CN116024154A

CN116024154A - 一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法

Info

Publication number: CN116024154A
Application number: CN202310322566.5A
Authority: CN
Inventors: 韩双艳; 王帅; 赵风光; 林影
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2023-03-30
Filing date: 2023-03-30
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2043-03-30
Also published as: CN116024154B

Abstract

本发明公开一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，属于生物技术领域。该方法结合了MMC和SFC两种适应性实验室进化方式，以甲醇作为筛选压力，来驱动毕赤酵母GS115菌株增加其对高甲醇的耐受性和利用率。该进化菌株的优良特性使其具有非常良好的工业应用前景，可广泛用于利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高值化学品，也为非灭菌型发酵生产提供可能性。此两种适应性结合的进化方法可以被应用于其他菌株的不同耐受条件的进化，并且大幅缩短进化周期，提高菌株耐受性。

Description

一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，并根据该方法得到一株耐高甲醇浓度的毕赤酵母。

背景技术

巴斯德毕赤酵母（ Komagataella phaffii， K. phaffii）（简称毕赤酵母）是一种典型的甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源，因其拥有较成熟的蛋白分泌表达系统，成为受欢迎的微生物细胞工厂。但其对甲醇的利用率与同化效率不理想，甲醇及有毒代谢中间产物的积累对细胞具有毒性，不利于菌体生长和重组蛋白的大量生成。因此开发能够高效耐受甲醇的毕赤酵母菌株显得尤为重要。

适应性实验室进化又称定向进化、实验室进化，是利用微生物固有的“生物鲁棒性”，即特定的压力条件下，适应环境的正突变生物体能获得后代数量优势（如菌体生长速度，底物消耗速度，耐受高温、高或低pH值以及不同有机溶剂等），通过连续传代培养获得数量富集，在此基础上产生新的基因正突变以获得质量富集。长时间处于高甲醇浓度下的微生物会产生一系列基因型的变化来响应甲醇胁迫压力，从而得到能耐受不利的生长环境的微生物菌株。

常用的适应性实验室进化就是在摇瓶中通过连续培养法（Shake Flask Culture，SFC）实现进化，进化的速度取决于基因突变率和筛选条件，但是自然突变率通常很低，导致许多进化周期较长，从几个月甚至数年不等，进化时间越长，传代培养过程越容易染菌，从而引起进化失败。最近在提高菌株甲醇耐受的研究中，朱泰承等人的专利通过摇瓶驯化的毕赤酵母菌株的比生长速率与出发菌株GS115相比至多提升1.95倍，在固体培养基中可耐受50g/L以上的甲醇，而毕赤酵母出发菌株GS115仅能耐受至多20g/L（相当于2.67%）的甲醇；Yamada等人通过多拷贝乳酸脱氢酶在毕赤酵母中表达，可以用4%甲醇为碳源在分批补料发酵；Guo等人通过代谢工程手段修饰毕赤酵母，可以用2%甲醇为碳源在摇瓶中发酵。然而目前毕赤酵母菌株甲醇耐受能力还有待进一步的加强。

全自动高通量微生物液滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）是基于液滴微流控技术研发而成的一款微生物培养系统。MMC是适应性实验室进化的方式之一，具有高通量、自动传代、化学因子梯度添加、在线检测液滴光谱、微生物分选等功能，具有很好的微生物高效培养与筛选的功能。MMC有着超高通量、高灵敏度、定量准确性等优点，极大加速了具有特定功能微生物的筛选速度。在最近的研究中，Yun等人用MMC进化，用了30天时间提高 Clostridium butyricum对100 g/L的1，3-丙二醇耐受。目前并没有相关研究将MMC应用于毕赤酵母甲醇耐受相关研究的先例。然而MMC进化存在极限，即菌株在到达一定的耐受极限时很难继续进化。如何去突破菌株进化的极限是目前的研究方向之一。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法。

本发明的另一目的在于提供一株耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株。

本发明的再一目的在于提供上述方法或毕赤酵母菌株的应用。

本发明以GS115菌株为出发菌株，通过甲醇介导的MMC和SFC两种实验室适应性进化方式获得的高甲醇耐受的毕赤酵母突变菌株，来提高毕赤酵母对于甲醇的耐受能力及其在实际应用中的价值。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，包括如下步骤：使用MMC和SFC两种适应性实验室进化的方式：首先使用MMC，以不同浓度甲醇为唯一碳源的液体培养基，对毕赤酵母进行进化，得到能够在3～6%甲醇浓度条件下生长的毕赤酵母菌株；然后通过SFC对获得的毕赤酵母菌株进一步进化，最终可以在短时间内得到可以在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。

优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母（ Komagataella phaffii， K. phaffii）GS115，但不限于此。

具体包括如下步骤：

1）活化：将毕赤酵母（ K. phaffii）进行活化，离心后收集菌体并弃上清，洗涤菌体两次后，将菌体接种在甲醇为碳源的液体培养基中进行培养，待菌株进入稳定期后用做MMC进化中的种子液；

2）MMC进化：首先将步骤1）获得的种子液传代于0.1～1.0%甲醇浓度的液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的液体培养基，连续传代近15～30次，MMC进化所需总时间为300～500h；

3）筛选：将长势较好的液滴筛选出来，划线，挑取单菌落在含有4%～6%甲醇浓度的液体培养基中进行摇瓶/平板发酵验证，筛选出能高效耐受甲醇的优良菌株，继续进行SFC进化；

4）SFC进化：将MMC筛选到的优良菌株首先在含有0.1～1%甲醇浓度的液体培养基中活化培养（培养48～72h），然后转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中进行培养一定时间（初始OD₆₀₀为0.1～2，培养24～96h）；如果在一定时间（24～96h）内OD₆₀₀达到8～15，进化菌株转移到含有下一个甲醇浓度的液体培养基中继续培养（初始OD₆₀₀为0.1～2）；如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养；通过SFC进化共300～500h后，获得在8～20%（优选10～13%）甲醇浓度条件下正常生长的菌株。

进一步的，步骤1）中：

所述的活化为将毕赤酵母（ K. phaffii）在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）固体培养基平板上挑取单菌落接种至YPD液体培养基中活化培养；其中，活化培养的时间为48h～72h（优选72h）；

所述的洗涤为用无菌生理盐水洗涤；

所述的甲醇为碳源的液体培养基为含有0.1～1%（v/v）甲醇浓度的液体培养基；优选为含有0.1～1%（v/v）甲醇浓度的BMMY液体培养基；

所述的1%（v/v）浓度甲醇等于7.5 g/L甲醇。

进一步的，步骤2）中：

将种子液装入MMC的进样小瓶中（0.1 OD左右的种子液与油相），另外两个进样小瓶分别装入纯甲醇与油相和0.1～1%甲醇浓度的BMMY液体培养基与油相。

所述的液体培养基均为BMMY液体培养基；

进一步的，步骤3）中：

所述的划线是在YPD平板上划线；

所述的液体培养基为BMMY液体培养基；

步骤3）筛选出的优良菌株可以在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中正常生长的菌株（OD₆₀₀=5～8）。

步骤4）中所述的液体培养基为BMMY液体培养基；

步骤4）中，转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基，优选的，进化甲醇浓度间隔为2%；

步骤4）中，SFC进化后获得的菌株在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵36～48h生物量达到OD₆₀₀=15～20，在10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵96～144h达到OD₆₀₀=15～20。

上述方法，所述培养基是以甲醇为唯一碳源的培养基。

上述方法，所述YPD固体培养基成分（包括但不限于）：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、15g/L琼脂，pH自然；所述YPD液体培养基包括20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，pH自然；所述BMMY液体培养基成分包括10g/L酵母精提物、20g/L蛋白胨、13.4g/L YNB、100ml/L PH=6 PBS（甲醇灭菌后加入）。

上述方法，步骤1），步骤2），步骤3）及步骤4）所述的常用（但不限于）培养条件为28～32℃，摇床转速180～250 rpm。

一种耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株，通过上述方法制得。

所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株，名称为 Komagataella phaffii GS115WS026-4，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号：GDMCCNo：63184。

所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株，在液体培养基中可耐受10%（75g/L）浓度的甲醇，固体培养基可以耐受13%（97.5g/L）浓度的甲醇，而出发菌株GS115在液体培养基中仅能耐受至多2.67%（20g/L）的甲醇。

所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株在耐受高浓度甲醇或高效利用甲醇方面的应用。

所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株在表达外源蛋白和高值化学品方面的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明结合了MMC和SFC两种适应性实验室进化方式，以甲醇作为筛选压力，来驱动毕赤酵母GS115菌株增加其对高甲醇的耐受性和利用率。该进化菌株的优良特性使其具有非常良好的工业应用前景，可广泛用于利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高值化学品，也为非灭菌型发酵生产提供可能性。此两种适应性结合的进化方法可以被应用于其他菌株的不同耐受条件的进化，提高菌株耐受性。

附图说明

图1为毕赤酵母GS115的MMC进化图。

图2为GS115，WS026-4（MMC），WS026-14（MMC）在4%甲醇浓度下的生长曲线图。

图3为WS026-4/14（MMC）菌株的SFC进化过程图。

图4为GS115，WS026-4/14（MMC），WS026-4/14（MMC-SFC）菌株在6%，8%和10%甲醇浓度下的生长曲线图。

图5为GS115，WS026-4（MMC），WS026-4（MMC-SFC）进化后的毕赤酵母在高甲醇（6%、10%、13%）下菌株耐受性情况对比结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.巴斯德毕赤酵母（ K. phaffii）GS115的MMC进化

一、原始菌株的活化

将-80℃保存的巴斯德毕赤酵母（ K. phaffii）GS115菌液采用YPD固体平板（20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，pH自然，15g/L琼脂）进行培养，分离获得单菌落，然后挑取一个单克隆接种至YPD培养基中，30℃，200r/m震荡培养72h。取YPD液体培养基活化后的菌液，离心（5000rpm，5min）收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤两次，离心（5000rpm，5min），将菌体重悬于含1%（v/v）甲醇的BMMY液体培养基（10g/L酵母精提物、20g/L蛋白胨、13.4g/L YNB、100ml/L PH=6 PBS）中进行培养，30℃，200r/m震荡培养48h，待菌株进入稳定期作为种子液进行接下来的进化。

二、MMC进化

将种子液装入MMC的进样小瓶中（OD₆₀₀=0.1的种子液与油相），另外两个进样小瓶分别装入纯甲醇与油相，1%甲醇浓度的BMMY液体培养基与油相。首先传代于1.0%甲醇浓度的BMMY液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的BMMY液体培养基，连续传代17次。通过MMC进化407h后，获得液滴Drop26（WS026）进行接下来的筛选。

三、筛选

如图1所示，在MMC的进化中，甲醇浓度为5%的压力下，GS115的生长趋近于0。为了将长势较好的液滴筛选出来，将5%下的液滴Drop26（WS026）分选出来，在YPD平板上面划线，挑取单菌落在含有6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中进行摇瓶发酵验证，筛选出能高效耐受甲醇的优良菌株WS026-4（MMC），WS026-14（MMC）。其中，使用MMC进化的菌株WS026-4（MMC）可以在4%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵48h进入平稳（OD₆₀₀=20.9）（见图2），在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵48h时OD₆₀₀为7.2（见图4）。

实施例2.巴斯德毕赤酵母（ K. phaffii）GS115的SFC进化

一、SFC进化流程

将实施例1中经过MMC驯化得到的能高效耐受甲醇的优良菌株WS026-4（MMC）、WS026-14（MMC）分别首先接种于1%甲醇浓度的BMMY液体培养基中活化培养，5000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌生理盐水洗涤菌体2次后，接种于4%甲醇浓度的BMMY液体培养基中进行培养（初始OD₆₀₀=1，培养48h），如果在48小时内OD₆₀₀达到10～12，进化菌株转移到含有6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中继续培养（初始OD₆₀₀为1）。如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养。

二、SFC进化结果

经过MMC驯化407h后，毕赤酵母菌株WS026-4（MMC）、WS026-14（MMC）分别在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中培养48h后，5000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌生理盐水洗涤菌体2次后，再次接种于6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中培养48h，其中，菌株WS026-4（MMC）-1的OD₆₀₀达到10.76；收集6%甲醇浓度的BMMY液体培养基培养的菌体，接种于8%甲醇浓度的BMMY液体培养基中培养48h后，5000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌生理盐水洗涤菌体2次后，再次接种于8%甲醇浓度的BMMY液体培养基培养48h，其中，WS026-4（MMC）-2的OD₆₀₀达到10；收集8%甲醇浓度的BMMY液体培养基培养的菌体，接种于10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中培养48h后，5000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌生理盐水洗涤菌体2次后，连续两次接种于10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中培养48h，其中，WS026-4（MMC）-3的OD₆₀₀达到11.32。WS026-4/14（MMC）菌株的SFC进化过程如图3所示，通过SFC进化了共336h后，获得进化后的菌株WS026-4（MMC-SFC），WS026-14（MMC-SFC）；其中，进化菌株WS026-4（MMC-SFC）可以在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵48h生物量达到OD₆₀₀=18.7（见图4），并且可以在10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵96h生物量达到OD₆₀₀=20（见图4）。

实施例3.进化菌株WS026-4（MMC-SFC）甲醇耐受

一、生长曲线的测定

在菌株培养的过程中，每隔12h取样检测菌株的生长情况即OD₆₀₀。采用比色法进行测定，取1mL发酵液于1.5mL离心管中，离心（5000rpm，5min），去上清液，用生理盐水洗涤后，重悬酵母细胞，稀释适当的倍数后，采用紫外分光光度计在600nm下用0.5cm光径的比色皿测定吸光度，再乘以相应的稀释倍数即为酵母的OD₆₀₀，测定GS115，WS026-4（MMC），WS026-4（MMC-SFC），WS026-14（MMC）和WS026-14（MMC-SFC）在6%，8%和10%甲醇浓度的BMMY液体培养基的生长曲线。如图4所示，在6%，8%和10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中GS115生长滞后，甚至不生长。WS026-4（MMC）和WS026-14（MMC）菌株在6%甲醇浓度条件下的BMMY液体培养基下生长状态相似，生长缓慢，约为未进化菌株GS115的7倍。WS026-4（MMC-SFC）和WS026-14（MMC-SFC）进化菌株可以在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中可以正常生长，约是MMC进化菌株的2.6倍，约为未进化菌株GS115的18倍。在8%甲醇浓度的BMMY液体培养基中，WS026-4（MMC）和WS026-14（MMC）生长滞后，而WS026-4（MMC-SFC）和WS026-14（MMC-SFC）生长正常。在10%甲醇浓度的BMMY液体培养基中，进化菌株在前期生长都比较滞后，而WS026-4（MMC-SFC）和WS026-14（MMC-SFC）在48h时分别为OD₆₀₀=6.93，OD₆₀₀=5.94；在96h时，分别OD₆₀₀=20，OD₆₀₀=19.55。

二、菌株耐受甲醇能力的平板检测

取培养后的WS026-4（MMC）和WS026-4（MMC-SFC）发酵液，调整各菌株的OD₆₀₀=1，经梯度稀释不同的倍数后，各取3μL分别点样于含有6%，10%和13%甲醇浓度（45g/L，75g/L，以及97.5g/L）的BMMY固体培养基，30℃培养，比较各菌株的生长情况，以巴斯德毕赤酵母GS115作为对照。如图5所示，随着甲醇浓度的提高（依次为6%-45g/L，10%-75g/L以及13%-97.5g/L），对照菌株GS115在BMMY固体培养基上不生长。经过甲醇驯化的WS026-4（MMC-SFC）培养3天后，在6%和10%甲醇浓度的BMMY平板上均长势良好，而在13%甲醇浓度的BMMY平板上长势较慢；但是在5天后，WS026-4（MMC-SFC）可以正常生长出来，而WS026-4（MMC）只在含6%甲醇浓度的BMMY平板生长。

三、WS026-4（MMC-SFC）的甲醇耐受评价结果

结果显示经甲醇驯化的菌株在甲醇为唯一碳源的BMMY培养基中的生长优势更加明显，对照菌株GS115在高强度的甲醇添加条件下，生长受到了抑制，甚至死亡，高浓度甲醇迅速自由扩散到细胞中可能时细胞死亡的原因。而经过驯化的菌株仍然可以照常生长，WS026-4（MMC-SFC）菌株在生长速率方面优势特别显著。结果表明与以往单独进行SFC方法相比，MMC和SFC二者相结合的适应性实验室进化能获得更为高浓度甲醇耐受的进化菌株。经过较高浓度甲醇的驯化之后，这些菌株获得了高甲醇耐受性，为工业上利用甲醇生产高价值化学品提供了新的模式菌株，也为非灭菌型发酵生产提供可能性。

综上所述，将菌株WS026-4（MMC-SFC）命名为 Komagataella phaffii GS115WS026-4，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号：GDMCCNo：63184。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：使用MMC和SFC两种适应性实验室进化的方式对毕赤酵母：首先使用MMC，以不同浓度甲醇为唯一碳源的液体培养基，对毕赤酵母进行进化，得到能够在3～6%甲醇浓度条件下生长的毕赤酵母菌株；然后通过SFC对获得的毕赤酵母菌株进一步进化，最终能在短时间内得到在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述毕赤酵母为毕赤酵母（Komagataella phaffii）GS115。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）活化：将毕赤酵母进行活化，离心后收集菌体并弃上清，洗涤菌体两次后，将菌体接种在甲醇为碳源的液体培养基中进行培养，待菌株进入稳定期后用做MMC进化中的种子液；

2）MMC进化：首先将步骤1）获得的种子液传代于0.1～1.0%甲醇浓度的液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的液体培养基，连续传代15～30次，MMC进化所需总时间为300～500h；

4）SFC进化：将MMC筛选到的优良菌株首先在含有0.1～1%甲醇浓度的液体培养基中活化培养，然后转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中进行培养一定时间；如果在一定时间内OD₆₀₀达到8～15，进化菌株转移到含有下一个甲醇浓度的液体培养基中继续培养；如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养；通过SFC进化共300～500h后，获得在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述的甲醇为碳源的液体培养基为含有0.1～1%v/v甲醇浓度的液体培养基；

步骤1）中，所述的洗涤为用无菌生理盐水洗涤；

步骤1）中，所述的液体培养基为BMMY液体培养基；

步骤2）中，所述的液体培养基均为BMMY液体培养基；

步骤3）中，所述的液体培养基为BMMY液体培养基；

步骤4）中，所述的液体培养基为BMMY液体培养基；

步骤1），步骤2），步骤3）及步骤4）所述的培养的条件为28～32℃，转速180～250 rpm；

步骤4）中，所述的活化培养的时间为48～72h；

步骤4）中，所述的培养一定时间为培养24～96h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

步骤4）中，转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中所用的甲醇浓度间隔为2%。

6.权利要求1～5任一项所述的方法在制备耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株中的应用。

7.一种耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株，其特征在于，通过权利要求1～5任一项所述的方法制得。

8.根据权利要求7所述的毕赤酵母菌株，其特征在于：所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株，名称为Komagataella phaffii GS115 WS026-4，于2023年02月22日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：63184。

9.根据权利要求7或8所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株在耐受高浓度甲醇或高效利用甲醇方面的应用。

10.根据权利要求7或8所述的耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株在表达外源蛋白和高值化学品方面的应用。