CN105316245A - 一种低蛋白酶a菌种 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低蛋白酶A菌种，该菌种保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC7.152；分类学命名：Saccharomyces？cerevisiae，P36；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101，保藏日期：2014年1月16日。本发明的低蛋白酶A菌种是采用传统诱变育种技术选育得到的，与出发菌株相比较，该菌株具有发酵前期降糖速度快，双乙酰还原速度快，蛋白酶A分泌低的特点。

Description

一种低蛋白酶A菌种
技术领域
本发明涉及一种微生物菌种，属于生物工程技术领域，特别是涉及一种低蛋白酶A菌种。
背景技术
随着纯生啤酒在啤酒生产中占有越来越大的比例，这种不经高温杀菌的生产技术伴随而来会有另一个负面影响，就是活性蛋白酶A对泡沫蛋白的降解作用变得不容忽视。对啤酒泡沫的研究认为，主要原因是由于纯生啤酒生产采用低温膜过滤技术，没有受到高温对酶活的破坏，因而导致蛋白酶A对泡沫蛋白的分解作用得以延续，引起啤酒在贮存过程中产生泡沫。
由于不同品牌的啤酒中蛋白酶A含量有明显的差异，如果能有针对性的选育蛋白酶A缺陷酵母菌株，即可有望解决改善啤酒的泡沫稳定性的问题，现有技术尚没有解决啤酒的泡沫稳定性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低产蛋白酶A菌株，所要解决的技术问题是使其采用传统诱变育种技术选育得到的，与出发菌株相比较，该菌株具有发酵前期降糖速度快，双乙酰还原速度快，蛋白酶A分泌低的特点。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种低产蛋白酶A菌株，该菌种保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC7.152，保藏日期：2014年1月16日，分类学命名：Saccharomycescerevisiae，P36；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
本发明的低产蛋白酶A菌株，是通过以下方法制备的：
酿造用啤酒酵母作为出发菌株，经过优化后的亚硝基胍(NTG)与甲基磺酸乙酯(EMS)方法连续复合诱变后，采用酸变性血红蛋白平板筛选出17株突变株，再通过发酵性能测试筛选出适合酿造的菌株，最后再经发酵传代试验，选出遗传性能稳定的菌株P36(CGMCC7.152)。
本发明的低产蛋白酶A菌株，所述NTG和EMS复合诱变过程为：
酿造用啤酒酵母作为出发菌株，经优化的亚硝基胍(NTG)条件诱变后并培养一段时间后，取经过NTG诱变的酵母菌悬液，接入5mL麦汁培养液中，28℃培养24h，再用经过优化的甲基磺酸乙酯(EMS)条件复合诱变处理。
本发明的低产蛋白酶A菌株，所述筛选方法过程为：
1)挑取蛋白酶A缺陷型和野生型酵母菌种分别在YPD平板上生长的菌落，转移至甘油平板28℃培养3-4天，激活蛋白酶A；
2)将10ml覆盖液(琼脂2％,0.3％酸变性血色蛋白)均匀倒于平板，37℃培养2-3天；然后在每个平板平铺1-2ml10％三氯醋酸，终止反应；
3)挑出蛋白酶A活力较低菌落，接于麦汁斜面上，28℃培养24h，置于4℃冰箱中保藏。
本发明的低产蛋白酶A菌株，所述步骤2)中，根据透明圈直径与菌落直径比值的大小判断其水解酸变性血色蛋白的能力，比值越小说明蛋白酶A的活力越低。
借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：
本发明采用传统诱变育种技术选育得到的，与出发菌株相比较，该菌株具有发酵前期降糖速度快，双乙酰还原速度快，蛋白酶A分泌低的特点。
附图说明
图1是菌株的发酵性能曲线图。
图2为P36菌(CGMCC7.152)与它的出发菌株生产的啤酒蛋白酶A与泡持性。
图3所示为菌种特性图。
具体实施方式
本发明所提供的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该菌种保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC7.152保藏日期：2014年1月16日，分类学命名：Saccharomycescerevisiae，P36。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。邮政编码：100101。
酿造用啤酒酵母作为出发菌株，经过优化后的亚硝基胍(NTG)与甲基磺酸乙酯(EMS)方法连续复合诱变后，采用酸变性血红蛋白平板筛选出17株突变株，再通过发酵性能测试筛选出适合酿造的菌株，最后再经发酵传代试验，选出遗传性能稳定的菌株。
其中的NTG和EMS复合诱变，其过程可以表述如下：
出发菌株经优化的亚硝基胍(NTG)条件诱变后并培养一段时间后。取经过NTG诱变的酵母菌悬液，接入5mL麦汁培养液中，28℃培养24h，再用经过优化的甲基磺酸乙酯(EMS)条件复合诱变处理。
其中的筛选方法，其过程可以表述如下：
初筛采用酸变性血红蛋白平板法。
挑取蛋白酶A缺陷型和野生型酵母菌种分别在YPD平板上生长的菌落，转移至甘油平板28℃培养3-4天，激活蛋白酶A；将10ml覆盖液(琼脂2％,0.3％酸变性血色蛋白)均匀倒于平板，37℃培养2-3天；然后在每个平板平铺1-2ml10％三氯醋酸，终止反应。根据透明圈直径与菌落直径比值的大小判断其水解酸变性血色蛋白的能力，比值越小说明蛋白酶A的活力越低。挑出蛋白酶A活力较低菌落，接于麦汁斜面上，28℃培养24h，置于4℃冰箱中保藏。
该菌株的发酵性能见下图1曲线。图1显示的是菌株发酵情况、酵母增殖情况和双乙酰还原时间(P36菌即CGMCC7.152)。该菌株蛋白酶A分泌情况，以及与出发菌株相比在蛋白酶A分泌性能以及它对泡持性的影响。
由图1中可以看到该菌株具有快速还原糖(5天到达极限)，双乙酰还原快(7天)的特性。
该菌株的发酵性能测试如下：
麦汁：按6：4比例加入大麦和大米原料，制得12°P麦汁，
发酵：麦汁满罐酵母接种量12-16×106个/ml。试验P36菌株，发酵工艺：11℃发酵，糖度降到6°P时升温到15℃，待糖降到极限检测双乙酰合格后，降温至0℃。
该菌株蛋白酶A分泌情况，以及与出发菌株相比在蛋白酶A分泌性能以及它对泡持性的影响见图2。从图2为P36菌株与出发菌株，发酵生产的啤酒它们的蛋白酶A含量与泡持性，由图看到P36菌株明显优于出发菌株。
如图3所示，菌株特征：在显微镜下观察，该菌株的细胞为椭圆形，一端芽殖，大小为(7.1-13.4)*(2.3-3.5)μm，在固体培养基上呈乳白色，边缘齐整，表面光滑。
实施例1
400吨生产试验
1、糖化：按照60％麦芽与40％大米的重量份比例制备麦汁，利用中试设备制得麦汁浓度为12°P；
2、发酵：麦汁冷却后充氧量为10～12ppm，接种菌种，接种量控制在5-10×106个/ml,发酵温度为120℃,糖度降至6°P后升温到15℃，并开始保压；检测产品的蛋白酶A及泡持性；
3、菌株：试验P36菌株(CGMCC7.152)；
4、成品的蛋白酶A含量及泡持性如下表1所示
表1成品的蛋白酶A含量及泡持性
由上述表1的数据可以看到，用P36菌株生产的啤酒活性的蛋白酶A含量较低(34.2U*10-5/ml)，泡持性较好(253秒)。
实施例2
400吨生产试验
1、糖化：用60％麦芽重量份比例，与大米、玉米淀粉制备的18°P麦汁；
2、发酵：麦汁冷却后充氧量为10～12ppm，接种菌种，接种量控制在2.5*107个/ml,发酵温度为120℃；糖度降至7°P后升温到15℃，并开始保压；检测产品的蛋白酶A及泡持性；
3、菌株：试验P36菌株(CGMCC7.152)；
4、成品的蛋白酶A含量及泡持性如下表2所示：
表2、成品的蛋白酶A含量及泡持性
由上述表2的数据可以看出，用P36菌株用于18。P高浓发酵，生产的10。P啤酒，活性的蛋白酶A含量较低(34.)，泡持性较好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种低蛋白酶A菌种，其特征在于：该菌种保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC7.152，保藏日期：2014年1月16日，分类学命名：Saccharomycescerevisiae，P36；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的低蛋白酶A菌种，其特征在于，是通过以下方法制备的：
酿造用啤酒酵母作为出发菌株，经过优化后的亚硝基胍(NTG)与甲基磺酸乙酯(EMS)方法连续复合诱变后，采用酸变性血红蛋白平板筛选出17株突变株，再通过发酵性能测试筛选出适合酿造的菌株，最后再经发酵传代试验，选出遗传性能稳定的菌株—P36(CGMCC7.152)。
3.根据权利要求2所述的低蛋白酶A菌种，其特征在于：所述NTG和EMS复合诱变过程为：
酿造用啤酒酵母作为出发菌株，经优化的亚硝基胍(NTG)条件诱变后并培养一段时间后，取经过NTG诱变的酵母菌悬液，接入5mL麦汁培养液中，28℃培养24h，再用经过优化的甲基磺酸乙酯(EMS)条件复合诱变处理。
4.根据权利要求2所述的低蛋白酶A菌种，其特征在于：所述筛选方法过程为：
1)挑取蛋白酶A缺陷型和野生型酵母菌种分别在YPD平板上生长的菌落，转移至甘油平板28℃培养3-4天，激活蛋白酶A；
2)将10ml覆盖液(琼脂2％,0.3％酸变性血色蛋白)均匀倒于平板，37℃培养2-3天；然后在每个平板平铺1-2ml10％三氯醋酸，终止反应；
3)挑出蛋白酶A活力较低菌落，接于麦汁斜面上，28℃培养24h，置于4℃冰箱中保藏。
5.根据权利要求3所述的低蛋白酶A菌种，其特征在于：
步骤2)中，根据透明圈直径与菌落直径比值的大小判断其水解酸变性血色蛋白的能力，比值越小说明蛋白酶A的活力越低。
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