CN100427583C - 高糖化酶活的菌种、酶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖化酶制剂及其制备方法和应用。本发明获得一株高糖化酶活黑曲霉突变株IN7-31，保藏号为CGMCC No.1818，该突变株糖化酶活力是出发菌株的3.5倍左右，能够有效提高淀粉质原料的利用率。应用该突变株建立了固态、液态发酵法生产糖化酶制剂新工艺。制得的麸曲糖化酶制剂酶活力可达7000～12000单位/g(mg/h)。液态糖化酶制剂酶活力可达2200～4200单位/ml。同时，该菌株还具有产酶速度快、不产生色素、无霉腐味等特点，由该菌株制备的糖化酶制剂可广泛应用于发酵、酿造产品的生产及其他降解淀粉质原料的生产活动。
Description
技术领域
本发明涉及酶，属于糖化酶，具体是一种高糖化酶活的菌种、酶制剂及其制备方法和应用。
技术背景
酶工程是生物工程的一个重要组成部分，而糖化酶从来就是酶工程研究的重点方向之一。目前，糖化酶的理论研究主要集中在酶结构的多型性、催化反应动力学、酶基因及其代谢调控等方面，而应用研究依然集中在糖化酶高活力菌株的选育、酶的固定化和酶制剂的推广应用技术等方面。
在糖化酶高活力菌株选育及酶制剂应用技术方面，曾经在我国出现过一个研究高潮，取得了一批成果，并且有一些糖化酶高活力菌株实现了产业化生产，有力地推动了相关产业的发展。然而由于种种原因，近10年来这方面的研究工作处于一个低潮期，相关的成果报道锐减，于是造成了当前研究工作滞后于生产发展需求的尴尬局面。目前，糖化酶研究与应用的基本现状是：
1、酶活力单位不统一，轻工部GB/T1803-93标准(轻工部部颁标准：工业用糖化型淀粉酶质量标准)规定：“在最适条件下，每小时转化淀粉质底物产生1mg葡萄糖称为1个酶活单位”(定义1)。但也有人将“在最适条件下，每分钟转化淀粉质底物产生1ug葡萄糖定义为1个酶活单位”(定义2)。两个酶活单位差别较大，造成了概念混乱与使用错误，有些文献报道甚至出现自相矛盾的结果。
2、由于菌种选育过程耗时长，工作量大，定向性差，成功率低，近年来对这一研究的人力、财力、精力投入越来越少。因此，近10年来只有少数研究报道，例如1999年，无锡轻院的谷海先等报道其选育的糖化酶高产菌株发酵液糖化酶酶活为1736单位/ml，折合定义2表示为28991单位/ml。
3、目前，国内糖化酶制剂的生产方式主要有两种，即液态发酵法和固态发酵法。液态发酵法的糖化酶活力处在如下水平：例如，1998年大连酿酒厂报道其发酵生产水平为890单位/ml，折合定义2表示为14863单位/ml。又如，2001年江西豪德集团生物工程有限公司德糖化酶生产水平平均在1800单位/ml，折合定义2表示为30060单位/ml，通过补料发酵方式可以提高至2280～2400单位/ml，折合定义2表示为38076～40080单位/ml。糖化酶活力普遍不高。采用固态发酵法，糖化酶发酵产品包括麸曲和大曲两种，麸曲是由糖化酶活力较高的菌株制备的固态糖化酶制剂，而大曲则是由多种功能微生物组成的固态混合发酵剂。麸曲的糖化酶活多在2400单位/g，折合定义2表示为40080单位/g以下，而大曲的糖化酶活则更低，一般在1000单位/g，折合定义2表示为16700单位/g左右。例如，2006年湘西河溪香醋厂使用的麸曲优势菌种糖化酶活力为1798单位/g，折合定义2表示为30026单位/g。汾酒大曲的糖化酶活平均在1200单位/g左右，折合定义2表示为20040单位/g。此外，多数麸曲糖化酶生产菌株会产生大量的色素，且成曲后有难闻的霉腐味，严重影响着糖化酶制剂的应用。
4、目前，糖化酶制剂被广泛地应用于酒精、白酒、黄酒、抗生素、有机酸、食醋等产品的生产中。精制糖化酶不仅运用于很多的发酵生产中，也被一些食品加工行业使用，例如有报道在雪糕生产中可使用糖化酶降解淀粉原料以改善产品的组织构造和形体状态。而粗酶制剂(例如大曲或麸曲)则多用于传统酿造产品的生产过程中，例如山西的汾酒、老陈醋等酿造产品就是使用特制的大曲作为其糖化发酵剂。
但是，无论是液态发酵还是固态发酵制备的糖化酶制剂，当前存在的主要问题是生产菌株的糖化酶活力不高，尤其是在生产固态糖化酶制剂时会产生难闻的霉腐味及大量色素，严重影响固态糖化酶制剂的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种高糖化酶活的菌种，该菌种不仅糖化酶活力高，而且具有色素少、无霉腐味的特点；同时提供高糖化酶活麸曲和高糖化酶活液态制剂及其制备方法和两种制剂的应用。
本发明提供的一种高糖化酶活的菌种，是选用黑曲霉As3.4309，通过等离子诱变、氯化锂～紫外线复合诱变等诱变方法多次交叉处理，最终获得高糖化酶活菌株黑曲霉IN7-31，该菌株已于2006年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1818；分类命名：黑曲霉(Aspergillus niger)。
该菌株具有如下特征：
土豆培养基上生长较快，菌落直径7天可达5～6cm，菌落颜色为黄白色，培养基平板背面无色素，无霉腐味。
光学显微镜下观察可见菌丝很短，孢子较少，菌丝有横隔，小梗双层，分生孢子球形，直径4～7微米。
麸皮培养物无霉腐味，糖化酶酶活约为7000～12000单位/g(折合成单位2表示为116900～200400单位/g)，较出发菌株糖化酶酶活提高了约3.5倍。
该菌株试管传代5次产酶能力没有明显变化，产酶性状稳定。
本发明提供的一种高糖化酶活麸曲，采用麸皮培养基和保藏号为CGMCC No.1818的菌种在合适的条件下培养制得。
本发明提供的一种高糖化酶活麸曲的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将保藏号为CGMCC No.1818的菌种在斜面培养基活化2～4次；(2)将活化的菌种接入麸皮种子培养基，在25～33℃温度下培养24～96小时制得固态菌种：(3)将固态菌种接入麸皮培养基中，在25～33℃温度下通风培养70～100小时即制得高糖化酶活麸曲。
所述的步骤(1)中使用的斜面培养基可以为土豆培养基(即PDA培养基)；步骤(2)中使用的麸皮种子培养基可以是按重量份数计包括：麸皮100份，水100～120份；步骤(3)使用的麸皮培养基可以是按重量份数计包括麸皮95～100份，稻壳0～5份，玉米淀粉3～5份，硫酸铵0.5～1份，磷酸二氢钾0.3～0.5份，水100～120份。
所述的步骤(2)、(3)中培养温度优选为28～30℃。
所述的步骤(3)中接种量为5～10％；所述的通风培养具体优选条件为：通风量为1∶0.3～1∶0.5，通风培养36～54小时后，翻曲一次，调节通风量为1∶0.5～1∶1，共培养70～100小时即制得高酶活麸曲。
本发明一种高糖化酶活麸曲的用途，这种麸曲可广泛应用于酿酒、酿醋、酒精、有机酸等产品的生产中，由于该麸曲无霉腐味且不产生色素，尤其适合用于各种白酒、黄酒与食醋的酿造生产中。
本发明提供的一种高糖化酶活液态制剂，其特征在于采用液态发酵培养基和保藏号为CGMCC No.1818的菌种在合适的条件下培养制得。
本发明提供的一种高糖化酶活液态制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将保藏号为CGMCC No.1818的菌种在斜面培养基活化2～4次；(2)将活化的菌种接入液态菌种培养基，在25～33℃温度下培养24～72小时制得液态菌种；(3)将液态菌种接入液态发酵培养基中，控制pH为5～7，在25～33℃温度下，通风、搅拌培养50～100小时即制得高糖化酶活液态制剂。
所述的步骤(1)中使用的斜面培养基可以是土豆培养基(即PDA培养基)；步骤(2)中使用的液态菌种培养基可以是查氏培养基或土豆培养基；步骤(3)中使用的液态发酵培养基可以是按重量份数计包括：玉米粉6～12份，豆粉1～3份，麸皮1～3份，硫酸铵0.5～3份，磷酸氢二钾0.5～1.5份，磷酸二氢钾0.5～1.5份，水85～92份。
所述步骤(2)具体操作是：菌种在土豆斜面传代活化两次后，以无菌水洗下孢子，接种至液态菌种培养基中，优选培养条件：28～30℃、80～120rpm摇床培养36～48小时即制得液态菌种。
所述步骤(3)具体操作是：按5～10％接种量接种发酵培养基，控制通气量为1∶0.8～1∶1.2，溶氧为10％～20％。
所述的步骤(2)、(3)中培养温度优选为28～30℃。
所述的步骤(3)中pH优选为6。
本发明一种高糖化酶活液态制剂的用途，该种液态制剂主要用于制备精制糖化酶，以及在酿酒、酿醋、酒精、有机酸、抗生素等生产中的应用。
与现有技术相比本发明的优点与效果：
本发明的高糖化酶活菌株IN7-31生长速率与出发菌株As3.4309相差不大，但产酶速度则明显高于As3.4309。
IN7-31菌株糖化酶活力高，由该菌种制备的麸曲糖化酶酶活可达7000～12000单位/g曲粉(折合成单位2表示为116900～200400单位/g曲粉)，而由该菌种通过液态深层发酵制备的糖化酶发酵液糖化酶酶活可达2200～4200单位/ml(折合成单位2表示为36740～70140单位/ml)。
IN7-31菌株的液态深层发酵生产工艺简便，生产成本低，发酵液糖化酶酶活高，易于提取和纯化。
IN7-31菌株制备的麸曲除糖化酶活力高之外，还具有色素少、无霉腐味等特点，在阴凉条件下存放3个月酶活仅丧失30％左右，非常适合于酿造生产使用。
附图说明
图1IN7-31与As3.4309的菌落形态颜色比较图
图中，IN7-31菌落颜色为黄白色，As3.4309菌落颜色为深褐色。
本发明所述的菌种IN7-31已于2006年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1818。
具体实施方式
实施例1 黑曲霉IN7-31与出发菌黑曲霉As3.4309生产性状比较
1.菌种
黑曲霉IN7-31、黑曲霉As3.4309
2.培养基
斜面培养基：土豆培养基(PDA)，121℃、20min灭菌。
麸皮种子培养基；麸皮∶水＝1∶1，150mL三角瓶分装10g培养基，8层纱布封口，121℃、90min灭菌。
麸皮培养基：麸皮∶水＝1∶1，1000mL瓷缸分装200g培养基，棉花纱布封口，121℃、120min灭菌。
3.高糖化酶酶活麸曲的制备
种子培养物的制备：把斜面传代活化两次的黑曲霉菌株IN7-31和As3.4309以一定的接种量分别接种于麸皮种子培养基，28℃培养72小时制得生产菌种。
麸曲的制备：将IN7-31和As3.4309生产菌种以5％的接种量分别接种于麸皮培养基，即每缸接种10g生产菌种(As3.4309作为对照组)。置于28℃培养室，自缸假底处通风培养，通风量为1∶0.5，培养48小时后翻曲一次，并且将通风量提高至1∶1。84小时后停止培养，取样测定糖化酶活力。
4.结果
IN7-31麸曲糖化酶酶活为8248单位/g曲粉(折合定义2表示为137742单位/g曲粉)，而对照组As3.4309麸曲糖化酶酶活为2624单位/g曲粉(折合定义2表示为43820单位/g曲粉)。
实施例2 高糖化酶酶活麸曲制作1
1.麸皮培养基
麸皮∶玉米淀粉∶水＝100∶4∶100，
2.高糖化酶酶活麸曲的制备
把斜面传代活化两次的黑曲霉菌株IN7-31以一定的接种量分别接种于麸皮种子培养基，28℃培养72小时制得生产菌种。将IN7-31生产菌种以10％的接种量接种于麸皮培养基，置于28℃培养室，自缸假底处通风培养，通风量为1∶0.5，培养48小时后翻曲一次，并且将通风量提高至1∶1。70小时后停止培养，取样测定糖化酶活力。
3.结果
IN7-31麸曲糖化酶酶活为7540单位/g曲粉(折合定义2表示为125918单位/g曲粉)，换算为绝干曲酶活为11712单位/g曲粉(折合定义2表示为195590单位/g曲粉)。
实施例3 高糖化酶酶活麸曲制作2
1.麸皮培养基
麸皮∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶玉米淀粉∶水，＝100∶0.5∶0.3∶3∶120
2.高糖化酶酶活麸曲的制备
生产菌种的制备同实施例2。
将IN7-31生产菌种以5％的接种量接种于麸皮培养基，置于30℃培养室，自缸假底处通风培养，通风量为1∶0.5，培养48小时后翻曲一次，并且将通风量提高至1∶1。90小时后停止培养，取样测定糖化酶活力。
3.结果
IN7-31麸曲糖化酶酶活为8539单位/g曲粉(折合定义2表示为142601单位/g曲粉)。
实施例4利用高糖化酶酶活麸曲优化山西老陈醋传统酿造工艺
对照组1采用传统山西老陈醋酿酒工艺，按照规定比例混合高粱、大曲和水，每缸装料2kg，按工艺要求控制室温在25～28℃，发酵周期18天。对照组2与优化组分别以As3.4309和IN7-31麸曲置换掉一半大曲，其余工艺参数同传统生产工艺。对照组与优化组均施行三个平行试验。
发酵结束后，采用气相色谱检测发酵液中的酒精含量，并测定发酵醪的初糖和残糖。
结果见下表：
实施例5 摇瓶制备液态糖化酶制剂
1.培养基
土豆培养基：配方同实施例1，不加琼脂。
摇瓶发酵培养基：玉米粉8g，豆粉3g，硫酸铵0.05g，麸皮2g，水90ml，置于300ml三角瓶中，121℃、20min灭菌。
2.液态糖化酶的制备
生产菌种制备：把斜面传代活化两次的黑曲霉菌株IN7-31以一定的接种量接种于土豆培养基中，摇床转速120rpm，温度28℃，培养48小时制得生产菌种。
液态糖化酶的制备：将IN7-31生产菌种以5％的接种量分别接种于摇瓶发酵培养基中，置于28℃摇床发酵培养，摇床转速120rpm。96小时后停止培养，取样测定糖化酶活力。
3.结果
IN7-31摇瓶发酵液糖化酶酶活为2256单位/ml发酵液(折合定义2表示为37675单位/ml发酵液)。
实施例6 小型发酵罐制备液态糖化酶制剂
1.培养基
液态菌种培养基：土豆培养基(配方同实施例5)
发酵培养基：玉米粉60g，可溶性淀粉20g，豆饼粉10g，硫酸铵1.5g，麸皮10g，自来水900ml。121℃、40min灭菌。
2.液态糖化酶制剂的制备
菌种制备：取新鲜的IN7-31斜面一支，以无菌水洗下孢子，接种于液态菌种培养基中，28℃、120rpm摇床培养48h即制得液态菌种。
液态深层通气发酵制备糖化酶：采用5升全自动发酵罐进行试验，培养基为发酵培养基，装料系数为70％，接种量为10％，pH控制为6，温度控制为28℃，溶氧控制为20％，发酵过程中不补料，发酵92小时后测定发酵液糖化酶酶活。
3.结果
IN7-31的发酵液糖化酶酶活为3531单位/ml发酵液(折合定义2表示为58967单位/ml发酵液)。
实施例7 小型发酵罐制备液态糖化酶制剂
1.培养基
液态菌种培养基：土豆培养基(配方同实施例5)
发酵培养基：玉米粉100g，豆饼粉10g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g，麸皮10g，自来水900ml。121℃、40min灭菌。
2.液态糖化酶制剂的制备
菌种制备：同实施例6菌种制备。
液态深层通气发酵发酵制备糖化酶：采用5升全自动发酵罐进行试验，培养基为发酵培养基，装料系数为70％，接种量为10％，pH控制为6，温度控制为28℃，溶氧控制为20％，发酵过程中不补料，发酵65小时后测定发酵液糖化酶酶活。
3.结果
IN7-31的发酵液糖化酶酶活为4120单位/ml发酵液(折合定义2表示为68804单位/ml发酵液)。
Claims (10)
1、一种高糖化酶活的菌种，其特征在于所述菌种是黑曲霉IN7-31菌株，保藏号为CGMCCNo.1818。
2、一种高糖化酶活麸曲，其特征在于采用麸皮培养基和保藏号为CGMCC No.1818的菌种培养制得。
3、按照权利要求2所述的一种高糖化酶活麸曲的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将保藏号为CGMCC No.1818的菌种在斜面培养基活化2～4次；(2)将活化的菌种接入麸皮种子培养基，在25～33℃温度下培养24～96小时制得固态菌种；(3)将固态菌种接入麸皮培养基中，在25～33℃温度下通风培养70～100小时即制得高糖化酶活麸曲。
4、按照权利要求3所述的一种高糖化酶活麸曲的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)、(3)中培养温度为28～30℃。
5、按照权利要求2所述的一种高糖化酶活麸曲的用途，在酿酒、酿醋、酒精、有机酸生产中的应用。
6、一种高糖化酶活液态制剂，其特征在于采用液态发酵培养基和保藏号为CGMCCNo.1818的菌种培养制得。
7、按照权利要求6所述的一种高糖化酶活液态制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将保藏号为CGMCC No.1818的菌种在斜面培养基活化2～4次；(2)将活化的菌种接入液态菌种培养基，在25～33℃温度下培养24～72小时制得液态菌种；(3)将液态菌种接入液态发酵培养基中，控制pH为5～7，在25～33℃温度下，通风、搅拌培养50～100小时即制得高糖化酶活液态制剂。
8、按照权利要求7所述的一种高糖化酶活液态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2)、(3)中培养温度为28～30℃。
9、按照权利要求7所述的一种高糖化酶活液态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中pH为6。
10、按照权利要求6所述的一种高糖化酶活液态制剂的用途，其特征是用于制备精制糖化酶，以及在酿酒、酿醋以及酒精、有机酸、抗生素生产中的应用。
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