CN114507660A - 一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于微生物发酵工程技术领域，提供了一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，包括以下步骤：步骤1：应用ARTP诱变技术得到超高浓菌株突变体库；步骤2：使用基于液滴微流控技术的高通量筛选方法选育超高浓酿造菌株；步骤3：MMC微流控选育及菌株适应性驯化；步骤4：梯度平板选育；步骤5：糖代谢力复筛；步骤6：优选菌株的酿造性能分析。该方法有效的增加了每次筛选的菌株数量，缩短了筛选的周期，降低筛选工作强度，提高了整个筛选的工作效率及目标性，得到适合下面发酵的超高浓酿造菌株。

Description

一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法。

背景技术

啤酒超高浓酿造(麦汁浓度18～25°P)是指在啤酒生产过程中采用比正常浓度更高的麦汁浓度进行发酵，并在发酵后期用水稀释成常规浓度啤酒的技术。

常压室温等离子体诱变(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是近年来利用在大气压下产生的，温度在25～40℃之间，具有高活性粒子浓度的等离子体射流的新型诱变技术，具有操作简便、设备简单、条件温和、安全性高及诱变快速等优良特性。对啤酒酵母等真菌的诱变会比常规的紫外诱变效果更加明显，且诱变菌能够被用于食品行业的生产。

液滴微流控是一种近几年新发展起来的高通量筛选技术。从样品制备，反应培养到最后的检测，分选均在微小芯片中的微通道内完成，其最大优势在于可将单细胞包埋于液滴中，每个液滴都可作为独立的微反应器进行细胞培养及代谢产物生产，最高筛选通量达108/d，具有检测试剂消耗成本低、速度快、通量高等显著特点，可对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母等不同类型微生物在内，进行具备不同细胞特性或一些代谢产物的高通量筛选。

啤酒酵母作为啤酒酿造的核心，在高浓胁迫下的啤酒酵母存在活力下降、形态异常、代谢异常、衰老死亡乃至自溶等问题。因此，在传统啤酒酵母“黑箱操作”筛选技术的基础上，建立目的性和预见性更明确的快速选育方法，基于风味导向选育超高浓酿造酵母菌株，是本领域急需解决的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，旨在解决啤酒酵母作为啤酒酿造的核心，在高浓胁迫下的啤酒酵母存在活力下降、形态异常、代谢异常、衰老死亡乃至自溶的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，包括以下步骤：

步骤1：应用ARTP诱变技术得到超高浓菌株突变体库；

步骤2：使用基于液滴微流控技术的高通量筛选方法选育超高浓酿造菌株；

步骤3：MMC微流控选育及菌株适应性驯化；

步骤4：梯度平板选育；

步骤5：糖代谢力复筛；

步骤6：优选菌株的酿造性能分析。

1.进一步的技术方案，所述步骤1的具体步骤包括：

步骤1.1：选择处于对数生长中期的出发菌株细胞进行等离子诱变，测定致死率，绘制出发菌株的等离子诱变致死率曲线，确定合适的等离子诱变时间；

步骤1.2：选择致死率在85％左右的等离子诱变时间作为诱变处理条件，对酵母菌株进行等离子诱变，依据相应的ARTP诱变条件多批次处理备选菌株，构建酵母诱变突变库。

2.进一步的技术方案，所述步骤2的具体步骤包括：

步骤2.1：连续筛选培养基，

A：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖5％(w/v)，乙醇5％(w/v)；

B：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖10％(w/v)，乙醇10％(w/v)；

C：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖15％(w/v)，乙醇15％(w/v)；

步骤2.2：菌株接种于2mL YPD培养基中，25℃、250r/min培养14h，当OD600为0.1时转接至连续筛选培养基，12℃、250r/min培养14h，菌体洗涤重悬，当OD600为1时转接至5mL连续筛选培养基中，超声处理(超声破碎仪总功率950W，使用功率4％，超声9.9s，停9.9s，共1min)获得单分散的酵母细胞；

步骤2.3：采用液滴生成芯片制备单细胞液滴，其中水相为含有不同麦芽糖和酒精浓度培养基的细胞悬浮液，主要包含：20μL不同菌体浓度的单分散酵母细胞悬液，加入到连续筛选培养基中，总体积200μL；将油相和水相分别加入到1mL注射器内，注射器置于注射泵中与芯片连接，设定油相300μL/h，水相100μL/h，通过液滴制备芯片制备单细胞液滴，生成液滴直径约25μm，单细胞液滴12℃静置培养至所需时间后进行信号检测。

进一步的技术方案，所述步骤3的具体步骤包括：液滴静置于恒温培养箱10℃培养24h，筛选时设定液滴流速为10–15μL/h，油相流速为200–250μL/h，液滴筛选速度约250Hz，分选阈值为液滴细胞信号最高的0.1％，收集约200–250个液滴至1mL装有麦汁培养基的EP管中，分别涂布于多个高浓梯度平板中，10℃培养待长出单菌落。

进一步的技术方案，所述步骤4的具体步骤包括：在20-25°P梯度平板对筛选出的菌株进行分离纯化，选取在高浓区生长快速、强壮的菌落，重复三次；浓度梯度所用培养基：20P和25P麦汁添加2％琼脂，方法为先将25P培养基铺入微倾放置的培养皿内，使铺好的培养基在培养皿内一侧成15°角，等凝固后再将20P培养基铺入水平放置培养皿，直到培养基平面水平为止。

进一步的技术方案，所述步骤5包括α-葡萄糖苷酶活力分析和乙醇脱氢酶活力分析，通过检测糖转运关键限速酶α-葡萄糖苷酶活力，筛选抗渗透压能力高的菌株，通过检测乙醇代谢过程中乙醇脱氢酶活力，筛选抗乙醇毒性能力高的菌株。

进一步的技术方案，所述步骤6的具体步骤包括：对经过梯度平板筛选和糖代谢能力复筛所得菌株进行实验室规模发酵实验，验证高浓菌株酿造过程的酵母综合状态、啤酒理化风味质量，重点考察酵母增殖能力、降糖能力以及风味代谢能力，进行菌株优选，确定超高浓酿造优选菌株。

本发明实施例提供的一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，根据啤酒酵母的生长特点，应用ARTP诱变技术构建超高浓啤酒酿造菌株突变体库，并利用液滴微流控技术建立筛选酵母的高通量筛选模型，对菌株进行驯化培养基初步条件筛选，通过梯度增加筛选压力(麦汁及乙醇浓度)，采用微液滴连续驯化筛选代替传统的挑菌培养方法，有效的增加了每次筛选的菌株数量，缩短了筛选的周期，降低筛选工作强度，提高了整个筛选的工作效率及目标性，得到适合下面发酵的超高浓酿造菌株。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的ARTP诱变流程示意图；

图2为本发明实施例所提供的MMC驯化实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例：如图1和2所示，一种下面发酵酵母超高浓酿造菌株的高通量选育。

一、出发菌株的ARTP诱变构建突变库：挑取单菌落至5mL 16°P麦汁培养基中，37℃、250r/min，培养24h；制备菌悬液，选择适宜的诱变条件为功率120w，气量10slm，时间为30-45s，按照图1所示ARTP诱变流程对出发菌株进行诱变，得到超高浓菌株突变体库，得到出发菌株诱变后的平板50块(每块平板30-40个菌落)；

二、基于液滴微流控技术的高通量筛选方法条件确定：挑取单菌落至2mL 16°P麦汁培养基中，25℃、250r/min培养；按5％接种量转接至18°P麦汁培养基(不添加酒精)中，培养液转入MMC进样瓶；确定最佳的MMC驯化实验条件为：培养温度为15℃；培养基为22°P麦汁；驯化压力乙醇浓度为5％-10％。

三、MMC微流控选育及适应性驯化：诱变后的菌液重悬在5mL的18°P麦汁培养基中(不含酒精)，将诱变液转入MMC进样瓶，然后转入MMC微流控细胞分选仪，选择“适应性进化”功能，对酵母进行驯化培养，实验参数见表1：

表1 MMC优化后实验参数

驯养约4周后，提取生长情况最优的10个液滴涂平板(16°P琼脂平板)进行保存，培养温度25℃，培养时间48h-72h，筛选得到的突变菌。

四、梯度平板选育：筛选所得菌株进行3次活化的菌悬液用无菌水进行稀释梯度，选择10-3和10-4梯度，吸取0.2mL涂布至(16～22°P)浓度梯度培养基中，25℃培养48h，观察菌落生长情况，选取在高浓区生长快速、强壮的菌落，重复分离3次，最后在高浓区选取数个菌落划线至小斜面中保藏，各划斜面2支。

五、糖代谢力复筛：对菌液进行粗酶液提取后，分别测定其乙醇脱氢酶Ⅱ活力和α-糖苷酶活力。综合α-gc及ADHⅡ酶活结果对菌株BE-256进行筛选，发现菌株26b，16b-2两酶活在同组中均处于较高水平，表明两株菌具备在高浓环境下快速增殖及代谢的能力，确定BE-256优选菌为26b及16b-2。

经糖代谢力复筛，共得到了10株发酵性能优良的优选菌，C7-1中5％7％梯度各一株，8％9％各三株，BE-256两株。这些菌都具备在高浓环境下快速增殖及代谢的能力。

表2经糖代谢力复筛得到的优选菌

六、优选菌株的酿造性能分析：对糖代谢力优选菌进行实验室量筒发酵，量筒发酵中的接种量为18～22×106个/mL，跟踪主发酵过程中酵母数，降糖及死亡情况，绘制相应曲线，贮酒结束后检测理化指标，可发酵性糖和风味物质。结果如表3，表4，表5所示。感官品评结果如表6所示。

表3贮酒结束发酵液理化指标

表4贮酒结束发酵液可发酵性糖

表5贮酒结束发酵液风味物质

表6感官品评结果

从12株菌贮酒结束发酵液理化指标和风味物质来看，贮酒期Y酵母9株菌和be256三株菌菌种内酿造啤酒的原浓、酒精度、发酵度等各指标均处于相同水平，Y酵母各株菌的残糖、乙醛、甲酸乙酯量显著高于be256三株菌，酒精度、发酵度、DMS、乙酸异丁酯、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、辛酸乙酯显著低于be256三株菌。综合理化指标和感官品评结果，变筛选得到的优选菌株9-50，醇香酯香明显，口感较协调。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：应用ARTP诱变技术得到超高浓菌株突变体库；

步骤2：使用基于液滴微流控技术的高通量筛选方法选育超高浓酿造菌株；

步骤3：MMC微流控选育及菌株适应性驯化；

步骤4：梯度平板选育；

步骤5：糖代谢力复筛；

步骤6：优选菌株的酿造性能分析。

2.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤1的具体步骤包括：

步骤1.1：选择处于对数生长中期的出发菌株细胞进行等离子诱变，测定致死率，绘制出发菌株的等离子诱变致死率曲线，确定合适的等离子诱变时间；

步骤1.2：选择致死率在85％左右的等离子诱变时间作为诱变处理条件，对酵母菌株进行等离子诱变，依据相应的ARTP诱变条件多批次处理备选菌株，构建酵母诱变突变库。

3.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤2的具体步骤包括：

步骤2.1：连续筛选培养基，

A：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖5％(w/v)，乙醇5％(w/v)；

B：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖10％(w/v)，乙醇10％(w/v)；

C：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖15％(w/v)，乙醇15％(w/v)；

步骤2.2：菌株接种于2mL YPD培养基中，25℃、250r/min培养14h，当OD600为0.1时转接至连续筛选培养基，12℃、250r/min培养14h，菌体洗涤重悬，当OD600为1时转接至5mL连续筛选培养基中，超声处理获得单分散的酵母细胞；

步骤2.3：采用液滴生成芯片制备单细胞液滴，其中水相为含有不同麦芽糖和酒精浓度培养基的细胞悬浮液，主要包含：20μL不同菌体浓度的单分散酵母细胞悬液，加入到连续筛选培养基中，总体积200μL；将油相和水相分别加入到1mL注射器内，注射器置于注射泵中与芯片连接，设定油相300μL/h，水相100μL/h，通过液滴制备芯片制备单细胞液滴，生成液滴直径约25μm，单细胞液滴12℃静置培养至所需时间后进行信号检测。

4.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤3的具体步骤包括：液滴静置于恒温培养箱10℃培养24h，筛选时设定液滴流速为10–15μL/h，油相流速为200–250μL/h，液滴筛选速度约250Hz，分选阈值为液滴细胞信号最高的0.1％，收集约200–250个液滴至1mL装有麦汁培养基的EP管中，分别涂布于多个高浓梯度平板中，10℃培养待长出单菌落。

5.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤4的具体步骤包括：在20-25°P梯度平板对筛选出的菌株进行分离纯化，选取在高浓区生长快速、强壮的菌落，重复三次；浓度梯度所用培养基：20P和25P麦汁添加2％琼脂，方法为先将25P培养基铺入微倾放置的培养皿内，使铺好的培养基在培养皿内一侧成15°角，等凝固后再将20P培养基铺入水平放置培养皿，直到培养基平面水平为止。

6.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤5包括α-葡萄糖苷酶活力分析和乙醇脱氢酶活力分析，通过检测糖转运关键限速酶α-葡萄糖苷酶活力，筛选抗渗透压能力高的菌株，通过检测乙醇代谢过程中乙醇脱氢酶活力，筛选抗乙醇毒性能力高的菌株。

7.根据权利要求6所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤6的具体步骤包括：对经过梯度平板筛选和糖代谢能力复筛所得菌株进行实验室规模发酵实验，验证高浓菌株酿造过程的酵母综合状态、啤酒理化风味质量，重点考察酵母增殖能力、降糖能力以及风味代谢能力，进行菌株优选，确定超高浓酿造优选菌株。

8.根据权利要求3所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤2.2中的超声处理使用的超声破碎仪总功率为950W，使用功率4％，超声9.9s，停9.9s，共1min。

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