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例33
分离通过GTF-J和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的100mL反应物在37℃下搅动24小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：210g/L蔗糖，含有来自唾液链球菌(S.salivarius)的GTF-J(GI#47527；实施例3)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(0.6％v/v)，以及含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例14)的里氏木霉粗蛋白提取物(20％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化84mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表25)。
表25：由GTF-J/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例34
分离通过GTF-I和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的100mL反应物在37℃下搅动24小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：200g/L蔗糖，含有在来自远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)的GTF-I(GI:450874；实施例8)的大肠杆菌蛋白粗提取物(5％v/v)，以及含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例14)的里氏木霉粗蛋白提取物(15％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化87mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表26)。
表26：由GTF-I/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例35
分离通过GTF-S和MUT3264的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的200mL反应物在37℃下搅动40小时，然后4℃下储存84小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：210g/L蔗糖，含有来自链球菌属(Streptococcussp.)C150的GTF-S(GI:495810459；实施例9)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)，以及含有来自腐殖质类芽孢杆菌(MUT3264，GI：257153264；实施例12)的突变酶的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表27)。
表27：由GTF-S/mut3264突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例36
分离通过GTF-B和MUT3264的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的200mL反应物在37℃下搅动24小时，然后加热至90℃并持续15分钟以使酶失活：100g/L蔗糖，含有来自变异链球菌(Streptococcus mutans)NN2025的GTF-B(GI:290580544；实施例6)的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)，以及含有来自腐殖质类芽孢杆菌(MUT3264，GI：257153264；实施例12)的突变酶的大肠杆菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化132mL的上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表28)。
表28：由GTF-B/mut3264突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例37
分离通过GTF-S和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的600mL反应物在125rpm和37℃下振荡27.5小时，然后在微波炉中(1000瓦)加热4分钟以使酶失活：300g/L蔗糖，含有来自链球菌属(Streptococcus sp.)C150的GTF-S(GI:495810459；实施例11)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(20％v/v)，以及含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例14)的里氏木霉粗蛋白提取物(2.5％v/v)在蒸馏去离子H2O中的溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖，然后通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化整个上清液。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表29)。
表29：由GTF-S/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38
分离由GTF-J产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的3000mL反应物在125rpm和pH 5.5以及47℃下振荡21h，然后加热至60℃并持续30min以使酶失活：200g/L蔗糖、和含有来自唾液链球菌的GTF-J(GI#47527；实施例3)的大肠杆菌浓缩粗蛋白提取物(1.0％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖；然后通过旋转蒸发使上清液浓缩至900mL，并通过使用BioGel P2树脂(BioRad)的SEC纯化。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表30)。
表30：由GTF-J产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38A
分离通过GTF-S同系物GTF0974和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动21h，然后加热至90℃并持续30分钟以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌57.I的GTF0974(GI:387760974；实施例11A和11D)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表31)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表31)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表31：由GTF0974/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38B
分离通过GTF-S同系物GTF4336和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动21h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)SK126的GTF4336(GI：488974336；实施例11A和11D)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表32)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表32)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表32：由GTF4336/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38C
分离通过GTF-S同系物GTF0470和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动44h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)K12的GTF0470(GI：488980470；实施例11A和11D)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表33)，然后通过使用DiaionUBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表33)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表33：由GTF0470/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38D
分离通过GTF-S同系物GTF6549和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动53h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)M18的GTF6549(GI：490286549；实施例11A和11D)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(7.5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表34)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表34)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表34：由GTF6549/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38E
分离通过GTF-S同系物GTF4491和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动22h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)JIM8777的GTF4491(GI：387784491；实施例11A和11D)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表35)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表35)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表35：由GTF4491/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38F
分离通过GTF-S同系物GTF1645和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动46h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属HSISS3的GTF1645(GI：544721645；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表36)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表36)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表36：由GTF1645/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38G
分离通过GTF-S同系物GTF6099和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动52h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属HSISS2的GTF6099(GI：544716099；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表37)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表37)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表37：由GTF6099/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38H
分离通过GTF-S同系物GTF7317和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动46h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)PS4的GT7317(GI：488977317；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表38)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表38)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表38：由GTF7317/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38I
分离通过GTF-S同系物GTF8487和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动40h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌CCHSS3的GTF8487(GI：340398487；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表39)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表39)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表39：由GTF8487/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38J
分离通过GTF-S同系物GTF3879和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动52h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属HSISS4的GTF3879(GI：544713879；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(15％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表40)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表40)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表40：由GTF3879/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38K
分离通过GTF-S同系物GTF3808和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动22h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属SR4的GTF3808(GI：573493808；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表41)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表41)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表41：由GTF3808/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38L
分离通过GTF-S同系物GTF8467和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动47h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌NU10的GTF8467(GI：660358467；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表42)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表42)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表42：由GTF8467/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38M
分离通过GTF-S同系物GTF0060和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动47h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属ACS2的GTF0060(GI：576980060；实施例11A)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表43)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表43)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表43：由GTF0060/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
比较例38N
分离通过GTF-S和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动90h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属(Streptococcus sp.)C150的GTF0459(GI：495810459；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(5％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表44)，然后通过使用Diaion UBK530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表44)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表44：由GTF0459/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
比较例38O
分离通过GTF-S非同系物GTF0487和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动214h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌PS4的GTF0487(GI：495810487；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(20％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表45)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表45)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表45：由GTF0487/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
比较例38P
分离通过GTF-S非同系物GTF5360和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动214h，然后加热至90℃并持续30min以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自变异链球菌JP9-4的GTF5360(GI：440355360；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(20％v/v)，和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.075％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表46)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表46)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表46：由GTF5360/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38Q
分离通过C-端截短的GTF0974-T4和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动24h，然后加热至90℃并持续30分钟以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌57.I的GTF0974的型式(GI:387760974；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(0.61％v/v)(其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF0974-T4，实施例11B))、和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.11％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表47)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表47)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表47：由GTF0974-T4/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38R
分离通过C-端截短的GTF0974-T5和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动24h，然后加热至90℃并持续30分钟以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自唾液链球菌57.I的GTF0974的型式(GI:387760974；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(0.51％v/v)(其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF0974-T5，实施例11B))、和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.11％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表48)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表48)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表48：由GTF0974-T5/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例38S
分离通过C-端截短的GTF3808-T5和MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤维
将包含下列物质的250mL反应物在pH 5.5和47℃下搅动19h，然后加热至90℃并持续30分钟以使酶失活：450g/L蔗糖、含有来自链球菌属SR4的GTF3808的型式(GI:573493808；实施例11A和11C)的枯草芽孢杆菌粗蛋白提取物(0.77％v/v)(其具有葡聚糖结合结构域的部分的附加C端截短形式(GTF3808-T5，实施例11B))、和含有来自马尔尼菲青霉18224的突变酶(MUT3325，GI:212533325；实施例15)的里氏木霉粗蛋白提取物UFC(0.11％v/v)的蒸馏去离子H2O溶液。将所得的产物混合物离心，并且通过HPLC分析所得的上清液的可溶性单糖、二糖和低聚糖(表49)，然后通过使用Diaion UBK 530(Na+形式)树脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC将低聚糖与上清液分离。将包含低聚糖≥DP3的SEC级分合并并通过旋转蒸发浓缩以通过HPLC进行分析(表49)。将合并的SEC级分稀释至5重量％干固体(DS)并且冷冻干燥以产生干固体形式的纤维。
表49：由GTF3808-T5/mut3325突变酶产生的可溶性低聚糖纤维。
实施例39
由GTF-J和由GTF/突变酶组合产生的可溶性低聚糖纤维的异头键分析
如实施例31至实施例38中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性低聚糖纤维混合物中的每一种的异头键记录在表50和表51中。
表50：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键分析。
实施例39A
由GTF-S、GTF-S同系物和GTF-S非同系物与MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤 维的异头键分析
如实施例38A至实施例38P中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性低聚糖纤维混合物中的每一种的异头键记录在表52和表53中。
表52：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键分析。
实施例39B
由GTF-S同系物和GTF-S同系物的C端截短形式与MUT3325的组合产生的可溶性低 聚糖纤维的异头键分析的比较
如实施例38Q至实施例38S中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且通过1H NMR谱并通过GC/MS分析所得的固体，如一般方法部分中所述(上文)。这些可溶性低聚糖纤维混合物中的每一种的异头键记录在表54和表55中，并且与它们的对应的非截短的同系物进行比较。
表54：通过 1 H NMR谱对可溶性低聚糖的异头键分析。
实施例40
由GTF-J和由GTF/突变酶组合产生的可溶性低聚糖纤维的粘度
将如实施例19至实施例26中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表56)。
表56：在20℃下测量的12％(w/w)可溶性低聚糖纤维溶液的粘度(ND＝未测定)。
实施例编号 GTF/突变酶 粘度(cP)
31 GTF7527/mut3264 1.4
32 GTF2379/mut3264 ND
33 GTF7527/mut3325 2.0
34 GTF0874/mut3325 1.6
35 GTF0459/mut3264 1.7
36 GTF0544/mut3264 6.7
37 GTF0459/mut3325 1.8
38 GTF7527/没有突变酶 ND
实施例40A
由GTF-S、GTF-S同系物和GTF-S非同系物与MUT3325的组合产生的可溶性低聚糖纤 维的粘度
将如实施例38A至实施例38P中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量，并且将所得的固体用于制备可溶性纤维的12重量％蒸馏去离子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下测量可溶性纤维溶液的粘度(以厘泊(cP)为单位记录，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表57)。
表57：在20℃下测量的12％(w/w)可溶性低聚糖纤维溶液的粘度。
实施例41
由GTF-J和由GTF/突变酶组合产生的可溶性低聚糖纤维的可消化性
将如实施例19至实施例26和实施例38A至实施例38P中所述制备的通过色谱法纯化的可溶性低聚糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。可消化性测试规程改编自Megazyme综合总膳食纤维测定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最终酶浓度保持与AOAC方法相同：50单位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，对于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言为3.4单位/mL。如由AOAC方法所推荐的，每种反应中的底物浓度为25mg/mL。每种反应物的总体积为1mL，而不是由初始规程建议的40mL。在具有或不具有两种消化酶的处理的情况下，一式两份分析每种样品。详细过程描述如下：
通过将来自综合总膳食纤维测定盒的20mg纯化的猪胰腺α-淀粉酶(150,000单位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的马来酸钠缓冲液(50mM，pH 6.0加2mM CaCl2)中并搅动5分钟，之后添加来自相同试剂盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300单位/mL)来制备酶原液。然后在玻璃小瓶中将0.5mL酶原液与0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，并将消化反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h。对于每种纤维样品平行进行重复反应。通过将0.5mL马来酸盐缓冲液(50m，pH 6.0加上2mM CaCl2)和0.5mL可溶性纤维样品(50mg/mL)混合，并且反应混合物在振荡培养箱中以轨道运动在37℃和150rpm下温育恰好16h，一式两份进行对照反应。在16h之后，从培养箱中移除所有样品并且立即加入75μL的0.75M碱性溶液以终止反应。将小瓶立即置于95-100℃的加热块中，并且温育20分钟，偶尔振荡(用手)。淬灭之后，每种反应混合物的总体积为1.075mL。如一般方法中所述，通过利用Aminex HPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每个反应中释放的葡萄糖量。将麦芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的阳性对照(表58-60)。
为计算可消化性，使用下式：
可消化性＝100％*[用酶处理后释放的葡萄糖量(mg)-酶不存在时释放的葡萄糖量(mg)]/1.1*总纤维量(mg)
表58：可溶性低聚糖纤维的可消化性。
表59：可溶性低聚糖纤维的可消化性。
表60：可溶性低聚糖纤维的可消化性。
实施例42
使用可溶性低聚糖/多糖纤维作为碳源的体外气体产生
将通过色谱法纯化的可溶性低聚糖/多糖纤维的溶液通过冻干干燥至恒定重量。随后，使用如一般方法中所述的方法，评估作为碳源的单独的可溶性低聚糖/多糖可溶性纤维样品的体外气体产生。包括如下物质作为对照碳源：85(可溶性玉米纤维，Tate&Lyle)、FM06(可溶性玉米纤维或糊精，Roquette)、600F(耐消化麦芽糖糊精，Archer Daniels Midland Company&Matsutani Chemical)、GR(菊粉，得自Beneo(Mannheim，Germany))、UltraTM(聚右旋糖，Danisco)、GOS(低聚半乳糖，Clasado Inc.(Reading，UK))、P95(低聚果糖(果糖低聚糖，FOS，Beneo)，LACTITOL MC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)和葡萄糖。表61列出了在3h和24h下由肠道微生物群产生的体外气体产量。表62列出由来自对照的肠道微生物群和由来自GTF0459同系物序列搜索识别的序列产生的体外气体产量。表63列出由来自对照的肠道微生物群和由来自GTF0459同系物序列搜索识别的同源序列的截短形式产生的体外气体产量。
表61：由肠道微生物群产生的体外气体产量。
表62：由肠道微生物群产生的体外气体产量。
表63：由肠道微生物群产生的体外气体产量。
实施例43
结肠发酵建模和脂肪酸的测量
使用半连续结肠模拟器对结肠发酵建模，如由等人所述(Nutri.Cancer(2005)52(1):94-104)；简单来说，结肠模拟器由包含模拟回肠液的四个玻璃容器组成，如Macfarlane等人所述(Microb.Ecol.(1998)35(2):180-187)。模拟器用新鲜的人粪便微生物群接种，并且每三个小时用新的回肠液喂养，内容物的部分从一个容器转移到下一个容器。回肠液包含浓度为1％的所述测试组分中的一种。所述模拟持续48h，此后收获四个容器的内容物用于进一步分析。进一步分析涉及微生物代谢物诸如短链脂肪酸(SCFA)(也称为挥发性脂肪酸(VFA))和支链脂肪酸(BCFA)的测定。分析如Holben等人(Microb.Ecol.(2002)44:175-185)所述进行；简单来说，将模拟器内容物离心并且将上清液用于SCFA和BCFA分析。将新戊酸(内标)和水与上清液混合并离心。离心后，向上清液中添加草酸溶液，并且然后将混合物在4℃下温育，并且然后再次离心。通过使用火焰离子化检测器和氦气作为载气的气相色谱来分析所得的上清液。还提供由ULTRATM(聚右旋糖，Danisco)、P95(低聚果糖；果糖低聚糖，“FOS”，Beneo)、乳糖醇(LactitolMC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和阴性对照的样品产生的比较数据。测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度(表64)。
表64：模拟代谢和脂肪酸产生的测量。
实施例44
在不同温度下制备葡糖基转移酶(GTF)的提取物用于纤维制备
使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的表达系统在大肠杆菌菌株DH10B中表达用于实施例1和实施例2的唾液链球菌gtfJ酶(SEQ ID NO:5)。简单地讲，将大肠杆菌DH10B细胞由优化用于在大肠杆菌中表达gtfJ酶的DNA序列(SEQ ID NO:4)密码子转化为表达SEQ ID NO：5。该DNA序列包括在表达载体(DNA 2.0,MenloPark CA)中。将转化的细胞接种于初始光密度(OD，在600nm处)为0.025的LB培养基(10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中，并使其在37℃下于培养箱中生长，同时在250rpm下进行振荡。当其达到0.8-1.0的OD600时，添加1mM IPTG来诱导培养物。将诱导的培养物置于摇动器上并在诱导3小时后收获。
为收获gtfJ酶(SEQ ID NO:5)，在离心机中离心细胞(25℃，16,000rpm)，重新悬浮于5.0mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中并且在冰上冷却至4℃。采用0.1mm二氧化硅小珠使用珠粒打浆机使细胞破碎，然后在4℃和16,000rpm下离心以使未破碎细胞和细胞碎片沉淀。将粗提取物(包含可溶性gtfJ酶，SEQ ID NO：5)与沉淀分离，并通过Bradford蛋白质测定法分析来测定蛋白质浓度(mg/mL)。
如下制备用于实施例45的附加gtf酶。用包含特定gtf-编码DNA序列的基于的构建体使大肠杆菌细胞(Invitrogen,CarlsbadCalifornia)转化。每条序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达gtf酶。将表达特定gtf酶的单独的大肠杆菌菌株在振荡情况下，在37℃下在具有氨苄青霉素(100mg/mL)的LB培养基中培养至OD600＝0.4-0.5，此时添加IPTG至终浓度为0.5mM。IPTG诱导后，在37℃下培养培养物2-4小时。通过以5,000×g离心15分钟收获细胞，并将细胞(以20％重量体积比)重悬于补充有DTT(1.0mM)的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLMInstruments,Rochester,NY)以确保>95％的细胞裂解。在4℃下以12,000xg对裂解细胞离心30分钟。通过BCA蛋白质测定和SDS-PAGE分析所得的上清液，以确认表达gtf酶，并将上清液保存在-20℃下。
反应特征分析
从反应混合物中周期性取样并使用配备有折射率检测器的Agilent 1260C HPLC进行分析。在0.6mL/min的流速和85℃下，将使用去离子水的Aminex HP-87C柱(BioRad)用于监测蔗糖和葡萄糖。在0.6mL/min的流速和85℃下，将使用去离子水的Aminex HP-42A柱(BioRad)用于由DP2-DP7(先前使用麦芽低聚糖计算)定量低聚糖。
实施例45
在各种温度下使用GTF-J的低聚糖制备
期望量的蔗糖，在某些情况下，葡萄糖，和20mM磷酸二氢钾使用去离子水溶解并在1L无挡板的带夹套烧瓶中稀释成750mL，所述烧瓶连接至Lauda RK20循环冷却器。然后添加FERMASURETM(DuPont，Wilmington，DE)(0.5mL/L反应)，并利用5重量％氢氧化钠水溶液或5重量％硫酸水溶液将pH调节至5.5。通过添加0.3体积％的包含GTF-J(SEQ ID NO：5)的粗酶提取物引发反应，如实施例44中所述。使用4-叶PTFE置顶机械混合器以100rpm向反应混合物提供搅拌。在通过完全消耗蔗糖或后续测量之间蔗糖浓度无变化来确定反应完成后，过滤反应浆液以去除不溶性聚合物。可溶性低聚糖的收率根据实施例44中的方法通过HPLC测定，并且在表65中呈现。
表65：在各种操作条件下，使用gtf-J的低聚糖收率。
这些结果展示当反应在高于42℃下运行时，增加可溶性低聚糖的收率，低聚糖的收率可通过添加受体分子，诸如葡萄糖来进一步增加，并且在添加受体分子时，形成的明串珠菌二糖量减少。
实施例46
使用其它GTF酶的低聚糖制备
使用去离子水溶解期望量的蔗糖和20mM磷酸二氢钾，并且转移到配备有聚丙烯盖的玻璃瓶中。然后添加FermaSureTM(DuPont，Wilmington，DE)(0.5mL/L反应物)，并利用5重量％氢氧化钠水溶液或5重量％硫酸水溶液将pH调节至5.5。反应通过添加如实施例44中制备的酶粗提取物来引发。测试来自下列的另外的截短GTF：远缘链球菌(Streptococcussobrinus)(GTF0874；SEQ ID NO：16)、汗毛链球菌(Streptococcus downei)(GTF1724；SEQID NO：81)、和Streptococcus dentirousetti(GTF5926；SEQ ID NO：84)。使用PTFE搅拌棒或Inova 42培养箱摇动器向反应混合物提供搅拌，并且使用块加热器或培养箱摇动器加热反应。在通过完全消耗蔗糖或后续测量之间蔗糖浓度无变化来确定反应完成后，过滤反应浆液以去除不溶性聚合物。可溶性低聚糖的收率根据实施例44中的方法通过HPLC测定，并且在表66中呈现。
表66：在各种操作条件下使用gtf酶的低聚物收率比较。
这些结果展示实施例44中所述的行为对于其它gtf酶而言是普遍的。
实施例47
制备包含可溶性α-葡聚糖纤维的纤维组合物
该实施例描述了制备包含本文所公开的可溶性α-葡聚糖纤维的组合物。
根据上文所公开的方法制备两种可溶性α-葡聚糖纤维组合物。根据前述给定的过程通过HPLC测定低聚糖的Brix和浓度。结果在表67中示出。如下所述，组合物用于制备纤维水、可勺性酸乳、和干棒小吃。
表67：可溶性α-葡聚糖纤维组合物的特性。
实施例48
纤维水制剂的制备
以下实施例描述了使用实施例47中制备的纤维组合物制备纤维水制剂。
表68：纤维水制剂的组成
使用实施例47的纤维组合物制备两种纤维水制剂。将去离子水添加到合适的混合容器中。将可溶性α-葡聚糖纤维、蔗糖、柠檬酸、抗坏血酸和盐添加到混合容器中并且将所得的混合物共混5分钟。按表68详述的量添加混合物的组分。在共混步骤之后，在搅动下，将红色食品着色剂、樱桃风味剂、覆盆子风味剂和蔓越莓风味剂添加到水混合物中。在完成该添加之后，在106.7℃下，在3000磅每平方英寸(psig)(20.7MPa)下，使混合物经受超高温(UHT)巴氏灭菌并持续7秒，并且使用间接蒸汽(IDS)单元在2500/500psig(17.24/3.45MPa)下将混合物均化。将混合物添加到瓶中，并且将瓶在冰浴中冷却，然后储存在冷藏机中。
实施例49
可勺性酸乳制剂的制备
以下实施例描述了使用实施例47中制备的纤维组合物制备两种可勺性酸乳。
表69：可勺性酸乳的组分
使用表69中详述的成分制备两种可勺性酸乳。将食品淀粉、明胶(250B)和脱脂乳固体共混。然后将该固体共混物加添加到全脂乳和脱脂乳的混合物中。将可溶性α-葡聚糖纤维也添加到牛奶中并且搅动混合物。将该混合物通过槽中巴氏灭菌在87.2℃下巴氏灭菌30分钟。然后在17.24MPa(第一阶段)和3.45MPa(第二阶段)下，使经巴氏灭菌的混合物在两阶段均化器中均化。然后将混合物冷却至43.3℃，并利用酸乳培养物接种。将接种的培养物温育至pH为4.6。温育之后，在酸乳压机中将混合物冷却至4.4℃。冷却之后，将酸乳包装并储存在冷藏机中。
实施例50
制备干棒小吃
以下实施例描述了使用实施例47中制备的纤维组合物制备干棒小吃。
表70：干棒小吃的组分
由表70中详述的组分制备干棒小吃。将玉米糖浆和可溶性α-葡聚糖纤维1添加到合适的混合容器中并温热至37.8℃。在独立的容器中，加热椰子油以使油融化。将液体椰子油添加到玉米糖浆/纤维混合物中并搅动一分钟。将大豆蛋白块、燕麦片、香草奶油、迷你烘焙片、阿拉伯胶和可可粉添加到混合物中并搅动30秒。搅动之后，将固体从混合容器的侧面刮去，并且持续搅动直至形成生面团。将生面团形成为棒，并且用牛奶巧克力涂料化合物涂覆所述棒。
实施例51
制备酸乳–可饮用沙冰
以下实施例描述了使用本发明的纤维制备酸乳–可饮用沙冰的方法。
表71：
成分 重量％
蒸馏水 49.00
Supro XT40大豆蛋白分离物 6.50
果糖 1.00
Grindsted ASD525，Danisco 0.30
苹果汁浓缩物(70Brix) 14.79
草莓果泥，单一强度 4.00
香蕉果泥，单一强度 6.00
简单的低脂酸乳-希腊风格，Cabot 9.00
1％Red40Soln 0.17
草莓风味剂(DD-148-459-6) 0.65
香蕉风味剂(#29513) 0.20
75/25苹果酸/柠檬酸共混物 0.40
本发明可溶性纤维样品 8.00
总计 100.00
实施例52
高纤维片的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备高纤维片。
表72：
1-Danisco.
实施例53
软巧克力碎片曲奇的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备软巧克力碎片曲奇。
表73：
实施例54
减脂油酥松饼(REDUCED FAT SHORT-CRUST PASTRY)的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备减脂油酥松饼。
表74：
成分 重量％
面粉，清蛋白液 56.6
水 15.1
人造黄油 11.0
酥油 11.0
本发明纤维 6.0
盐 0.3
实施例55
低糖谷物簇(low sugar cereal cluster)的制备
以下实施例描述了利用本发明纤维中的一种制备低糖谷物簇。
表75：
成分 重量％
糖浆粘结剂 30.0
乳糖醇，MC50％
本发明纤维溶液(70Brix)25％
水25％
谷物混合物 60.0
燕麦片70％
片状燕麦10％
酥脆米10％
燕麦片10％
植物油 10.0
实施例56
果胶冻的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备果胶冻。
表76：
实施例57
橡皮糖(CHEWY CANDY)的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备橡皮糖。
表77：
实施例58
咖啡-樱桃冰淇淋的制备
以下实施例描述了利用本发明的纤维制备咖啡-樱桃冰淇淋。
表78：
1-Danisco.

Claims (15)

1.一种可溶性α-葡聚糖纤维组合物，其包含：
a.至少75％的α-(1，3)糖苷键；
b.少于25％的α-(1，6)糖苷键；
c.少于10％的α-(1，3，6)糖苷键；
d.小于5000道尔顿的重均分子量；
e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；
f.在4至40范围内的右旋糖当量(DE)；以及
g.小于12％的可消化性，如由分析化学师协会(Association of AnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所测量的；
h.在25℃下，在水中至少20％(w/w)的溶解度；以及
i.小于5的多分散指数。
2.一种碳水化合物组合物，其包含：0.01重量％至99重量％(基于干固体)的根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
3.一种食物产品，其包含根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物或根据权利要求2所述的碳水化合物组合物。
4.一种制备可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，所述α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1，3)糖苷键或者一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并，由此制备包含可溶性α-葡聚糖纤维组合物的产物；以及
c.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物与步骤(b)的所述产物分离。
5.一种制备根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有至少75％的α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；
iii.至少一种α-葡聚糖水解酶，所述α-葡聚糖水解酶能够水解具有一个或多个α-(1，3)糖苷键或者一个或多个α-(1，6)糖苷键的葡聚糖聚合物；以及
iv.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并包括将食物产品内的反应组分的系列合并。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述至少一种葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：153具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述至少一种α-葡聚糖水解酶为突变酶，并且所述至少一种葡糖基水解酶和至少一种突变酶包含氨基酸序列以及它们的截短形式，所述氨基酸序列与选自以下序列的组合的序列具有至少90％的同一性：
a.葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO：3、5或它们的组合)和突变酶MUT3325(SEQ IDNO：27)；
b.葡糖基转移酶GTF7527(SEQ ID NO：3、5或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQ IDNO：21、22、24或它们的任意组合)；
c.葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO：17、19或它们的组合)或它们的同系物(SEQ IDNO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112或它们的组合)和突变酶MUT3325(SEQ ID NO：27)；以及
d.葡糖基转移酶GTF0459(SEQ ID NO：17、19或它们的组合)或它们的同系物(SEQ IDNO：88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112或它们的组合)和突变酶MUT3264(SEQ ID NO：21、22、24或它们的任意组合)。
9.一种制备根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物的方法，所述方法包括：
a.提供反应组分的系列，其包括：
i.蔗糖；
ii至少一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶能够催化具有一个或多个α-(1，3)糖苷键的葡聚糖聚合物的合成；以及
iii.任选地一种或多种受体；
b.在适当的含水反应条件下将所述反应组分的系列合并以形成单一反应混合物，其中所述反应条件包括大于45℃并且小于55℃的反应温度，由此形成包含葡萄糖低聚物的产物混合物；
c.将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与包含葡萄糖低聚物的产物混合物分离；以及
d.任选地，将所述可溶性α-葡聚糖纤维组合物浓缩。
10.一种用于制备共混碳水化合物组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物与下列物质合并：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、二氢查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支链麦芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、低聚异麦芽糖、填料、赋形剂、粘结剂或它们的任意组合。
11.一种减小食品或饮料的血糖指数的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物掺入食品或饮料中。
12.一种在哺乳动物中抑制血糖水平升高、降低脂质水平、治疗便秘、或改变脂肪酸产生的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物施用于哺乳动物的步骤。
13.一种化妆品组合物、药物组合物或低生龋性组合物，其包含根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物。
14.根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物在适用于被动物、包括人类食用的食品组合物中的用途。
15.一种组合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固体)的根据权利要求1所述的可溶性α-葡聚糖纤维组合物以及：合生素、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草药、草药提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾类、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、益生菌生物或它们的任意组合。
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