CN113249287B - 一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用 - Google Patents
一株表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种高效分泌表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的食品安全级菌株，其特征在于，该菌株属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已于2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22577。利用该菌株发酵生产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，可以直接将酶分泌到细胞外，产酶量高，且宿主杂蛋白较少，发酵粗酶液可直接用于果糖的转化反应或与载体结合制备固定化酶，产酶工艺简单，成本低；菌株发酵过程中无需添加抗生素，目的基因的表达无需添加诱导剂，D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的生产达到食品安全级。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株，尤其是食品安全级菌株，以及利用所述菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖（D-allulose）是D-果糖碳-3位置的差向异构体，其甜度是蔗糖的70%，口感和特性与蔗糖非常类似，但热量只有0.4 kcal/g,同时具有改善脂质代谢、降低餐后血糖、抗糖尿病、抗肥胖等特殊生理功能，因此D-阿洛酮糖是蔗糖的理想替代品。相关研究还表明D-阿洛酮糖可通过竞争性抑制转运蛋白的进出，减少机体对膳食中果糖和葡萄糖的吸收；通过诱导GLP-1的释放，激活迷走神经传入信号以限制摄食和高血糖。美国食品与药物管理局（FDA）于2011年将D-阿洛酮糖认证为GRAS（Generally recognized as safe），并于2019年发表公告将其排除在添加糖和总糖成分表之外。D-阿洛酮糖可用作肥胖和糖尿病人的代糖，也可作为健康人群的理想甜味剂，在食品、保健品等领域具有广阔的应用前景。
目前D-阿洛酮糖的主要生产方法是酶转化法，即利用阿洛酮糖 3-差向异构酶（或塔格糖 3-差向异构酶）将果糖转化为D-阿洛酮糖，已经有大量微生物来源的阿洛酮糖 3-差向异构酶被发现和报道。同时利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等宿主菌为出发菌株，构建了异源表达阿洛酮糖 3-差向异构酶的工程菌株。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）不会产生内毒素和致热致敏蛋白，且具有高效的蛋白表达和分泌能力，是发酵生产食品用酶的理想宿主菌。中国专利CN104894047B基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记以B. subtilis 1A751为宿主菌构建表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达菌株，发酵液总酶活达16U/mL。中国专利CN108102995B构建生产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，发酵48h胞内酶活最高178 U/mL。
大多数D-阿洛酮糖 3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中为胞内表达，该目标蛋白不能分泌到胞外。这就需要利用全细胞转化方式进行阿洛酮糖的生产，细胞组分会对后续产品分离纯化及结晶带来一定影响。中国专利CN105602925B证实了来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（RDPE）在枯草芽孢杆菌表达时能够借助非经典分泌途径高效地分泌到胞外，发酵液可直接用于转化。中国专利CN105602879B构建了高效分泌RDPE的枯草芽孢杆菌工程菌株，RDPE的分泌水平最高可以达到95 U/mL。D-阿洛酮糖3-差向异构酶分泌表达水平的进一步提高，有助于提升发酵效率，降低阿洛酮糖的生产成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，所述菌株分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶水平高，发酵简单可控，易于放大生产。为达此目的，本发明采用以下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株已于2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为2021年5月21日，保藏编号为CGMCC No.22577。
本发明的菌株原始出发菌株是筛选自豆谷发酵样品中，命名为B. subtilis C2。该菌株具有较强的外源蛋白分泌能力，其天然缺失两个蛋白酶基因（nprE、aprA），能极大程度降低外源蛋白的降解。本发明通过基因改造进一步构建获得本发明的高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株的构建方法，其中敲除了宿主菌株的D-丙氨酸消旋酶基因，并通过表达载体向宿主细胞导入D-丙氨酸消旋酶基因和其启动子进行回补，代替卡那霉素作为筛选标记，使得宿主细胞不含有抗生素基因，培养时不需要加入抗生素，是一种食品级安全的宿主细胞；同时通过表达载体向宿主细胞导入D-阿洛酮糖3-差向异构酶，实现了宿主细胞对该酶的分泌表达。
第二方面，本发明提供利用第一方面所述的高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。
具体的实施方式中，将所述食品安全级菌株在培养基中发酵，再从发酵液中分离D-阿洛酮糖3-差向异构酶。优选地，所述培养条件是37℃、200rpm，培养48-60h。
在一个具体实施方式中，所述培养基的成分为：蛋白胨 1.2%，酵母粉 2.4%，KH2PO417mM，K2HPO4 72mM，甘油 0.4%。
第三方面，第一方面所述的食品安全级菌株在制备D-阿洛酮糖中的应用。优选地，其以果糖为底物，以所述菌株的发酵液作为粗酶液或者从中分离提纯分离D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行催化反应获得的D-阿洛酮糖。更优选地，催化反应的条件为60℃、200rpm水浴中进行。
第四方面，第一方面所述的食品安全级菌株在制备富含D-阿洛酮糖的果汁中的应用。具体地是利用果糖含量较高的水果果汁，加入本发明食品安全级枯草芽孢杆菌发酵生产的粗酶液进行转化，以生产出富含D-阿洛酮糖的果汁饮品。更具体操作方法如下：首先利用小苏打对果汁pH值进行小范围的调节，使其pH不低于5.0；然后以1%（v/v）的加酶量加入所述食品安全级菌株的发酵粗酶液，60℃条件下反应4h。在具体实施方式中，分别以苹果汁、葡萄汁、橙汁、红枣汁、枸杞汁、桑葚汁、石榴汁、罗汉果汁、猕猴桃汁进行转化反应。
本发明提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，首先获得表现较佳的B. subtilis C2，该菌株作为出发菌株进行食品安全级表达菌株的构建。同时，本发明的菌株构建过程中采用无痕敲除的方式，不含有其他来源基因片段；表达载体骨架全部为枯草芽孢杆菌来源，不含有任何抗性基因，以及大肠杆菌复制子等基因元件。利用该菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，可以直接将酶分泌到细胞外，产酶量高，且宿主杂蛋白较少，发酵粗酶液可直接用于果糖的转化反应或与载体结合制备固定化酶，产酶工艺简单，成本低；菌株发酵过程中无需添加抗生素，目的基因的表达无需添加诱导剂，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产达到食品安全级。
附图说明
图1 不同枯草芽孢杆菌菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶相对活性。
图2 枯草芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的无痕敲除过程。
图3 食品级安全质粒pWA-DPE图谱。
图4 菌株发酵上清液的SDS-PAGE图。其中，泳道1、2和3分别是三个平行样品发酵60h上清液的SDS-PAGE图。
图5利用本发明菌株的发酵粗酶液制备D-阿洛酮糖产量随时间的变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1、高外源蛋白表达活力的枯草芽孢杆菌的筛选
从豆谷发酵样品中筛选枯草芽孢杆菌，具体方法为：将样品用3层纱布过滤，过滤液80℃处理20 min后用无菌生理盐水按照10-3到10-7进行梯度稀释，取0.1 mL的稀释液涂布于LB固体平板，37℃培养箱培养24 h，将平板上生长的单菌落划线纯化，并进行16s rDNA菌种鉴定，共获得约15株枯草芽孢杆菌单菌落。
将质粒pMA5-RDPE转化到上述15株枯草芽孢杆菌中，以SR培养基进行培养，测定发酵上清液中D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性，结果发现编号为C2的枯草芽孢杆菌分泌表达RDPE的能力最强，且表达量优于商业化宿主菌B. subtilis 168、1A751、WB600等，结果如图1所示。基因组测序发现，该菌株天然缺失两个蛋白酶基因（nprE、aprA），将其命名为B. subtilis C2，并以该菌株作为出发菌株进行食品安全级表达菌株的构建。
实施例2、敲除质粒的构建
（1）在pHT43质粒上连接抗核酸内切酶蛋白mazE，mazE基因处于lpp启动子的控制下。扩增lpp启动子和mazE基因，将lpp启动子和mazE基因融合，获得lpp-mazE融合片段，重组连接质粒pHT43，获得质粒pHT43-mazE；
（2）扩增大肠杆菌的mazF基因，重组连接pHT43-mazE质粒，获得枯草芽孢杆菌无痕敲除质粒pHT43-mazEF；
（3）扩增D-丙氨酸消旋酶的上下游片段各1000 bp，PCR融合两片段。将融合的D-丙氨酸消旋酶上下游片段重组连接到质粒pHT43-mazEF，获得D-丙氨酸无痕敲除质粒pHT43-mazEF-AR。
实施例3、D-丙氨酸消旋酶基因敲除菌株的构建
（1）将D-丙氨酸无痕敲除质粒pHT43-mazEF-AR转化B.subtillisC2，涂布含氯霉素的LBG平板。
（2）将在含有氯霉素的LBG平板上生长的单菌落接种LB液体培养基，将在含有氯霉素的LBG平板上生长的单菌落接种LB液体培养基，从平板上挑取单菌落分别点在添加D-丙氨酸的LB平板和同时添加氯霉素与D-丙氨酸的LB平板上，37 ℃培养箱倒置培养。菌株在氯霉素平板上不生长，而相对应的含有D-丙氨酸的LB平板上生长，则说明质粒被消除，获得D-丙氨酸消旋酶基因敲除的B. subtilis C2 △dal。由于基因操作采用无痕敲除的方式进行，不会引入任何其他来源的基因片段。
实施例4、D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达质粒的构建
（1）PCR扩增获得B. subtilis C2的D-丙氨酸消旋酶基因及其启动子片段，利用该片段替换枯草芽孢杆菌表达质粒pWB980上的卡那霉素抗性基因及启动子，得到pWA质粒；
（2）PCR扩增RDPE基因（其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示），将其连接到pWA质粒的p43启动子后，获得异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的质粒pWA-DPE。该质粒骨架全部为枯草芽孢杆菌来源，不含有任何抗性基因及大肠杆菌复制子（图3）。
实施例5、表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株的构建
取10 μL表达质粒pWA-DPE转入枯草芽孢杆菌B. subtilis C2 △dal感受态，37℃、100rpm复苏1.5h，涂布LB培养基固体平板，37℃培养箱过夜培养，对生长的单菌落进行菌落PCR验证，能正确扩增出丙氨酸消旋酶基因及D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的单菌落即为表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，命名为B. subtilis DPE。
该菌株已于2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为2021年5月21日，保藏编号为CGMCCNo.22577。
实施例6、利用食品安全级枯草芽孢杆菌发酵产酶
将菌株B. subtilis DPE接种于种子培养基（蛋白胨 1.0%，酵母粉 0.5%，NaCl1.0%）中，37℃、200rpm，培养14-16h，然后以1%接种量接种于发酵培养基（蛋白胨 1.2%，酵母粉 2.4%，KH2PO4 17mM，K2HPO4 72mM，甘油 0.4%）中，37℃、200rpm，培养48-60h，定时取样，测定发酵液中D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活。
测定方法如下：1ml反应体系中，果糖终浓度为80 g/L，缓冲液为磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.5），加入10 μl适当稀释的发酵粗酶液，并加入终浓度为1 mM的Mn2+，60℃保温10min，然后煮沸5 min以终止酶反应。用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。1U酶活单位定义为每分钟催化产生1μmol D-阿洛酮糖所需酶量。菌体发酵48h后，测定发酵粗酶液酶活为1260 U/ml,发酵60h后，发酵粗酶液酶活有了进一步提升，达到1573 U/ml。图4显示发酵60h发酵上清液的SDS-PAGE图，可见上清液中目标蛋白含量很高，且宿主杂蛋白较少，可直接用于果糖的转化反应或与载体结合制备固定化酶。
实施例7、利用发酵粗酶液制备D-阿洛酮糖
在250mL三角瓶中加入80g果糖、70mL自来水及终浓度为1mM的MnCl2，配置成终浓度为80%（w/v）的果糖溶液，加入1mL实施例6中所述粗酶液，在60℃、200rpm水浴摇床中反应，分别于2、4、6、8h取1mL反应液煮沸10min灭酶，稀释适当倍数后，HPLC检测D-果糖转化率，计算D-阿洛酮糖生成量。图5表明，反应4h即可达到平衡，底物D-果糖的转化率为32.5％，阿洛酮糖产量为260g/L。
实施例8、利用发酵粗酶液制备富含D-阿洛酮糖的果汁
利用果糖含量较高的水果果汁，加入以食品安全级枯草芽孢杆菌发酵生产的粗酶液进行转化，可以生产出富含D-阿洛酮糖的果汁饮品。具体操作方法如下：首先利用小苏打对果汁pH值进行小范围的调节，使其pH不低于5.0；然后以1%（v/v）的加酶量加入实施例6中所述粗酶液，60℃条件下反应4h；反应产物稀释适当倍数后，HPLC检测D-果糖转化率，计算D-阿洛酮糖生成量。分别以苹果汁、葡萄汁、橙汁、红枣汁、枸杞汁、桑葚汁、石榴汁、罗汉果汁、猕猴桃汁进行转化反应，反应后果汁中D-阿洛酮糖含量与转化率如表1中所示。
表1 各种果汁中果糖转化为D-阿洛酮糖情况
从结果可见，实施例6中所述粗酶液能够有效将果汁中果糖转化为D-阿洛酮糖，生产出富含D-阿洛酮糖的健康果汁产品。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> Ruminococcus sp.
<400> 1
MKYGIYYAYW EKEWNGDYKY YIDKISKLGF DILEISCGAF SDYYTKDQEL IDIGKYAKEK 60
GVTLTAGYGP HFNESLSSSE PNTQKQAISF WKETLRKLKL MDIHIVGGAL YGYWPVDYSK 120
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HAAVMEPFVM QGGTVGHDIK IWRDIIGNCS EVTLDMDAQS ALHFVKHVFE V 291
Claims (11)
1.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，其特征在于，该菌株属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已于2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22577。
2.利用权利要求1所述的食品安全级菌株制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述食品安全级菌株在培养基中发酵，再从发酵液中分离D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵条件是37℃、200rpm，培养48-60h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基的成分为：蛋白胨 1.2%，酵母粉2.4%，KH2PO4 17mM，K2HPO4 72mM，甘油 0.4%。
6.根据权利要求1所述的食品安全级菌株在制备D-阿洛酮糖中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以果糖为底物，以所述菌株的发酵液作为粗酶液或者从中分离提纯分离D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行催化反应获得的D-阿洛酮糖。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应的条件为60℃、200rpm水浴中进行。
9.根据权利要求1所述的食品安全级菌株在制备富含D-阿洛酮糖的果汁中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，利用果糖含量较高的水果果汁，加入所述食品安全级枯草芽孢杆菌发酵生产的粗酶液进行转化，以生产出富含D-阿洛酮糖的果汁饮品，其中果糖含量较高的水果果汁是苹果汁、葡萄汁、橙汁、红枣汁、枸杞汁、桑葚汁、石榴汁、罗汉果汁、猕猴桃汁。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，首先利用小苏打对所述果汁pH值调节至不低于5.0；然后加入所述食品安全级菌株的发酵粗酶液，于60℃条件下进行反应。
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