CN113186141B

CN113186141B - 一种一锅法高效合成莱鲍迪苷m的方法

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Publication number: CN113186141B
Application number: CN202110376139.6A
Authority: CN
Inventors: 刘思颖; 潘力; 王斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2023-01-06
Anticipated expiration: 2041-04-08
Also published as: CN113186141A

Abstract

本发明公开一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，属于生物工程技术领域。本发明在不添加UDPG的条件下，利用廉价底物ST在体外先经UGT76G1催化为RA，再经EUGT11催化产生RD，最终被UGT76G1转化为RM，旨在用较简单的生产方法，更廉价的底物，得到高品质的甜味剂RM。当三重启动子启动转录时，限速酶EUGT11酶活是单启动子控制转录时的2.13倍，且在酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39的条件下，该体系将10mM ST转化为3.79±0.31mM莱鲍迪苷M，较之前提升了2.35倍，为低成本高效酶法合成RM提供技术支持。

Description

一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M(RM)的方法。

背景技术

甜叶菊原产于巴拉圭和巴西，其叶片中可提取出一类甜度高且热量低的糖苷类化合物，几个世纪以来，一直被南美洲的人们用作为天然甜味剂，包括甜菊苷(Stevioside，ST)，莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)，莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，RD)和莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，RM)。其中ST和RA含量较为丰富(约占叶片干重的7％和3％)，但与RD和RM相比，它们的甜度不及后者，且随添加量不断增加，苦涩味逐渐显现，故在应用于食品生产时会影响产品风味^[1]。而RD和RM作为高品质甜味剂，甜度为蔗糖的400倍，口感更加纯净，但是含量十分稀少，仅占叶片干重的0.3％^[2]。利用传统物理方法从叶片中提纯莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的产量远远不能满足市场需求，且生产量少，工艺繁琐，成本较高^[3][4]。

甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1可以在糖基供体UDPG存在的条件下，催化两种糖基转移反应：由ST生成RA^[5]，或由RD产生RM^[6]。而水稻来源的糖基转移酶EUGT11则可以利用糖基供体UDPG，以RA为底物催化生成RD^[7]。在以上三个糖基转移反应中，均需要UDPG作为糖基供体，但UDPG价格昂贵，使甜味剂的生产成本大幅增加。而蔗糖合成酶可利用廉价原料UDP，在蔗糖存在的情况下，将葡萄糖基转移至UDP，生成UDPG和果糖(图1b)，且该过程可逆，可以实现UDP-UDPG的循环反应^{[8][9][10][11]}。当糖基转移反应与SUS1介导的UDP-UDPG循环反应偶联，不直接添加昂贵底物UDPG时，各糖基转移反应也能正常进行。

目前多数生产方法仅利用单个酶与蔗糖合成酶偶联产生单一种类的糖苷，且产物大多为RA或RD^[12][13]，在合成莱鲍迪苷M时也常以昂贵原料莱鲍迪苷D作为底物，使得生产成本较高，且产量不高。

参考文献：

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发明内容

为了克服现有技术中用于合成莱鲍迪苷M的方法合成效率较低且底物莱鲍迪苷D价格昂贵的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法。

本发明将廉价底物ST先经UGT76G1催化为RA，再经EUGT11催化产生RD，最终被UGT76G1转化为RM(图1a，b)，将终产物RM产量提升2.35倍，且该方法避免直接用昂贵的RD作为合成RM的底物，为低成本高效酶法合成RM提供技术支持。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种高效表达EUGT11的重组菌，所述重组菌以pET-22b(+)质粒为出发载体，以大肠杆菌作为宿主菌，在多重启动子操控下高效表达EUGT11。

优选的，所述的多重启动子为至少三重启动子；进一步为三重启动子或四重启动子。

优选的，所述的启动子为T7启动子。

优选的，所述的大肠杆菌为E.coli Rosetta(DE3)。

一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：

分别构建异源表达的UGT76G1，SUS1的重组菌，以及构建上述高效表达EUGT11的重组菌，分别经诱导发酵产酶后以细胞粗酶液进行催化反应，无需添加UDPG，利用蔗糖、甜菊苷(ST)和二磷酸尿苷(UDP)，将SUS1介导的UDP-UDPG循环反应与三步糖基转移反应偶联形成级联反应，将三个单级联反应串联，在体外形成通路，建立一锅法多酶级联反应体系，催化甜菊苷高效合成莱鲍迪苷M。

UGT76G1(甜叶菊来源糖基转移酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

EUGT11(水稻来源糖基转移酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

SUS1(拟南芥来源蔗糖合成酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

优选的，诱导发酵中诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG在发酵体系中的浓度为0.5～1mM；进一步为0.5mM。

优选的，一锅法多酶级联反应体系中蛋白质量比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11＝1：(2～4)：(12.3～36.9)；进一步为1：(2～4)：(24.6～36.9)；更进一步为1：4：36.9。

进一步，一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：(1～2)：(2.13～6.39)；进一步为1：(1～2)：(4.26～6.39)；更进一步为1：2：6.39。EUGT11/3copies of T7表示三重启动子操控下表达的EUGT11。

进一步，一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：EUGT11/4copies of T7＝1：(1～2)：(1.81～5.43)；进一步为1：(1～2)：(3.62～5.43)；更进一步为1：2：5.43。EUGT11/4copies of T7表示四重启动子操控下表达的EUGT11。

优选的，一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50mU/mL，换算成蛋白质量用量为0.8mg/mL。

所述的细胞粗酶液为发酵得到的菌体经超声破碎所获得的含酶的粗酶液。

所述的一锅法多酶级联反应体系为：蔗糖和UDP经SUS1催化生成UDPG；UDPG和ST经UGT76G1催化生成莱鲍迪苷A(RA)；UDPG和RA经EUGT11催化生成莱鲍迪苷D(RD)；UDPG和RD经UGT76G1催化生成莱鲍迪苷M(RM)。

所述的一锅法多酶级联反应体系中，蔗糖的起始反应浓度为100～700mM；甜菊苷(ST)的起始反应浓度为1～10mM；二磷酸尿苷(UDP)的起始反应浓度为2～20mM；

进一步，所述的一锅法多酶级联反应体系中，蔗糖的起始反应浓度为700mM；甜菊苷(ST)的起始反应浓度为10mM；二磷酸尿苷(UDP)的起始反应浓度为20mM。

优选的，所述的催化反应的条件为35～40℃，180～220r/min催化反应24～48h；进一步为37℃，220r/min催化反应24～48h。

本发明中，为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活，从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量，将限速酶EUGT11表达质粒的T7启动子核心区域串联，并比较一重，二重，三重和四重启动子启动转录时该酶活性，当三重启动子启动转录时，重组酶EUGT11的酶活最高。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明在不添加UDPG的条件下，利用廉价底物ST经体外多酶级联反应体系转化为RM，旨在用较简单的生产方法，更廉价的底物，得到高品质的甜味剂RM。

(2)当三重启动子启动转录时，限速酶EUGT11酶活是单启动子控制转录时的2.13倍，且在酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39的条件下，该体系将10mM ST转化为3.79±0.31mM莱鲍迪苷M，较之前提升了2.35倍。

附图说明

图1是体外多酶级联反应通路由ST合成RM示意图；其中，a为体外多酶级联反应体系线路图；b为UDP-UDPG循环再生原理图。

图2是各转化子酶活测定体系中UDP/UDPG产量分析示意图；其中，a为UDP，UDPG标品HPLC曲线，UDPG出峰时间为10.46min，UDP出峰时间为11.75min；b为Rosetta-SUS1粗酶液酶活测定的HPLC曲线；c为Rosetta-UGT76G1(ST)粗酶液酶活测定的HPLC曲线；d为Rosetta-UGT76G1(RD)粗酶液酶活测定的HPLC曲线；e为Rosetta-EUGT11粗酶液酶活测定的HPLC曲线。

图3是各体外单级联反应中酶活力配比对底物转化率的影响示意图；其中，a为SUS1：EUGT11；b为SUS1：EUGT11(3copies of T7)；c为SUS1：UGT76G1(ST)；d为SUS1：UGT76G1(RD)；UGT76G1(RD)和UGT76G1(ST)表示UGT76G1分别以RD和以ST为底物进行催化，EUGT11表示单启动子启动转录的EUGT11，EUGT11(3copies of T7)表示三重启动子启动转录的EUGT11。

图4是体外多酶级联反应体系产物分析；其中，a为各甜菊醇糖苷(ST、RA、RD、RM)标品出峰时间，RD出峰时间为3.34min，RM出峰时间为3.93min，RA出峰时间为6.88min，ST出峰时间为7.86min；b为酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39下的体外多酶级联体系反应48h后HPLC结果；c为酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11＝1：2：3下的体外多酶级联体系反应48h后HPLC结果；d为用大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主破碎后的粗酶液代替酶反应中的Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1破碎后的粗酶液进行体外多酶级联体系反应48h后HPLC结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明体外多酶级联反应通路由ST合成RM示意图，如图1所示；其中，a为体外多酶级联反应体系线路图；b为UDP-UDPG循环再生原理图。

实施例1：单重启动子表达载体pET22b-UGT76G1，pET22b-EUGT11及pET-22b-SUS1构建

甜叶菊来源糖基转移酶UGT76G1(基因序列如SEQ ID NO：2所示)，水稻来源糖基转移酶EUGT11(基因序列如SEQ ID NO：4所示)及拟南芥来源蔗糖合成酶SUS1(基因序列如SEQID NO：6所示)的基因序列均由南京金斯瑞公司优化合成，并分别克隆至载体pUC57，得到pUC57-UGT76G1，pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1三个质粒。以质粒pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1为模板，采用引物(UGT76G1-F/R、EUGT11-F/R、SUS1-F/R)分别将目的片段扩增，将大小正确的PCR产物并回收备用。用XhoⅠ和NdeⅠ酶切载体pET-22b(+)并纯化，将纯化后的载体分别和目的基因片段连接。将10μL连接产物分别转化至E.coli Match1T1，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板。挑取阳性转化子扩大培养后提质粒，经XhoⅠ和NdeⅠ酶切验证正确，送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，得到测序正确的质粒pET22b-UGT76G1，pET22b-EUGT11及pET-22b-SUS1，并将对应菌株于甘油中低温保藏。

UGT76G1-F：5′-TTTAAGAAGGAGATATACATATGGAGAATAAGACAGAAACCACCGT-3′；(SEQID NO：7)

UGT76G1-R：5′-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGAGGCTACTAATGTAAGAAACCA-3′；(SEQID NO：8)

EUGT11-F：5′-TTTAAGAAGGAGATATACATATGGACTCCGGTTACAGCTC-3′；(SEQ ID NO：9)

EUGT11-R：5′-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTCTTTGTAGCTCCGCAGTTG-3′；(SEQ IDNO：10)

SUS1-F：5′-TTTAAGAAGGAGATATACATATGGACTCCGGTTACAGCTC-3′；(SEQ ID NO：11)

SUS1-R：5′-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAATCGTCTTGGGCGAGAGGGA-3′。(SEQ ID NO：12)

实施例2：EUGT11多重启动子表达载体构建

以质粒pET22b-EUGT11为模板，引物F/R(F：5′-TGTGAGCGGATAACAATTCCATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG-3′(SEQ ID NO：13)；R：5′-AGTGAGTCGTATTAATTTCGTTCGGCGTGGGTATGGTGGC-3′(SEQ ID NO：14))扩增得到含有和目的基因EUGT11的pET22b载体骨架的大片段，命名为pET22b-scaffold-EUGT11，胶回收备用。将2 copies of T7-F和2 copies of T7-R(表1)两条寡核苷酸链在98℃条件下变性5min，自然降至室温完成退火，形成双重启动子双链片段，命名为2 copies of T7，回收该片段备用。将另外两对寡核苷酸链3 copies ofT7-F和3 copies of T7-R，4 copies of T7-F和4copies of T7-R(表1)也进行如上操作，分别退火形成三重启动子和四重启动子双链片段，分别命名为3 copies of T7和4 copiesof T7。分别将双链片段2 copies of T7，3 copies of T7和4 copies of T7与pET22b-scaffold-EUGT11连接，转化至大肠杆菌E.coli Match1T1。经带有氨苄青霉素的抗性平板初步筛选阳性转化子，将酶切鉴定正确的转化子送至广州天一辉远基因科技有限公司测序。得到含有双重，三重及四重启动子的EUGT11表达质粒，分别命名为pET22b-EUGT11/2copies of T7，pET22b-EUGT11/3 copies of T7，pET22b-EUGT11/4 copies of T7。

表1用于载体构建的寡核苷酸序列(5′-3′)

实施例3：重组大肠杆菌诱导表达

将质粒pET22b-UGT76G1，pET22b-EUGT11，pET22b-SUS1，pET22b-EUGT11/2 copiesof T7，pET22b-EUGT11/3 copies of T7，pET22b-EUGT11/4 copies of T7分别转化至E.coli Rosetta(DE3)，经氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性转化子，分别命名为Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1、Rosetta-EUGT11/2copies of T7、Rosetta-EUGT11/3copies of T7和Rosetta-EUGT11/4copies of T7。将以上重组大肠杆菌分别于液体LB中培养8小时左右，以1％(v/v)接种量转接于100mL新鲜LB液体培养基，待菌体生长至OD₆₀₀在0.7左右，向其中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至工作浓度为0.5mM，并在20℃，200r/min条件下低温诱导培养。诱导20h后，以4℃8000r/min离心收集菌体，30mL超纯水洗涤两次，最后用10mL 50mM pH 7的磷酸缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎30min，离心取上清液得到粗酶液，用于后续BCA法蛋白浓度测定及酶活测定。

实施例4：重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1表达活性研究

1)酶活测定体系糖基转移酶UGT76G1酶活测定体系：将Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200μL。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，1mM ST或1mM RD，2mM UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)，3mM MgCl₂，控制粗酶液的蛋白质量为0.5mg。在37℃，220r/min条件下反应30min后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析UDP/UDPG。

糖基转移酶EUGT11酶活测定体系：将Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200μL。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，1mM RA，2mMUDPG，3mM MgCl₂，控制粗酶液的蛋白质量为0.5mg。在37℃，220r/min条件下反应30min后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析UDP/UDPG。

蔗糖合成酶SUS1酶活测定体系：将Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200μL。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，700mM蔗糖，2mMUDP(二磷酸尿苷)，3mM MgCl₂，控制粗酶液的蛋白质量为0.5mg。在37℃，220r/min条件下反应30min后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析UDP/UDPG。

2)表达活性研究结果

分别对重组菌Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液进行酶活测定，以探究UGT76G1、EUGT11和SUS1在大肠杆菌胞内重组表达情况。糖基转移酶UGT76G1，EUGT11催化UDPG转化为UDP，故按照反应生成UDP的量计算酶活；SUS1催化UDP转化为UDPG，按照反应生成UDPG的量计算酶活。结果如表2，Rosetta-UGT76G1(ST)酶活为31.35±0.54U/g，Rosetta-UGT76G1(RD)酶活为19.27±0.57U/g，Rosetta-EUGT11酶活为5.09±0.14U/g，Rosetta-SUS1酶活为65.34±1.67U/g，宿主Rosetta(DE3)粗酶液基本无活性，表明UGT76G1、EUGT11和SUS1均已在大肠杆菌胞内成功表达。

其中，Rosetta-UGT76G1催化不同糖基转移反应时，UDPG转化率差异较大(表2，图2c，d)，催化ST转化为RA的酶活为催化RD转化为RM酶活的1.63倍。EUGT11的酶活最低，反应结束只有少量UDP产生(图2e)，可初步认为在体外多酶级联催化体系中，EUGT11是该体系的限速酶。SUS1的UDP转化率最高，反应结束后UDP几乎完全转化为UDPG(图2b)，较高的酶活使得该酶能在体外多酶级联反应体系中为糖基转移反应提供足量糖基供体UDPG。

表2重组大肠杆菌粗酶液酶活测定

Enzyme	Specific activity(U/g)
		UGT76G1(RD)	19.27±0.57
UGT76G1(ST)	31.35±0.54
		EUGT11	5.09±0.14
SUS1	65.34±1.67
		Rosetta-control	0.09±0.01

注：UGT76G1(RD)和UGT76G1(ST)表示UGT76G1分别以RD和以ST为底物进行催化。Rosetta-control为Rosetta宿主破碎得到的粗酶液在同样条件下进行催化。

实施例5：重组酶UGT76G1和EUGT11对糖苷类底物转化率研究

1)反应体系：

UGT76G1对底物转化率测定体系：将Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200μL。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，1mM ST或1mMRD，2mM UDPG，3mM MgCl₂，控制粗酶液的用量，使反应体系中的酶活力为10mU。在37℃，220r/min条件下反应24h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤，用于HPLC分析ST/RA或RD/RM，并计算ST或RD的转化率。

EUGT11对底物转化率测定体系：将Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200μL。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，1mM RA，2mMUDPG，3mM MgCl₂，控制粗酶液的用量，使反应体系中的酶活力为10mU。在37℃，220r/min条件下反应24h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤，用于HPLC分析RA/RD，并计算RA的转化率。

2)转化率定结果

为了确定体外多酶级联反应体系中的限速酶，我们比较了在相同酶活力下糖基转移酶UGT76G1对ST和RD转化率以及EUGT11对RA的转化率。结果如表3，重组酶UGT76G1几乎可以将ST完全转化为RA，保证多酶级联反应第一步的催化效率。重组酶EUGT11对RA的转化率最低，导致RD产量低，不能为RM的合成提供足量的前体，故该步骤应为体外多酶级联反应体系中的限速步骤。

表3重组酶UGT76G1和EUGT11对底物的转化

Enzyme	Conversion rate of substrate(％)
		UGT76G1(ST)	98.92±0.79
UGT76G1(RD)	57.49±1.01
		EUGT11	13.25±0.96

注：UGT76G1(RD)和UGT76G1(ST)表示UGT76G1分别以RD和以ST为底物进行催化。

实施例6：在不同串联个数启动子操控下表达的EUGT11酶活比较

为提升限速酶EUGT11活性，从而提升体外多酶级联反应整体催化效率，本发明将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联，分别构建含有一重，二重，三重和四重启动子的EUGT11表达质粒的重组大肠杆菌，并测定酶活，具体参照实施例4。结果如表4，在相同反应条件下，相比单启动子控制下表达的EUGT11，三重启动子将酶活提升2.13倍。四重启动子也使得酶活提升1.81倍，而二重启动子几乎使该酶失活，酶活仅为0.29±0.02U/g。

表4不同串联个数启动子操控下表达的EUGT11酶活

Enzyme	Specific activity(U/g)
		EUGT11	5.09±0.14
EUGT11/2copies of T7	0.29±0.02
		EUGT11/3copies of T7	10.84±0.05
EUGT11/4copies of T7	9.21±0.62
		Rosetta-control	0.09±0.01

实施例7：体外各单级联反应最佳酶活力或蛋白质量配比探究

1)体外单级联体系产物转化率测定体系：

UGT76G1和SUS1参与的体外单级联体系中ST转化率测定：

破碎获得Rosetta-UGT76G1和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反应体系中SUS1酶活力为10mU，UGT76G1酶活力分别为10mU、20mU、30mU，使得反应体系中双酶酶活力比例为1：1、1：2、1：3。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，700mM蔗糖，1mMST，2mM UDP，3mM MgCl₂，补加蒸馏水至200μL。在37℃，220r/min条件下反应24h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析ST/RA，并计算ST转化率。

EUGT11和SUS1参与的体外单级联体系中RA转化率测定：

破碎获得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反应体系中SUS1酶活力为10mU(蛋白质量为0.16mg)，EUGT11酶活力分别为10mU、20mU、30mU，换算成蛋白质量分别为1.96mg、3.93mg、5.9mg，使得反应体系中双酶酶活力比例为1：1、1：2、1：3，换算成蛋白质量比为1：12.3、1：24.6、1：36.9。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，700mM蔗糖，1mM RA，2mM UDP，3mM MgCl₂，补加蒸馏水至200μL。在37℃，220r/min条件下反应24h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析RA/RD，并计算RD转化率。破碎Rosetta-EUGT11/3copies of T7，得到的粗酶液也按照同样体系反应，其中，Rosetta-EUGT11/3copies of T7的粗酶液的用量为：反应体系中的蛋白质量与EUGT11酶活力对应的蛋白质量一致；具体为：使反应体系中SUS1酶活力为10mU，Rosetta-EUGT11/3copies of T7酶活力分别为21.3mU、42.6mU、63.9mU，使得反应体系中双酶酶活力比例为1：2.13、1：4.26、1：6.39。

UGT76G1和SUS1参与的体外单级联体系中RD转化率测定：

破碎获得Rosetta-UGT76G1和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反应体系中SUS1酶活力为10mU，UGT76G1酶活力分别为10mU、20mU、30mU，使得反应体系中双酶酶活力比例为1：1、1：2、1：3。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，700mM蔗糖，1mMRD，2mM UDP，3mM MgCl₂，补加蒸馏水至200μL。在37℃，220r/min条件下反应24h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析RD/RM，并计算RD转化率。

2)体外各单级联反应最佳酶活力配比

为便于确定体外多酶级联反应体系的酶活力配比，先对各单级联反应的最佳酶活力配比进行探究。本发明控制单酶级联反应中SUS1与糖基转移酶UGT76G1的酶活力配比为1：1，1：2，1：3，单酶级联反应中SUS1与糖基转移酶EUGT11或EUGT11/3copies of T7的蛋白质量配比为1：12.3、1：24.6、1：36.9；比较三种酶活力或蛋白质量配比下各糖基转移酶对底物的转化率，转化率最高时的酶活力或蛋白质量配比为该单级联反应的最佳酶活力或蛋白质量配比，结果如图3。

重组酶EUGT11和EUGT11/3copies of T7催化RA转化为RD的单级联反应情况如图3a和3b，由此可知，单启动子控制下的EUGT11和三重启动子控制下的EUGT11都在蛋白质量配比为1：36.9时出现RA最高转化率，且后者最高转化率为前者的2.18倍。重组酶UGT76G1催化ST转化为RA的单级联反应结果如图3c，当酶活力配比为1：2时，ST转化率最高，再增加糖基转移酶的量，产物RA转化率略有降低。重组酶UGT76G1催化RD转化为RM的单级联反应结果如图3d，当酶活力配比为1：2时RD转化率最高，再增加UGT76G1至酶活力配比为1：3时RD转化率大幅降低。

将每个单酶级联反应体系的最佳酶活力配比综合，则体外多酶级联反应体系酶活力配比为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39，换算成蛋白质量比例为SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：4：36.9。

实施例8：三重启动子操控下表达的EUGT11对体外多酶级联反应体系中RM产量探究

1)体外多酶级联体系产物测定体系

破碎获得Rosetta-SUS1，Rosetta-UGT76G1和Rosetta-EUGT11的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反应体系中SUS1酶活力为10mU，以酶活力比例SUS1：UGT76G1：EUGT11＝1：2：3，或者，SUS1：UGT76G1：EUGT11/3 copies of T7＝1：2：6.39加入反应体系中。其中各组份及终浓度为50mM pH 7磷酸钾缓冲液，700mM蔗糖，10mM ST，20mM UDP，3mM MgCl₂，补加蒸馏水至200μL。在37℃，220r/min条件下反应48h后，95℃加热5min使酶失活，超纯水稀释十倍，经0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析ST/RA/RD/RM。

2)三重启动子操控下表达的EUGT11对体外多酶级联反应体系中RM产量影响

为了研究EUGT11的表达效率对体外多酶级联反应体系终产物RM产量的影响，我们将单启动子操控下表达的EUGT11参与的反应体系SUS1：UGT76G1：EUGT11＝1：2：3与三重启动子操控下表达的EUGT11参与的反应体系SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39在相同条件下反应48h后，用HPLC对反应后各体系中的ST，RA，RD，RM进行定量分析，结果如图4和表5所示。在两个体系中，ST均完全转化为RA，而在三重启动子控制下的EUGT11参与的体系中，由于RA转化率提升，使得RD和RM产量均高于单重启动子控制下的EUGT11参与的的反应体系(图4)。相比单重启动子控制下的EUGT11参与的反应体系，三重启动子控制下的EUGT11使得反应结束时RD产量提升2.52倍，RM产量也随之提升2.35倍。

表5体外多酶级联反应体系产物浓度分析

注：EUGT11指SUS1：UGT76G1：EUGT11＝1：2：3反应体系；EUGT11/3 copies of T7指SUS1：UGT76G1：EUGT11/3copies of T7＝1：2：6.39反应体系；Control group表示空白体系，用宿主发酵得到的粗酶液代替各重组菌粗酶液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> UGT76G1的氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> UGT76G1的核苷酸序列

<400> 2

atggagaata agacagaaac caccgttcgc cgccgccgcc gcatcatttt gttccccgtg 60

ccgttccaag gtcacatcaa ccctatcctc cagctcgcca atgtccttta cagcaagggc 120

ttctccatta ccatcttcca cacgaatttc aacaagccca agacgagcaa ctacccccat 180

ttcaccttcc gcttcatcct ggacaacgac ccccaggacg aacgcatctc caatctgcct 240

acccatggtc cacttgcagg aatgcggatt cctatcatca acgaacatgg cgcagacgag 300

ctgcgccgcg agttggaact cctcatgctg gcatctgaag aagacgagga agtcagctgt 360

ctgatcaccg acgcactttg gtacttcgcc caaagcgtgg ccgactccct taatctgcgt 420

cggctcgtcc tgatgaccag ctccctcttc aacttccatg cgcatgtcag cctgccacaa 480

ttcgacgagc tgggttacct ggaccccgac gacaagacgc gtctggagga acaagcatcg 540

ggattcccca tgctgaaggt caaggacatc aagtcggctt acagcaactg gcaaatcctg 600

aaggagatct tgggaaagat gatcaagcag acgaaggctt cttccggcgt tatctggaat 660

tccttcaagg aattggagga atccgagctt gaaaccgtta tccgcgaaat tccggcacca 720

tccttcttga tcccattgcc taagcacctc actgcctcct ctagctcctt gcttgaccat 780

gaccgtactg tcttccagtg gcttgaccaa cagccacctt cttccgttct gtacgtctcg 840

ttcggtagca cgtctgaagt cgacgagaag gacttcttgg agatcgcccg gggacttgtg 900

gacagcaagc aatccttcct gtgggtcgtt cgtcccggtt tcgtgaaggg atctacctgg 960

gtcgagcctt tgccggacgg tttcttgggc gagcgtggac gcattgtgaa gtgggtcccc 1020

caacaggagg tcttggcgca tggagcaatt ggcgcattct ggacccattc tggttggaat 1080

agcaccctgg aatctgtctg tgagggagtt cccatgatct tcagcgactt cggtctcgac 1140

caaccgctta atgcccgcta catgagcgac gtgctgaagg ttggagtgta cctcgaaaac 1200

ggttgggagc gcggagaaat cgccaatgca atccgccgtg ttatggtgga cgaggaagga 1260

gaatacatcc gccagaatgc tcgcgtcctt aagcagaagg ctgacgtctc gctcatgaag 1320

ggtggaagct cttacgagtc tttggagtct ctggtttctt acattagtag cctc 1374

<210> 3

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EUGT11的氨基酸序列

<400> 3

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

290 295 300

Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

325 330 335

Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

385 390 395 400

Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

420 425 430

Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

435 440 445

Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

<210> 4

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EUGT11的核苷酸序列

<400> 4

atggactccg gttacagctc cagctacgct gctgctgctg gtatgcacgt cgtgatctgc 60

ccttggctcg ctttcggtca tctgctccct tgcctggatc tcgctcagcg tctggcttcc 120

cgtggtcacc gtgtgtcctt cgtcagcacc cctcgtaaca tcagccgtct ccctcctgtg 180

cgtcctgctc tggctcctct cgtggctttc gtcgctctgc ctctccctcg tgtcgagggt 240

ctgcctgacg gtgctgaatc caccaacgat gtgcctcacg accgtcctga tatggtcgag 300

ctgcatcgtc gtgctttcga cggtctcgct gctcctttca gcgaattcct gggtaccgcc 360

tgcgctgact gggtcatcgt ggatgtcttc caccattggg ctgctgctgc tgctctcgag 420

cacaaggtgc cttgcgccat gatgctgctc ggctccgctc atatgatcgc cagcatcgct 480

gatcgtcgtc tggaacgtgc tgaaaccgag tcccctgctg ctgctggtca aggtcgtcct 540

gctgctgctc ctaccttcga ggtcgctcgt atgaagctca tccggaccaa aggctccagc 600

ggtatgagcc tggctgaacg gttctccctg accctcagcc gttccagcct cgtcgtgggt 660

cgttcctgcg tggaattcga gcccgaaacc gtccctctgc tcagcaccct ccgtggcaag 720

cccatcacct tcctgggtct catgcctcct ctgcacgagg gtcgtcgtga ggacggtgaa 780

gatgctaccg tgcgttggct ggacgctcag cctgctaagt ccgtcgtgta cgtggctctg 840

ggtagcgagg tccctctcgg tgtggagaaa gtccatgaac tggctctcgg tctggaactc 900

gctggtaccc gcttcctgtg ggctctgcgt aaacctaccg gtgtcagcga cgctgatctg 960

ctccctgctg gtttcgagga acgtacccgt ggtcgtggtg tcgtggctac ccgctgggtg 1020

ccgcaaatgt ccatcctcgc tcacgctgct gtcggtgctt tcctgaccca ttgcggttgg 1080

aacagcacca tcgaaggcct catgttcggt cacccgctga tcatgctccc catcttcggt 1140

gaccagggtc ccaacgctcg tctcatcgag gccaagaacg ctggcctgca agtggctcgc 1200

aacgacggcg atggttcctt cgatcgtgaa ggtgtcgctg ctgctatccg tgctgtggct 1260

gtcgaggaag agtccagcaa ggtgttccag gccaaagcta agaaactcca agagatcgtc 1320

gccgacatgg cttgccatga acgttacatc gatggcttca tccagcaact gcggagctac 1380

aaagac 1386

<210> 5

<211> 808

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SUS1的氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

100 105 110

Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

115 120 125

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

130 135 140

Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

195 200 205

Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg

225 230 235 240

Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

305 310 315 320

Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg

340 345 350

Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu

370 375 380

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

420 425 430

Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

435 440 445

Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

450 455 460

Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr

465 470 475 480

Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr

485 490 495

Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His

500 505 510

Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala

515 520 525

Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

530 535 540

Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn

545 550 555 560

Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe

565 570 575

Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu

580 585 590

Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Val

595 600 605

Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala

610 615 620

Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly

625 630 635 640

Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu

645 650 655

Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala

660 665 670

Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly

675 680 685

Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val

690 695 700

His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala

705 710 715 720

Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser

725 730 735

His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys

740 745 750

Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val

755 760 765

Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg

770 775 780

Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala Gln

785 790 795 800

Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp

805

<210> 6

<211> 2424

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SUS1的核苷酸序列

<400> 6

atggccaacg ctgagcgcat gatcacccgt gtccacagcc agcgcgagcg tctgaacgaa 60

accctcgtga gcgagcgtaa cgaagtcctg gccctgctct cccgggtgga agctaaaggc 120

aagggtatcc tccagcaaaa ccagatcatc gccgagttcg aagctctgcc cgaacaaacc 180

cgcaagaaac tcgagggcgg tcctttcttc gacctgctca aatccaccca ggaagccatc 240

gtcctgcctc cctgggtggc tctggctgtc aggcctaggc ctggcgtgtg ggagtacctg 300

cgcgtcaacc tccacgccct ggtcgtggag gaactccaac ccgctgaatt cctgcatttc 360

aaagaggaac tcgtggatgg cgtcaagaac ggtaacttca ccctcgagct ggacttcgaa 420

cctttcaacg ccagcatccc tcgtccgacc ctccacaaat acatcggcaa cggtgtggat 480

ttcctgaacc ggcacctcag cgctaaactg ttccatgaca aggagtccct gctccccctg 540

ctcaagttcc tccgtctgca cagccatcaa ggcaaaaacc tcatgctgtc cgaaaagatc 600

cagaacctca acaccctgca acataccctg cggaaagccg aggaatacct cgctgagctg 660

aagagcgaaa ccctctacga ggaattcgaa gccaagttcg aggaaatcgg cctggaacgc 720

ggctggggtg ataacgctga gcgcgtcctc gacatgatcc gtctgctcct ggatctcctg 780

gaagcccccg acccttgcac cctcgagacc ttcctgggtc gtgtgccgat ggtcttcaac 840

gtcgtgatcc tgagccccca cggctacttc gcccaggata acgtcctcgg ttaccccgac 900

accggcggtc aggtcgtgta catcctggat caagtgcgcg ctctcgagat cgaaatgctg 960

caacgtatca aacagcaagg cctcaacatc aagcctcgga tcctcatcct caccaggctc 1020

ctgcctgatg ctgtgggtac cacctgtggc gagaggctgg aacgcgtgta cgatagcgaa 1080

tactgtgaca tcctcagggt gcctttcagg accgagaaag gtatcgtccg taagtggatc 1140

agccggttcg aagtgtggcc ctacctggag acctacaccg aagacgccgc tgtcgagctc 1200

tccaaagaac tgaacggcaa gcctgatctc atcatcggca actacagcga cggtaacctg 1260

gtcgcctccc tcctggctca caaactcggt gtgacccagt gcaccatcgc ccatgctctg 1320

gagaaaacca agtacccgga cagcgatatc tactggaaga aactcgacga taagtaccac 1380

ttctcctgcc aattcaccgc cgatatcttc gctatgaacc ataccgactt catcatcacc 1440

agcaccttcc aggagatcgc cggctccaaa gaaaccgtgg gtcaatacga gtcccacacc 1500

gctttcaccc tgcctggtct gtacagggtg gtgcatggta tcgacgtgtt cgatcctaag 1560

ttcaacatcg tcagcccggg cgccgacatg tccatctact tcccctacac cgaggaaaaa 1620

cgccgtctga ccaagttcca cagcgaaatc gaggaactcc tgtactccga tgtggagaac 1680

aaagaacatc tctgcgtcct gaaggacaag aaaaagccca tcctgttcac catggctcgt 1740

ctcgatcggg tgaaaaacct cagcggcctg gtcgaatggt acggcaagaa caccaggctg 1800

agggagctgg ctaacctggt ggtggtcggc ggtgatcgtc gcaaagaatc caaggacaac 1860

gaggaaaaag ctgagatgaa aaagatgtac gacctgatcg aggaatacaa gctcaacggc 1920

cagttccgct ggatcagctc ccaaatggat cgcgtccgta acggcgagct gtaccgttac 1980

atctgcgaca ccaagggtgc cttcgtgcag cctgccctgt acgaagcttt cggcctcacc 2040

gtggtcgagg ctatgacctg cggtctcccc accttcgcca cctgcaaagg cggtcctgct 2100

gaaatcatcg tccacggcaa gagcggtttc cacatcgatc cttaccatgg tgaccaggct 2160

gctgataccc tggctgactt cttcaccaaa tgcaaggaag atccgagcca ttgggacgag 2220

atctccaaag gcggtctgca acggatcgag gaaaagtaca cctggcagat ctacagccaa 2280

cgcctcctga ccctcaccgg cgtgtacggt ttctggaaac acgtctccaa cctggaccgg 2340

ctcgaagccc gtcggtacct ggagatgttc tatgctctca agtataggcc tctggctcag 2400

gctgtccctc tcgcccaaga cgat 2424

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> UGT76G1-F

<400> 7

tttaagaagg agatatacat atggagaata agacagaaac caccgt 46

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> UGT76G1-R

<400> 8

gctttgttag cagccggatc tcagaggcta ctaatgtaag aaacca 46

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EUGT11-F

<400> 9

tttaagaagg agatatacat atggactccg gttacagctc 40

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EUGT11-R

<400> 10

gctttgttag cagccggatc tcagtctttg tagctccgca gttg 44

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SUS1-F

<400> 11

tttaagaagg agatatacat atggactccg gttacagctc 40

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SUS1-R

<400> 12

gctttgttag cagccggatc tcaatcgtct tgggcgagag gga 43

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F

<400> 13

tgtgagcgga taacaattcc ataattttgt ttaactttaa gaaggag 47

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R

<400> 14

agtgagtcgt attaatttcg ttcggcgtgg gtatggtggc 40

<210> 15

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2 copies of T7-F

<400> 15

taatacgact cactataggt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat 60

tc 62

<210> 16

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2 copies of T7-R

<400> 16

cctatagtga gtcgtattac ctatagtgag tcgtattacc tatagtgagt cgtattaatt 60

tcg 63

<210> 17

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3 copies of T7-F

<400> 17

taatacgact cactataggt aatacgactc actataggta atacgactca ctatagggga 60

attgtgagcg gataacaatt c 81

<210> 18

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3copies of T7-R

<400> 18

cctatagtga gtcgtattac ctatagtgag tcgtattacc tatagtgagt cgtattacct 60

atagtgagtc gtattaattt cg 82

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4 copies of T7-F

<400> 19

taatacgact cactataggt aatacgactc actataggta atacgactca ctataggtaa 60

tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc 100

<210> 20

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4 copies of T7-R

<400> 20

cctatagtga gtcgtattac ctatagtgag tcgtattacc tatagtgagt cgtattacct 60

atagtgagtc gtattaccta tagtgagtcg tattaatttc g 101

Claims

1.一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于：包括如下步骤：

分别构建异源表达的UGT76G1，SUS1的重组菌，以及构建高效表达EUGT11的重组菌，所述高效表达EUGT11的重组菌以pET-22b（+）质粒为出发载体，以大肠杆菌作为宿主菌，在多重启动子操控下高效表达EUGT11，分别经诱导发酵产酶后以细胞粗酶液进行催化反应，利用蔗糖、ST和UDP，将SUS1介导的UDP-UDPG循环反应与三步糖基转移反应偶联形成级联反应，将三个单级联反应串联，在体外形成通路，建立一锅法多酶级联反应体系，催化ST高效合成莱鲍迪苷M；

所述一锅法多酶级联反应体系中蛋白质量比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（2～4）：（12.3～36.9）；

所述UGT76G1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述SUS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述EUGT11的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的多重启动子为三重启动子；

所述的启动子为T7启动子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述UGT76G1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述SUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL，换算成蛋白质量用量为0.8mg/mL。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（1～2）：（2.13～6.39）；

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

一锅法多酶级联反应体系中酶活力比例为SUS1：UGT76G1：多重启动子操控下表达的EUGT11=1：（1～2）：（1.81～5.43）；

一锅法多酶级联反应体系中SUS1的酶活力用量为50 mU/mL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述的一锅法多酶级联反应体系中，蔗糖的起始反应浓度为100～700 mM； ST的起始反应浓度为1～10mM；UDP的起始反应浓度为2～20mM；

所述的催化反应的条件为35～40℃，180～220r/min催化反应24～48h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

诱导发酵中诱导剂为IPTG，IPTG在发酵体系中的浓度为0.5～1 mM；

所述的细胞粗酶液为发酵得到的菌体经超声破碎所获得的含酶的粗酶液；

所述的一锅法多酶级联反应体系为：蔗糖和UDP经SUS1催化生成UDPG；UDPG和ST经UGT76G1催化生成RA；UDPG和RA经EUGT11催化生成RD；UDPG和RD经UGT76G1催化生成莱鲍迪苷M。