CN116218933B - 一种两阶段混菌发酵棉粕及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及棉粕发酵技术领域，提供了一种两阶段混菌发酵棉粕及其制备方法和应用。本发明提供的一种两阶段混菌发酵棉粕的方法，包括如下步骤：在棉粕发酵物中接种屎肠球菌种子液，进行脱毒处理；在脱毒后的棉粕发酵物中接种米曲霉发酵剂，进行降解处理；降解后的棉粕发酵物烘干、粉碎，得到发酵棉粕。本发明利用屎肠球菌和米曲霉对棉粕进行混菌固态发酵，在降低FG含量的同时，提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品质，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及棉粕发酵技术领域，尤其涉及一种两阶段混菌发酵棉粕及其制备方法和应用。
背景技术
棉粕作为棉花的副产品拥有巨大的商业价值。棉粕中氨基酸含量高且粗蛋白含量仅次于豆粕，是一种优质的植物性蛋白饲料。但其中的游离棉酚(FG)对动物体的肾脏，生殖功能等具有一定的毒害作用，这就大大限制了它在饲料中的应用。因此现有的研究主要集中于棉籽粕的脱毒，而对于在降解毒素的同时提高其蛋白品质的研究鲜有进行。
在棉籽粕脱毒发酵工艺中，一般采用混菌发酵方式。目前混菌发酵方式大都采用酵母菌和芽孢杆菌进行发酵脱毒，常用菌种有酿酒酵母，产朊假丝酵母，枯草芽孢杆菌等。此类微生物虽然有较好的脱毒能力，但其对提高蛋白品质的效果不佳。另外，目前的混菌发酵通常采用混菌同步发酵，不能将微生物的作用最大化。因此，对棉粕混菌发酵方法的改良是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种两阶段混菌发酵棉粕，最大限度的发挥微生物降解游离棉酚和分解大分子蛋白的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种两阶段混菌发酵棉粕的方法，包括如下步骤：
(1)在棉粕发酵物中接种屎肠球菌种子液，进行脱毒处理；
(2)在步骤(1)脱毒后的棉粕发酵物中接种米曲霉发酵剂，进行降解处理；
(3)将步骤(2)降解处理后的棉粕发酵物烘干、粉碎，得到发酵棉粕。
优选地，步骤(1)中所述棉粕发酵物包括如下重量份的成分：棉粕80～90份、玉米粉5～15份、麸皮2～8份；所述棉粕发酵物的初始发酵水分为55～60％。
优选地，步骤(1)中所述屎肠球菌种子液的制备方法为：将菌浓度为8.8×108～9.0×108CFU/mL的屎肠球菌按照体积百分比1.5～2.5％接入pH为6.2～6.8得出MRS培养基中，在34～40℃下培养21～27h。
优选地，步骤(1)中所述接种为按照质量百分比2～3％在棉粕发酵底物中接种屎肠球菌种子液；所述脱毒处理的温度为34～40℃；所述发酵时间为20～28h。
优选地，步骤(2)中所述米曲霉发酵剂的制备方法为：将菌浓度为8.2×105～8.8×105CFU/mL的米曲霉按照质量百分比8.1～8.7％接入装有麸皮种子培养基中，在27～33℃下培养69～75h。
优选地，所述麸皮种子培养基包括麸皮、面粉和水，所述麸皮、面粉和水的质量比为6～8：2～4：4～6。
优选地，步骤(2)中所述接种为按照质量百分比2～3％在棉粕发酵底物中接种米曲霉发酵剂；所述降解处理的温度27～33℃；所述发酵时间为69～75h。
优选地，所述烘干温度为65～75℃；所述烘干时间为21～27h；所述粉碎目数为20～60目。
本发明提供了一种两阶段混菌发酵棉粕的方法得到的发酵棉粕。
本发明提供了一种发酵棉粕在制备饲料中的应用。
本发明以屎肠球菌和米曲霉为发酵菌，采用混菌分步发酵法。在棉粕底物中，先接种屎肠球菌发酵1d后，再接种米曲霉发酵3d，最大限度的发挥了各菌株降解游离棉酚和分解大分子蛋白的作用，本发明在没有添加外接酶的情况下，酸溶蛋白仍有显著提升。因此，本发明达到了在降低FG含量的同时，提高了棉粕蛋白的利用率，改善了棉粕品质。本发明可以为工业饲料的生产和固态发酵系统的研究提供有价值的参考案例。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中单菌固态发酵实验中不同菌种对棉粕底物中游离棉酚的脱毒率柱状图；其中，1代表米曲霉、2代表黑曲霉、3代表产朊假丝酵母、4代表植物乳杆菌、5代表屎肠球菌、6代表枯草芽杆菌、7代表地衣芽孢杆菌；
图2为实施例1中单菌固态发酵实验中不同菌种对棉粕底物的蛋白品质提升效果柱状图；其中，1代表黑曲霉、2代表酿酒酵母、3代表产朊假丝酵母、4代表植物乳杆菌、5代表屎肠球菌、6代表枯草芽杆菌、7代表地衣芽孢杆菌、8代表米曲霉、9代表贝莱斯芽孢杆菌；
图3为实施例2中不同菌种混菌固态发酵对酸溶蛋白和粗蛋白、脱毒率影响的柱状图；A代表屎肠球菌+地衣芽孢杆菌、B代表屎肠球菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉、C代表屎肠球菌+米曲霉、D代表屎肠球菌+植物乳杆菌、E代表屎肠球菌+植物乳杆菌+米曲霉、F代表屎肠球菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉+植物乳杆菌；J代表植物乳杆菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉；
图4为实施例3中两菌同步或两步固态发酵后棉粕中游离棉酚的含量；其中，1表示同步固态发酵、2表示两阶段固态发酵、3：空白对照；
图5为实施例4中不同初始水分含量对粗蛋白和酸溶蛋白含量的影响；
图6为实施例4中不同接种量对粗蛋白和酸溶蛋含量的影响；
图7为实施例4中米曲霉不同发酵温度对粗蛋白和酸溶蛋白含量的影响；
图8为实施例4中米曲霉不同发酵时间对粗蛋白和酸溶蛋白含量的影响；
图9为实施例5不同两阶段发酵方式对发酵效果的影响图；其中1表示先接种屎肠球菌，再接种米曲霉的两阶段固态发酵；2表示先接种屎肠球菌，再接种米曲霉的两阶段液态发酵；3表示先接种米曲霉，再接种屎肠球菌的两阶段固态发酵。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用单菌进行固态发酵
本实施例采用米曲霉、黑曲霉、产朊假丝酵母、植物乳杆菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌单独对棉粕发酵物进行发酵。具体的：
将菌浓度为8.5×105CFU/g米曲霉按照质量百分比2％接种至麸皮种子培养基(麸皮：面粉：水质量为7：3：5)，在30℃下培养72h，使菌种酶活达到最大，得到米曲霉种子，备用。
将菌浓度为7.9×105CFU/g黑曲霉按照质量百分比2％接种至30g麸皮种子培养基(麸皮：面粉：水质量为7：3：5)，在30℃下培养72h，使菌种酶活达到最大，得到黑曲霉种子，备用。
将菌浓度为5.5×107CFU/mL产朊假丝酵母按照质量百分比2％接种至优化后的产朊假丝酵母培养基，在28℃下培养24h,得到产朊假丝酵母种子，备用。产朊假丝酵母培养基：葡萄糖19.86g、酵母膏9.56g、K2HPO41.45g、MgSO 1.12g，蒸馏水1000mL，pH值为5。
将菌浓度为8.6×108CFU/mL植物乳杆菌按照质量百分比2％接种至200mL的MRS培养基，在37℃的恒温培养箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌种子，备用。MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉37g、葡萄糖20g、吐温80 1.08g、无水磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、无水柠檬酸三铵/柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、L-半胱氨酸0.5g、乳糖20g、食用消泡剂琼脂15g、蒸馏水1000mL。
将菌浓度为8.9×108CFU/mL的屎肠球菌按照体积百分比2％接种到200mL的MRS培养基中，在37℃的恒温培养箱中静置培养24h，得到屎肠球菌种子，备用。MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉膏粉8g、酵母膏粉37g、葡萄糖20g、吐温80 1.08g、无水磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、无水柠檬酸三铵/柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、L-半胱氨酸0.5g、乳糖20g、食用消泡剂琼脂15g、蒸馏水1000mL。
将菌浓度为7.08×108CFU/mL枯草芽孢杆菌按照质量百分比2％接种至200ml的枯草芽孢杆菌优化培养基，在37℃的恒温摇床中静置培养24h，得到枯草芽孢杆菌种子，备用。枯草芽孢杆菌培养基：可溶性玉米淀粉67.0g、糖蜜14.1g、蛋白胨10g、K2HPO4·3H2O 9.2g及MgSO4·7H2O 1.5g。
将菌浓度为4.4×105CFU/mL地衣芽孢杆菌按照质量百分比2％接种至100mL优化后的地衣芽孢杆菌培养基，在30℃培养24h，得到地衣芽孢杆菌种子，备用。地衣芽孢杆菌培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉15g、牛肉浸粉3g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、加蒸馏水至1L。pH7.2，25℃得到地衣芽孢杆菌种子，备用。
上述的发酵时间均是通过酶活时间曲线测定的最大酶活培养时间。
将上述7种单菌分别接种到棉粕发酵物中，其中米曲霉种子的接种量为2.5％、黑曲霉种子的接种量为2.5％、产朊假丝酵母种子的接种量为2.5％、植物乳杆菌种子的接种量为2.5％、屎肠球菌种子的接种量为2.5％、枯草芽孢杆菌种子的接种量为2.5％、地衣芽孢杆菌种子的接种量为2.5％。接种后米曲霉和黑曲霉在30℃下培养3天，植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌在37℃下培养1天，产朊假丝酵母在30℃下培养1天。培养结束后，测定每种单菌发酵后游离棉酚的含量。游离棉酚根据GB/T13086-2020测定，计算脱毒率((发酵后物料游离棉酚含量/发酵前物料游离棉酚含量)*100)。结果如图1所示。测定每种单菌发酵后蛋白的含量，粗蛋白根据GB/T6432-2018测定；酸溶蛋白根据GB/T22492—2008测定；蛋白溶解度根据GB/T19541-2017测定。结果如图2所示。
从图1可以看出，屎肠球菌5的脱毒率最佳，其次是植物乳杆菌4、黑曲霉2、地衣芽孢杆菌7、产朊假丝酵母3、枯草芽孢杆菌6，米曲霉1的脱毒效果最差。因此，选择脱毒效果较好的单菌(屎肠球菌、植物乳杆菌、黑曲霉、地衣芽孢杆菌)进行后续的混菌实验，但由于黑曲霉发酵后饲料的感官条件不佳，因此，仅选择脱毒效果好的屎肠球菌、植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌进行后续的混菌实验。
从图2中可以看出。米曲霉和黑曲霉将蛋白质分解成小分子肽的能力较强，但由于黑曲霉发酵后饲料的感官条件不佳，因此将米曲霉选为降解蛋白的菌种。
实施例2
不同菌种混菌固态发酵
在实施例1的基础上，本实施例选择米曲霉为降解蛋白菌种，选择屎肠球菌、植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌作为脱毒菌种，进行混菌固态发酵实验。具体的：
将菌浓度为8.5×105CFU/g米曲霉按照质量百分比2％接种至麸皮种子培养基(麸皮：面粉：水质量为7：3：5)，在30℃下培养72h，使菌种酶活达到最大，得到米曲霉种子，备用。将培养24h的种子液加入无菌水稀释至5×105CFU/mL，再进行后续接种。
将菌浓度为8.9×108CFU/mL的屎肠球菌按照体积百分比2％接种到200mL的MRS培养基中，在37℃的恒温培养箱中静置培养24h，得到屎肠球菌种子，备用。MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉37g、葡萄糖20g、吐温80 1.08g、无水磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、无水柠檬酸三铵/柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、L-半胱氨酸0.5g、乳糖20g、食用消泡剂琼脂15g、蒸馏水1000mL。将培养24h的种子液加入无菌水稀释至5×105CFU/mL，再进行后续接种。
将菌浓度为4.4×105CFU/mL地衣芽孢杆菌按照质量百分比2％接种至100ml优化后的地衣芽孢杆菌培养基，在30℃培养24h,得到地衣芽孢杆菌种子，备用。地衣芽孢杆菌培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉15g、牛肉浸粉3g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、加蒸馏水至1L。pH7.2，25℃得到地衣芽孢杆菌种子，备用。
将菌浓度为8.6×108CFU/mL植物乳杆菌按照质量百分比2％接种至200ml的MRS培养基，在37℃的恒温培养箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌种子，备用。MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉37g、葡萄糖20g、吐温80 1.08g、无水磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、无水柠檬酸三铵/柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、L-半胱氨酸0.5g、乳糖20g、食用消泡剂琼脂15g、蒸馏水1000mL。将培养24h的种子液加入无菌水稀释至5×105CFU/mL，再进行后续接种。
将不同菌种进行组合，其中米曲霉种子的接种量为2.5％，黑曲霉种子的接种量为2.5％、产朊假丝酵母种子的接种量为2.5％、植物乳杆菌种子的接种量为2.5％、屎肠球菌种子的接种量为2.5％、枯草芽孢杆菌种子的接种量为2.5％、地衣芽孢杆菌种子的接种量为2.5％。
按照实施例1的方法得到米曲霉、屎肠球菌、植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌的种子，按照特定比例混合，并按照5％的质量比接种到棉粕发酵物中。4种菌的组合及配比如下：
A：屎肠球菌+地衣芽孢杆菌，质量比1：1；
B：屎肠球菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉，质量比1：1：1；
C：屎肠球菌+米曲霉，质量比1：1；
D：屎肠球菌+植物乳杆菌，质量比1：1；
E：屎肠球菌+植物乳杆菌+米曲霉，质量比1：1：1；
F：屎肠球菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉+植物乳杆菌，质量比1：1：1：1；
J：植物乳杆菌+地衣芽孢杆菌+米曲霉，质量比1：1：1；
接种后，接种接种后米曲霉和黑曲霉在30℃下培养3天，植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌在37℃下培养1天，产朊假丝酵母在30℃下培养1天。发酵结束后，测定粗蛋白、酸溶蛋白和游离棉酚的含量，并计算脱毒率。粗蛋白根据GB/T6432-2018测定；酸溶蛋白根据GB/T22492—2008测定；蛋白溶解度根据GB/T19541-2017测定；游离棉酚根据GB/T13086-2020测定。结果如图3所示。
从图3中可以看出，各组粗蛋白含量差异不显著，除D组和J组外，其他组酸溶蛋白含量差异也不显著。D组酸溶蛋白含量显著下降，说明米曲霉和植物乳杆菌混合发酵时，不利于酸溶蛋白含量的提高。所有组中C组粗蛋白及酸溶蛋白质量分数均最高，分别为44.25％、19.57％；相比于未发酵棉粕(J组)分别提高了11％和75.3％。C组混菌发酵后脱毒率可达到94.79％。
从B、C组的脱毒率可以看出，B组的脱毒率相对于C组显著下降，这表明虽然屎肠球菌和地衣芽孢杆菌都是脱毒效果较强的菌株，但是混合使用具有拮抗作用。再结合D、E、F组的实验结果也发现，不同菌种混合发酵具有不同程度的拮抗或协同作用。
因此选择使用屎肠球菌和米曲霉混菌发酵棉粕底物。
实施例3
本实施例采用实施例2中筛选的屎肠球菌和米曲霉的组合进行同步和两阶段混菌发酵。
本实施例中使用的屎肠球菌种子液和米曲霉发酵剂同实施例1。
(1)屎肠球菌和米曲霉同步固态发酵：
在100g棉粕发酵底物(棉粕：玉米粉：麸皮＝85g：10g：5g，含水量55％)，同时接种屎肠球菌种子液和米曲霉发酵剂，二者的质量比为1：1的屎肠球菌种子液(2.5g＝2.78mL)和米曲霉发酵剂(2.5g)。置于35℃下发酵72h。得到发酵棉粕。
(2)屎肠球菌和米曲霉两阶段固态发酵
准备100g棉粕发酵底物(棉粕：玉米粉：麸皮＝85g：10g：5g，含水量55％)，按照质量百分比2.5％接种屎肠球菌种子液(2.5g＝2.78mL)，在37℃下脱毒处理1d；然后按照质量百分比2.5％接种米曲霉发酵剂(2.5g)，在30℃下降解处理3d。得到发酵棉粕。
(3)空白对照
对棉粕发酵物(棉粕：玉米粉：麸皮＝85g：10g：5g，含水量55％)进行在0.1MPa下，120℃灭菌15min。获得灭菌棉粕。
将上述三组制备的发酵棉粕和灭菌棉粕在70℃下烘干24h，粉碎后过40目筛网，取粉末用于测定游离棉酚含量，结果如图4所示。
从图4中可以看出，未经发酵处理的灭菌棉粕游离棉酚含量较高，为1370mg/kg。经过(1)、(2)发酵处理的发酵棉粕中游离棉酚含量显著下降，但是两阶段固态发酵法优于同步发酵。两阶段固态发酵的棉粕中游离棉酚含量为44mg/kg，传统的同步固态发酵的棉粕中游离棉酚含量为129mg/kg。
实施例4
本实施例以粗蛋白和酸溶蛋白的含量为指标对两阶段发酵的实验参数进行优化。
按照实施例3中两阶段固态发酵工艺进行接种、发酵处理，对比不同水分含量(45％、50％、55％、60％、65％)，不同接种量(1％、3％、5％、7％、9％)；以及米曲霉发酵阶段的不同发酵温度(26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、不同发酵时间(以接种米曲霉后开始计算，48h、72h、96h、120h)对粗蛋白和酸溶蛋白含量的影响，确定发酵的最佳工艺参数。
在上述实验发酵完成后，将发酵产物于70℃烘24h，粉碎过40目筛。测定各组粗蛋白和酸溶蛋白含量。结果如图5～8所示。
1.初始水分
棉籽粕经混菌在不同初始水分下发酵后的粗蛋白和酸溶蛋白质量分数有所变化。如图5所示，当初始发酵水分小于55％时，酸溶蛋白质量分数较低。当初始发酵水分提高至55％时，发酵后棉籽粕的酸溶蛋白质量分数提高至24.65％，相比空白对照(未发酵的棉粕底物)提高了19.43％，但当初始发酵水分超过55％，酸溶蛋白的质量分数明显下降(p＜0.05)，因此，55％为混菌发酵棉籽粕提高酸溶蛋白的最佳初始发酵水分。
2.接种量
图6为混菌发酵在不同接种量下发酵棉籽粕后的粗蛋白和酸溶蛋白质量分数。结果表明，当混菌接种量在3％～5％时，粗蛋白和酸溶蛋白的质量分数有显著提升(p＜0.05)，但当接种量超过5％时，粗蛋白和酸溶蛋白的质量分数随着接种量的升高而降低。
3.发酵温度
根据实施例1的实验结果可知，米曲霉是影响蛋白降解的菌株，因此，本实施例仅对米曲霉的发酵温度和发酵时间优化。
米曲霉在不同温度下发酵棉籽粕72h后的酸溶蛋白质量分数也有所不同。如图7所示，当米曲霉在26～30℃之间发酵时，酸溶蛋白的质量分数有显著上升(p＜0.05)，但当发酵温度超过30℃时，酸溶蛋白的质量分数随着温度的升高而降低。其适宜的发酵温度为30～32℃。
由于固态发酵不利于散热，因此在发酵过程中物料实际温度会高于所设温度，较高的温度可能对米曲霉的生长产生了不利影响，减弱了米曲霉的产酶能力，从而导致降解大分子蛋白的能力下降，以酸溶蛋白的提高为标准，试验表明，30℃是发酵棉粕较为合适的温度。
4.发酵时间
图8为混菌发酵在不同发酵时间下发酵棉籽粕后的粗蛋白和酸溶蛋白质量分数。结果表明，当米曲霉发酵时间在72h～96h时，粗蛋白的质量分数有显著提升(p＜0.05)，但当发酵时间延长至120h时，粗蛋白和酸溶蛋白的质量分数随着时间的升高而降低。因此，米曲霉适宜的发酵时间为72～96h。
但随着发酵时间的增加，营养物质和培养基pH值逐渐降低，发酵微生物生长缓慢，蛋白酶活性逐渐丧失。在发酵后期，培养基中含有大量的有机酸，酸解对蛋白质的降解起主要作用，但这种降解过程效率低，耗时长。因此，酸溶蛋白含量的几乎没有改变。考虑到发酵的周期以提高生产效率，确定最佳的发酵时间为72h。
综上，本实施例对实施例3中采用的两阶段固态发酵工艺参数进行了验证，结果表明，实施例3中两阶段固态发酵工艺能够最大限度的提高粗蛋白和酸溶蛋白的含量。
实施例5
在上述实施例3、4的基础上，对两阶段固态发酵的不同方式进行比较。
(1)固体发酵1：同实施例3。
(2)液态发酵2：与实施例3的区别在于，调整棉粕发酵底物的含水量时采用屎肠球菌种子液，将含水量调整为55％，形成液态发酵的环境。其他步骤同实施例3。
(3)固态发酵3：与实施例3相比，区别在于在棉粕发酵物中先接种米曲霉发酵剂，再接种屎肠球菌种子液。
测定上述发酵产品中游离棉酚的含量，结果如图9所示。从图9可以看出，虽然同为两阶段发酵，但是不同两阶段发酵方式对发酵效果的影响也较大，其中以本发明实施例3的发酵方式最优。
由于液态发酵用屎肠球菌种子液代替水调整发酵底物的含水量，导致屎肠球菌的接种量增大，不足以支撑后续加入的米曲霉的生长，导致米曲霉对大分子蛋白分解能力降低，酸溶蛋白含量提升效果较差。因此选择只加入少量且比例适宜的屎肠球菌种子液进行固态发酵，能同时满足屎肠球菌和米曲霉的生长，促进其对游离棉酚的降解和大分子蛋白的分解。
此外，发酵方式3将屎肠球菌和米曲霉的接种顺序对调后，降解游离棉酚的效果显著变差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种两阶段混菌发酵棉粕的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在棉粕发酵物中接种屎肠球菌种子液，进行脱毒处理；
(2)在步骤(1)脱毒后的棉粕发酵物中接种米曲霉发酵剂，进行降解处理；
(3)将步骤(2)降解处理后的棉粕发酵物烘干、粉碎，得到发酵棉粕。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述棉粕发酵物包括如下重量份的成分：棉粕80～90份、玉米粉5～15份、麸皮2～8份；所述棉粕发酵物的初始发酵水分为55％～60％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述屎肠球菌种子液的制备方法为：将菌浓度为8.8×10 8～9.0×10 8 CFU/mL的屎肠球菌按照体积百分比1.5％～2.5％接入pH为6.2～6.8的MRS培养基中，在34～40℃下培养21～27h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述接种为按照质量百分比2％～3％在棉粕发酵底物中接种屎肠球菌种子液；所述脱毒处理的温度为34～40℃；所述脱毒处理的时间为20～28h。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述米曲霉发酵剂的制备方法为：将菌浓度为8.2×10 5～8.8×10 5 CFU/mL的米曲霉按照质量百分比8.1％～8.7％接入装有麸皮种子培养基中，在27～33℃下培养69～75h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述麸皮种子培养基包括麸皮、面粉和水，所述麸皮、面粉和水的质量比为6～8：2～4：4～6。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述接种为按照质量百分比2％～3％在棉粕发酵底物中接种米曲霉发酵剂；所述降解处理的温度27～33℃；所述降解处理的时间为69～75h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烘干的温度为65～75℃；所述烘干的时间为21～27h；所述粉碎的目数为20～60目。
9.一种权利要求1～8任一项所述的两阶段混菌发酵棉粕的方法得到的发酵棉粕。
10.一种权利要求9所述的发酵棉粕在制备饲料中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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