CN111647546B - 特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法 - Google Patents
特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，属于菌株选育领域。该选育方法包括：筛选出发菌株、筛选初筛菌株、初筛菌株的适应性进行培养及菌株评价试验等步骤。利用本发明提供的高效选育方法筛选得到一株特高浓啤酒酵母菌株TG‑01，其保藏编号为CGMCC No.19839，于2020年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明通过通过建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的方法，将2‑脱氧‑D‑葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株。在菌株选育领域具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于菌株选育领域，尤其涉及一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法。
背景技术
超高浓酿造技术是国内外啤酒行业发展的新趋势，可大幅度降低能耗、提高设备利用率，且麦汁浓度越高，优势越突出。与高浓酿造相比，特高浓酿造(≥22°P)对酵母菌株提出了更高的技术要求和难度，如特高浓麦汁、高渗透压等环境会影响酵母正常的生理生化特征，降低酵母活力及发酵性能，最终影响啤酒的风味及协调性。因此实现特高浓酿造技术的前提是选育出能够适用于发酵特高浓麦汁、抵抗高渗透压、高酒精度且性能良好的酵母。目前，国内有报道通过化学诱变、培养分离、高酒精环境驯化等方法筛选出能发酵28°P特高浓麦汁的酵母菌株，该方法不仅存在发酵周期较长、步骤繁琐、筛选效率低等缺陷，同时难以适应更高浓度的麦汁发酵环境。因此，如何开发出一种操作简便、性能良好、筛选效率高的特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法是本领域技术人员亟待解决的一项课题。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的发酵周期较长、步骤繁琐、筛选效率低等问题，提出一种操作简便、筛选效率高、性能良好的的特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，所述方法具体步骤如下：
将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；
将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；
对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；
对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。
作为优选，所述适应性进化复筛步骤具体为：
将所述初筛菌株接种至添加特高浓麦汁的麦汁培养基中培养后，将菌液加入全自动高通量微生物液滴培养仪中，在适应性进化模式下培养，生成液滴；
将所述液滴转入添加乙醇的麦汁培养基中，通过提高乙醇的浓度，进行菌株驯化，根据其生长速度，筛选得到复筛菌株。
作为优选，所述特高浓麦汁的浓度为26-32°P，所述麦汁培养基中无水乙醇的添加量为6-16％。
作为优选，所述特高浓麦汁是通过以下方法制备得到的：
通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，以调整麦汁糖度和氨基氮含量，得到浓度为26-32°P的特高浓麦汁；
其中，所述特高浓麦汁中氨基氮的含量为300-350mg/L。
作为优选，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇20-30％、琼脂2％；
YPD液体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖 0.5-2％；
初筛培养基的配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇20-30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05-2％、琼脂2％。
作为优选，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、琼脂2％；
所述初筛培养基的配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05％、琼脂2％。
作为优选，所述出发菌株在YPD液体培养基中的培养条件为：25-28℃培养48-60h，每天震荡2-3次。
作为优选，所述菌悬液涂布于初筛培养基上的培养条件为：25-28℃培养 10-14天，所述低浓度麦汁的浓度为10-12°P。
作为优选，所述菌株评价试验包括EBC管发酵试验、2L发酵试验和10L 发酵试验。
利用上述任一优选技术方案所述的高效选育方法筛选得到一种特高浓啤酒酵母菌株TG-01，其保藏编号为CGMCC No.19839，分类命名为 Saccharomyces pastorianus，于2020年05月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，通过建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的方法，将2-脱氧-D-葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株；
2、本发明提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，整个筛选流程步骤简单、筛选过程高效、选育出的菌株能够很好的适应中试以上生产规模，能够在特高浓(26-32°P)啤酒酿造中得到很好的应用。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的现有菌株在不同浓度麦汁中的发酵度结果图；
图2为本发明实施例所提供的复筛菌株EBC管发酵的发酵度结果图；
图3为本发明实施例所提供的利用复筛菌株所得冷贮啤酒成熟度结果示意图，其中，图A为冷贮啤酒的双乙酰含量，图B为冷贮啤酒的乙醛含量；
图4为本发明实施例所提供的复筛菌株的死亡率结果图；
图5为本发明实施例所提供的编号21#、61#的酵母菌株遗传稳定性实验验证结果，其中图A为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的发酵度、图B为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的双乙酰含量、图C为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的乙醛含量、图D为编号21#、61# 的酵母菌株传代前后所得啤酒的醇酯比；
图6为本发明实施例所提供的酵母菌株2L发酵规模下的发酵性能测定结果图，其中，图A为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的发酵度、图B为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的双乙酰含量、图C为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的乙醛含量、图D为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的总醇含量、图E为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的总酯含量、图F为编号21#、 61#的酵母菌株所得啤酒的醇酯比含量。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，所述方法具体步骤如下：
将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；
将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；
对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；
对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。
在上述选育方法中，并未选择化学诱变或物理诱变的方法对待选菌株进行诱变处理，而是通过建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的方法，将2-脱氧-D-葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株。
此外，在将菌悬液涂布于初筛培养基上时，所述菌悬液的浓度约为6*108个/mL，取约0.2mL的菌悬液涂布于初筛培养基上。
在一优选实施例中，所述适应性进化复筛步骤具体为：
将所述初筛菌株接种至添加特高浓麦汁的麦汁培养基中培养后，将菌液加入全自动高通量微生物液滴培养仪中，在适应性进化模式下培养，生成液滴；
将所述液滴转入添加乙醇的麦汁培养基中，通过提高乙醇的浓度，进行菌株驯化，根据其生长速度，筛选得到复筛菌株。
在上述优选实施例中，选择将所述菌液在全自动高通量微生物液滴培养仪中进行适应化培养的原因在于：使用全自动高通量微生物液滴培养仪，通过逐步增加酒精浓度，进行驯化培养，选择生长良好的菌株。该方法驯化条件更为温和、条件操作简单、便捷，节省工作量。
在一优选实施例中，所述特高浓麦汁的浓度为26-32°P，所述麦汁培养基中无水乙醇的添加量为6-16％。
在上述优选实施例中，所述特高浓麦汁的浓度可选择26、27、28、29、 30、31、32°P或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内；此外还需要特别说明的是，在上述优选实施例中提到的麦汁培养基无需限定具体的配方成分，仅需在浓度为26-32°P的特高浓麦汁中不断提高无水乙醇的添加量，添加量范围为6-16％，使酵母菌株进行适应性进化。其中，无水乙醇的添加量可选取6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、 16％或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
在一优选实施例中，所述特高浓麦汁是通过以下方法制备得到的：
通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，以调整麦汁糖度和氨基氮含量，得到浓度为26-32°P的特高浓麦汁；
其中，所述特高浓麦汁中氨基氮的含量为300-350mg/L。
在上述优选实施例中，通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，使得所述特高浓麦汁中氨基氮的含量达到300-350mg/L。其中，所述氨基氮的含量可选取300、310、320、330、340、350mg/L或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
在一优选实施例中，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇 20-30％、琼脂2％；
YPD液体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖 0.5-2％；
初筛培养基的配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇20-30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05-2％、琼脂2％。
在上述优选实施例中，在添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方中，无水乙醇的添加量可选择6、7、8、9、10％或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内；山梨醇的添加量可选取20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内；
在初筛培养基中，无水乙醇的添加量可选择6、7、8、9、10％或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内；山梨醇的添加量可选取 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30％或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内；2-脱氧-D-葡萄糖的添加量可选取0.05、0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
此外，需要进一步说明的是，在初筛培养基中山梨醇、2-脱氧-D-葡萄糖和乙醇的添加量可按照菌株的实际生长情况在上述限定范围内进行调整，以培养10-14天可培养出1-10个单菌落为准，然后挑取边缘整齐的单菌落进行后续的实验操作。
在一优选实施例中，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、琼脂 2％；
所述初筛培养基的配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05％、琼脂2％。
在一优选实施例中，所述出发菌株在YPD液体培养基中的培养条件为： 25-28℃培养48-60h，每天震荡2-3次。
在一优选实施例中，所述菌悬液涂布于初筛培养基上的培养条件为： 25-28℃培养10-14天，所述低浓度麦汁的浓度为10-12°P。
在上述优选实施例中，所述培养条件中温度可选择25、26、27、28℃或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内，培养时间可选取 10、11、12、13、14天或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内，低浓度麦汁的浓度可选取10、11、12或或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
在一优选实施例中，所述菌株评价试验包括EBC管发酵试验、2L发酵试验和10L发酵试验。
在上述优选实施例中，菌株评价试验的具体步骤如下：
·EBC发酵试验的具体步骤为：
将筛选出的复筛菌株接种至装有26-32°P特高浓麦汁的EBC管 (235mL)中进行发酵试验，发酵条件为10-18℃，发酵10-15天后，发酵结束检测发酵度、成熟度、风味等指标，根据上述检测指标选择性能良好的酵母菌株进行后续的扩大发酵试验。
·2L发酵试验的具体步骤为：
将EBC发酵试验筛选出的酵母菌株进行2L扩大发酵试验，将该菌株接种至装有2L特高浓麦汁(26-32°P)的发酵罐中进行发酵试验，发酵条件为 10-18℃，发酵10-15天后，发酵结束检测发酵度、成熟度、风味等指标，并进行品评。
·10L发酵试验的具体步骤为：
将EBC发酵试验筛选出的酵母菌株进行10L扩大发酵试验，将该菌株接种至装有10L特高浓麦汁(26-32°P)的发酵罐中进行发酵试验，发酵条件为10-18℃，发酵10-15天后，发酵结束检测发酵度、成熟度、风味等指标，并进行品评。
本发明还提供了利用上述任一优选实施例所述的高效选育方法筛选得到一种特高浓啤酒酵母菌株TG-01，其保藏编号为CGMCC No.19839，其分类命名为Saccharomycespastorianus，于2020年05月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
本实施例提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，具体方法为：
·培养基配方：
YPD固体培养基(添加乙醇和山梨醇)：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、琼脂2％；
YPD液体培养基：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％；
初筛培养基：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05％、琼脂2％；
麦汁培养基：特高浓麦汁的浓度为32°P、无水乙醇的添加量从6％逐步提升至16％。
·实验设备：恒温培养箱、全自动高通量微生物液滴培养仪等。
·实验方法：
(1)将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基平板上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；
(2)将出发菌株在YPD液体培养基中于25℃培养48h后，每天震荡2～3 次，然后取混匀后的菌悬液(约6*108个/mL)0.2mL，涂布于初筛培养基上 25℃条件下培养10-14天，待其长出单菌落后，挑取边缘平整的单菌落转至 12°P麦汁中培养，得到初筛菌株；
(3)将初筛菌株接种至添加32°P特高浓麦汁的麦汁培养基中培养后，将菌液加入全自动高通量微生物液滴培养仪中，在适应性进化模式下培养，生成液滴；
将液滴转至添加6％乙醇的麦汁培养基中培养，通过不断提高乙醇的添加量，逐步提高至16％，进行菌种驯化，根据菌株生长速度，筛选得到复筛菌株；
(4)对复筛菌株进行菌株评价试验，根据其各自的生长速度，最终筛选得出特高浓啤酒酵母菌株。
此外，本实验室还将现有啤酒酵母(未经任何驯化处理)接种于不同浓度的麦汁中进行发酵实验，最终得到相关的发酵度数据，具体发酵结果如图1 所示。从图1所示的数据可以看出当麦汁浓度不断升高时，该酵母菌株的发酵度呈显著下降趋势，当麦汁浓度达到30°P时发酵度下降尤为明显，相对普通啤酒而言已经不可接受，因此对现有酵母进行高效地驯化和选育工作是十分必要的。
实施例2
本实施例利用实施例1提供的选育方法筛选得到10株复筛菌株进行EBC 发酵实验，其具体方法如下：
利用本发明实施例1提供的筛选方法筛选得到10株复筛菌株，菌株编号分别为8#、10#、11#、21#、38#、39#、46#、55#、61#、4-3#，将上述酵母菌株在32°P特高浓麦汁中进行EBC管发酵试验，通过评估上述酵母菌株的发酵指标和成熟度指标，筛选出适用于特高浓酿造的酵母菌株。其中，EBC 管发酵实验操作及实验结果如下所示：
(1)实验材料与方法：
·实验分组：
实验组：8#、10#、11#、21#、38#、39#、46#、55#、61#、4-3#；
对照组：出发菌株(未经任何驯化处理的普通啤酒酵母)。
·特高浓麦汁的配制：
通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，以调整麦汁糖度和氨基氮含量，得到浓度为32°P的特高浓麦汁。其中，调整特高浓麦汁中氨基氮的含量达到300-350mg/L。
·EBC管发酵实验方法：
将实验组和对照组的酵母菌株接种至装有32°P特高浓麦汁的EBC管 (235mL)中，将酵母接种量控制在3.6*107～4.0*107个/mL，180rpm振荡10min 以保证发酵过程中的氧气供给，18℃条件下发酵10天，测定上述酵母菌株的发酵度、所得冷贮啤酒双乙酰和乙醛含量、酵母死亡率等各项数据，以评价酵母菌株特性。
(2)实验结果分析：
·酵母菌株发酵度：
上述酵母菌株的发酵度数据如图2所示，由图中数据可看出与对照组出发菌株相比，编号为21#、46#、61#、4-3#的酵母发酵度提高幅度较大，均超过65％，符合实验预期。
·冷贮啤酒双乙酰和乙醛含量：
利用各酵母菌株进行发酵所得冷贮啤酒中双乙酰和乙醛含量如图3所示。从图3(左图)中可看出，利用各复筛菌株酿造的啤酒中双乙酰含量较对照组相比呈明显下降趋势，其中利用编号为8#、10#、21#、38#、39#、61#、 4-3#酵母所得啤酒的双乙酰含量下降幅度最大，下降率高达60.83％-69.18％。
从图3(右图)中可看出，各利用选育酵母菌株所得冷贮啤酒的乙醛含量下降程度低于双乙酰，但编号为21#、39#、55#、61#、4-3#的酵母菌株所得冷贮啤酒中的乙醛含量较对照组相比有所降低。
·酵母菌株的死亡率：
各选育酵母菌株在发酵过程中的死亡率数据如图4所示。由图4可看出，与对照组相比，各选育菌株的死亡率均有显著下降，下降率约为 63.16％～75.12％。其中编号8#、39#的酵母菌株死亡率下降尤为显著，其死亡率分别为6.2％和5.2％。
综上所述，在分别对各选育菌株进行发酵度、所得冷贮啤酒双乙酰和乙醛含量、酵母死亡率等各项指标进行测定后发现：从酵母发酵度层面分析，与对照组相比，编号为21#、46#、61#、4-3#的酵母菌株发酵度提高幅度较大，均超过65％；从测定利用各酵母所得冷贮啤酒的双乙酰和乙醛含量发现，与对照组相比，编号8#、10#、21#、38#、61#、4-3#酵母的双乙酰含量较低，编号21#、39#、55#、61#、4-3#酵母的乙醛含量较低。由此可见，各菌株酵母菌株经过一系列的驯化处理后，其发酵度得到明显提高、啤酒的双乙酰和乙醛含量均有所下降，酵母菌株死亡率显著也降低，因此本发明提供的驯化方法得到的酵母菌株在特高浓酿造领域具有很高的实际应用价值。
实施例3
本实施例利用实施例2得到的相关结果，对复筛菌株进行遗传稳定性实验，其具体方法如下：
·实验方法：
根据实施例2得到的一系列结果，根据发酵度、啤酒成熟度(啤酒中双乙酰和乙醛含量)等指标选择编号21#、61#酵母菌株进行传代驯化，以验证其遗传稳定性。具体方法为：将21#、61#酵母菌株在32°P特高浓麦汁中进行传代，传到10代后将传代后酵母与原酵母进行EBC管发酵试验(实验方法同实施例2)，对比两株酵母传代前后发酵性能指标。
·实验结果：
编号21#和61#酵母菌株传代前后的发酵度、双乙酰和乙醛含量及醇酯比对比图如图5所示。从图中数据可知，21#、61#酵母菌株传代前后的发酵度、成熟度(双乙酰和乙醛含量)、醇酯数据及醇酯比等指标无明显差异，这表明编号21#、61#的两株酵母的遗传稳定性较强。
实施例4
本实施例利用实施例2-3选育得到的21#、61#酵母菌株进行菌株发酵性能实验验证，其具体方法如下：
对本发明实施例2-3选育出的21#、61#酵母菌株进行2L发酵试验验证，分析上述菌株在2L发酵规模条件下发酵性能及各项指标是否符合特高浓菌株选育的要求，具体实验材料及步骤如下所示：
·实验材料：
编号21#、61#酵母菌株(从本发明实施例2-3筛选得到)。
·实验方法：
(1)32°P特高浓麦汁制备：制备方法同本发明实施例2；
(2)将21#、61#酵母菌株进行2L扩大发酵试验，将上述菌株接种至装有2L特高浓麦汁(32°P)的发酵罐中进行发酵试验，控制满罐酵母数为 3.6*107～4.0*107个/mL，180rpm振荡30min，在发酵温度为18℃的条件下发酵 12天，发酵结束后检测所得啤酒的发酵度、成熟度和风味等指标。
·实验结果分析：
21#、61#酵母菌株2L发酵试验的发酵度、双乙酰、乙醛、总醇、总酯及醇酯比数据如图6所示。由图中数据可以看出两株酵母发酵度均超过67％达到预期水平；双乙酰、乙醛含量均处于较好水平，但利用21#酵母所得的冷贮酒乙醛含量略高于61#酵母；从总醇、总酯及醇酯比水平来看，两株酵母无明显差异。
由此可见，在2L规模发酵水平下，编号21#、61#两株酵母的发酵性能都较好，均能达到特高浓酵母菌株的选育需求。
实施例5
本实施例在实施例4的基础上继续进行酵母菌株发酵性能验证实验，其具体方法如下：
在本发明实施例4的基础上进一步扩大发酵规模，分析对本发明实施例 3选育出的21#、61#酵母菌株在10L发酵规模条件下的发酵性能及各项指标是否还能符合特高浓菌株选育的要求，具体实验材料及步骤如下所示：
·实验材料：
编号21#、61#酵母菌株(从本发明实施例2筛选得到)，对两株酵母各进行2次发酵实验，编号为21#-1、21#-2、61#-1、61#-2。
·实验方法：
(1)32°P特高浓麦汁制备：制备方法同本发明实施例2；
(2)将21#、61#酵母菌株进行10L扩大发酵试验，将上述菌株接种至装有10L特高浓麦汁(32°P)的发酵罐中进行发酵试验，控制满罐酵母数为 3.6*107～4.0*107个/mL，180rpm充氧30min，在发酵温度为18℃的条件下发酵 12天，发酵结束后检测所得啤酒的发酵度、成熟度和风味等指标。
·实验结果分析：
表1是10L发酵试验所得冷贮酒的发酵度、成熟度数据。由表中数据可以看出21#-1、21#-2、61#-1、61#-2的发酵度分别为60.68％、60.52％、58.12％、58.26％，较2L发酵数据低很多；双乙酰、乙醛数据较2L发酵时偏高。
表1所得冷贮酒的发酵度、成熟度等各项指标
根据上述数据推测，鉴于2L发酵规模较小，且主要通过对已接种酵母的麦汁进行震荡充氧，保证了充氧量足够且接触充分；而10L试验主要采用对麦汁充氧，进罐后虽然充氧，但开罐加酵母时损失较多，从而导致10L发酵规模的充氧量较2L规模极为不足，而且酵母在10L罐里与氧气无法接触充分，因此导致了发酵度等数据偏低。
鉴于推测10L试验充氧不足的原因，针对61#酵母进行加大第三次充氧的极端充氧试验。
将充氧方式更改为三次充氧，具体为：麦汁混匀通无菌风30min；加酵母后充氧60min；发酵12h时充氧10min，其他工艺参照本实施例实验方法部分。发酵结果见表2。
表2改变充氧方式后所得冷贮酒发酵度、成熟度指标
| 菌株编号 | 充氧方式 | 发酵度/％ | 双乙酰/ppb | 乙醛/ppm | 戊二酮/ppb |
| 61#-I | 三次充氧 | 68.6 | 14.1 | 12.4 | 12 |
| 61#-II | 一次充氧 | 60.52 | 20.4 | 14.02 | 29.9 |
由表2中数据可知，将充氧方式改为三次充氧后，发酵度升高，双乙酰、乙醛下降，且酵母的发酵度、成熟度均处于较好水平。
品评结果
将经三次充氧所得特高浓啤酒用稀释水稀释到10度，经公司专业品评小组品评得出该啤酒干净、淡爽、无异杂味，符合要求，具体品评结果详见如表3。
表3利用特高浓啤酒酵母菌株制得特高浓啤酒的感官品评结果
| 分组 | 香气和口味 | 可接受度 |
| 2L发酵试验所得啤酒 | 干净、无异杂味 | 可接受 |
| 10L发酵试验所得啤酒 | 干净、无异杂味 | 可接受 |
| 对照组(未经驯化菌株发酵所得啤酒) | 微甜、微双乙酰味 | 不可接受 |
对比例1
本对比例提供了一种特高浓啤酒酵母的筛选方法，其具体方法如下：
一种特高浓啤酒酵母菌株的筛选方法，该菌种能适用于原麦汁浓度为 28°P的特高浓啤酒的发酵，具体步骤如下：
(1)EMS诱变育种：
将已经具备高浓酿造性能(18°P)的出发菌株采用EMS(甲基磺酸乙酯)进行低剂量的化学诱变；
(2)耐酒精筛选：
将经过化学诱变后的菌种接种于添加不同浓度(6-16％)酒精的麦汁中培养，根据其各自的发酵情况，选择耐受高浓度酒精能力强的菌株；
(3)长期驯化：
在试管中加入50mL麦汁(28°P)，并在其上覆盖2mL矿物油以创造微厌氧条件，将上述菌株进行12℃发酵测定实验，连续传代驯养，使其逐渐适应特高浓环境；
(4)300mL小试实验：
对新获得的菌株进行发酵培养，挑取上述筛选出的菌株一环并接入 10mL、12℃麦汁中，30℃培养24h，再将活化好的菌液全部接种至盛有300mL 的28°P麦汁的三角瓶中，用发酵栓密封，12℃发酵，根据发酵指标最终筛选出一株特高浓(28°P)啤酒酵母菌株。
将上述实施例与对比例比对分析发现，虽然对比例1中采用了化学诱变的方法能选育得到特高浓啤酒酵母菌株，且该菌株也能适用于原麦汁浓度为 28°P的特高浓啤酒的发酵，但该驯化方法采用的是剧烈的化学诱变法，对菌株基因组产生较大的改变，也会进一步影响菌株的遗传稳定性和发酵性能，难以将其应用于实际生产中，同时其是否能够适应更高浓度的原麦汁(>28° P)发酵环境也未见相关报道。而本发明提供的高效选育方法，是一种建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的筛选方法，将2-脱氧-D-葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株；而且该方法的整个筛选过程步骤简单、筛选过程高效、选育出的菌株能够很好的适应中试以上生产规模，能够在特高浓(26-32°P)啤酒酿造中得到很好的应用。
Claims (1)
1.一种特高浓啤酒酵母菌株TG-01，其特征在于，所述特高浓啤酒酵母菌株TG-01的保藏编号为CGMCC No. 19839，分类命名为巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus），于2020年05月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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