CN114480359B - 一种高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵工程技术领域,具体涉及一种高密度发酵生产阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法。针对目前发酵中阿洛酮糖3‑差向异构酶表达量低等问题,本发明通过控制发酵过程中的补料速度、提高发酵中后期的培养温度等措施,显著提高了重组枯草芽孢杆菌发酵OD值和发酵液中阿洛酮糖3‑差向异构酶的总酶活,显著增加了阿洛酮糖3‑差向异构酶的表达量,降低了阿洛酮糖的生产成本,具有极为广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域,具体涉及一种高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种稀有糖,具有蔗糖70%的甜度,但热量很低,是蔗糖良好的替代品。而且,D-阿洛酮糖的吸收率低于其他甜味剂,可降低机体对果糖和葡萄糖吸收的作用,降低脂肪的堆积量,从而降低Ⅱ型糖尿病和过度肥胖等病症的患病风险。目前还有研究发现D-阿洛酮糖还具有降低血脂和血糖的功能。美国食品与药物管理局(FDA)已将D-阿洛酮糖认证为GRAS(Generally recognized as safe),可作为食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在食品、保健品中具有广泛的应用前景。
阿洛酮糖3-差向异构酶能够将D-果糖差向异构为D-阿洛酮糖,是阿洛酮糖生产中的关键酶,酶产量的高低对阿洛酮糖的生产成本有很大的影响。
目前,对于D-阿洛酮糖的研究主要集中在其重组工程菌构建、酶的定点突变和定向进化及酶的固定化方面,对于如何提高阿洛酮糖3-差向异构酶重组工程菌发酵密度、显著提高其表达量的研究鲜有涉及。
高密度发酵是指微生物在深层液体发酵中通过发酵过程参数和补料控制,使菌体密度达到超过常规10倍以上的一种高效发酵技术。高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度,提高产物的表达量,相应地减少了发酵罐的体积,提高单位体积设备的生产能力,降低生物量的分离费用,缩短生产周期,从而达到降低生产成本,提高生产效率的作用,具有重要的工业应用价值。
专利CN112852795A提供了一种发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,该专利通过使用SR培养基和发酵条件优化,最终使阿洛酮糖3-差向异构酶的活性达到1436U/mL。但该方法并未使用发酵补料控制策略达到高密度发酵,发酵表达量仍有待提高。
发明内容
为了克服现有技术中发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶表达量低、纯度低、成本高等不足和缺点,本发明的目的在于提供一种高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,该方法极大地提高了菌体发酵密度,提高了阿洛酮糖3-差向异构酶的表达量和纯度,降低了生产成本,具有重要的工业应用价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,包括如下步骤:
(1)菌种活化
将重组枯草芽孢杆菌菌种接种至活化培养基中进行活化,得到活化种子液;
(2)发酵培养
发酵培养:将步骤(1)培养好的活化种子液按照体积百分比1~10%的比例加入到发酵培养基中,开始发酵,其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量1~6L/min,氧气设置0~3L/min,转速设置200~1000rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围在10~20%之间;当OD600升至80~120时,发酵温度升高至40~42℃;发酵过程中,当OD600升至5~20时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速10~30mL/h;当OD600升至30~50时,流加补料培养基的流速30~60mL/h;当OD600升至50~80时,流加补料培养基的流速60~90mL/h;当OD600升至80~100时,流加补料培养基的流速90~120mL/h;
步骤(1)中所述的重组枯草芽孢杆菌优选为重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1(已在申请号为“202010496928.9”,申请名称为“一种阿洛酮糖3-差向异构酶突变体、表达该突变体的工程菌及应用”中公开);
步骤(1)中所述的活化培养基包含如下组分:蛋白胨5~15g/L,酵母粉1~5g/L,氯化钠8~12g/L,卡那霉素25~50mg/L;
步骤(1)中所述的活化培养基优选包含如下组分:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,卡那霉素50mg/L;
步骤(1)中所述的重组枯草芽孢杆菌活化的具体操作优选为:
一级菌种活化:取冻存的重组枯草芽孢杆菌菌液,按照体积百分比0.1~1%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速180~220rpm,培养时间18~24h,得到一级活化种子液;
二级菌种活化:将培养好的一级活化种子液按照体积百分比1~10%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速180~220rpm,培养时间6~12h,得到二级活化种子液;
所述的一级活化种子液的制备条件优选为:
取冻存的重组枯草芽孢杆菌菌液,按照体积百分比0.2%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速200rpm,培养时间18~24h,至菌种OD600值至1.0~3.0,得到一级活化种子液;
所述的二级活化种子液的制备条件优选为:
将培养好的一级活化种子液按照体积百分比10%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速为200rpm,培养时间6~12h,至菌种OD600值至4.0~6.0,得到二级活化种子液;
步骤(2)中所述的发酵培养基包含如下组分:蛋白胨5~15g/L,酵母粉1~5g/L,磷酸二氢钾0.5~5g/L,磷酸氢二钾5~20g/L,四水氯化锰0.02~0.2g/L,葡萄糖2~10g/L;
步骤(2)中所述的发酵培养基优选包含如下组分:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,磷酸氢二钾15g/L,四水氯化锰0.1g/L,葡萄糖6g/L;
步骤(2)中所述的补料培养基优选包含如下按质量百分比计的组分:10~30%的葡萄糖和10~30%的酵母粉,所述的葡萄糖和酵母粉具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定;
步骤(1)、(2)中所述的活化培养基、发酵培养基和补料培养基优选高温灭菌,其中,活化培养基除卡那霉素外的其他组分高温灭菌后再加入卡那霉素;
所述的高温灭菌的条件优选为121℃灭菌20min;
步骤(2)中所述的发酵培养优选为:
发酵培养:将步骤(1)培养好的活化种子液按照体积百分比10%的比例加入到发酵培养基中,开始发酵;
其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为15%;当OD600升至100时,发酵温度升高至40℃;发酵过程中,当OD600升至10时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速15mL/h;当OD600升至35时,流加补料培养基的流速40mL/h;当OD600升至60时,流加补料培养基的流速80mL/h;当OD600升至90时,流加补料培养基的流速110mL/h;
所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,还包括如下步骤:
发酵至酶活不再继续增长时结束发酵,固液分离,得到粗酶液;进一步纯化,得到阿洛酮糖3-差向异构酶;
所述的固液分离的方式优选为离心;
所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法在D-阿洛酮糖生产中的应用;
本发明的原理:
(1)微生物在生长代谢过程中既可以利用无机氮(如氯化铵、硫酸铵等),也可以利用有机氮(如蛋白胨、酵母粉等),无机氮的利用需要微生物依靠自身的代谢将无机氮合成氨基酸,继而完成蛋白的表达,这会增大细胞自身的代谢负担,从而影响蛋白的表达量,另外氨浓度偏大也会导致细胞氨中毒。本发明提供一种添加有机氮的发酵培养基和补料培养基,其所含的氨基酸可直接被细胞吸收利用,从而降低细胞代谢的负担,更有利于提高阿洛酮糖3-差向异构酶的表达量。
(2)金属离子的存在往往对酶活性有重要意义。一般通过以下几种方式表现:作为辅因子与酶形成复合物,成为酶活性中心的组成成分;可以稳定酶分子的构象;可以作为酶与底物相连接的桥梁。本发明中所表达的阿洛酮糖3-差向异构酶在研究中发现锰离子对酶活有促进作用,而其他金属离子如镁离子、钙离子、铁离子、铜离子、锌离子的存在都对酶活有一定的抑制作用。因此,本发明在发酵培养基中添加适量的氯化锰,更有利于提高阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活。
(3)酶的分泌一般是通过细胞膜上的转运蛋白进行分泌,而分泌的速度是受细胞膜通透性以及细胞代谢速率的限制。另一种情况,细胞死亡裂解也会促使胞内酶释放,但是同时也会造成胞内杂蛋白的释放,降低目标蛋白纯度,增大后续分离纯化的难度和成本。本发明中采用发酵中后期提高培养温度的方法,改善细胞膜的通透性和提高细胞的代谢速率,从而加快目标酶的分泌,避免了发酵后期细胞死亡裂解导致的酶纯度下降,更有利于后续的分离纯化和节约成本。
(4)在发酵的补料过程中,细胞密度会随着补料不断增加,细胞密度越高,越有利于酶表达量的提高。但是,当培养基中由于补料控制不当导致葡萄糖浓度偏高时,会诱导细胞CcpA蛋白(碳分解代谢物阻遏调控因子)的表达,从而抑制蛋白的转录翻译;同时,还会因为碳源浓度偏高导致菌体生长速率过快而引起质粒丢失。因此,本发明中根据不同时间段菌体密度不同,所需要的营养量也不同为依据,建立了根据不同OD600值调控补料速度的策略,目的使发酵过程中的碳氮源维持一个相对平衡和较低的水平,更有利于提高阿洛酮糖3-差向异构酶的表达量,降低阿洛酮糖的生产成本。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明在发酵过程中通过控制发酵培养基和补料培养基的有机氮含量,降低了细胞代谢的负担,从而有利于阿洛酮糖3-差向异构酶的表达量的提高。
(2)本发明在发酵过程中控制发酵培养基中氯化锰的含量,提高了阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活。
(3)本发明采用高密度发酵策略,并控制发酵过程中不同菌体密度时的补料速度等,显著提高了重组枯草芽孢杆菌发酵的菌体密度,将OD600发酵密度提高至150以上。
(4)本发明将发酵中后期的培养温度提高至40~42℃,改善细胞膜的通透性和提高细胞的代谢速率,从而加快目标酶的分泌,避免了发酵后期细胞死亡裂解导致的酶纯度下降,更有利于后续的分离纯化和节约成本。
(5)通过本发明提供的生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,可以使发酵液中阿洛酮糖3-差向异构酶的总酶活提高至4783U/mL,该方法显著提高了阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵表达量。
(6)本发明降低了阿洛酮糖的生产成本,具有极为广泛的工业应用前景。
附图说明
图1是实施例1中发酵方法测得的重组枯草芽孢杆菌生长曲线和酶活曲线图。
图2是对比例1中发酵方法测得的重组枯草芽孢杆菌生长曲线和酶活曲线图。
图3是对比例2中发酵方法测得的重组枯草芽孢杆菌生长曲线和酶活曲线图。
图4是对比例3中发酵方法测得的重组枯草芽孢杆菌生长曲线和酶活曲线图。
图5是对比例4中发酵方法测得的重组枯草芽孢杆菌生长曲线和酶活曲线图。
图6是实施例1、对比例1和对比例4发酵结束粗酶液的SDS-PAGE胶图(样品稀释成相同的酶活,上样体积一致),其中,1:实施例1样品,2:对比例1样品,3为对比例4样品,M:Maker。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例中的重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1,已在申请号为“202010496928.9”,申请名称为“一种阿洛酮糖3-差向异构酶突变体、表达该突变体的工程菌及应用”中公开。
下述实施例中所用的试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1高密度发酵(发酵培养基和补料培养基中以蛋白胨、酵母粉为氮源)
(1)培养基配制
A.活化培养基:活化培养基组成为蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,121℃灭菌20min后,无菌条件下加入卡那霉素至50mg/L。
B.发酵培养基:发酵培养基组成为蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,磷酸氢二钾15g/L,四水氯化锰0.1g/L,葡萄糖6g/L,121℃灭菌20min。
C.补料培养基:补料培养基组成为质量百分比为15%的葡萄糖和质量百分比为20%的酵母粉,121℃灭菌20min。
(2)菌种活化
一级菌种活化:取重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1保存菌液100μL接入到装有50mL活化培养基的250mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速200rpm,培养时间24h,至菌种OD600值至2.0,得到一级活化种子液;
二级菌种活化:将培养好的一级活化种子液取50mL接入到装有500mL活化培养基的3000mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速200rpm,培养时间8h,至菌种OD600值至5.0;得到二级活化种子液;
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为15%;当OD600升至100时,发酵温度升高至40℃;发酵过程中,当OD600升至10时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速15mL/h;当OD600升至35时,流加补料培养基的流速40mL/h;当OD600升至60时,流加补料培养基的流速80mL/h;当OD600升至90时,流加补料培养基的流速110mL/h。
(4)放罐:发酵至酶活不再继续增长时结束发酵,发酵液4000rpm离心30min,即得粗酶液。
实施例2高密度发酵(发酵培养基和补料培养基中以蛋白胨、酵母粉为氮源)
(1)培养基配制
A.活化培养基:活化培养基组成为蛋白胨5g/L,酵母粉1g/L,氯化钠8g/L,121℃灭菌20min后,无菌条件下加入卡那霉素至25mg/L。
B.发酵培养基:发酵培养基组成为蛋白胨5g/L,酵母粉1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾5g/L,四水氯化锰0.02g/L,葡萄糖2g/L,121℃灭菌20min。
C.补料培养基:补料培养基组成为质量百分比为10%的葡萄糖和质量百分比为10%的酵母粉,121℃灭菌20min。
(2)菌种活化
一级菌种活化:取重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1保存菌液50μL接入到装有50mL活化培养基的250mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速180rpm,培养时间24h,至菌种OD600值至1.0,得到一级活化种子液;
二级菌种活化:将培养好的一级活化种子液取5mL接入到装有500mL活化培养基的3000mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速180rpm,培养时间12h,至菌种OD600值至4.0;得到二级活化种子液;
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量1L/min,氧气设置0L/min,转速设置200rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为10%;当OD600升至80时,发酵温度升高至40℃;发酵过程中,当OD600升至5时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速10mL/h;当OD600升至30时,流加补料培养基的流速30mL/h;当OD600升至50时,流加补料培养基的流速60mL/h;当OD600升至80时,流加补料培养基的流速90mL/h;
(4)放罐:发酵至酶活不再继续增长时结束发酵,发酵液4000rpm离心30min,即得粗酶液。
实施例3高密度发酵(发酵培养基和补料培养基中以蛋白胨、酵母粉为氮源)
(1)培养基配制
A.活化培养基:活化培养基组成为蛋白胨15g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,121℃灭菌20min后,无菌条件下加入卡那霉素至50mg/L。
B.发酵培养基:发酵培养基组成为蛋白胨15g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾5g/L,磷酸氢二钾20g/L,四水氯化锰0.2g/L,葡萄糖10g/L,121℃灭菌20min。
C.补料培养基:补料培养基组成为质量百分比为30%的葡萄糖和质量百分比为30%的酵母粉,121℃灭菌20min。
(2)菌种活化
一级菌种活化:取重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1保存菌液500μL接入到装有50mL活化培养基的250mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速220rpm,培养时间18h,至菌种OD600值至3.0,得到一级活化种子液;
二级菌种活化:将培养好的一级活化种子液取50mL接入到装有500mL活化培养基的3000mL三角瓶中,于恒温振荡器中培养,其中,培养温度37.0℃,转速220rpm,培养时间6h,至菌种OD600值至6.0;得到二级活化种子液;
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量6L/min,氧气设置3L/min,转速设置1000rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为20%;当OD600升至120时,发酵温度升高至42℃;发酵过程中,当OD600升至20时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速30mL/h;当OD600升至50时,流加补料培养基的流速60mL/h;当OD600升至80时,流加补料培养基的流速90mL/h;当OD600升至100时,流加补料培养基的流速120mL/h;
(4)放罐:发酵至酶活不再继续增长时结束发酵,发酵液4000rpm离心30min,即得粗酶液。
对比例1 37℃恒温和不补料发酵
(1)溶液配制
A.活化培养基:同实施例1。
B.发酵培养基:同实施例1。
(2)菌种活化
一级菌种活化:同实施例1。
二级菌种活化:同实施例1。
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度控制溶氧范围在15%。
(4)放罐:同实施例1。
对比例2 37℃恒温和补料发酵
(1)溶液配制
A.活化培养基:同实施例1。
B.发酵培养基:同实施例1。
C.补料培养基:同实施例1。
(2)菌种活化
一级菌种活化:同实施例1。
二级菌种活化:同实施例1。
(3)发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为15%;发酵过程中,当OD600升至10时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速15mL/h;当OD600升至35时,流加补料培养基的流速40mL/h;当OD600升至60时,流加补料培养基的流速80mL/h;当OD600升至90时,流加补料培养基的流速110mL/h。
(4)放罐:同实施例1。
对比例3发酵中后期温度提高至40℃和不补料发酵
(1)溶液配制
A.活化培养基:同实施例1。
B.发酵培养基:同实施例1。
(2)菌种活化
一级菌种活化:同实施例1。
二级菌种活化:同实施例1。
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度控制溶氧范围在15%;当OD600升至20时,发酵温度升高至40℃。
(4)放罐:同实施例1。
对比例4发酵培养基和补料培养基中以氯化铵为氮源
(1)溶液配制
A.活化培养基:同实施例1。
B.发酵培养基:发酵培养基组成为氯化铵5g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,磷酸氢二钾15g/L,四水氯化锰0.1g/L,葡萄糖6g/L,121℃灭菌20min。
C.补料培养基:补料培养基组成为质量百分比为20%的葡萄糖和质量百分比为10%的氯化铵,121℃灭菌20min。
(2)菌种活化
一级菌种活化:同实施例1。
二级菌种活化:同实施例1。
(3)发酵培养
发酵培养:将3150mL发酵培养基加入5L发酵罐中,121℃灭菌处理20min后,将步骤(2)制得的二级活化种子液取350mL加入到发酵培养基中,开始发酵;其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为15%;当OD600升至100时,发酵温度升高至40℃;发酵过程中,当OD600升至10时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速15mL/h;当OD600升至35时,流加补料培养基的流速40mL/h;当OD600升至60时,流加补料培养基的流速80mL/h;当OD600升至90时,流加补料培养基的流速110mL/h。
(4)放罐:同实施例1。
效果实施例
(1)发酵过程中样品检测
①吸光度检测:实施例1、对比例1~4发酵开始后每4h取样使用紫外分光光度计检测发酵液OD600值,记录并绘制生长曲线。
②酶活检测:以质量分数为10%的果糖溶液(磷酸钾缓冲液,pH8.0,含1mM Mn2+)为底物,加入适当对比例1~4中的发酵液,60℃下反应20min;反应结束后,于沸水浴中处理5min,利用HPLC测定产物D-阿洛酮糖的含量,从而计算酶活。
(2)SDS-PAGE检测:
将实施例1、对比例1和对比例4制得的粗酶液稀释至相同的酶活(100U/mL),加loading buffer混匀后100℃煮沸10min,上样,其中,上样量10μL,然后进行电泳,其中,电泳条件为:分离胶12%,浓缩胶5%,恒压100V。
表1实施例1和对比例1~对比例4发酵方法结果比对分析
实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
<![CDATA[下罐OD<sub>600</sub>值]]> | 158 | 21 | 146 | 34 | 110 |
酶活U/mL | 4783 | 1584 | 3272 | 1501 | 2002 |
本发明发明人意外发现,对于重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1,在发酵培养过程中,酶的分泌速度是受限制的,在对比例1中发酵中后期菌体胞内还能检测到较高的酶活,说明部分酶还没有被分泌到胞外;继续培养一段时间后,菌体密度会出现下降趋势,此时酶活达到最高(表1、图3),说明菌体裂解把胞内的酶释放出来,但同时菌体的裂解也把胞内的杂蛋白释放出来,导致粗酶液中存在较多的杂蛋白,增加了纯化的难度和成本(图6)。
对比例2与实施例1的区别在于:37℃恒温发酵,与对比例1的区别在于采用补料发酵,从图3可以看出,与对比例1相比,对比例2采用补料发酵可以提高发酵罐内的菌体密度以及酶活,但是实施例1的酶活显著高于对比例2,说明将发酵中后期的培养温度提高至合适温度,可以加快目标酶的分泌。
对比例3与实施例1的区别在于:发酵中后期温度提高至40℃但采用不补料发酵,从图4可以看出,单独采用增加发酵中后期的培养温度这一措施,并不能有效提高菌体密度和酶活。但与对比例1相比,可以使发酵周期从48h缩短至40h,且发酵酶活和对比例1并无太大差异,进一步说明发酵后期提高温度可以加快酶的分泌速度。
对比例4与实施例1的区别在于:发酵培养基和补料培养基采用无机氮源氯化铵,从图5可以看出,采用无机氮源降低了菌体密度,酶活也降低了至少一倍。而实施例1采用有机氮源,降低了细胞代谢的负担,从而有利于菌体密度的增加和阿洛酮糖3-差向异构酶的表达量的提高。微生物在生长代谢过程中更倾向于利用有机氮(如蛋白胨、酵母粉等),无机氮的利用需要微生物依靠自身的代谢将无机氮合成氨基酸,继而完成蛋白的表达,这会增大细胞自身的代谢负担,从而影响蛋白的表达量。从图1和图5可以看出,虽然实施例1和对比例4都采用了高密度发酵方法,但是蛋白表达量却相差1倍多,这跟发酵过程中采用氮源的种类有很大关系。无机氮更有利于细胞生长,而有机氮更有利于蛋白表达。
从图1和图6可以看出,实施例1通过发酵过程中补料控制,可保持菌体密度持续增长;通过发酵后期提高培养温度,可以改善细胞膜的通透性,进而显著提高酶的分泌速度,不需要让菌体裂解释放胞内酶和杂蛋白,可相应缩短发酵周期,且提高粗酶液的纯度,其中,使用实施例1中的方法,其下罐菌体密度提高了近6倍,酶活提高了2倍左右。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)菌种活化
将重组枯草芽孢杆菌菌种接种至活化培养基中进行活化,得到活化种子液;
(2)发酵培养
发酵培养:将步骤(1)培养好的活化种子液按照体积百分比1~10%的比例加入到发酵培养基中,开始发酵,其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量1~6L/min,氧气设置0~3L/min,转速设置200~1000rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围在10~20%之间;当OD600升至80~120时,发酵温度升高至40~42℃;发酵过程中,当OD600升至5~20时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速10~30 mL/h;当OD600升至30~50时,流加补料培养基的流速30~60 mL/h;当OD600升至50~80时,流加补料培养基的流速50~90 mL/h;当OD600升至80~100时,流加补料培养基的流速90~120 mL/h;
步骤(1)中所述的重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌工程菌B-3-1。
2.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的活化培养基包含如下组分:蛋白胨5~15g/L,酵母粉1~5 g/L,氯化钠8~12 g/L,卡那霉素25~50 mg/L。
3.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的重组枯草芽孢杆菌活化的具体操作为:
一级菌种活化:取冻存的重组枯草芽孢杆菌菌液,按照体积百分比0.1~1%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速180~220rpm,培养时间18~24h,得到一级活化种子液;
二级菌种活化:将培养好的一级活化种子液按照体积百分比1~10%的比例接种至活化培养基中,恒温振荡培养,其中,培养温度37.0℃,转速180~220rpm,培养时间6~12h,得到二级活化种子液。
4.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的发酵培养基包含如下组分:蛋白胨5~15g/L,酵母粉1~5g/L,磷酸二氢钾0.5~5 g/L,磷酸氢二钾5~20 g/L,四水氯化锰0.02~0.2 g/L,葡萄糖2~10 g/L。
5.根据权利要求4所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的发酵培养基包含如下组分:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾2.5 g/L,磷酸氢二钾15g/L,四水氯化锰0.1g/L,葡萄糖6 g/L。
6.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的补料培养基包含如下按质量百分比计的组分:10~30%的葡萄糖和10~30%的酵母粉。
7.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的发酵培养为:
发酵培养:将步骤(1)培养好的活化种子液按照体积百分比10%的比例加入到发酵培养基中,开始发酵;
其中,发酵条件初始设定:温度37.0℃,空气流量5L/min,氧气设置1L/min,转速设置800rpm;发酵过程控制:发酵过程中控制溶氧范围为15%;当OD600升至100时,发酵温度升高至40℃;发酵过程中,当OD600升至10时,开始流加补料培养基,流加补料培养基的流速15mL/h;当OD600升至35时,流加补料培养基的流速40 mL/h;当OD600升至60时,流加补料培养基的流速80 mL/h;当OD600升至90时,流加补料培养基的流速110 mL/h。
8.根据权利要求1所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,其特征在于:
所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法,还包括如下步骤:
发酵至酶活不再继续增长时结束发酵,固液分离,得到粗酶液;进一步纯化,得到阿洛酮糖3-差向异构酶。
9.权利要求1-8任一项所述的高密度发酵生产阿洛酮糖3-差向异构酶的方法在D-阿洛酮糖生产中的应用。
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