CN113481134A - 一种生产乙醇的基因工程蓝细菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。本发明构建了由pcpc560强启动子驱动的pdc和yqhd整合入蓝细菌基因组slr0301位点的载体pMD0301‑pdc/yqhd。进一步利用分子生物技术，引入外源基因maeB同时敲除蓝藻糖原靶向功能基因（slr1176）以敲除糖原竞争性途径，构建由pcpc560启动子驱动的苹果酸盐基因（maeB）整合入蓝细菌基因组slr1176位点的载体pJS503‑maeB。证实通过光强启动子Pcpc560替代铜离子诱导启动子PpetE，增强外源基因的表达提高pdc和yqhd酶的表达来提高蓝细菌中乙醇产量，同时提高中间体丙酮酸产量可进一步提升乙醇的产量。

Description

一种生产乙醇的基因工程蓝细菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。

背景技术

随着煤炭和石油等化石燃料的消耗引起一系列问题。一方面，化石燃料的燃烧造成了严重的环境问题，如酸雨、温室效应等。另一方面，化石燃料作为一种不可再生资源，面临着能源枯竭的问题。因此，可再生生物燃料的开发引起了世界各的关注。生物乙醇作为一种可再生生物燃料，引起了世界各地研究人员的兴趣。

在生物技术领域，人们越来越有兴趣利用蓝藻作为光合微生物细胞工厂生产各种高价值的分子产品，如乙烯、丙酮、异戊二烯和异丁醇。为了获得目标生物燃料的有效生产，蓝藻已经通过构建多种类型的异源生物合成途径进行了基因修饰。然而，基于蓝藻的合成平台在工业生产应用中有待进一步研究，其中生产产量仍不理想。这是因为在构建用于生产目标化合物的工程代谢途径中，需要以一些内源性基础代谢物的有效利用作为基础如丙酮酸和乙酰辅酶A。然而这些内源性基础代谢物往往被消耗在细胞生长和生理活动的内源性途径中，包括氨基酸合成和TCA循环，这限制了生物合成途径合成化学品的生产产量。为了最大限度地利用合成的化学物质的产量，一种方法是在强启动子的驱动下，通过过度表达密码子优化的光合蓝藻外源基因，对生物合成途径进行基因修饰。另一种替代方法是减少内源性代谢对碳资源的潜在竞争，并使更多的碳和能量通量用于蓝藻的化学生产。

发明内容

有鉴于此，为了增加蓝藻生产乙醇的产量，本发明提供了一种生产乙醇的基因工程蓝细菌。本发明首次验证在蓝藻中引入外源基因maeB以及敲除slr1176基因对提高蓝藻生产乙醇的正面作用，可高效提高乙醇的生物合成。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在本发明的一个方面，在集胞藻PCC6803中构建一条高效合成生物乙醇的代谢途径，利用同源替换敲除蓝藻中的slr1176基因以实现乙醇在集胞藻PCC6803体内的合成。

本发明提供了一种生产乙醇的基因工程蓝细菌，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述蓝细菌中含有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ ID NO.3 所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQ ID NO.4所示；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步地，所述蓝细菌引入NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB基因，敲除slr1176基因；所述maeB基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蓝细菌通过基因手段使光强启动子Pcpc560驱动丙酮酸脱羧酶及NADPH依赖型醛还原酶的一个和/或多个基因位点表达。

本发明的另一方面是通过选取大肠杆菌的NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB作为外源基因，该基因表达产物将三羧酸循环中间代谢物苹果酸盐转化为丙酮酸，同时产生NADPH，而后丙酮酸脱羧酶与NADPH依赖型醛还原酶共表达将丙酮酸转化为生物乙醇，并消耗NADPH，可有效提高NADPH依赖型醛还原酶活性并提高乙醇产量。

进一步地，本发明敲除slr1176基因提高乙醇的合成产量，实现利用蓝细菌高效合成生物乙醇的目的。

本发明还提供了一种能高效产生乙醇的构建体，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ ID NO.3 所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQ IDNO.4所示；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述构建体中引入NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB基因，同时敲除slr1176基因；所述maeB基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

更进一步地，所述构建体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置，所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段为集胞藻PCC6803的slr1776基因的N-末端序列和C-末端序列，或集胞藻PCC6803的slr0301基因的N-末端序列和C-末端序列；所述slr1176基因的N-末端序列如SEQ ID NO.5所示，slr1176基因的C-末端序列如SEQ ID NO.6所示；所述slr0301基因的N-末端序列如SEQ ID NO.7所示，slr0301基因的C-末端序列如SEQ ID NO.8所示。

更进一步地，所述构建体还包含有用于筛选蓝细菌转化体的标记基因；所述标记基因包括但不限于，例如卡那霉素抗性基因(例如参见NC_003239.1)，红霉素抗性基因(例如参见NC_015291.1)和壮观霉素抗性基因的Omega片段，其序列如SEQ ID NO.9所示，氯霉素素抗性基因，其序列如SEQ ID NO.10所示。此类标记基因是本领域技术人员熟知的。

本发明还提供了一种重组载体，其包含上述的构建体。

本发明还提供了一种包含上述构建体或重组载体的菌株。

本发明还提供了一种在蓝细菌中生产乙醇的方法，所述方法为将上述构建体导入集胞藻PCC6803中，培养后获得基因工程蓝藻，从培养物中获得乙醇。所述的集胞藻PCC6803中还包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明为了验证pdc和yqhd 在蓝细菌生产乙醇中的作用，构建了由pcpc560强启动子驱动的pdc和yqhd整合入蓝细菌基因组slr0301位点的载体pMD0301-pdc/yqhd。进一步利用分子生物技术，引入外源基因maeB同时敲除蓝藻糖原靶向功能基因（slr1176）以敲除糖原竞争性途径，构建了由pcpc560启动子驱动的苹果酸盐基因（maeB）整合入蓝细菌基因组slr1176位点的载体pJS503-maeB。证实通过光强启动子Pcpc560替代铜离子诱导启动子PpetE，增强外源基因的表达提高pdc和yqhd酶的表达来提高蓝细菌中乙醇产量，同时提高中间体丙酮酸产量可进一步提升乙醇的产量。

附图说明

图1是代谢途径流程图；

图2是载体pMD-slr0301的基本结构图；

图3是重组质粒pMD-slr0301-Ω的基本结构图；

图4是重组质粒pMD0301的基本结构图；

图5是中间载体pMD0301-pdc的基本结构图；

图6是中间载体pMD0301-pdc/yqhd的基本结构图；

图7是载体pMD-slr1176的基本结构图；

图8是重组质粒pMD-slr1176-Ω的基本结构图；

图9是重组质粒pMD1176的基本结构图；

图10是中间载体pJS503-maeB的基本结构图；

图11是14天培养周期内的乙醇生产情况对比图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。除非特别指明，否则本发明中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

相关术语：

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所涉及的菌株培养，分子生物学，分子遗传学等操作步骤均为相应领域内广泛的常规步骤。同时为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本发明中所使用的“蓝细菌（cyanobacteria）”是一类光和自养的原核微生物，其能够利用太阳能固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻，在发明中，蓝细菌和蓝藻可以互换使用。本发明中所使用的蓝细菌为集胞藻PCC6803，购自于中科院水生生物研究所。

如本发明中所使用的“丙酮酸脱羧酶”（Pyruvate decarboxylase pdc）能够催化由丙酮酸转化为乙醛的酶。

如本发明中所使用的“NADPH依赖性醛还原酶”（NADPH-dependent aldehydereductase yqhd）是一种能够催化由乙醛转化为乙醇的反应的酶并在转化过程中消耗NADPH。

如本发明中所使用的Pcpc560启动子是指集胞藻PCC6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco)的操纵子的启动子，其序列如SEQ IDNO.1所示，Pcpc560启动子在蓝细菌中具有活性。

如本发明中所使用的slr1176 基因(例如参见NC_952017)是集胞藻PCC6803基因组中编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶的基因，该基因的缺失会导致糖原的靶向功能障碍。

如本发明中所使用的slr0301基因(例如参见NC_92236)是集胞藻PCC6803基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的基因，该基因的缺失会增加中间体丙酮酸的积累量。

如本发明中所使用的maeB基因通过对Metacyc、NCBI数据库进行生物信息学分析与比较，选取大肠杆菌的NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB作为外源基因，用于本发明合成生物乙醇。具体方法：通过NCBI数据库获得大肠杆菌的NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB的核苷酸序列，根据集胞藻PCC6803生物系统的密码子偏好性，采用经在线软件（http://www.jcat.de/）对大肠杆菌的NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB核苷酸序列优化，优化后的序列由上海生工合成，其序列如SEQ ID NO.2所示。

如本发明中所使用的载体是指能够将DNA片段(例如，目的基因)插入其中从而允许将DNA片段转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的DNA片段所编码的蛋白获得表达时，载体也称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、柯斯质粒等等。

如本发明中所使用的“同源重组”是指发生在非姐妹染色单体(sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

不受任何理论束缚，本发明认为，蓝藻产生乙醇的机制如下：蓝藻体内固碳经开尔文循环生成中间体丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的催化下变成乙醛，乙醛在NADPH依赖性醛还原酶的作用下转化为乙醇。而野生型PCC6803内源表达乙醇脱氢酶，但表达量极低。同时野生型PCC6803并不表达丙酮酸脱羧酶，因此，本发明提供一种高效生产生物乙醇的代谢途径；其代谢途径流程图如图1所示。使用的NADPH依赖型醛还原酶（yqhd）在将乙醛催化为乙醇的过程中同时消耗NADPH，通过基因工程引入丙酮酸脱羧酶（pdc）和NADPH依赖型醛还原酶（yqhd）提高乙醇产量，同时敲除编辑磷酸烯醇丙酮酸合成酶的slr0301基因。

实施例1：用于基因敲入和基因敲除的载体的构建

（1）载体pMD0301-pdc/yqhd的构建

以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr0301Up-F（5’-ACATGCATGCATTAACTCCCGCAGAAAGGGA-3’）和slr0301Up-R（5’-CGACGCGTCGACATCATGGGTGCCCACCTCTTCA-3’）引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(来自于Takara)SphI / MLuI位点上，从而得到载体PMD-0301U。以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以Slr0301Dw-F（5’-CTAGTCTAGACGGCTTCTCCATTGGCTCCAAT-3’）、Slr0301Dw-R（5’-CGGGAGCTCGAATTCTAGAGTGCTTAGTGCATCTAACGC-3’）为引物进行PCR扩增，将获得的PCR产物克隆到PMD-0301U的XbaI / KpnI位点上，获得载体pMD-slr0301，其基本结构如图2所示。以质粒pJS406（含sp抗性基因）为模板，SP-F（5’-CCACGCGTAAGCTTGGATCCGCTCACGCAACTGGTCCAGAA-3’）、SP-R（5’-CGAGCTCGGTACCGCCCTCAACCTCTCCATTTCC-3’）为引物，将含有壮观霉素抗性基因片段Ω插入到载体pMD-slr0301的两个目的片段之间，获得重组质粒pMD-slr0301-Ω，其基本结构如图3所示；以集胞藻PCC6803基因组为模板，Pcpc-F（5’-CGTCTAGAGGATCCCCTGTAGAGAAGAGTCCCTG-3’）、Pcpc-R（5’-TTTCTCCTCTTTTGAATTAATCTCCTACTTGACTTTATGAG-3’）;TrbcL-F（5’-CGCGTCGACCGGTGTTTGGATTGTCGGAGT-3’）、TrbcL-R（5’-CCGACGCGTAAGCTTCCGGTAATTGGTAAATTGCTGTC-3’）为引物，分别将启动子Pcpc560和TrbcL终止子等序列插入到重组质粒pMD-slr0301-Ω的BamHI/SalI和SalI/HindIII的位点上，获得重组质粒pMD0301，其基本结构如图4所示。

以丙酮酸脱羧酶为模板，PDC-F（5’-TGCAAATTGGCTTGAAACATC-3’）、PDC-R（5’-GGCATAGCCTTCGGCACTAAA-3’）为引物，PCR扩增反应体系：Star高保真聚合酶0.5ul，模板2μL, 5×PSbuffer 10μL，dNTPs 5μL, 上、下游引物各1μL，ddH2O 30.5μL。PCR反应程序如下:95℃变性5min；95℃变性30s；55℃，30s；72℃延伸 1min；72℃延伸10min，32个循环。PCR产物用生工DNA回收试剂盒（PCR quick purification）进行快速回收，并测定其浓度。回收片段经过限制性内切酶切割与T4连接酶的连接作用，插入到重组质粒pMD0301中，连接产物经过转化DH5a感受态细胞、菌液涂布于相应抗性LB固体培养基后，24h挑阳性克隆菌并进行PCR验证，获得中间载体pMD0301-pdc，其基本结构如图5所示。

以NADPH依赖型醛还原酶为模板，Yqh-F（5’-AGGTGGCTAACGGCGTAGTGG-3’）、Yqh-R（5’-CTTTCAGGGCTTTCGGACCAT-3’）为引物，PCR扩增反应体系：Star高保真聚合酶0.5ul，模板2μL, 5×PSbuffer 10μL，dNTPs 5μL, 上、下游引物各1μL，ddH2O 30.5μL。PCR反应程序如下:95℃变性5min；95℃变性30s；55℃，30s；72℃延伸1min；72℃延伸10min，32个循环。PCR产物用生工DNA回收试剂盒（PCR quick purification）进行快速回收，并测定其浓度。回收片段经过限制性内切酶切割与T4连接酶的连接作用，插入到中间载体pMD0301-pdc，连接产物经过转化DH5a感受态细胞、菌液涂布于相应抗性LB固体培养基后，24h挑阳性克隆菌并进行PCR验证，获得中间载体pMD0301-pdc/yqhd，其基本结构如图6所示。

（2）载体pJS503-maeB的构建

以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr1176Up-F（5’-ACATGCATGCCAGTTAGCCTAGGCAGTGGTTC-3’）和slr1176Up-R（5’-CGACGCGTCGACCGCCCCCTAAATCCCCCAATA-3’）引物进行PCR扩增并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体的SphI / MLuI位点上，从而得到载体PMD-1176U。以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以Slr1176Dw-F（5‘-CTAGTCTAGAGTCGACCATTGCCGCAACGACACTG-3’）、Slr1176Dw-R（5‘-CGAGCTCGGTACCACCAAAGAGTTATTGGCGGCTA-3’）为引物进行PCR扩增，将获得的PCR产物克隆到载体PMD-1176U的XbaI /KpnI位点上，获得载体pMD-slr1176，其基本结构如图7所示。以生工合成的cam基因序列为模板，Cam-F（5‘-ACCGGCATGCGTTGATCGGCACGTAAGAGGT-3’）、Cam-R（5‘-CAACTGCAGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC-3’）为引物，将含有氯霉素抗性基因片段Ω插入到载体pMD-slr1176的两个目的片段之间，获得重组质粒pMD-slr1176-Ω，其基本结构如图8所示。以集胞藻PCC6803基因组为模板，Pcpc-F、Pcpc-R;TrbcL-F、TrbcL-R为引物，分别将启动子Pcpc560和TrbcL终止子等序列插入到重组质粒pMD-slr1176-Ω的BamHI/SalI和SalI/HindIII的位点上，获得重组质粒pMD1176，其基本结构如图7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

以优化后的苹果酸脱氢酶maeB为模板，MaeB-F（5’-AGGAGATTAATTCAAAAGAGGAGAAAATGGATGACCAGTTAAAACAAAGTGC-3’）、MaeB-R（5’-ATCCAAACACCGGTCGACTGCAGTTACAGCGGTTGGGTTTGCGCT-3’）为引物，进行PCR扩增，回收片段经过限制性内切酶切割与T4连接酶的连接作用，插入到重组质粒pMD1176，连接产物经过转化DH5a感受态细胞、菌液涂布于相应抗性LB固体培养基后，24h挑阳性克隆菌并进行PCR验证，获得中间载体pJS503-maeB，其基本结构如图10所示。

实施例2：基础蓝藻的转化和转化子的筛选

（1）转化集胞藻PCC6803及抗性传代

集胞藻PCC 6803具有天然DNA转化系统，可以进行自然转化，通过同源双交换的方式实现基因重组，并整合到基因组中，所以可以通过自然转化实现基因敲除的目的。转化过程及抗性传代具体流程如下：

用培养2-3天的新鲜菌株，此时菌体的OD₇₃₀ nm 在0.5左右；取一定量的新鲜菌液，3500 g，15 min 离心得到菌体细胞沉淀，去上清，得细胞沉淀；用适量的新鲜培养基重悬菌体沉淀，并分装至1.5 mL无菌的离心管中；将纯化后的融合PCR产物加入到离心管中混匀，光照培养箱中培养5小时，每小时摇动一次；取200 μL上述培养的细胞于相应的抗性平板上涂布均匀，倒置在培养箱中培养10天左右可得转化后的单克隆；无菌环境中，挑取单菌落在新的抗性平板上划线传代，长出新的单菌落后继续划线传代三至五代，直到采用菌落 PCR方法验证得到目的基因被完全取代的敲除突变株。

（2）菌株(藻株)、质粒培养

集胞藻PCC6803在BG11培养液中培养，条件28~30℃和光照条件下(30μE/m²·s)静置培养。在培养液中另外含有10 μg/mL的壮观霉素，所有溶液均用去离子水配置制，根据需要添加不同浓度的铜离子。所有器皿均为塑料器皿。E. coli DH5α在37℃ LB培养基中培养，含有质粒的大肠杆菌菌株加入相应的抗生素(壮观霉素、硫酸卡那霉素、氨苄青霉素工作浓度均为50μg/ mL) 。经过上述步骤转化蓝藻PCC6803，将得到菌株命名为Syn-0301-pdc/yqhd。

实施例3：提高乙醇产量的蓝藻的转化

（1）二次转化及抗性传代培养

将实施例2中所获得的菌株Syn-0301-pdc/yqhd反复纯化后获得高拷贝的突变株Syn-0301-pdc/yqhd，将实施例1所构建的中间载体pJS503-maeB转入突变株Syn-0301-pdc/yqhd中以构建提高乙醇产量的突变株Syn503-maeB。转化过程及抗性传代具体流程如下：用培养 2-3 天的新鲜Syn-0301-pdc/yqhd，此时菌体的 OD₇₃₀ nm在0.5左右；取一定量的新鲜菌液，3500 g，15 min 离心得到菌体细胞沉淀，去上清，得细胞沉淀；用适量的新鲜培养基重悬菌体沉淀，并分装至 1.5 mL 无菌的离心管中；将纯化后的融合 PCR 产物加入到离心管中混匀，光照培养箱中培养 5 小时，每小时摇动一次；取200 μL上述培养的细胞于相应的抗性平板上涂布均匀，倒置在培养箱中培养10天左右可得转化后的单克隆；无菌环境中，挑取单菌落在新的抗性平板上划线传代，长出新的单菌落后继续划线传代三至五代，直到采用菌落 PCR 方法验证得到目的基因被完全取代的敲除突变株。获得突变株后，反复利用抗性筛选获得二次突变株Syn503-maeB。(壮观霉素、氯霉素工作浓度均为20μg/ mL)。构建得到以下菌株：

野生型集胞藻PCC6803（葡萄糖耐受）。

Syn-0301-pdc/yqhd：slr0301上下游同源替换基因组，壮观霉素抗性基因与含有由pcpc560强启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc和大肠杆菌的NADPH依赖型醛还原酶yqhd。最后TrbcL终止子控制反应的终止。

Syn503-maeB:将构建的质粒pJS503-maeB二次转入纯化的Syn-0301-pdc/yqhd中。在已经敲除slr0301基础上，同时导入由强启动子pcpc560驱动外源基因pdc，yqhd的Syn-0301-pdc/yqhd突变株中再次敲除slr1176基因，并引入有pcpc560强启动子驱动的maeB基因。

实施例4：乙醇产量的测定

（1）培养方式：利用相对封闭的塑料培养容器培养，装50mL BG11培养基（含前面所述的相应抗性10μg/mL），初始接种突变株浓度为OD730在1左右，条件28-30℃和光照条件下(30μE/m²·s) 静置培养。

（2）乙醇的检测：每天从培养容器中取1 mL培养液（混合均匀），于10000g离心2分钟分离上清于沉淀。上清液经0.22微米滤膜过滤。蓝藻沉淀经细胞破碎仪破碎（5min），破碎后使用去离子水洗涤并再次用0.22微米滤膜过滤。所有过滤后所得物经高效液相色谱仪（示差检测器）检测乙醇含量并绘制曲线。

（3）实验结果

分别观察野生型集胞藻PCC6803、Syn-0301-pdc/yqhd及Syn503-maeB中的乙醇产量。在蓝细菌Syn-0301-pdc/yqhd、Syn503-maeB中检测了乙醇产量，而野生型集胞藻PCC6803中未检测到乙醇的产生。图11是14天培养周期内的乙醇生产情况对比图；由图11可见，野生型集胞藻PCC6803中没有乙醇生成，而Syn503-maeB相较于Syn-0301-pdc/yqhd产量具有明显提升，其生物合成乙醇的最高平均产率可达2.6g/L。可见通过提高pdc和yqhd酶的表达可以提高蓝细菌中乙醇产量，如同时提高中间体丙酮酸产量的蓝藻突变株Syn503-maeB具有相当可观的乙醇产量提升。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种生产乙醇的基因工程蓝细菌

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acctgtagag aagagtccct gaatatcaaa atggtgggat aaaaagctca aaaaggaaag 60

taggctgtgg ttccctaggc aacagtcttc cctaccccac tggaaactaa aaaaacgaga 120

aaagttcgca ccgaacatca attgcataat tttagcccta aaacataagc tgaacgaaac 180

tggttgtctt cccttcccaa tccaggacaa tctgagaatc ccctgcaaca ttacttaaca 240

aaaaagcagg aataaaatta acaagatgta acagacataa gtcccatcac cgttgtataa 300

agttaactgt gggattgcaa aagcattcaa gcctaggcgc tgagctgttt gagcatcccg 360

gtggcccttg tcgctgcctc cgtgtttctc cctggattta tttaggtaat atctctcata 420

aatccccggg tagttaacga aagttaatgg agatcagtaa caataactct agggtcatta 480

ctttggactc cctcagttta tccgggggaa ttgtgtttaa gaaaatccca actcataaag 540

tcaagtagga gattaattca 560

<210> 2

<211> 2280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggatgacc agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttccagt tccagggaaa 60

atccaggttt ctccaaccaa gcctctggca acacagcgcg atctggcgct ggcctactca 120

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ttcgccggga ttgatgtatt tgacattgaa gttgacgaac tcgacccgga caaatttatt 360

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ccaatgatcc tggcgctggc gaacccggaa ccggaaattc tgccgccgct ggcgaaagaa 900

gtgcgtccgg atgccatcat ttgcaccggt cgttctgact atccgaacca ggtgaacaac 960

gtcctgtgct tcccgttcat cttccgtggc gcgctggacg ttggcgcaac cgccatcaac 1020

gaagagatga aactggcggc ggtacgtgcg attgcagaac tcgcccatgc ggaacagagc 1080

gaagtggtgg cttcagcgta tggcgatcag gatctgagct ttggtccgga atacatcatt 1140

ccaaaaccgt ttgatccgcg cttgatcgtt aagatcgctc ctgcggtcgc taaagccgcg 1200

atggagtcgg gcgtggcgac tcgtccgatt gctgatttcg acgtctacat cgacaagctg 1260

actgagttcg tttacaaaac caacctgttt atgaagccga ttttctccca ggctcgcaaa 1320

gcgccgaagc gcgttgttct gccggaaggg gaagaggcgc gcgttctgca tgccactcag 1380

gaactggtaa cgctgggact ggcgaaaccg atccttatcg gtcgtccgaa cgtgatcgaa 1440

atgcgcattc agaaactggg cttgcagatc aaagcgggcg ttgattttga gatcgtcaat 1500

aacgaatccg atccgcgctt taaagagtac tggaccgaat acttccagat catgaagcgt 1560

cgcggcgtca ctcaggaaca ggcgcagcgg gcgctgatca gtaacccgac agtgatcggc 1620

gcgatcatgg ttcagcgtgg ggaagccgat gcaatgattt gcggtacggt gggtgattat 1680

catgaacatt ttagcgtggt gaaaaatgtc tttggttatc gcgatggcgt tcacaccgca 1740

ggtgccatga acgcgctgct gctgccgagt ggtaacacct ttattgccga tacatatgtt 1800

aatgatgaac cggatgcaga agagctggcg gagatcacct tgatggcggc agaaactgtc 1860

cgtcgttttg gtattgagcc gcgcgttgct ttgttgtcgc actccaactt tggttcttct 1920

gactgcccgt cgtcgagcaa aatgcgtcag gcgctggaac tggtcaggga acgtgcacca 1980

gaactgatga ttgatggtga aatgcacggc gatgcagcgc tggtggaagc gattcgcaac 2040

gaccgtatgc cggacagctc tttgaaaggt tccgccaata ttctggtgat gccgaacatg 2100

gaagctgccc gcattagtta caacttactg cgtgtttcca gctcggaagg tgtgactgtc 2160

ggcccggtgc tgatgggtgt ggcgaaaccg gttcacgtgt taacgccgat cgcatcggtg 2220

cgtcgtatcg tcaacatggt ggcgctggcc gtggtagaag cgcaaaccca accgctgtaa 2280

<210> 3

<211> 872

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagttata ccgtgggcac ctatttggcc gaacgcttgg tgcaaattgg cttgaaacat 60

cattttgccg tggccggcga ttataactta gtgttgttag ataatttatt gttgaataaa 120

aatatggaac aagtgtattg ttgtaatgaa ttgaattgtg gctttagtgc cgaaggctat 180

gcccgcgcca aaggcgccgc cgccgccgtg gtgacctatt ccgtgggcgc cttgtccgcc 240

tttgatgcca ttggcggtgc ttatgccgaa aatttgcccg tgattttgat tagtggcgcc 300

cccaataata atgatcatgc cgccggccat gtgttgcatc atgccttggg caaaaccgat 360

tatcactatc aattagaaat ggccaaaaat attaccgccg ccgccgaagc catttatacc 420

cccgaagaag cccccgccaa aattgatcat gtgattaaaa ccgccttgcg cgagaaaaaa 480

cccgtgtatt tggaaattgc ctgtaatatt gcctccatgc cctgtgccgc ccccggcccc 540

gcctccgcct tgtttaatga tgaagcctcc gatgaagcca gtctgaatgc cgccgtggaa 600

gaaaccttaa aatttattgc caatcgcgat aaagtggccg tgttggtggg ctccaaattg 660

cgggccgcgg gtgccgaaga agccgccgtg aaatttgccg atgccttagg cggcgccgtg 720

gccaccatgg ccgccgccaa atccttcttt cccgaagaaa atccccatta tattgggacc 780

tcctggggtg aagtgagtta tcccggcgtg gaaaaaacca tgaaagaagc cgatgccgtg 840

attgccttag cccccgtgtt taatgattat tc 872

<210> 4

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300

accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360

caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420

gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480

caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210> 5

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtgttgtt ggcaatcgag aggtctgctt gtgaaacgtg tcttagcgat tatcctgggc 60

ggtggggccg ggacccgcct ctatccttta accaaactca gagccaaacc cgcagttccc 120

ttggccggaa agtatcgcct catcgatatt cccgtcagta attgcatcaa ctcagaaatc 180

gttaaaattt acgtccttac ccagtttaat tccgcctccc ttaaccgtca catcagccgg 240

gcctataatt tttccggctt ccaagaagga tttgtggaag tcctcgccgc ccaacaaacc 300

aaagataatc ctgattggtt tcagggcact gctgatgcgg tacggcaata cctctggttg 360

tttagggaat gggacgtaga tgaatatctt attctgtccg gcgaccatct ctaccgcatg 420

gattacgccc aatttgttaa aagacaccgg gaaaccaatg ccgacataac cctttccgtt 480

gtgcccgtgg atgacagaaa ggcacccgag ctgggcttaa tgaaaatcga cgcccagggc 540

agaattactg acttttctga aaagccccag ggggaagccc tccgggccat gcaggtggac 600

accagcgttt tgggcctaag tgcggagaag gct 633

<210> 6

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgaagcct tctatgaggc taatttagcc ctgaccaaac aacctagtcc cgactttagt 60

ttttataacg aaaaagcccc catctatacc aggggtcgtt atcttccccc caccaaaatg 120

ttgaattcca ccgtgacgga atccatgatc ggggaaggtt gcatgattaa gcaatgtcgc 180

atccaccact cagttttagg cattcgcagt cgcattgaat ctgattgcac cattgaggat 240

actttggtga tgggcaatga tttctacgaa tcttcatcag aacgagacac cctcaaagcc 300

cggggggaaa ttgccgctgg cataggttcc ggcaccacta tccgccgagc catcatcgac 360

aaaaatgccc gcatcggcaa aaacgtcatg attgtcaaca aggaaaatgt ccaggaggct 420

aaccgggaag agttaggttt ttacatccgc aatggcatcg tagtagtgat taaaaatgtc 480

acgatcgccg acggcacggt aatctag 507

<210> 7

<211> 619

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcattaactc ccgcagaaag ggaaaagttt cccccgctct gtccagattt tgtgttggaa 60

ctactttccc ccagtgatgc cctagctgca actcaagcaa aaatgcgtga atatttaagc 120

tgtggaacgg agttaggctg gttaattaat ccgattgatc aacaagtgga aatatatcgc 180

cctgattccc cgatagaaat attaaacaaa ccccaaacac tcaatggcga tcgcctgttg 240

ccggacttgg aactcaatgt ggcttggtta tggggggcaa actaattcag aatctccatg 300

acacttcaaa gacttgccta ttaccttcat aagaaaatag ggatattaat aattgccgag 360

taacaaggca catatgggta tgatagcgcg aatttccacc ctaggacaat tttttaataa 420

ttaattaaca ctagatttaa gaaacctatc aatttataaa taattaccaa caaaataaag 480

tttactatat caacctcgat aaactgaagg tatcgattag gggtaaatag atatggtaag 540

ttcagtcgtc gaaaaaacct ctgtagccca taaagaaacg gctttaatcc tctggtttga 600

agaggtgggc acccatgat 619

<210> 8

<211> 622

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggcttctcc attggctcca atgatttaac ccaattaact ttaggtttag accgggattc 60

ttccctcgtt gcccatctgt ttgatgaacg caatctaggg gtcaaacgga tggtcaaaat 120

ggccattgaa acggcgaaag ctaacggtcg caaaatcggt atctgtggcc aagccccctc 180

ggattatcct gagtttgctg aatttttagt ggaattgggc attgattcca ttagcttaaa 240

ccctgattct gtgctgaaaa ctgttctacg cattgcagag gtggaaaaag ccctaggcta 300

ggaaatggtg tttattttgc cgactaaggc taaaccataa atacagcccc ttctttcccg 360

ctggttcaat tccaagggta aggaggggtt aaaatgcagt caatattaag agtggatggt 420

tcattttggg caagggttaa aaacctttaa attttggatg attgccaggg caagtctttg 480

acatcccgca gagaaaatta tgggaagtaa tggctacatc agttgattca aatcagttaa 540

aggggcttcg cccggcaaaa ccatgagcga tcgccacaaa accaaagctc aattactcca 600

ggaaatggag aggttgaggg cg 622

<210> 9

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc 60

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc 120

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa 180

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc 240

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt 300

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt 360

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa 420

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag 480

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct 540

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc 600

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat 660

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc 720

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 780

gtcggcaaat aa 792

<210> 10

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180

cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240

gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300

acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360

tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540

gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600

gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660

cc 662

<210> 11

<211> 5352

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaccc gctggttagc 60

cggaatttcc gtccagattc cctttccaga tgtccccctc ggttctaaac ttgacttcga 120

agtgtgttgt tggcaatcga gaggtctgct tgtgaaacgt gtcttagcga ttatcctggg 180

cggtggggcc gggacccgcc tctatccttt aaccaaactc agagccaaac ccgcagttcc 240

cttggccgga aagtatcgcc tcatcgatat tcccgtcagt aattgcatca actcagaaat 300

cgttaaaatt tacgtcctta cccagtttaa ttccgcctcc cttaaccgtc acatcagccg 360

ggcctataat ttttccggct tccaagaagg atttgtggaa gtcctcgccg cccaacaaac 420

caaagataat cctgattggt ttcagggcac tgctgatgcg gtacggcaat acctctggtt 480

gtttagggaa tgggacgtag atgaatatct tattctgtcc ggcgaccatc tctaccgcat 540

ggattacgcc caatttgtta aaagacaccg ggaaaccaat gccgacataa ccctttccgt 600

tgtgcccgtg gatgacagaa aggcacccga gctgggctta atgaaaatcg acgcccaggg 660

cagaattact gacttttctg aaaagcccca gggggaagcc ctccgggcca tgcaggtgga 720

caccagcgtt ttgggcctaa gtgcggagaa ggctacctgt agagaagagt ccctgaatat 780

caaaatggtg ggataaaaag ctcaaaaagg aaagtaggct gtggttccct aggcaacagt 840

cttccctacc ccactggaaa ctaaaaaaac gagaaaagtt cgcaccgaac atcaattgca 900

taattttagc cctaaaacat aagctgaacg aaactggttg tcttcccttc ccaatccagg 960

acaatctgag aatcccctgc aacattactt aacaaaaaag caggaataaa attaacaaga 1020

tgtaacagac ataagtccca tcaccgttgt ataaagttaa ctgtgggatt gcaaaagcat 1080

tcaagcctag gcgctgagct gtttgagcat cccggtggcc cttgtcgctg cctccgtgtt 1140

tctccctgga tttatttagg taatatctct cataaatccc cgggtagtta acgaaagtta 1200

atggagatca gtaacaataa ctctagggtc attactttgg actccctcag tttatccggg 1260

ggaattgtgt ttaagaaaat cccaactcat aaagtcaagt aggagattaa ttcaaaagag 1320

gagaaaatgg atgaccagtt aaaacaaagt gcacttgatt tccatgaatt tccagttcca 1380

gggaaaatcc aggtttctcc aaccaagcct ctggcaacac agcgcgatct ggcgctggcc 1440

tactcaccag gcgttgccgc accttgtctt gaaatcgaaa aagacccgtt aaaagcctac 1500

aaatataccg cccgaggtaa cctggtggcg gtgatctcta acggtacggc ggtgctgggg 1560

ttaggcaaca ttggcgcgct ggcaggcaaa ccggtgatgg aaggcaaggg cgttctgttt 1620

aagaaattcg ccgggattga tgtatttgac attgaagttg acgaactcga cccggacaaa 1680

tttattgaag ttgtcgccgc gctcgaacca accttcggcg gcatcaacct cgaagacatt 1740

aaagcgccag aatgtttcta tattgaacag aaactgcgcg agcggatgaa tattccggta 1800

ttccacgacg atcagcacgg cacggcaatt atcagcactg ccgccatcct caacggcttg 1860

cgcgtggtgg agaaaaacat ctccgacgtg cggatggtgg tttccggcgc gggtgccgca 1920

gcaatcgcct gtatgaacct gctggtagcg ctgggtctgc aaaaacataa catcgtggtt 1980

tgcgattcaa aaggcgttat ctatcagggc cgtgagccaa acatggcgga aaccaaagcc 2040

gcatatgcgg tggtggatga cggcaaacgt accctcgatg atgtgattga aggcgcggat 2100

attttcctgg gctgttccgg cccgaaagtg ctgacccagg aaatggtgaa gaaaatggct 2160

cgtgcgccaa tgatcctggc gctggcgaac ccggaaccgg aaattctgcc gccgctggcg 2220

aaagaagtgc gtccggatgc catcatttgc accggtcgtt ctgactatcc gaaccaggtg 2280

aacaacgtcc tgtgcttccc gttcatcttc cgtggcgcgc tggacgttgg cgcaaccgcc 2340

atcaacgaag agatgaaact ggcggcggta cgtgcgattg cagaactcgc ccatgcggaa 2400

cagagcgaag tggtggcttc agcgtatggc gatcaggatc tgagctttgg tccggaatac 2460

atcattccaa aaccgtttga tccgcgcttg atcgttaaga tcgctcctgc ggtcgctaaa 2520

gccgcgatgg agtcgggcgt ggcgactcgt ccgattgctg atttcgacgt ctacatcgac 2580

aagctgactg agttcgttta caaaaccaac ctgtttatga agccgatttt ctcccaggct 2640

cgcaaagcgc cgaagcgcgt tgttctgccg gaaggggaag aggcgcgcgt tctgcatgcc 2700

actcaggaac tggtaacgct gggactggcg aaaccgatcc ttatcggtcg tccgaacgtg 2760

atcgaaatgc gcattcagaa actgggcttg cagatcaaag cgggcgttga ttttgagatc 2820

gtcaataacg aatccgatcc gcgctttaaa gagtactgga ccgaatactt ccagatcatg 2880

aagcgtcgcg gcgtcactca ggaacaggcg cagcgggcgc tgatcagtaa cccgacagtg 2940

atcggcgcga tcatggttca gcgtggggaa gccgatgcaa tgatttgcgg tacggtgggt 3000

gattatcatg aacattttag cgtggtgaaa aatgtctttg gttatcgcga tggcgttcac 3060

accgcaggtg ccatgaacgc gctgctgctg ccgagtggta acacctttat tgccgataca 3120

tatgttaatg atgaaccgga tgcagaagag ctggcggaga tcaccttgat ggcggcagaa 3180

actgtccgtc gttttggtat tgagccgcgc gttgctttgt tgtcgcactc caactttggt 3240

tcttctgact gcccgtcgtc gagcaaaatg cgtcaggcgc tggaactggt cagggaacgt 3300

gcaccagaac tgatgattga tggtgaaatg cacggcgatg cagcgctggt ggaagcgatt 3360

cgcaacgacc gtatgccgga cagctctttg aaaggttccg ccaatattct ggtgatgccg 3420

aacatggaag ctgcccgcat tagttacaac ttactgcgtg tttccagctc ggaaggtgtg 3480

actgtcggcc cggtgctgat gggtgtggcg aaaccggttc acgtgttaac gccgatcgca 3540

tcggtgcgtc gtatcgtcaa catggtggcg ctggccgtgg tagaagcgca aacccaaccg 3600

ctgtaactgc agtcgaccgg tgtttggatt gtcggagttg tactcgtccg ttaaggatga 3660

acagttcttc ggggttgagt ctgctaacta attagccatt aacagcggct taactaacag 3720

ttagtcattg gcaattgtca aaaaattgtt aatcagccaa aacccactgc ttactgatgt 3780

tcaacttcga cagcaattta ccaattaccg gggatccgtt gatcggcacg taagaggttc 3840

aactttcacc ataatgaaat aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt 3900

tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata 3960

tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat 4020

aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac 4080

aagttttatc cggcctttat tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc 4140

cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc 4200

gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc 4260

cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat 4320

ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc 4380

accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg 4440

ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat 4500

gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat 4560

gagtggcagg gcggggcgta accattgaag ccttctatga ggctaattta gccctgacca 4620

aacaacctag tcccgacttt agtttttata acgaaaaagc ccccatctat accaggggtc 4680

gttatcttcc ccccaccaaa atgttgaatt ccaccgtgac ggaatccatg atcggggaag 4740

gttgcatgat taagcaatgt cgcatccacc actcagtttt aggcattcgc agtcgcattg 4800

aatctgattg caccattgag gatactttgg tgatgggcaa tgatttctac gaatcttcat 4860

cagaacgaga caccctcaaa gcccgggggg aaattgccgc tggcataggt tccggcacca 4920

ctatccgccg agccatcatc gacaaaaatg cccgcatcgg caaaaacgtc atgattgtca 4980

acaaggaaaa tgtccaggag gctaaccggg aagagttagg tttttacatc cgcaatggca 5040

tcgtagtagt gattaaaaat gtcacgatcg ccgacggcac ggtaatctag ggccagtttc 5100

tttcctcgca ccatagccat gaccgctccc gttaaagcag taaaatccct gagccaaaag 5160

tttgcccccc tccggtctgt cctggatcaa ttggacggcc tgggcattct tgcctggggg 5220

attttgatgc tcaagtactc tttttctggg gaattgggtt tactcattca tcccaactat 5280

tttgggttgg tgacagtgac ggaattcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 5340

ttgttatccg ct 5352

Claims (10)

1.一种生产乙醇的基因工程蓝细菌，其特征在于，所述蓝细菌中含有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ IDNO.3 所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQ ID NO.4所示；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的蓝细菌，其特征在于，所述蓝细菌引入NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB基因，敲除slr1176基因；所述maeB基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的蓝细菌，其特征在于，所述蓝细菌通过基因手段使光强启动子Pcpc560驱动丙酮酸脱羧酶及NADPH依赖型醛还原酶的一个和/或多个基因位点表达。

4.一种生物合成乙醇的构建体，其特征在于，所述构建体包含与在蓝细菌中具

有活性的启动子可操作的连接第一基因和第二基因；其中，第一基因为丙酮酸脱羧酶基因，其序列如SEQ ID NO.3 所示，第二基因为NADPH依赖型醛还原酶基因，其序列如SEQID NO.4所示；所述的具有活性的启动子是光强启动子Pcpc560，其序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的构建体，其特征在于，所述构建体中引入NADP依赖型苹果酸脱氢酶maeB基因，同时敲除slr1176基因；所述maeB基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述的构建体，其特征在于，所述构建体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置，所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段为集胞藻PCC6803的slr1776基因的N-末端序列和C-末端序列，或集胞藻PCC6803的slr0301基因的N-末端序列和C-末端序列；所述slr1176基因的N-末端序列如SEQ ID NO.5所示，slr1176基因的C-末端序列如SEQ ID NO.6所示；所述slr0301基因的N-末端序列如SEQ ID NO.7所示，slr0301基因的C-末端序列如SEQ ID NO.8所示。

7.一种重组载体，其特征在于，其包含权利要求4~6任一项的构建体。

8.包含权利要求4~6任一项的构建体或权利要求7的重组载体的菌株。

9.一种在蓝细菌中生产乙醇的方法，其特征在于，将权利要求4~6任一项的构建体导入集胞藻PCC6803中，培养后获得基因工程蓝藻，从培养物中获得乙醇。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的集胞藻PCC6803中还包含有用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

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