CN101851589B - 超高浓啤酒酿造菌种及筛选该菌种的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适合超高浓啤酒酿造菌种的培养基，利用该培养基筛选菌种方法及筛选获得的菌种，并提供利用该超高浓啤酒菌种酿造啤酒的方法。筛选菌种的培养基包括2-脱氧-D-葡萄糖成分。筛选方法包括驯化、培养、连续分离、筛选、评价步骤，筛选出抵制2-脱氧-D-葡萄糖并且还原双乙酰能力强，耐酒精，适合20°P超高浓麦汁的菌种。使用本发明提供的菌种及方法生产的高浓啤酒大大设备利用率提高，生产成本降低，和常规浓度发酵的啤酒相比，口感更淡爽，口味更干净。
Description
技术领域
本发明涉及到一种超高浓啤酒酿造用菌种及其筛选方法以及用到的培养基，优选的该菌种适用于超高浓啤酒为原麦汁浓度在20°P以上的啤酒酿造工艺。
背景技术
超高浓酿制啤酒在我国，甚至在德国都是一个新课题。啤酒高浓度酿造(High GravityBrewing)是指在啤酒酿造过程中糖化得到较高的麦芽汁浓度(15°P-18°P)，在糖化以后的工序中再加水稀释到正常浓度(10-12°P)。对于18°P以上的麦汁称为VHG麦汁(Very HighGravity)，即超高浓度麦汁。采用高浓度酿造后稀释技术，能大大提高糖化，发酵设备的利用率，可以在投资和运行成本降低的情况下，增加产量20％～40％。国内一般的啤酒生产商的高浓酿造几乎在13-16°P之间，很少有超过18°P的高浓酿造。
当前的超高浓酿造过程中，由于渗透压的增加、酒精含量的提高以及营养平衡的改变，都对啤酒酵母的性能产生较大的影响：如细胞形态的变化、细胞活性降低，发酵性能的降低。啤酒企业使用中最直接的感受是存在酵母伴随使用代数增加，性能降低，凝聚性变差，酵母自溶等问题。另外，高浓酿造啤酒在稀释至与常浓酿造啤酒乙醇浓度相当时酒体较淡，因此风味难以与常浓酿造啤酒相比，且往往比常浓酿造啤酒的泡持性要差。本发明提供一种筛选出的超高浓啤酒酿造菌种有益的解决了上述问题，改善了酿造后的超高浓啤酒的品质。
发明内容
本发明提供一种用于筛选超高浓啤酒发酵菌种的YPM培养基，该培养基成分包含酵母浸出物0.5％-2％，蛋白胨1％-3％，麦芽糖0.5％-2％，2-脱氧-D-葡萄糖0.02％-0.1％，琼脂。
上述YPM培养基，其中培养基成分优选为酵母浸出物1％，蛋白胨2％，麦芽糖1％，2-脱氧-D-葡萄糖0.05％。
本发明还提供一种筛选超高浓啤酒菌种的方法，其包括菌种驯化、培养、连续分离、二次筛选、评价步骤，其在培养步骤中使用上述YPM培养基。
本发明还提供一种通过上述方法筛选出的超高浓啤酒发酵菌种，其抵制2-脱氧-D-葡萄糖，可以同时利用葡萄糖和麦芽糖，麦芽三糖。该超高浓啤酒发酵菌种优选为一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该酿酒酵母Y(2010年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3566)除具有上述发酵超高浓啤酒的性质外，还具有还原双乙酰能力强，耐酒精的性质。
本发明还提供一种通过接种上述菌种酿造超高浓啤酒的方法，其包括糖化、发酵、稀释步骤。
正常酵母对糖的利用顺序是先利用果糖和葡萄糖，等果糖和葡萄糖利用完后，再利用麦芽糖和麦芽三糖，一般麦芽糖和麦芽三糖比葡萄糖要晚利用24-36小时。这一点在高浓酿造中表现的尤为明显。因为高浓需要添加糖浆，而糖浆中大约有30％葡萄糖，所以在高浓酿造时的表现就是降糖速度慢和发酵不完全。引起这种现象的原因是葡萄糖的抑制机理，葡萄糖和果糖能抑制麦芽糖和麦芽三糖的代谢。这种机理通过抑制某些蛋白和酶的合成导致其他的糖类代谢的途径比如三羧酸循环等的失活。某些在葡萄糖抑制方面有缺陷的酵母可以在葡萄糖的存在下利用麦芽糖和麦芽三糖，从而能够加快糖的利用率。葡萄糖的结构类似物2-脱氧-D-葡萄糖能够引起酵母的葡萄糖抑制，但不被酵母利用。因此，当将2-脱氧-D-葡萄糖加入到只含有麦芽糖的培养基中，酵母是不生长的。如果将抵制2-脱氧-D-葡萄糖的酵母分离出来，用与高浓发酵，这种2-脱氧-D-葡萄糖抵制型酵母可以同时利用葡萄糖和麦芽糖，麦芽三糖，从而加快发酵速度，使高浓发酵更完全。
本发明利用物理诱变的手段处理酵母，筛选出抵制2-脱氧-D-葡萄糖的酵母，利用梯度平板选育出还原双乙酰能力强，耐酒精的；为了使酵母能够适应高浓的发酵环境，将筛选的酵母在20°P超高浓麦汁中长期驯养，使其逐渐适应发酵环境，性能较出发菌株有很大的改观。本发明优选筛选出具有上述性质的酿酒酵母Y，保藏号为CGMCC No.3566。
本发明筛选步骤优选为：
(1)驯化：将菌株在高浓环境中连续驯化3-5次。
(2)培养：将驯化好的培养液涂布YPM：酵母浸出物0.5-2％，蛋白胨1-3％，麦芽糖0.5-2％，2-脱氧-D-葡萄糖0.02-1％，琼脂(优选为酵母浸出物1％，蛋白胨2％，麦芽糖1％，2-脱氧-D-葡萄糖0.05％，琼脂)平板，30℃培养2-3天。
(3)分离：将长出的菌落再在上述平板中划线培养分离一次，找出单菌落进行单菌落分离。同时接种10ml液体试管进行活化，采用梯度稀释法分离单菌落。
(4)重复第三步，连续分离三代，每代分离酵母十支。
(5)筛选：在小试管中加入5ml高浓麦汁(20°P)，并在其上覆盖2ml矿物油造成微厌氧环境，将上述选出的菌种接种进行120℃发酵测定，通过每天测定失重看其发酵速度快慢，根据其生长速度选出10株。
(6)筛选：进行发酵栓实验，12℃发酵，根据发酵性能选出2-3株。
(7)评价：进行小试线试验，选出适合高浓酿造的酵母。
本发明通过接种筛选出的菌种酿造超高浓啤酒的步骤优选为：
1)糖化，利用麦芽和大米等制成高浓原麦汁16°P，在煮沸锅中添加糖浆，调麦汁浓度至20°P；
2)发酵，麦汁冷却后对其充氧量并接种菌种，接种量控制在1.5～1.8*107个/ml，发酵温度为14℃，升压糖度控制在6～7°P；
3)稀释，高浓稀释工艺稀释比在80～100％。
利用本发明培养基筛选出的菌种酿造的啤酒，稀释后的正常浓度的啤酒的理化指标符合国家标准的要求。啤酒的口感和常规浓度发酵的啤酒相比，口感更淡爽，口味更干净。
具体实施方式
实施例1超高浓度酵母的选育。
随机选取啤酒厂三株啤酒酵母菌株作为出发酵母菌株经过以上方法进行诱变，这三株酵母菌株分别为：YJ，F，36，经过以下选育步骤：
1出发菌株的活化
将菌种按3％的添加量接种麦芽汁中，25℃摇床培养24h，至酵母对数生长期，此时菌体活力最好，适合诱变。
2细胞悬液制备
在3500r/min转速下离心活化好的菌液10min，收集菌体，用灭菌生理盐水洗涤一次，旋涡混合器振荡10min，血球计数板计数菌体个数，再用生理盐水调整细胞浓度使之成为 106个/ml的菌悬液。
3EMS诱变育种
悬浮细胞于1ml无菌磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，加30ul EMS原液，振荡分散细胞，置于30℃摇床培养30min；离心，悬浮细胞于无菌水中，用5％Na2S2O3洗涤两次，再悬浮细胞于1ml无菌水中，稀释到10-3，涂布于完全培养基平板，28℃培养2-3天，对活菌进行计数。计算致死率和存活率。
5菌种筛选
诱变后的菌液涂布初筛培养平板，30℃培养3-4天，至菌落可见；挑取生长出的菌落转移复筛培养平板(2-脱氧-D-葡萄糖平板)培养3-4天，在培养基上生长的菌株即为目的菌株。
6发酵栓实验
对新获得的诱变菌株进行发酵培养：挑取上述筛选出的菌种一环；接入10mL麦汁中，30℃培养24小时；再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL20°P麦汁的三角瓶中，用发酵栓密封，12℃发酵9天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2克以内表明发酵结束。待发酵结束后，检测发酵指标。
7实验测定结果
| 指标 | YJ出发 | Y选育 | F出发 | F选育 | 36出发 | 36选育 |
| 双乙酰 | 0.15 | 0.08 | 0.12 | 0.09 | 0.14 | 0.10 |
| 降糖速度 | 8天 | 7天 | 9天 | 8天 | 8天 | 7天 |
| 乙醛 | 25 | 16 | 28 | 12 | 22 | 14 |
| 耐酒精度 | 10％ | 12％ | 10％ | 11％ | 10％ | 12％ |
| 高级醇 | 102 | 98 | 92 | 88 | 98 | 89 |
从以上指标看出，经过本发明培养基使用以上诱变，驯化，选育步骤，选育出菌株均比出发菌株的发酵性能指标都有很大的改善。
8将优选的Y选育酵母，接种到100L 20°P的麦汁中进行高浓发酵，
原浓：20°P
主发酵温度：14℃
接种酵母数：1.76*107个/ml
发酵高峰期酵母数：10*107个/ml
发酵度：66％
将其稀释为8°P、10°P、12°P三个浓度，各项指标测定描述如下：
风味指标
口感品评：
总的评价
高浓酿造的酒体清亮，酒体柔和；口味清爽，有酒花香和麦芽香，还有令人愉快的酯香味。
实施例2超高浓啤酒的发酵
使用以上菌种1，2，A，B通过以下发酵步骤发酵：
1)糖化，利用60～70％麦芽和30～40％大米等制成原麦汁浓度为16°P，在煮沸锅中添加糖浆，调麦汁浓度为20°P；
2)发酵，麦汁冷却后充氧量为10～12ppm，接种菌种，接种量控制在1.5～1.8*107个/ml，发酵温度为14℃，升压糖度控制在6～7°P；
3)稀释，高浓稀释工艺稀释比在80～100％。
发酵性能指标
实施例3啤酒厂实施
某20万吨啤酒厂(全部生产12°P啤酒)，如采用超高浓发酵技术，原麦汁浓度为20°P，则可以在不增加设备投资的情况下，与传统12°P发酵工艺相比，产能增加(20-12)/12×100＝75％，大大提高了设备利用率，降低了生产成本。
Claims (2)
1.一株适合超高浓度啤酒酿造的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为：CGMCCNo.3566，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母在制备超高浓度啤酒中的应用。
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