CN108865912A - 一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法，所述方法是将毕赤酵母中的GCW19基因敲除，本发明可以高效地获得具有甲醇耐受显著增加的毕赤酵母工程菌株gcw19Δ。与传统毕赤酵母菌株相比，本发明的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中该菌株生长速率明显提高。本发明方法获得的毕赤酵母工程菌株促进酵母细胞在甲醇中的快速生长，为实现利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高附加值化学品提供了良好的宿主菌株，具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法。
背景技术
随着当今世界石油资源的日益减少和甲醇单位成本的降低，用甲醇作为新的石化原料来源已经成为一种趋势。但是近年来我国甲醇工业发展十分迅猛，大量的甲醇急需下游产品的消化。在传统下游应用，包括塑料、合成纤维、合成橡胶、胶粘剂、染料、涂料、香料、医药和农药等方面有着重要的作用。随着煤化工国产化工艺技术及装备大型化取得突破，醇醚燃料、甲醇制烯烃芳烃等新兴煤化工产业发展前景乐观。另外，基于国际石油价格上涨和中国汽油消费量大幅增加的发展趋势，甲醇汽油、甲醇燃料和二甲醚等新型燃料的优越品质逐渐引起了人们的重视，世界各国也相继研发了不同掺和比例的甲醇汽油，成为甲醇新的消费增长点。
除了替代传统的石化资源，利用甲醇作为碳源来生产蛋白也受到广泛的研究和关注。1969年，Kiochi Ogata等人首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，这种嗜甲醇酵母立刻引起人们极大的兴趣。此后通过这种酵母在甲醇为主要基质培养基上发酵生成单细胞菌体，作为一种单细胞蛋白推向市场作为高蛋白的动物饲料。在生产中，原料甲醇的成本占总成本的50％以上，加之近几年蛋白质饲料日益短缺，所以无论从甲醇下游产品开发，还是从饲料工业的需求角度分析，甲醇蛋白都是一只十分重要且极具市场潜力和发展前景的产品。
除了生产单细胞蛋白，这种嗜甲醇的菌株可以用于外源蛋白的表达。目前应用最广泛的巴斯德毕赤酵母受体是由Cregg于1985年建立的菌株GS115。这种细胞内含有甲醇代谢途径所必需的酶，如乙醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中乙醇氧化酶是甲醇代谢途径中的十分重要的酶，也是催化甲醇代谢第一步反应的酶，它能使甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢，过氧化氢酶又降解过氧化氢为氧气和水，过氧化氢又进一步氧化甲醛为甲酸和CO2，这样通过两种脱氢酶的作用使细胞以甲醇为唯一碳源。由于乙醇氧化酶与氧的亲合力低，所以在以甲醇为唯一碳源时，会代偿性产生大量的乙醇氧化酶，约占全部可溶性蛋白质的30％，而在以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到乙醇氧化酶，这说明乙醇氧化酶基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。一般来说，毕赤酵母在表达外源蛋白的大规模高密度发酵过程中，主要分为两个阶段，即菌体生长增殖阶段和诱导外源蛋白表达阶段。第一个阶段是酵母细胞营养生长阶段，菌体快速积累达到一定的菌体量需要价格低廉且能使酵母细胞生长迅速的碳源，通常为甘油和葡萄糖，而葡萄糖易产生葡萄糖效应，因而多用甘油作为唯一碳源。第二个阶段的外源蛋白表达是以甲醇作为唯一碳源进行诱导。在这个过程中，甲醇的精确流加是确定外源蛋白表达的关键，流加速率过低时细胞的生长受到限制，且诱导外源蛋白表达的强度过低，流加速率过高超过了毕赤酵母对于甲醇的利用速率，就会在过程中积累高浓度的甲醇，甲醇代谢产生的大量甲醛及过氧化氢，对细胞的毒害作用包括抑制细胞的生长、甚至造成细胞的死亡和裂解，胞内蛋白酶大量释放并降解分泌表达的外源蛋白。因此，选育耐高浓度甲醇的毕赤酵母菌株是提高外源蛋白表达量的重要途径之一。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，通过将毕赤酵母的GCW19基因敲除，构建出甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株，从而提供毕赤酵母菌的甲醇耐受性，由此获得的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株能够以甲醇为唯一碳源或者在搞浓度甲醇培养基中快速生长并生产酶制剂和高附加值化学品。
为了达到上述技术效果，本发明提供了如下技术方案：
一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，所述方法是将毕赤酵母的GCW19基因敲除。
优选地，所述毕赤酵母基因GCW19的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
优选地，该方法中用于构建甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的出发菌株为巴斯德毕赤酵母GS115。
更为具体地，本发明的方法具体包括如下步骤：
(1)GCW19基因敲除组件的构建：GCW19基因敲除是以毕赤酵母GS115基因组作为模板，在引物P5/P6和P7/P8作用下进行PCR扩增，分别获得基因GCW19上游和下游同源臂大约600bp的片段，而后以质粒pPICZαA-Cre为模板，在引物P3/P4作用下扩增两端带有lox71和lox66的Cre-ZeoR表达盒，所述引物序列为：
P5:GATTTGTAAACATCATCGCCAGG(SEQ ID NO：2)，
P6:AGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACTTAATGCGAGAGTTGCACCGAT(SEQ ID NO：3)，
P7:GGAGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGCTGGTCTCTTCGTCGCTATGTT(SEQ ID NO：4)，
P8:GCATGATGGTCAATTCGGCACTA(SEQ ID NO：5)，
P3:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGATCTAACATCCAAAGACG(SEQ ID NO：6)，
P4:TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCTCCAGCTTGCAAATTAA(SEQ ID NO：7)；
(2)GCW19基因敲除表达盒的构建：将成功扩增的上下游片段和Cre-ZeoR表达盒进行重叠延伸PCR，构建GCW19基因敲除表达盒GCW19-Cassette；
(3)GCW19基因缺失的毕赤酵母菌株构建：将成功构建的GCW19基因敲除表达盒转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过敲除表达盒两端的同源臂与敲除靶基因上下游片段的同源重组，将敲除靶基因替换掉；成功替换的菌株利用甲醇诱导Cre酶的表达，执行loxp71和loxp66位点间Cre-ZeoR基因片段的切除，实现GCW19基因的无痕敲除。
在本发明的实施例中，本发明的是利用Cre/loxP重组酶系统对毕赤酵母的GCW19基因敲除(所述GCW19基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，GenBank登录号为CAY68818.1)。为了便于说明及重现，本发明的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株是通过如下具体步骤而获得：
(1)GCW19基因上下游同源臂的扩增。提取毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，根据GCW19基因在染色体上的位置，找出基因上游和下游约600bp片段为模板。设计引物扩增GCW19基因上游的同源臂片段和下游的同源臂片段。
(2)Cre-ZeoR表达盒的扩增。以质粒pPICZαA-Cre为模板，设计引物扩增得到Cre-ZeoR表达盒，表达盒5’端带有lox71位点序列，3’端带有lox66位点序列。
(3)敲除表达盒的构建。通过重叠延伸PCR的方法将步骤(1)中扩增的GCW19基因上游同源臂片段和下游同源臂片段，以及步骤(2)中扩增的Cre-ZeoR表达盒进行融合，得到GCW19基因的敲除表达盒片段“上游同源臂-loxp71-Cre-ZeoR表达盒-loxp66-下游同源臂”。
(4)利用山梨醇处理制备毕赤酵母GS115细胞感受态。
(5)将步骤(3)得到的GCW19基因敲除盒表达盒片段利用电转化方法转入步骤(4)中制备的感受态酵母中，涂布于含博来霉素100μg/mL的YPDZ固体平板中培养。
(6)将步骤(5)中长出的转化子进行鉴定，挑取阳性转化子接种于含1％甲醇的YPM液体培养基中培养24h以诱导Cre酶的表达，剔除loxp71和loxp66序列间的Cre-ZeoR表达盒，得到无痕敲除GCW19基因的菌株gcw19Δ。
(7)将步骤(6)中获得的基因敲除菌株gcw19Δ在分别含1％，2％和3％甲醇的BMMY培养基中培养，生长速度和出发菌株GS115相比显著提升。
相对于现有技术本发明具有如下的优点和有益效果：本发明方法利用Cre/loxP系统敲除毕赤酵母GCW19基因，可以高效获得对甲醇耐性显著提升的毕赤酵母工程菌株。本方法具有操作简单，方便易行等特点。本发明获得的工程菌株gcw19Δ与出发菌株GS115相比，具有良好的甲醇耐受性，在BMMY培养基甲醇浓度为1％，2％和3％时均可生长，而出发菌株GS115在前24h生长缓慢，24h生长基本停滞。由此可见，与传统毕赤酵母菌株相比，本发明的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中该菌株生长速率明显提高，通过本发明方法获得的毕赤酵母工程菌株能够促进酵母细胞在甲醇中的快速生长，为实现利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高附加值化学品提供了良好的宿主菌株，具有良好的工业应用前景。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
附图说明
图1为gcw19Δ菌株敲除组件的电泳图，包括GCW19基因上游同源臂GCW19-U，GCW19基因下游同源臂GCW19-D，Cre-ZeoR表达盒以及三部分融合片段“上游同源臂-loxp71-Cre-ZeoR表达盒-loxp66-下游同源臂”的GCW19基因敲除表达盒GCW19-Cassette。
图2为博来霉素筛选标记切除的敲除菌株平板验证。
图3为敲除菌株的菌落PCR鉴定电泳图。
图4为不同甲醇浓度下BMMY培养基中敲除菌株gcw19Δ和对照菌株GS115的比生长速率。
图5为敲除菌株gcw19Δ和对照菌株GS115在摇瓶中的生长曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、毕赤酵母GCW19基因敲除菌株的获得
一、GCW19基因敲除组件的构建。以毕赤酵母GS115基因组为模板，根据已报道的毕赤酵母GS115的GCW19基因及其侧翼序列，设计引物P5/P6扩增GCW19基因上游的同源臂片段GCW19-U，设计引物P7/P8扩增GCW19基因下游的同源臂片段GCW19-D。引物序列为：
P5:GATTTGTAAACATCATCGCCAGG
P6:AGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACTTAATGCGAGAGTTGCACCGAT
P7:GGAGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGCTGGTCTCTTCGTCGCTATGTT
P8:GCATGATGGTCAATTCGGCACTA
以质粒pPICZαA-CRE为模板，设计引物P3/P4扩增Cre-ZeoR序列，其中P3引物5’端带有lox71位点序列，P4引物3’端带有lox66位点序列，引物序列为：
P3:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGATCTAACATCCAAAGACG
P4:TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCTCCAGCTTGCAAATTAA
以基因组和质粒为模板分别进行PCR扩增时，PCR反应体系为：2×PCR Buffer25.0mL，2.5mM dNTPs 10.0μL，引物2μL(引物浓度10mM)，基因组DNA 200.0ng，KOD DNApolymerase 1.0μL，ddH2O补齐至50μL。PCR反应条件为：94oC预变性5min，98oC变性10s，55oC退火30s，68oC延伸1kb/min，变性退火和延伸过程循环30次，最后68oC延伸7min。得到扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段(图1)。基因GCW19上游同源臂GCW19-U长度为663bp，下游同源臂GCW19-D长度为635bp，Cre-ZeoR表达盒长度为3556bp，电泳结果与理论大小一致。
二、GCW19基因敲除表达盒的构建。将上述扩增的三个DNA片段：GCW19-U，GCW19-D以及Cre-ZeoR表达盒作为模板，以P5和P8为引物扩增GCW19基因的敲除表达盒片段“上游同源臂-loxp71-Cre-ZeoR表达盒-loxp66-下游同源臂”，简称为GCW19-Cassette。PCR反应体系和条件与上述一致。得到扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段(图1)，与GCW19基因敲除表达盒的理论大小4854bp大小一致。
三、GCW19基因缺失的毕赤酵母菌株构建。将毕赤酵母GS115细胞在YPD固体平板上进行活化。挑取转化子至新鲜的YPD液体培养基中生长至OD 600达到1.3-1.5。室温下6000rpm离心5min收集菌体，每管加入新鲜配制的LDST溶液(100mM醋酸锂，10mM二硫苏糖醇，0.6M山梨醇，10mM Tris-HCl，调整pH＝7.5，过滤除菌)，30oC孵育30min。室温下6000rpm离心5min收集菌体，用1mL冰浴的1M山梨醇重悬菌体，转至1.5mL离心管中，用山梨醇重复洗涤3次。)用400μL冰浴的1M山梨醇重悬菌体制成感受态细胞，分装成每管80μL，快速转入-80oC冰箱中。将上述(二)中构建的GCW19-Cassette取出0.1～2μg加入感受态细胞中，使用电穿孔仪进行电击(设置参数为电压1.5kV，电阻200Ω，电容25mF，电击时间5ms)，最终通过敲除表达盒两端的同源臂与敲除靶基因上下游片段的同源重组，将敲除靶基因替换掉。
将上述成功替换GCW19基因的菌株进行甲醇诱导Cre酶的表达，执行loxp71和loxp66位点间Cre-ZeoR基因片段的切除，实现GCW19基因的无痕敲除。具体方法如下：将成功替换GCW19基因的菌株接种于含1％甲醇的YPM培养基中，30oC，250rpm培养24h。蘸取菌液，涂布于含博来霉素的YPDZ固体平板和不含博来霉素的YPD平板中进行筛选，30oC培养箱中培养72h。在不含博来霉素的YPD平板上生长，同时在含博来霉素的YPDZ平板上不生长，初步鉴定成功剔除含Cre酶及博来霉素筛选标记的Cre-ZeoR的表达盒(图2)。对上述鉴定正确的菌株进行菌落PCR鉴定，同时以毕赤酵母GS115为对照菌株，设计引物P9/P10扩增GCW19基因上游大约800bp至下游800bp的一段序列。电泳结果显示敲除菌株gcw19Δ和对照菌株GS115扩增的条带大小差异即为敲除片段GCW19的大小。说明目的基因敲除成功，且抗性标记切除成功(图3)。引物序列为：
P9:CCCTGGTCCGTTACTCTCCTCTA(SEQ ID NO：8)
P10:CAACTACTGGAGCAATTGGAGAA(SEQ ID NO：9)
实施例2、敲除菌株gcw19Δ的耐受性实验
一、菌株在96孔板中的生长分析。将实施例1中成功敲除的菌株gcw19Δ和对照菌株GS115在YPD固体培养基中活化后，接种于含1％甘油的BMGY培养基中培养约18h达到对数生长期。控制起始细胞OD600＝0.1，分别接种至含1％，2％和3％甲醇的BMMY培养基中的96孔板中，装液量为150μL，培养温度30oC，转速1000rpm，置于微孔板振荡器中培养。每隔2h测定一次细胞OD600值，并计算对数生长条件下菌株在不同甲醇浓度的培养基中的比生长速率(图4)。从结果看，对照菌株GS115在甲醇培养基中生长缓慢，随着甲醇浓度的增加，细胞比生长速度显著下降，说明甲醇对细胞生长造成了一定的毒害。而敲除菌株gcw19Δ比生长速率在不同甲醇浓度的BMMY培养基中的比生长速率均明显高于对照菌株GS115。其中在2％甲醇浓度的BMMY培养基中比生长速率最高。
二、菌株在摇瓶中的生长分析。将上述方法验证的菌株在装液量为10％的250mL三角瓶中进行扩大培养，进一步验证在甲醇培养基中的生长情况。将活化的菌株接种于含25mL的BMGY培养基中，培养约24h达到对数生长期。控制细胞的起始数量OD600＝1，分别接种在以1％，2％和3％甲醇为碳源的25mLBMMY培养基中，30oC，转速250rpm，每隔24h补加相应体积的甲醇并测定菌体OD600，发酵120h细胞的生长情况如图5所示。结果显示敲除菌株gcw19Δ在不同甲醇浓度的培养基中生长速度都明显强于对照菌株，而对照菌株GS115在1％甲醇浓度的BMMY培养基中生长缓慢，而在更高甲醇浓度的BMMY培养基中生长受到了抑制，发酵至24h以后生长基本停止。这些结果说明了经过敲除的菌株gcw19Δ对甲醇具有高耐受特性。
相比于现有技术，上述实施例提供的技术方案具备如下有益效果：
本发明方法利用Cre/loxP系统敲除毕赤酵母GCW19基因，可以高效获得对甲醇耐性显著提升的毕赤酵母工程菌株。本方法具有操作简单，方便易行等特点。本发明获得的工程菌株gcw19Δ与出发菌株GS115相比，具有良好的甲醇耐受性，在BMMY培养基甲醇浓度为1％，2％和3％时均可生长，而出发菌株GS115在前24h生长缓慢，24h生长基本停滞。由此可见，与传统毕赤酵母菌株相比，本发明的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中该菌株生长速率明显提高，通过本发明方法获得的毕赤酵母工程菌株能够促进酵母细胞在甲醇中的快速生长，为实现利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高附加值化学品提供了良好的宿主菌株，具有良好的工业应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> SEQUENCE LISTING
<130> 一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 447
<212> DNA
<213> 毕赤酵母（Pichia pastoris）
<400> 1
atgcaattca aaagtttgat cggtgcaact ctcgcattaa gcgttgttaa ggctacaact 60
gagttggagc caatcttcac aaatgatgtc aatgtcacag tccccacggt gccaccagag 120
atcacttcaa cccctgatgt tagtgttcct ggaaacttga ccgaaactgg aggactcaca 180
aacaccacag gaacaggagg atttactaat accactgcaa ctggcacagg aggtttcact 240
aataccactg caacaggcac gggcacaggc acaggcactg gaaccggaac cggcacaggc 300
acaggcacag gcacaggaac tggcactgga accggtactg gtactggtac cactggcaca 360
ggtacagaaa ctggtaacgg tgcccaagcg gtactaggta gttcagtctt agccgcagct 420
ggtctcttcg tcgctatgtt aatttga 447
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gat 63
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gtt 63
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Claims (6)
1.一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法是将毕赤酵母的GCW19基因敲除。
2.如权利要求1所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述毕赤酵母基因GCW19的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
3.如权利要求2所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，该方法中用于构建甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的出发菌株为巴斯德毕赤酵母GS115。
4.如权利要求3所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)GCW19基因敲除组件的构建：GCW19基因敲除是以毕赤酵母GS115基因组作为模板，在引物P5/P6和P7/P8作用下进行PCR扩增，分别获得基因GCW19上游和下游同源臂大约600bp的片段，而后以质粒pPICZαA-Cre为模板，在引物P3/P4作用下扩增两端带有lox71和lox66的Cre-ZeoR表达盒，所述引物序列为：
P5:GATTTGTAAACATCATCGCCAGG，
P6:AGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACTTAATGCGAGAGTTGCACCGAT，
P7:GGAGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGCTGGTCTCTTCGTCGCTATGTT，
P8:GCATGATGGTCAATTCGGCACTA，
P3:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGATCTAACATCCAAAGACG，
P4:TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCTCCAGCTTGCAAATTAA；
(2)GCW19基因敲除表达盒的构建：将成功扩增的上下游片段和Cre-ZeoR表达盒进行重叠延伸PCR，构建GCW19基因敲除表达盒GCW19-Cassette；
(3)GCW19基因缺失的毕赤酵母菌株构建：将成功构建的GCW19基因敲除表达盒转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过敲除表达盒两端的同源臂与敲除靶基因上下游片段的同源重组，将敲除靶基因替换掉；成功替换的菌株利用甲醇诱导Cre酶的表达，执行loxp71和loxp66位点间Cre-ZeoR基因片段的切除，实现GCW19基因的无痕敲除。
5.一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株，其特征在于，该甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株是通过如权利要求1-4中任意一项所述的方法构建而成。
6.如权利要求5中所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇作为唯一碳源生产酶制剂中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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| CN116606752A (zh) * | 2023-05-19 | 2023-08-18 | 江南大学 | 一种毕赤酵母甲酸盐营养缺陷型菌株及其制备方法和应用 |
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