CN109234341A - 全细胞催化合成甜味剂组合物的方法 - Google Patents

全细胞催化合成甜味剂组合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，属于食品添加剂技术领域。本发明解决的技术问题是提供生产成本低的甜味剂组合物的生产方法。该方法采用全细胞催化合成，以莱鲍迪苷A为底物，以重组微生物为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，得到甜味剂组合物。本发明采用全细胞催化转化，方法简单，控制转化条件可以得到特定配比的莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的组合物，无需提纯后再复配，可以降低生产成本。采用本发明方法，可以得到一种与蔗糖口感相似的甜味剂组合物，不引入任何人工合成成分，纯天然，无能量，水溶性也较好。

Description

全细胞催化合成甜味剂组合物的方法
技术领域
本发明涉及全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，属于食品添加剂技术领域。
背景技术
甜味剂是指能赋予软饮料甜味的物质。目前，人们使用最多的天然甜味剂为蔗糖，蔗糖能够为人们提供甜味，其口感也被人们普遍接受，但是，蔗糖中的热量较高，糖尿病患者以及肥胖人群均需要在饮食中进行严格控制，因此，需要无热量或者低热量的代替蔗糖的甜味剂。
甜菊糖(steviol glycosides)是从甜叶菊(Stevia rehaudiana)叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，具有高甜度(为蔗糖的250～300倍)、低热量(为蔗糖的1/300)，无毒副作用，无致癌物质，食用安全等优点，受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视，成为继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种具有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。
甜菊糖苷类化合物组分众多，均具有四环二萜母核并且有不同程度的糖基化修饰及不同程度的甜味口感，目前，被识别的甜菊糖苷化合物主要有甜菊苷(Stevioside.ST)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷C(RC)、莱鲍迪苷D(RD)、莱鲍迪苷M(RM)等，其中，仅甜菊苷和莱鲍迪苷A被商业化应用，广泛用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。
虽然甜菊苷和莱鲍迪苷A具有低热量、高甜度，但是还存在除甜味之外的苦后味，其口感风味无法与蔗糖相当。而莱鲍迪苷D虽然与蔗糖口味相似，但是其溶解性不好。且目前，虽然有一些甜味剂组合物，但其制备方法均是采用较纯的原料复配得到，该方法对原料的纯度要求高，需要将原料提纯后再进行复配，成本较高。
因此，需要开发一种新型的、生产成本低的、口感好的甜味剂组合物，使其能够达到与蔗糖相似的口感风味，被广大消费者所接受。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种生产成本低的全细胞催化合成甜味剂组合物的方法。
本发明全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，以莱鲍迪苷A为底物，以重组微生物为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，得到甜味剂组合物，其中，重组微生物的菌体浓度OD600为80～120，莱鲍迪苷A浓度为1～80g/L；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/L，氯化锌浓度为0.5～2mmol/L，蔗糖浓度为30～50％(W/V)，pH值为7.5～8.5，所述重组微生物含有EUGT11编码基因和UGT76G1编码基因。
优选的，反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。
作为优选方案，重组微生物菌体浓度OD600为100，莱鲍迪苷A浓度为5g/L；柠檬酸三钠浓度为60mmol/L，氯化锌浓度为1mmol/L，蔗糖浓度为40％(W/V)，pH值为8.0。
作为优选方案，反应温度为37℃，反应时间为24h。
优选的，所述重组微生物为重组大肠杆菌、重组酵母菌、重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒状杆菌或重组链霉菌。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明采用全细胞催化转化，方法简单，控制转化条件可以得到特定配比的莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的组合物，无需提纯后再复配，可以降低生产成本。
2)采用本发明方法，可以得到一种与蔗糖口感相似的甜味剂组合物，不引入任何人工合成成分，纯天然，无能量，水溶性也较好。
具体实施方式
本发明全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，采用全细胞催化合成，以莱鲍迪苷A为底物，以重组微生物为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，得到甜味剂组合物，其中，重组微生物菌体浓度OD600为80～120，莱鲍迪苷A浓度为1～80g/L；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/L，氯化锌浓度为0.5～2mmol/L，蔗糖浓度为30～50％(W/V)，pH值为7.5～8.5，所述重组微生物含有EUGT11编码基因和UGT76G1编码基因。通过该方法，能够将RA转化成RD和RM的混合物。
优选的，反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。
作为优选方案，重组微生物的菌体浓度OD600为100，莱鲍迪苷A浓度为5g/L；柠檬酸三钠浓度为60mmol/L，氯化锌浓度为1mmol/L，蔗糖浓度为40％(W/V，即质量体积比)，pH值为8.0，反应温度为37℃，反应时间为24h。通过该方法，能够将RA转化成RD和RM的混合物，经HPLC进样检测，产物中莱鲍迪苷D:莱鲍迪苷M的重量比为3:1。
采用本发明方法，能够成功将RA转化成RD和RM的混合物，其方法简单，得到的产物不仅水溶性高，还具有与蔗糖相似的口感。
本发明方法中，重组微生物含有的EUGT11编码基因为现有的，在GenBank数据库中可以查到(Accession No.AK121682.1)。UGT76G1为UDP-glycosyltransferase 76G1，其氨基酸序列号为AAR06912.1，UGT76G1编码基因如序列1所示。
该重组微生物可以采用现有的基因工程方法得到，比如，将水稻EUGT11编码基因、甜菊UGT76G1编码基因与载体连接构建重组质粒，然后转化到微生物中，得到重组微生物。
为了提高RA的转化率，优选的，所述重组微生物为重组大肠杆菌、重组酵母菌、重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒状杆菌或重组链霉菌。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
1、重组微生物的制备：
提取水稻(Oryzasativa)叶总RNA并通过反转录获得水稻cDNA。根据GeneBank数据库中的EUGT11基因序列(AccessionNo.AK121682)，设计PCR扩增引物，上下游引物分别引入BamH I、Hind III位点，PCR扩增得到EUGT11编码基因。
提取甜叶菊总RNA并通过反转录获得水稻cDNA。根据GeneBank数据库中的EUGT11基因序列(AccessionNo.AK121682)，设计PCR扩增引物，上下游引物分别引入Nde I、XhoIII位点，PCR扩增得到UGT76G1编码基因。
将EUGT11片段与表达载体pETDuet分别用BamH I和Hind III双酶切，回收目的片段后以连接酶进行连接，得到pETDuet-EUGT11。
将UGT76G1片段与pETDuet-EUGT11分别用Nde I和Xho III双酶切，回收目的片段后以连接酶进行连接，得到pETDuet-EUGT11-UGT76G1。
将重组质粒pETDuet-EUGT11-UGT76G1转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，通过氨苄霉素抗性筛选，获得重组微生物。
2、菌体培养及蛋白表达：
挑重组微生物接种于2mL含Amp(氨苄霉素，100μg/mL)的LB培养基中(20mL小试管)，37℃培养4h，然后1％接种于100mLM9培养基中(500mL三角瓶)，37℃，250r/m条件培养2h(OD600～0.6)，用自来水浸泡，冷却10min，加IPTG(工作浓度100mM)，置于22℃，180r/m条件下诱导表达20h，收菌，冰浴。
M9培养基组分如表1：
表1
M9培养基组分 1L用量 备注
5×M9盐 200mL 可合并灭菌(121℃20min)
甘油 4mL
0.1M MgSO<sub>4</sub>(0.6g定容50mL) 20mL 单独灭菌(121℃20min)
0.02M CACl<sub>2</sub>(0.11g定容50mL) 5mL 单独灭菌(121℃20min)
5×M9盐组分为：Na2HPO4·12H2O 8.55g/100mL，KH2PO4 1.5g/100mL，NaCl 0.25g/100mL，NH4Cl 0.5g/100mL。
3、静息细胞转化
测定菌液的OD600，然后离心(4℃，3000g，离心10min)弃上清收集菌体，用静息细胞转化反应缓冲液(即磷酸钠缓冲液pH8.0，附加底物、蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠等)重悬菌体至OD600＝100。37℃培养箱静置24h，然后12000r/m室温离心10min，取上清过0.22μm滤膜，得到产物。其中，底物莱鲍迪苷A浓度为5g/L，蔗糖浓度为40％(w/v)，氯化锌浓度为1mM，柠檬酸三钠浓度为60mM。
HPLC进样检测，测试产物中的RD和RM的量，发现RD和RM的重量比为3:1。
实施例2～4
采用实施例1的方法，仅改变转化时的部分参数，得到产物，其中，改变的参数如表2所示。
表2
反应参数 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
OD600 100 80 120 110
莱鲍迪苷A浓度(g/L) 5 1 3 10
柠檬酸三钠浓度(mmol/L) 60 50 70 80
氯化锌浓度(mmol/L) 1 0.5 1.5 2
蔗糖浓度(％，w/v) 40 30 40 50
pH值 8.0 8.5 7.5 8.0
反应温度(℃) 37 35 38 40
反应时间(h) 24 20 28 30
测定实施例2～4制备的产物中的RD和RM的量，记录RD和RM的重量比，结果见表3。
表3
实施例编号 RD和RM的重量比
实施例1 3:1
实施例2 1.5:1
实施例3 4:1
实施例4 9:1
试验例1感官分析
参照采用BS ISO 4120感官分析方法学(三角试验)和GB 12311感官分析方法(三点检验)对甜味剂组合物进行测试评价分析，具体分析方法如下：
方法原理：同时向评价员提供一组三个样品，其中二个是完全相同的，评价员挑出单个的样品。
设备：检验负责人根据产品性质和样品数量等选择设备。使用的设备不应影响检验结果。优先使用符合检验需要的标准化设备。
抽样：按被检产品的抽样标准进行抽样。如果没有这样的标准或抽样标准不完全适用时，则由有关各方协商议定抽样方法。
环境：满足GB 10220所需条件。
评价员条件：应符合GB 10220规定的条件，所有评价员应该具有同等的资格和检验能力。
评价员数量：评价员数是根据检验目的与显著水平而定。通常是6个以上专家；或15个以上优选评价员；或25个以上初级评价员。在0.1％显著水平上需7个以上专家。
检验负责人：检验负责人一般不应参加检验，如果参加，也不应知道样品编号。检验负责人可就有关问题和样品性质进行不影响评价的初步介绍，当涉及检验玷染物时，应准备一个非玷染物样品和一个与之对照的玷染物样品。
被检样品的制备：提供足够量的样品A和B，每三个检验样品为一组。
按下述六种组合：ABB、AAB、ABA、BAA、BBA、BAB，从实验室样品中制备数目相等的样品组。
检验要求：不能使评价员从样品提供的方式中对样品的性质作出结论。应以同一方式〔相同设备、相同容器、相同数量产品和相同排列形式(三角形，直线等)〕制备各种检验样品组。任一样品组中，检验样品的温度是相同的，如可能，提供的检验系列中所有其他样品组的温度也应相同。盛装检验样品的容器应编号，一般是随机选取三位数。每次检验，编号应不同。
检验技术：告诉评价员检验目的，其程度应不使他们的结论产生偏倚。将制备的几组样品随机分配给评价员。评价员按规定次序检查各组检验样品，次序在同一系列检验中应相同。在评价同一组三个被检样品时，评价员对每种被检样品应有重复检验的机会。检验负责人在必要时可以告诉评价员提供的样品数量和体积。当评价员的数目不足6的倍数时，可采取下述两种方式。
a.舍弃多余样品组；
b.为每个评价员提供6组样品做重复检验。
当评价员不能鉴别其差异时，允许回答“无差异”。
结果的表达：
统计“有差异”或“无差异”答案数，当评价员人数n值大于100时，在不同显著水平上确定三点试验显著性差别所需答案的最少数目X按以下公式计算，取最接近的整数值。其中α是显著性水平，为一个预期值。
式中Z的值根据显著性水平α而变化：
α≤0.05 Z＝1.64
α≤0.01 Z＝2.33
α≤0.001 Z＝3.10
在统计假设检验中，公认的小概率事件的概率值被称为统计假设检验的显著性水平，记为α。α的取值越小，此假设检验的显著性水平越高。比如α设为0.05，这意味着抽样分布中的95％的样本算作常态样本，两端5％的样本算作极端样本。一个样本要是落入95％的常态样本中，那么它就被看做来自这一总体，或者说它和总体中的其他样本的差异仅仅是抽样造成的偶然误差，没有统计上显著的差异。一个样本要落入5％的极端样本中，就可以拒绝它来自这一总体的论断，而认为它来自其它的总体，或者说它和这一总体的其它样本的差异不是抽样误差，具有统计上显著的差异。
在本实施例中，
“0.1％显著水平(α≤0.001)为有差异”对应“不相似”
“5％显著水平(α≤0.05)为无差异”对应“相似”
“1％显著水平(α≤0.01)为无差异”对应“非常相似”
“0.1％显著水平(α≤0.001)为无差异”对应“无差异”
“无差异”答案占有较大的比例时，说明两个样品的差异低于评价员觉察阈。
将以上评价分析方法应用于分析实施例1～4的产物，对比样品为蔗糖，将样品和对比样品分别配成甜度相同的水溶液后按以上感官分析方法要求进行实验，有效评价人员：135个初级评价员，允许回答“无差异”。其口感比较试验结果见表4。
表4
表4中，DM 1:1混合物、DM 1:4混合物均采用RD(&gt;95％)和RM(&gt;95％)混合得到。通过表4的数据表明：本发明的生产方法得到的产物，其口感与蔗糖相似。

Claims (5)

1.全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，其特征在于：以莱鲍迪苷A为底物，以重组微生物为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，得到甜味剂组合物，其中，重组微生物的菌体浓度OD600为80～120，莱鲍迪苷A浓度为1～80g/L；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/L，氯化锌浓度为0.5～2mmol/L，蔗糖浓度为30～50％(W/V)，pH值为7.5～8.5，所述重组微生物含有EUGT11编码基因和UGT76G1编码基因。
2.根据权利要求1所述的全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，其特征在于：反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。
3.根据权利要求1所述的全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，其特征在于：重组微生物菌体浓度OD600为100，莱鲍迪苷A浓度为5g/L；柠檬酸三钠浓度为60mmol/L，氯化锌浓度为1mmol/L，蔗糖浓度为40％(W/V)，pH值为8.0。
4.根据权利要求2或3所述的全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，其特征在于：反应温度为37℃，反应时间为24h。
5.根据权利要求1所述的全细胞催化合成甜味剂组合物的方法，其特征在于：所述重组微生物为重组大肠杆菌、重组酵母菌、重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒状杆菌或重组链霉菌。
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