JP2023140307A - 高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法 - Google Patents
高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明は、微生物発酵工学の技術分野に係り、特に高密度発酵によるプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法に関するものである。プシコース３－エピメラーゼの発現レベルが低いなど、従来の発酵に存在する問題の解決。【解決手段】本発明では、発酵プロセスで流加速度をコントロールすること、発酵中期および後期において培養温度の改善を行うこと、および他の手段により、組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）による発酵中のＯＤ値および発酵ブロス中のプシコース３－エピメラーゼの全酵素活性が著しく向上し、プシコース３－エピメラーゼの発現が著しく向上するとともに、アルロースの製造コストが低減される。従って、産業界において非常に幅広く応用される見込みがある。【選択図】 図１
Description
本出願は、２０２２年３月２２日に出願された中国特許出願第２０２２１０２８８７９０．２号の優先権を主張するものであり、この出願は、本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
本発明は、微生物発酵工学の技術分野に関し、特に高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法に関する。
Ｄ－プシコースは、ショ糖の７０％の甘味を有しながら低カロリーで、ショ糖の良好な代替になる希少糖である。さらに、Ｄ－プシコースは他の甘味料に比べて吸収率が低く、体内でのフルクトースとグルコースの吸収を抑え、脂肪の蓄積を低下させることができるため、２型糖尿病や肥満などの病気のリスクを低減させることができる。現在、Ｄ－プシコースには、血中脂質および血糖値を下げる機能もあることが研究でわかっている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）がＤ－プシコースを一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）と認定しているため、食品添加物の成分としてＤ－プシコースが使用され得る。Ｄ－プシコースは、食品およびヘルスケア製品への幅広い応用が期待されている。
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼは、Ｄ－フルクトースをＤ－プシコースにエピマー化することができ、プシコースの生産における重要な酵素である。この酵素の製造は、プシコースの製造コストに大きく影響する。
現在、Ｄ－プシコースに関する研究は、遺伝子組換え株の構築、酵素の部位特異的変異導入や指向性進化、および酵素の固定化に、主に焦点を当てている。プシコース３－エピメラーゼを発現する遺伝子組換え株の発酵密度を高め、発現レベルを有意に増加させる方法に関する研究は、ほとんどない。
高密度発酵とは、微生物による液中発酵において、発酵パラメーターのコントロールや流加（ｆｅｅｄ）コントロールにより、細胞密度を従来技術の１０倍以上にする高効率な発酵技術のことである。高密度発酵は、発酵タンク内の細胞密度を高め、生成物の発現を増加させることができるので、それに伴い発酵タンクの容積が小さくなり、単位容積あたりの装置の生産能力が上がり、バイオマス分離のコストが下がり、製造期間が短縮されるので、製造コストが削減され、製造効率が向上する。したがって、高密度発酵は、産業への応用において大きな意義を有している。
中国特許出願公開第１１２８５２７９５号（ＣＮ１１２８５２７９５Ａ）は、発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法を提供する。この特許では、ＳＲ培地と発酵条件を最適化することにより、プシコース３－エピメラーゼの活性が最終的に１４３６Ｕ／ｍＬに達する。しかし、この方法では高密度発酵を実現するための発酵中の流加コントロールの方針は、採用されておらず、発酵中の発現レベルもまだ改善する必要がある。
先行技術における、発酵および製造におけるプシコース３－エピメラーゼの低い発現レベル、低い純度、高コストおよびその他の欠陥や欠点に鑑み、本発明の目的は、高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法を提供することである。本方法は、発酵中の細胞密度を大幅に改善させ、プシコース３－エピメラーゼの発現レベルと純度を高め、製造コストを低減するものであり、産業での応用に大きな意義がある。
本発明の目的は、以下の技術的解決策により達成される。
高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法は、以下のステップを含む：
（１）菌株の活性化
組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を活性化培地に接種して活性化し、活性化種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）懸濁液を得るステップ；および
（２）発酵培養
発酵培養：ステップ（１）で培養した前記活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１～１０体積％添加し、発酵させるステップ。
（１）菌株の活性化
組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を活性化培地に接種して活性化し、活性化種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）懸濁液を得るステップ；および
（２）発酵培養
発酵培養：ステップ（１）で培養した前記活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１～１０体積％添加し、発酵させるステップ。
前記発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量１～６Ｌ／分、酸素流量０～３Ｌ／分、回転数２００～１０００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵の際に、溶存酸素は、１０％～２０％の範囲でコントロールされ、ＯＤ６００が８０～１２０に上昇すると発酵温度は４０～４２℃に上昇され、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が５～２０に上昇すると流加培地は１０～３０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が３０～５０に上昇すると前記流加培地は３０～６０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が５０～８０に上昇すると前記流加培地は６０～９０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が８０～１００に上昇すると前記流加培地は９０～１２０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加される。
ステップ（１）に記載の前記組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、好ましくは、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株（出願番号２０２０１０４９６９２８．９号に開示されている名称「プシコース３－エピメラーゼ変異体、該変異体を発現する遺伝子操作された株、およびその使用」）。
ステップ（１）における前記活性化培地は、ペプトン５～１５ｇ／Ｌ、酵母粉末１～５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８～１２ｇ／Ｌ、およびカナマイシン２５～５０ｍｇ／Ｌを含む。
ステップ（１）における前記活性化培地は、好ましくは、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、カナマイシン２５～５０ｍｇ／Ｌを含む。
ステップ(１)における前記組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の前記活性化は、好ましくは具体的に以下を含む：
一次株活性化：凍結した組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞懸濁液を前記活性化培地に０．１～１体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得ることであり、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間は１８～２４時間である；および
二次株活性化：培養した前記一次活性化種細胞懸濁液を活性化培地に１～１０体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得ることであり、ここで、培養温度は３７．０℃、回転数は１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間は６～１２時間である。
一次株活性化：凍結した組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞懸濁液を前記活性化培地に０．１～１体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得ることであり、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間は１８～２４時間である；および
二次株活性化：培養した前記一次活性化種細胞懸濁液を活性化培地に１～１０体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得ることであり、ここで、培養温度は３７．０℃、回転数は１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間は６～１２時間である。
前記一次活性化種細胞懸濁液は、好ましくは、以下のようにして調製される：
凍結した組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞懸濁液を活性化培地に０．２体積％接種し、細胞培養物のＯＤ６００値が１．０～３．０となるまで一定温度で振盪しながら細胞培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は１８～２４時間である。
凍結した組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞懸濁液を活性化培地に０．２体積％接種し、細胞培養物のＯＤ６００値が１．０～３．０となるまで一定温度で振盪しながら細胞培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は１８～２４時間である。
前記二次活性化種細胞懸濁液は、好ましくは、以下のようにして調製される：
培養した前記一次活性化種細胞懸濁液を活性化培地に１０体積％接種し、細胞培養物のＯＤ６００値が４．０～６．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は６～１２時間である。
培養した前記一次活性化種細胞懸濁液を活性化培地に１０体積％接種し、細胞培養物のＯＤ６００値が４．０～６．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得、ここで培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は６～１２時間である。
ステップ（２）における発酵培地は、ペプトン５～１５ｇ／Ｌ、酵母粉末１～５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５～５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５～２０ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．０２～０．２ｇ／Ｌ、グルコース２～１０ｇ／Ｌを含む。
ステップ（２）における発酵培地は、好ましくは、ペプトン１０ｇ／Ｌ、および酵母粉末５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．１ｇ／Ｌ、およびグルコース６ｇ／Ｌを含む。
ステップ(２)における流加培地は、好ましくは、１０～３０重量％のグルコースおよび１０～３０重量％の酵母粉末を含む。グルコースおよび酵母粉末の具体的な濃度、流加速度および流加量は、菌株の増殖に依存する。
ステップ（１）およびステップ（２）における活性化培地、発酵培地および流加培地は、好ましくは高温で滅菌される。活性化培地中のカナマイシン以外の成分が高温で滅菌され、次いでカナマイシンが添加される。
高温滅菌は、好ましくは、１２１℃、２０分間の滅菌である。
ステップ（２）の発酵培養は、好ましくは、
発酵培養：ステップ（１）で培養した活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１０体積％添加し、発酵させること、を含む。
発酵培養：ステップ（１）で培養した活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１０体積％添加し、発酵させること、を含む。
発酵条件の初期設定は、温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍである。発酵プロセスをコントロールするために、発酵の際に、溶存酸素は、１５％にコントロールされ、ＯＤ６００が１００に上昇すると発酵温度は４０℃に上昇され、発酵プロセスにおいて、ＯＤ６００が１０に上昇すると１５ｍＬ／時間の流量で流加培地は流動的に添加され、ＯＤ６００が３５に上昇すると４０ｍＬ／時間の流量で流加培地は流動的に添加され、ＯＤ６００が６０に上昇すると８０ｍＬ／時間の流量で流加培地は流動的に添加され、ＯＤ６００が９０に上昇すると１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地は流動的に添加される。
本発明の高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法は、さらに以下のステップ：
酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、固液分離して粗酵素液を得、さらに精製してプシコース３－エピメラーゼを得るステップ、
を含む。
酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、固液分離して粗酵素液を得、さらに精製してプシコース３－エピメラーゼを得るステップ、
を含む。
固液分離の方法としては、遠心分離が好ましい。
本発明はまた、Ｄ－プシコースの製造における、高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法の使用を、さらに提供する。
本発明の原理：
（１）微生物の増殖および代謝には、無機窒素（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなど）または有機窒素（ペプトン、酵母粉末など）が、使用され得る。無機窒素を利用する場合、微生物が自らの代謝によって無機窒素をアミノ酸に変換し、タンパク質の発現を完了させることが要求される。そのため、細胞の代謝負荷が大きくなり、タンパク質の発現に影響を及ぼす。また、過剰なアンモニア濃度は、細胞のアンモニア中毒を引き起こす。本発明は、有機窒素を添加した発酵培地および流加培地を提供する。含まれるアミノ酸は、細胞に直接吸収されて利用され、細胞の代謝負荷を軽減し、プシコース３－エピメラーゼの発現を増やすことができる。
（１）微生物の増殖および代謝には、無機窒素（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなど）または有機窒素（ペプトン、酵母粉末など）が、使用され得る。無機窒素を利用する場合、微生物が自らの代謝によって無機窒素をアミノ酸に変換し、タンパク質の発現を完了させることが要求される。そのため、細胞の代謝負荷が大きくなり、タンパク質の発現に影響を及ぼす。また、過剰なアンモニア濃度は、細胞のアンモニア中毒を引き起こす。本発明は、有機窒素を添加した発酵培地および流加培地を提供する。含まれるアミノ酸は、細胞に直接吸収されて利用され、細胞の代謝負荷を軽減し、プシコース３－エピメラーゼの発現を増やすことができる。
（２）金属イオンの存在は、次のような点で酵素の活性に重要であることが多い：金属イオンは補酵素として、酵素と複合体を形成し、酵素の活性中心の構成要素となる；酵素分子のコンフォメーションを安定化させる；酵素と基質との間の橋渡しとして機能することができる。マンガンイオンが、本発明で発現するプシコース３－エピメラーゼの酵素活性を促進し、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、銅イオン、および亜鉛イオンなど他の金属イオンが存在すると、酵素活性を阻害する効果があることが研究の結果判明している。したがって、プシコース３－エピメラーゼの酵素活性を向上させるために、本発明の発酵培地には、適量の塩化マンガンが添加される。
（３）酵素は、一般に細胞膜上の輸送タンパク質を介して分泌され、その分泌速度は、細胞膜の透過性と細胞の代謝速度とによって制限される。また、細胞死や溶解により細胞内酵素の放出が促進され、さらに細胞内の不純タンパク質も放出されるため、標的タンパク質の純度が低下し、その後の分離と精製の困難さやコストが増加する。本発明では、発酵の中期と後期に培養温度を上昇させる方法が採用され、細胞膜の透過性を向上させ、細胞の代謝速度を上げることで、標的酵素の分泌を促進し、発酵後期の細胞死や溶解による酵素純度の低下を回避し、その後の分離および精製を容易にし、コスト削減を促進する。
（４）発酵における流加プロセスでは、細胞密度は、流加時に高くなる。細胞密度が高いと、酵素の発現が向上しやすくなる。しかし、不適切な流加コントロールにより培地中のグルコース濃度が高すぎると、細胞内でＣｃｐＡタンパク質（カーボンカタボライト抑制レギュレータ）の発現が誘導され、タンパク質の転写・翻訳が抑制される。また、炭素源の濃度が高いために細胞の増殖速度が上がりすぎることでも、プラスミドの消失が起こることがある。したがって、本発明では、異なる時期での細胞密度の違いによって必要な栄養素の量が異なることに応じて、異なるＯＤ６００値に従って流加量を調整する方針が立てられ、発酵プロセスにおいて炭素源と窒素源とを比較的バランス良く低いレベルに維持し、これにより、プシコース３－エピメラーゼの発現を増加させ、プシコースの製造コストを低減させる。
本発明は、先行技術に比べ、以下のような利点および効果を有する。
（１）本発明では、発酵プロセスの際に発酵培地および流加培地中の有機窒素含有量をコントロールすることにより、細胞の代謝負荷が低減し、プシコース３－エピメラーゼの発現が向上する。
（２）本発明では、発酵プロセスの際に発酵培地中の塩化マンガンの含有量をコントロールすることにより、プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が向上する。
（３）本発明では、高密度発酵の方針を採用し、発酵プロセスの際に異なる細胞密度での供給速度をコントロールすることにより、発酵中の組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞密度が有意に増加し、ＯＤ６００値が１５０以上に増加する。
（４）本発明では、発酵中期および発酵後期の培養温度を４０～４２℃に上昇させることにより、細胞膜の透過性が向上し、細胞の代謝速度が高まり、それによって、標的酵素の分泌が促進され、発酵後期の細胞死や溶解による酵素純度の低下が回避され、その後の分離および精製が容易になり、コスト削減が促進される。
（５）本発明で提供されるプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法により、発酵ブロス中のプシコース３－エピメラーゼの総酵素活性を、４７８３Ｕ／ｍＬまで高めることができる。本方法により、発酵の際のプシコース３－エピメラーゼの発現が著しく向上する。
（６）本発明では、プシコースの製造コストが削減される。従って、本発明は、産業界において非常に幅広く応用される見込みがある。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
以下、実施例および添付の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されない。
以下、実施例および添付の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されない。
実施例におけるステップ（１）の組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、中国特許出願第２０２０１０４９６９２８．９号の名称「プシコース３－エピメラーゼ変異体、該変異体を発現する遺伝子操作された株、およびその使用」で開示される、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株である。
以下の実施例で使用される試薬は、特に明記しない限り、市販のものが使用される。
実施例１：高密度発酵（発酵培地および流加培地の窒素源としてペプトンおよび酵母粉末を使用）
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ｂ．発酵培地：発酵培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．１ｇ／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分間滅菌した）。
Ｃ．流加培地：流加培地の組成：グルコース１５重量％、酵母粉末２０重量％（１２１℃、２０分間滅菌した）。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液１００μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が２．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は２４時間であった。
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液１００μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が２．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は２００ｒｐｍ、培養時間は２４時間であった。
二次菌株の活性化：培養した一次活性化種細胞懸濁液５０ｍＬを、活性化培地５００ｍＬを含む３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が５．０になるまで一定温度で振とう培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転速度は２００ｒｐｍ、培養時間は８時間であった。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１５％にコントロールし、ＯＤ６００が１００に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が１０に上昇したとき流加培地を１５ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３５に上昇したとき４０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が６０に上昇したとき８０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が９０に上昇したとき、１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１５％にコントロールし、ＯＤ６００が１００に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が１０に上昇したとき流加培地を１５ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３５に上昇したとき４０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が６０に上昇したとき８０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が９０に上昇したとき、１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
（４）発酵タンクからの排出：酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、発酵ブロスを４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、粗酵素液を得た。
実施例２：高密度発酵（発酵培地および流加培地の窒素源としてペプトン、酵母粉末を使用）
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母粉末１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母粉末１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ｂ．発酵培地：発酵培地の組成：ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母粉末１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．０２ｇ／Ｌ、グルコース２ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分間滅菌した）。
Ｃ．流加培地：流加培地の組成：グルコース１０重量％、酵母粉末１０重量％（１２１℃、２０分間滅菌した）。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液５０μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が１．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は１８０ｒｐｍ、培養時間は２４時間であった。
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液５０μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が１．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は１８０ｒｐｍ、培養時間は２４時間であった。
二次菌株の活性化：活性化培地５００ｍＬを含む３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、培養した前記一次活性化種細胞懸濁液５ｍＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が４．０になるまで一定温度で振とう培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転速度は１８０ｒｐｍ、培養時間は１２時間であった。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量１Ｌ／分、酸素流量０Ｌ／分、および回転数２００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１０％にコントロールし、ＯＤ６００が８０に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が５に上昇したとき流加培地を１０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３０に上昇したとき３０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が５０に上昇したとき６０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が８０に上昇したとき９０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量１Ｌ／分、酸素流量０Ｌ／分、および回転数２００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１０％にコントロールし、ＯＤ６００が８０に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が５に上昇したとき流加培地を１０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３０に上昇したとき３０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が５０に上昇したとき６０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が８０に上昇したとき９０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
（４）発酵タンクからの排出：酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、発酵ブロスを４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、粗酵素液を得た。
実施例３：高密度発酵（発酵培地および流加培地の窒素源としてペプトン、酵母粉末を使用）
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ａ．活性化培地：活性化培地の組成：ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分滅菌し、滅菌後カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した）。
Ｂ．発酵培地：発酵培地の組成：ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２０ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．２ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分間滅菌した）。
Ｃ．流加培地：流加培地の組成：グルコース３０重量％、酵母粉末３０重量％（１２１℃、２０分間滅菌した）。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液５００μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が３．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は２２０ｒｐｍ、培養時間は１８時間であった。
一次菌株の活性化：５０ｍＬの活性化培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株の保存細胞懸濁液５００μＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が３．０となるまで一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転数は２２０ｒｐｍ、培養時間は１８時間であった。
二次菌株の活性化：活性化培地５００ｍＬを含む３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコに、培養した一次活性化種細胞懸濁液５０ｍＬを接種し、細胞懸濁液のＯＤ６００値が６．０になるまで一定温度で振とう培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得た。培養温度は３７．０℃、回転速度は２２０ｒｐｍ、培養時間は６時間であった。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量６Ｌ／分、酸素流量３Ｌ／分、回転数１０００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を２０％にコントロールし、ＯＤ６００が１２０に上昇したとき発酵温度を４２℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が２０に上昇したとき流加培地を３０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が５０に上昇したとき６０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が８０に上昇したとき９０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が１００に上昇したとき１２０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを加え、１２１℃で２０分間滅菌を行った。ステップ（２）で得た二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量６Ｌ／分、酸素流量３Ｌ／分、回転数１０００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を２０％にコントロールし、ＯＤ６００が１２０に上昇したとき発酵温度を４２℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が２０に上昇したとき流加培地を３０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が５０に上昇したとき６０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が８０に上昇したとき９０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が１００に上昇したとき１２０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
（４）発酵タンクからの排出：酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、発酵ブロスを４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、粗酵素液を得た。
比較例１：流加無しの３７℃での定温発酵
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、回転数および純酸素の導入速度をコントロールすることにより、溶存酸素を１５％にコントロールした。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、回転数および純酸素の導入速度をコントロールすることにより、溶存酸素を１５％にコントロールした。
（４）発酵タンクからの排出：実施例１と同様である。
比較例２：流加有りの３７℃での定温発酵
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
Ｃ．流加培地：実施例１と同様である。
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
Ｃ．流加培地：実施例１と同様である。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
（３）発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１５％にコントロールし、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が１０に上昇したとき流加培地を１５ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３５に上昇したとき４０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が６０に上昇したとき８０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が９０に上昇したとき１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
（４）発酵タンクからの排出：実施例１と同様である。
比較例３：発酵の中期および後期で温度を４０℃まで上げる、流加無しの発酵
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：実施例１と同様である。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、回転数および純酸素の導入速度をコントロールすることにより、溶存酸素を１５％にコントロールした。ＯＤ６００が２０に上昇したとき、発酵温度を４０℃に上昇させた。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、回転数および純酸素の導入速度をコントロールすることにより、溶存酸素を１５％にコントロールした。ＯＤ６００が２０に上昇したとき、発酵温度を４０℃に上昇させた。
（４）発酵タンクからの排出：実施例１と同様である。
比較例４：塩化アンモニウムを窒素源として使用する、発酵培地と流加培地とによる発酵
（１）培地の調製
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：発酵培地の組成：塩化アンモニウム５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．１ｇ／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分間滅菌した）。
Ｃ．流加培地：流加培地の組成：グルコース２０重量％、塩化アンモニウム１０重量％（１２１℃で２０分間滅菌した）。
Ａ．活性化培地：実施例１と同様である。
Ｂ．発酵培地：発酵培地の組成：塩化アンモニウム５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．１ｇ／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ（１２１℃、２０分間滅菌した）。
Ｃ．流加培地：流加培地の組成：グルコース２０重量％、塩化アンモニウム１０重量％（１２１℃で２０分間滅菌した）。
（２）菌株の活性化
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
一次菌株の活性化：実施例１と同様である。
二次菌株の活性化：実施例１と同様である。
（３）発酵培養
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１５％にコントロールし、ＯＤ６００が１００に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が１０に上昇したとき流加培地を１５ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３５に上昇したとき４０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が６０に上昇したとき８０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が９０に上昇したとき１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
発酵培養：５Ｌの発酵タンクに発酵培地３１５０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間滅菌した。ステップ(２)で得られた二次活性化種細胞懸濁液３５０ｍＬを発酵培地に添加し、発酵させた。発酵条件の初期設定：温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍ。発酵プロセスのコントロール：発酵プロセスの際に、溶存酸素を１５％にコントロールし、ＯＤ６００が１００に上昇したとき発酵温度を４０℃に上昇させ、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が１０に上昇したとき流加培地を１５ｍＬ／時間の流量で流動的に添加し、ＯＤ６００が３５に上昇したとき４０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が６０に上昇したとき８０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加し、ＯＤ６００が９０に上昇したとき１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地を流動的に添加した。
（４）発酵タンクからの排出：実施例１と同様である。
効果例
（１）発酵中の試料検出
１．吸光度の検出：実施例１および比較例１～比較例４において、発酵開始後４時間毎に発酵ブロスをサンプリングし、発酵ブロスのＯＤ６００値を紫外線分光光度計で検出し記録した。成長曲線がプロットされた。
（１）発酵中の試料検出
１．吸光度の検出：実施例１および比較例１～比較例４において、発酵開始後４時間毎に発酵ブロスをサンプリングし、発酵ブロスのＯＤ６００値を紫外線分光光度計で検出し記録した。成長曲線がプロットされた。
２．酵素活性の検出：基質として１０重量％フルクトース溶液（リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０、１ｍＭのＭｎ２＋を含有）を用い、比較例１～比較例４の発酵ブロスを適量加え、６０℃で２０分間反応させた。反応後、反応系を沸騰水浴中で５分間処理し、生成物であるＤ－プシコースの含有量をＨＰＬＣで測定し、そこから酵素活性を算出した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる検出：
実施例１、比較例１および比較例４で調製した粗酵素液を同じ酵素活性（１００Ｕ／ｍＬ）になるように希釈し、ローディングバッファーを加えて均一に混合し、１００℃で１０分間煮沸した。試料を１０μＬの容量でローディングし、抽出ゲル１２％、濃縮ゲル５％、定電圧１００Ｖ等の条件で、電気泳動を行った。
実施例１、比較例１および比較例４で調製した粗酵素液を同じ酵素活性（１００Ｕ／ｍＬ）になるように希釈し、ローディングバッファーを加えて均一に混合し、１００℃で１０分間煮沸した。試料を１０μＬの容量でローディングし、抽出ゲル１２％、濃縮ゲル５％、定電圧１００Ｖ等の条件で、電気泳動を行った。
本発明者は、予想外に、遺伝子操作された組換え枯草菌Ｂ－３－１株による酵素分泌速度が、発酵培養プロセス中に制限されることを見出した。比較例１では、発酵中期および発酵後期の細胞においても高い酵素活性が検出され、一部の酵素が細胞の外部に分泌されていないことが示された。さらに一定期間培養すると、細胞密度が低下する。この時、酵素活性が最も高くなることから（表１、図３）、細胞が溶解され細胞内の酵素を放出していることが示唆される。しかし、細胞の溶解によって細胞内の不純タンパク質も放出されるため、粗酵素液中の不純タンパク質が多くなり、精製の難易度とコストが増加する（図６）。
比較例２は、実施例１とは、３７℃での定温発酵が異なり、比較例１とは、流加発酵が異なる。図３から分かるように、比較例１と比較して、比較例２の流加発酵は、発酵タンク内の細胞密度および酵素活性を向上させることができるが、実施例１の酵素活性は比較例２よりも有意に高く、発酵中期および発行後期の培養温度を適温まで上昇させることにより、目的酵素の分泌を促進させることができることが、示されている。
比較例３は、実施例１とは、発酵中期および発酵後期に４０℃に昇温する流加無しの発酵が、異なる。図４からわかるように、発酵中期と発酵後期に培養温度を上げるだけでは、細胞密度および酵素活性を効果的に改善させることはできない。しかし、比較例１と比較すると、発酵期間を４８時間から４０時間に短縮することができ、発酵中の酵素活性は比較例１と大差ない。さらに、発酵後期に温度を上げることで、酵素の分泌速度を加速させることができることを示している。
比較例４は、発酵培地および流加培地に無機窒素源である塩化アンモニウムを使用する点が、実施例１と異なる。図５から分かるように、無機窒素源を使用すると、細胞密度が低下し、酵素活性が少なくとも１倍低下する。実施例１で使用される有機窒素源は、細胞の代謝負荷を軽減し、細胞密度とプシコース３－エピメラーゼの発現量とを増加させる。微生物の増殖および代謝には、有機窒素（ペプトン、酵母粉末など）を使用することが好ましい。無機窒素を利用する場合、微生物が自らの代謝によって無機窒素をアミノ酸に変換し、タンパク質の発現を完了させる必要がある。そのため、細胞の代謝負荷が大きくなり、タンパク質の発現に影響が及ぼされる。図１および図５からわかるように、実施例１、比較例４ともに高密度発酵を採用しているが、タンパク質発現量は１倍を超えて異なっている。これは、発酵プロセスで使用する窒素源の種類に起因する可能性がある。無機窒素は細胞の増殖を促進し、有機窒素はタンパク質の発現を促進する。
図１および図６から、実施例１の発酵中の流加コントロールにより、細胞密度が連続的に上昇し続けていることがわかり、発酵後期に培養温度を上昇させることにより、細胞膜の透過性が向上し、酵素分泌速度が著しく向上していることがわかる。細胞内酵素や不純タンパク質を放出するために細胞を溶解する必要がなく、発酵期間が短縮され、それに伴い粗酵素液の純度も向上する。実施例１の方法を用いると、タンクから排出される際の細胞密度は約６倍増加し、酵素活性は約２倍増加する。
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらに限定されない。本発明の趣旨および原理から逸脱することなくなされた他の変更、修正、代替、組み合わせ、簡略化は、すべて同等の代替物であり、本発明の保護範囲に含まれる。
Claims (4)
- 高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法であって、
（１）菌株の活性化
組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を活性化培地に接種して活性化し、活性化種細胞懸濁液を得るステップ；および
（２）発酵培養
ステップ（１）で培養した前記活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１～１０体積％添加し、発酵させるステップであって、前記発酵条件の初期設定が、温度３７．０℃、空気流量１～６Ｌ／分、酸素流量０～３Ｌ／分、および回転数２００～１０００ｒｐｍ、を含み、発酵プロセスをコントロールするために、発酵の際に、溶存酸素が、１０％～２０％の範囲でコントロールされ、ＯＤ６００が８０～１２０に上昇すると発酵温度が４０～４２℃に上昇され、発酵プロセスの際に、ＯＤ６００が５～２０に上昇すると流加培地が１０～３０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が３０～５０に上昇すると前記流加培地が３０～６０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が５０～８０に上昇すると前記流加培地が５０～９０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加され、ＯＤ６００が８０～１００に上昇すると前記流加培地が９０～１２０ｍＬ／時間の流量で流動的に添加される、ステップ、
を含み、
ここで、ステップ（１）における前記組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が、遺伝子操作された組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ－３－１株である、方法。 - ステップ（１）における前記活性化培地が、ペプトン５～１５ｇ／Ｌ、酵母粉末１～５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８～１２ｇ／Ｌ、およびカナマイシン２５～５０ｍｇ／Ｌを含み、
ステップ(１)における前記組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の前記活性化が、
一次株活性化：凍結した組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞懸濁液を前記活性化培地に０．１～１体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、一次活性化種細胞懸濁液を得ることであって、ここで培養温度が３７．０℃、回転数が１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間が１８～２４時間であること；および
二次株活性化：培養した前記一次活性化種細胞懸濁液を活性化培地に１～１０体積％接種し、一定温度で振盪しながら培養し、二次活性化種細胞懸濁液を得ることであって、ここで、培養温度が３７．０℃、回転数が１８０～２２０ｒｐｍ、培養時間が６～１２時間であること、を含む、請求項１に記載の、高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法。 - ステップ(２)における前記発酵培地が、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１５ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．１ｇ／Ｌ、およびグルコース６ｇ／Ｌを含み；
ステップ(２)における前記流加培地が、１０～３０重量％のグルコースおよび１０～３０重量％の酵母粉末を含み、
ステップ（２）における前記発酵培養が、
発酵培養：ステップ（１）で培養した前記活性化種細胞懸濁液を発酵培地に１０体積％添加し、発酵させること、を含み、
前記発酵条件の初期設定が、温度３７．０℃、空気流量５Ｌ／分、酸素流量１Ｌ／分、回転数８００ｒｐｍを含み、発酵プロセスをコントロールするために、発酵の際に、溶存酸素が１５％にコントロールされ、ＯＤ６００が１００に上昇すると発酵温度が４０℃に上昇され、発酵の際に、ＯＤ６００が１０に上昇すると１５ｍＬ／時間の流量で流加培地が流動的に添加され、ＯＤ６００が３５に上昇すると４０ｍＬ／時間の流量で流加培地が流動的に添加され、ＯＤ６００が６０に上昇すると８０ｍＬ／時間の流量で流加培地が流動的に添加され、ＯＤ６００が９０に上昇すると１１０ｍＬ／時間の流量で流加培地が流動的に添加される、請求項１に記載の、高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法。 - 酵素活性がそれ以上上昇しなくなった時点で発酵を停止し、固液分離して粗酵素液を得、さらに精製してプシコース３－エピメラーゼを得るステップ、をさらに含む、請求項１に記載の、高密度発酵によりプシコース３－エピメラーゼを製造するための方法。
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