CN104726523B - 一种酶法制备莱鲍迪苷m的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，该方法利用番茄UDP‑糖基转移酶和土豆蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料生产莱鲍迪苷M。本发明的方法首先利用基因工程技术获得UDP‑葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶的高产重组菌株，然后收集生物酶粗品直接进行催化反应，反应体系中不添加UDP或UDP‑葡萄糖，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，通过蔗糖合酶催化UDP‑葡萄糖高效循环，通过番茄UDP‑葡萄糖基转移酶的作用，催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M。与已有的莱鲍迪苷M制备方法相比，工艺步骤短，成本低，具有重要的应用价值和良好的经济性。

Description

一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法

技术领域

本发明利用番茄UDP-糖基转移酶和马铃薯蔗糖合成酶，高效催化莱鲍迪苷A制备莱鲍迪苷M，属于生物催化转化技术领域。

背景技术

甜菊糖（Steviol glycosides）是从菊科草本植物甜叶菊（Stevia rebaudiana）叶中提取的天然甜味剂。它是30多种糖苷的混和物，不同糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊叶中三种最主要的糖苷成分在叶片中的含量通常为：甜菊苷（Stevioside）占叶片干重9.1%，莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,Reb A)占3.8%，莱鲍迪苷C（Rebaudioside C，Reb C)占0.6%。甜菊糖具有高甜度、低热量、高稳定性，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效，和利尿，免疫调节等效果，将其作为甜味剂应用于食品和饮料中的相关研究与经济性受到广泛关注。食品添加剂联合专家委员会（JECFA）对甜菊糖的使用已有相关申明。在美国和欧盟高纯度的甜菊糖产品已被正式批准作为食品添加剂。

近年来，包括以上三种糖苷组分在内，研发人员已从甜叶菊中分离得到11 种糖苷。莱鲍迪苷M ( Rebaudioside M，Reb M)是一种新发现的糖苷，与其它糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的400倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草异味低，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。2013年，美国FDA批准使用从甜叶菊叶子中提取的含有50%含量Reb M的甜菊糖产品，并承认它的一般安全性（GRAS）。2014年，美国FDA通过从甜叶菊叶子中提取的含有95%含量Reb M的GRAS认可，批准在除婴幼儿食品以外的饮料和食品中使用。2015年，澳大利亚新西兰食品标准局批准Reb M作为甜味剂用于食品。

甜叶菊叶子中Reb M的含量极少（少于1%），且只在甜菊Morita植株中被检测到。采用提取法生产Reb M需要大量的甜叶菊原料，另外富集Reb M的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。另外目前生物酶法合成Reb M的方法需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化Reb A生成Reb M，致使酶催化Reb A合成Reb M的经济性较差、缺乏市场竞争力。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，该方法使用能够过表达UDP-糖基转移酶和/或蔗糖合酶的工程菌，催化Reb A转化制备Reb M苷，利用生物酶催化莱鲍迪苷A制备莱鲍迪苷M。该方法合成鲍迪苷M的转化率高，经济可靠，适于鲍迪苷M的生产。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，包括以下步骤：

1）构建工程菌：克隆UDP-糖基转移酶基因与蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达或分别表达的载体，并转移到大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或谷氨酸棒杆菌等宿主菌中，获得过表达UDP-糖基转移酶和/或蔗糖合酶的工程菌；

2）制备莱鲍迪苷M（简称Reb M）：将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声或高压破碎，获得UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；以莱鲍迪苷A（简称Reb A）和蔗糖为原料，由制得的粗酶液中的UDP-糖基转移酶催化莱鲍迪苷A进行转化反应制备得到莱鲍迪苷M；该过程生成的UDP再由蔗糖合成酶催化生成UDP-葡萄糖。

进一步改进，所述工程菌是导入UDP-糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因的大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌等，用于催化Reb A制备Reb M。

另一种改进，所述底物莱鲍迪苷A的初始反应浓度为2-50 g/L，蔗糖与莱鲍迪苷A的质量比为1-10，由共表达上述两个酶的工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为2-20 mg/mL。

另一种改进，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH 6-8的缓冲溶液中进行生物转化。

另一种改进，所述转化反应的反应温度为20-50℃，反应时间为1-24 h。

本发明的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，具有以下有益效果：

（1）利用基因工程技术获得UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶的高产重组菌株，得到适合产业化的廉价易得的高活性生物酶，以酶法合成获得大量莱鲍迪苷M。

（2）与其他酶法合成莱鲍迪苷M的方法相比，本项目不需添加昂贵的UDP-葡萄糖，以廉价易得的莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，通过蔗糖合酶催化蔗糖合成UDP-葡萄糖，通过番茄UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M，反应转化率高（90%），进一步降低了生产成本。

（3）与其他酶法催化合成莱鲍迪苷M相比，利用基因工程技术获得的高活性UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶，不需通过复杂的蛋白纯化步骤分离出纯品，只需收集生物酶粗品，即可直接进行催化反应，进一步缩短了工艺步骤，降低生产成本。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例中所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷M分别简称为Reb A和Reb M，结构式分别参见I和II。

I II

实施例1：表达双酶基因的大肠杆菌工程菌的构建

将UDP-糖基转移酶基因（序列1）两端加上NdeI 和Xho I 酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pETDuet-1 相应的酶切位点中，置于T7 启动子的控制之下，构建表达 UGT76C4的重组质粒pEUGT。

采用南京金斯瑞生物科技有限公司的CloneEZ® 试剂盒，在Xho I酶切位点处，将蔗糖合成酶基因（序列3）序列克隆到pEUGT，构建表达质粒pEUGT-SUS。将pEUGT-SUS 转化到E. coli Rosetta (DE3)中，即得共表达双酶的工程菌E. coli Rosseta(pEUGT-SUS)。

实施例2：大肠杆菌工程菌发酵产酶

挑取工程菌E. coli Rosseta(pEUGT-SUS)至含50 µg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。然后按2%接种量接种到含相应抗生素的新鲜诱导培养基（15 g/L 蛋白胨, 25 g/L 酵母膏, 10 g/L NaCl, 2 g/L 葡萄糖and 3 g/L 乳糖）中，诱导表达12 h后，菌液于8000 rpm，4℃离心10 min，弃上清，沉淀备用。

实施例3：表达双酶的大肠杆菌粗酶液的制备

取实施例2中的菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液（100 mmol/L，pH 7.2）洗涤两次，洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞（功率300W，超声5 s，间歇5 s，共5 min），破碎后的液体于8000 rpm，4℃离心15 min，取上清即为粗酶液。

实施例4： 50 g/L Reb A为底物酶法合成Reb M

在反应体系中依次加入1.0g Reb A，4.0g蔗糖，适量粗酶液（12 mg/ml 总蛋白量）及0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）至终体积20ml，混合均匀后置于40 ℃水浴，200rpm 搅拌反应24h。反应结束后，取500μl 反应液，置于95℃水浴15min，再12,000rpm 离心1min 取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测。Reb A转化率为83.2%。

HPLC法色谱分析条件如下，以下实施例中产物的检测方法相同：

色谱柱：Lichrospher NH₂柱(250 mm×4.6 mm, 5 µm)；流动相为乙腈：水（80 :20；V : V）；流速：1 mL•min-1；柱温：40℃；检测波长：210 nm。

实施例5： 30 g/L Reb A为底物酶法合成Reb M

在反应体系中依次加入0.6g Reb A，2.0g蔗糖，适量粗酶液（9mg/ml 总蛋白量）及0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）至终体积20ml，混合均匀后置于30℃水浴，200rpm 搅拌反应24h。反应结束后，取500μl 反应液，置于95℃水浴15min，再12,000rpm离心1min 取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测。Reb A 转化率为90%。

实施例6： 10 g/L Reb A为底物酶法合成Reb M

在反应体系中依次加入0.2gReb A，1.6g蔗糖，适量粗酶液（6mg/ml 总蛋白量）及0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）至终体积20ml，混合均匀后置于30℃水浴，200rpm 搅拌反应16 h。反应结束后，取500μl 反应液，置于95℃水浴15min，再12,000rpm 离心1min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测。Reb A转化率为96.1%。

<110> 南京工业大学

<120> 一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 番茄

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atggaagcca agaaaaataa aatgagtata cttatgttac catggctagc tcatggtcac 60

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<210> 2

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<212> PRT

<213> 番茄

<400> 2

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<210> 3

<211> 2418

<212> DNA

<213> 马铃薯

<400> 3

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<212> PRT

<213> 马铃薯

<400> 4

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Claims (3)

1.一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）构建工程菌：克隆UDP－糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达载体，并转移到大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或谷氨酸棒杆菌中，获得过表达UDP－糖基转移酶基因和蔗糖合酶的工程菌；其中，所述UDP－糖基转移酶基因来自番茄，基因序列如SEQ.NO.1所示，所述蔗糖合成酶基因来自马铃薯，基因序列如SEQ.NO.3所示；

2）制备莱鲍迪苷M：将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声或高压破碎，获得UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，由制得的粗酶液中的UDP-糖基转移酶催化莱鲍迪苷A进行转化反应制备得到莱鲍迪苷M；该过程生成的UDP再由蔗糖合成酶催化生成UDP-葡萄糖；

所述底物莱鲍迪苷A的初始反应浓度为2-50 g/L，蔗糖与莱鲍迪苷A的质量比为1-10，由共表达上述两个酶的工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为2-20 mg/mL。

2.根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH 6-8的缓冲溶液中进行生物转化。

3.根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述转化反应的反应温度为20-50℃，反应时间为1-24 h。