CN103361375A - 蓝细菌生物合成乙醇的构建体、菌株与方法 - Google Patents

蓝细菌生物合成乙醇的构建体、菌株与方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在蓝细菌中高效生物合成乙醇的构建体，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自丙酮酸脱羧酶基因，所述第二基因选自乙醇脱氢酶基因。本发明还提供了包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中高效生物合成乙醇的方法，其中所述蓝细菌已进行了基因改造从而能够产生乙醇。

Description

蓝细菌生物合成乙醇的构建体、菌株与方法
技术领域
本发明涉及可再生能源领域和生物质能源领域。具体而言，本发明涉及用于在蓝细菌中高效生物合成乙醇的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中高效生物合成乙醇的方法，其中所述蓝细菌已进行了基因改造从而能够产生乙醇。 
背景技术
能源需求的持续加速增加与能源价格的不断攀升，石化能源供给不足以及大量使用石化能源所导致的环境污染与气候变化等问题，使得发展可再生替代能源迫在眉睫。生物燃料作为一种可再生替代能源是解决当前面临的诸多问题的重要手段之一。当前，以玉米或油菜等粮食作物为原料的第一代生物燃料发展路线由于“与人争粮，与粮争地”的问题，逐渐被摒弃。以非粮食作物为核心的纤维素乙醇与微藻生物柴油等“新一代生物燃料”正成为我国生物能源研究和发展的主流。纤维素乙醇的工艺路线“不与人争粮”，将农作物秸秆变废为宝，将其中的纤维素生物质水解为糖，然后再利用成熟的微生物乙醇发酵体系生产燃料乙醇，是一种非常有前景的生物燃料发展路线。但是其面临的主要瓶颈问题在于纤维素生物质高效降解、木质素分离以及五碳糖有效利用等三个方面。微藻生物柴油的工艺路线“不与粮争地”，在日照强烈的沙漠或海边大规模培养，再利用微藻体内大量积累的油脂，以生物或化学的办法使其与甲醇发生酯交换反应，生产脂肪酸甲酯(即生物柴油)，是一种极具前景的生物燃料发展路线。但是其面临的主要瓶颈问题在于微藻生物量积累与油酯积累不相统一，藻细胞的收集、脱水和酯交换反应副产物甘油的去除过程的能耗高等方面。总之，尽管纤维素乙醇和微藻生物柴油这两种重要的生物液体燃料发展路线都具有良好的发展前景，但是由于上述一些瓶颈问题的存在，生产成本大大增加，严重制约了其向产业化推广应用。 
蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium，Blue-green algae)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一，被认为是生物燃料合成方面研究的理想的模式物种之一(Angermayr，S.A.等人，2009)。 
近年来，蓝细菌作为新一代能源微生物系统被用于生产生物燃料，正引起了学术界和企业界的广泛关注。国内外研究者相继提出了利用蓝细菌固定二氧化碳生产乙醇(Deng and Coleman 1999，Dexter and Fu2009)、异戊二烯(Lindberg，Park et al.2009)、正丁醇(Lan and Liao2011)和异丁醛(Atsumi，Higashide et al.2009)等生物燃料分子的新一代生物能源研究思路。与当前主流生物液体燃料研发路线相比，蓝细菌生物燃料是具有高的能量和碳转换效率、低能耗和低成本等优势，是一种更有前景的生物液体燃料研发路线。 
利用基因工程手段改造蓝细菌合成生物乙醇的研究工作，最早是由加拿大多伦多大学的Coleman教授课题组在1999年报道的。该课题组通过在聚球藻PCC7942中共表达来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，首次实现了乙醇在蓝细菌中的生物合成。傅鹏程在2009年报道了其在美国夏威夷大学工作期间在集胞藻PCC6803中开展的类似研究，将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因在集胞藻PCC6803中共表达，实现了太阳能到生物乙醇的转化。此外，位于美国佛罗里达州的Algenol生物燃料公司，从事利用蓝细菌生产乙醇方面的研究多年。 
本领域仍然需要具有高效合成乙醇的相关途径，大幅提高乙醇的产量的基因工程蓝细菌。 
发明内容
本发明人首次成功地构建高效生物合成乙醇的蓝细菌所需的构建体和菌株，并验证该构建方法具有良好的可行性。 
相关术语 
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、有机化学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。 
如本发明中所使用的，“蓝细菌(Cyanobacterium)”是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻。在本发明中，“蓝细菌”和“蓝藻”可互换使用。单细胞蓝细菌的代表物种是集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803)。 
如本发明中所使用的，丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，pdc)是能够催化由丙酮酸转化为乙醛的反应的酶。 
如本发明中所使用的，乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，adh)是能够催化由乙醛转化为乙醇的反应的酶。 
如本发明中使用的，rbc启动子(Prbc)是指集胞藻PCC6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco)的操纵子的启动子(SEQ ID NO：1)。rbc启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO：1所示的序列。 
如本发明中所使用的，petE启动子(PpetE)是指编码质体蓝素(Plastocyanin，PC)的基因petE的启动子。质体蓝素是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体。petE启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如(NCBI ID：NC_000911)公开的序列。 
如本发明中所使用的，slr0168基因(例如参见NC_954899)是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因。前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活动没有影响，所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点(site)。 
如本发明中所使用的，slr1556基因(例如参见NC_952017)是集胞藻PCC6803基因组中编码乳酸脱氢酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，sll0945基因(例如参见NC_952804)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，sll1393基因(例如参见NC_952566)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，slr1993基因(例如参见NC_954541)是集胞藻PCC6803基因组中编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，slr1994基因(例如参见NC_954542)是集胞藻PCC6803基因组中编码β-酮硫解酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，slr1830基因(例如参见NC_954053)是集胞藻PCC6803基因组中编码聚-β-羟烷酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，slr1829基因(例如参见NC_954052)是集胞藻PCC6803基因组中编码聚-β-羟烷酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，slr0301基因(例如参见NC_952236)是集胞藻PCC6803基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。 
如本发明中所使用的，“能够产生乙醇的蓝细菌”是指这样的蓝细菌，其已被基因工程改造而能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，从而能够产生乙醇。可通过本领域公知的方法来改造蓝细菌，使得其能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，例如通过将编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的基因导入蓝细菌，或整合入蓝细菌的基因组。 
如本发明中所使用的，载体(vector)是指能够将DNA片段(例如，目的基因)插入其中从而允许将DNA片段(例如，目的基因)转移到受者细胞中 的一种核酸运载工具。当载体能使插入的DNA片段所编码的蛋白获得表达时，载体也称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。 
如本发明中所使用的，通常将DNA片段(例如，目的基因)与表达控制序列可操作地连接，以实现DNA片段(例如，目的基因)的组成型或诱导型表达。如本发明中所使用的，“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本发明中所使用的，“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达控制序列通常包括启动子，常常也包括转录终止序列，并且还可以包含其他序列，如增强子序列。 
如本发明中所使用的，“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。 
如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0％到至少大约15％v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-3℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少约16％v/v到至少大约30％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M 的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31％v/v到至少大约50％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行：Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)。但是，每增加1％的错配碱基对数目，双链体DNA的Tm下降1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定低严紧杂交条件是6xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1xSSC缓冲液，0.1％w/vSDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1部分，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等人，编辑(1995)Current Protocolsin Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，NewYork)。还可参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)。 
“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行例如，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444，1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software  Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。 
本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60％，或至少大约65％，或至少大约70％，或至少大约75％，或至少大约80％，或至少大约85％，或至少大约90％，或更高，例如大约95％，或大约96％，或大约97％，或大约98％，或大约99％，例如至少大约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。 
本发明的详细描述 
本发明的实施方案的一个目的就是要在蓝细菌体内构建一条高效生物合成乙醇的途径，实现乙醇在蓝细菌体内的合成。 
不希望受任何理论束缚，发明人现认为，蓝细菌产生乙醇的机制如下：在蓝细菌中，丙酮酸经过丙酮酸脱羧酶的催化作用生成乙醛，并且乙醛进一步在乙醇脱氢酶的催化作用下转化为乙醇。野生型蓝细菌(例如集胞藻PCC6803)内源表达乙醇脱氢酶(其编码基因为slr1192基因，参见例如NCBIID：NC_951896)，而不表达丙酮酸脱羧酶。因此，通过使蓝细菌表达丙酮酸脱羧酶(例如使用基因工程方法)，发明人成功地在蓝细菌细胞内构建了一条合成乙醇的途径，实现了乙醇在蓝细菌细胞内的合成。发明人进一步发现，蓝细菌的内源乙醇脱氢酶的表达量较低，不能满足大规模生产乙醇的需要。因此，不希望受任何理论束缚，发明人现认为，通过提高蓝细菌内丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的表达量(例如，通过使内源乙醇脱氢酶高表达，和/或通过表达外源丙酮酸脱羧酶)，可以提高丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量，从而可以提高下游产物乙醇的产量。 
本发明的实施方案的一个目的就是要在蓝细菌或在能够生产乙醇的蓝细菌中提高丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量，从而可以提高乙醇的产量，实现直接利用太阳能高效生物合成燃料乙醇的蓝细菌构建体。 
本发明的实施方案是利用在蓝细菌中具有活性的启动子驱动丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶在蓝细菌中一个或多个基因位点表达，利用蓝细菌光合微生物 的特点，吸收太阳能固定二氧化碳，合成乙醇作为生物燃料。 
本发明的实施方案的一个优点是在光合微生物蓝细菌体内利用太阳能固定二氧化碳合成乙醇，合成乙醇的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用这一技术制备的生物燃料不会受到原料不足的制约，使用这种生物燃料不会增加碳排放，是真正的零排放生物燃料。 
在一个方面，本发明的实施方案涉及用于在蓝细菌中合成乙醇的构建体，其可以包含有在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因。 
本发明提高了一种能够高效产生乙醇的构建体，其中，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自： 
1)丙酮酸脱羧酶基因； 
2)其核苷酸序列与1)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；和 
3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中的基因的序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因； 
以及其中所述第二基因选自： 
4)乙醇脱氢酶基因； 
5)其核苷酸序列与4)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；和 
6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。 
进一步地，所述构建体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置。所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段包括但不限于： 
集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr1556基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻 PCC6803的sll0945基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的sll1393基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr1993基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr1994基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr1830基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr1829基因的N-末端序列和C-末端序列；或集胞藻PCC6803的slr0301基因的N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重组。 
例如，所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段为分别slr0168基因的上游片段具有如SEQ ID NO：6所示的序列，以及slr0168基因的下游片段具有如SEQ ID NO：7所示的序列。 
例如，所述蓝细菌基因的上游片段和下游片段分别为slr1993-1994的上游基因片段具有如SEQ ID NO：8所示的序列，以及slr1993-1994的下游片段具有如SEQ ID NO：9所示的序列。 
在优选的实施方案中，所述在蓝细菌中具有活性的启动子是组成型启动子或诱导型启动子，例如可以选自但不限于Prbc启动子和PpetE启动子。例如，所述启动子具有SEQ ID NO：1所示的序列。 
在本发明的一个方面，所述丙酮酸脱羧酶基因为，例如但不限于：来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的CAA42157(例如参见Genbank_X59558.1)；来源于创伤弧菌(Vibro vulnificus)的HM172799(例如参见Genbank_HM172799.1)；来源于铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa)NIES-843的MAE36750(例如参见Genbank_AP009552.1)；来源于蓝杆藻(Cyanothece sp.)ATCC51142的cce_3766(例如参见NC_010546.1)，cce_4913(例如参见NC_010546.1)；来源于巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter Pasteurianus)的AAM21208(例如参见Genbank_AF368453.1)； 
在另一个优选的实施方案中，所述丙酮酸脱羧酶基因具有如SEQ ID NO：3所示的序列。另外，在本发明的实施方案中还可以使用与上面所列基因具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更加优选地至少95％同一性，最优选地至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；或者与上面所列基因在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因。 
在本发明的一个方面，所述乙醇脱氢酶基因为，例如但不限于：来源于集胞藻PCC6803的sll0990(例如参见NC_953785)；来源于集胞藻PCC6803的slr0942(例如参见NC_952986)；来源于集胞藻PCC6803的slr1192(例如参见NC_951896)；来源于鱼腥藻PCC7120的all0879(例如参见NC_1104473)；来源于鱼腥藻PCC7120的all2810(例如参见NC_1106408)；来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0459(例如参见NC_3773405)。 
在一个优选的实施方案中，所述乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO：4所示的序列。另外，在本发明的实施方案中还可以使用与上面所列基因具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更加优选地至少95％同一性，最优选地至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；或者与上面所列基因在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。 
优选的，乙醇脱氢酶来源于与宿主相同，例如，宿主为集胞藻，乙醇脱氢酶也来源于集胞藻。 
在进一步优选的实施方案中，所述构建体还可以包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。所述标记基因包括但不限于，例如卡那霉素抗性基因(例如参见NC_003239.1)，红霉素抗性基因(例如参见NC_015291.1)和壮观霉素抗性基因(SEQ ID NO：5)。此类标记基因是本领域技术人员熟知的。在一个优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因Omega片段，其例如具有如SEQ ID NO：5所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，其例如具有如SEQ ID NO：2所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因可以位于所述在蓝细菌中具有活性的启动子的上游或下游。 
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含上面所定义的构建体。 
可用于插入目的基因或构建体的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。 
在本发明的一个方面，提供了前面定义的构建体和/或前面定义的载体在能够产生乙醇的蓝细菌中提高乙醇产量的用途。在本发明的一个方面，所述能够产生乙醇的蓝细菌是指经基因工程改造而能够表达丙酮酸脱羧酶或能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，从而能够产生乙醇。 
在另一个方面，本发明提供了一种包含上面所定义的构建体和/或载体的蓝细菌，或者用上面所定义的载体转化的蓝细菌。在进一步优选的实施方案中，所述蓝细菌是能够产生乙醇的蓝细菌。 
在本发明的一个方面，提供了所述生产乙醇的蓝细菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.5882和CGMCC NO.5883，保藏时间是2012年3月8日。 
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含两个构建体，其中第一构建体是如上面所定义的构建体，第二构建体包含可替换蓝细菌中相关位点的与在蓝细菌中具有具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，所述第一基因选自： 
1)丙酮酸脱羧酶； 
2)其核苷酸序列与1)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；和 
3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中所列基因的序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因， 
以及所述第二基因选自： 
4)乙醇脱氢酶； 
5)其核苷酸序列与4)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；和 
6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中所列基因的序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。 
在一个优选的实施方案中，第二构建体所包含的启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在另一个优选的实施方案中，第二构建体所包含的启动子可以选自例如rbc启动子或petE启动子。例如所述第二构建体所包含的启动子具有如SEQ ID NO：1所示的序列。 
在一个优选的实施方案中，第二构建体所包含的丙酮酸脱羧酶基因可以选 自例如但不限于：来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的CAA42157(例如参见Genbank_X59558.1)；来源于创伤弧菌(Vibro vulnificus)的HM172799(例如参见Genbank_HM172799.1)，来源于铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa)NIES-843的MAE36750(例如参见Genbank_AP009552.1)；来源于蓝杆藻(Cyanothece sp.)ATCC51142的cce_3766(例如参见NC_010546.1)，cce_4913(例如参见NC_010546.1)；来源于巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter Pasteurianus的AAM21208(例如参见Genbank_AF368453.1)。在另一个优选的实施方案中，所述基因具有如SEQ ID NO：3所示的序列。 
在一个优选的实施方案中，第二构建体所包含的乙醇脱氢酶来源于集胞藻PCC6803的sll0990(例如参见NC_953785)；来源于集胞藻PCC6803的slr0942(例如参见NC_952986)；来源于集胞藻PCC6803的slr1192(例如参见NC_951896)；来源于鱼腥藻PCC7120的all0879(例如参见NC_1104473)；来源于鱼腥藻PCC7120的all2810(例如参见NC_1106408)；来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0459(例如参见NC_3773405)。在另一个优选的实施方案中，所述基因具有如SEQ ID NO：4所示的序列。 
在另一个优选的实施方案中，第二构建体还可以包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，例如但不限于，卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。在一个优选的实施方案中，第二构建体包含的标记基因与第一构建体包含的标记基因不同。 
在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含两种载体，其中第一载体包含前面所定义的第一构建体，并且第二载体包含前面所定义的第二构建体。 
在另一个方面，本发明的实施方案涉及一种蓝细菌，其包含上面所定义的第一构建体和/或第一载体，并且包含上面所定义的第二构建体和/或第二载体。在一个优选的实施方案中，所述蓝细菌是能够产生乙醇的蓝细菌。 
在本发明的一个方面，提供了所述生产乙醇的蓝细菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.5884，保藏时间是2012年3月8日。 
在进一步优选的实施方案中，本发明的实施方案涉及在能够产生乙醇的蓝细菌中进一步提高乙醇产量的方法，其包括将上面所定义的构建体和/或载体 导入所述蓝细菌中。 
在本发明的一个方面，提供了在能够产生乙醇的蓝细菌中提高乙醇产量的方法，其包括将前面定义的构建体和/或前面定义的载体导入所述蓝细菌中。其中所述能够产生乙醇的蓝细菌是指经基因工程改造而能够表达丙酮酸脱羧酶或能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，从而能够产生乙醇，优选的，所述构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。在一个优选的实施方案中，所述能够产生乙醇的蓝细菌是指，其经基因工程改造而能够表达丙酮酸脱羧酶，或能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，从而能够产生乙醇。例如，可以通过将包含有编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的基因的构建体和/或载体再次导入蓝细菌，或整合入蓝细菌的基因组的一个或多个位点，从而获得能够高效产生乙醇的蓝细菌。在另一个优选的实施方案中，将相应的前面定义的构建体和/或前面定义的载体整合入所述蓝细菌的基因组相应位点内。 
在本发明的一个方面，提供了在蓝细菌中生产乙醇的方法，所述方法包括： 
1)将前面定义的第一构建体和/或前面定义的第一载体，以及前面定义的第二构建体和/或前面定义的第二载体导入蓝细菌；和2)培养步骤1)获得的蓝细菌，并从培养物中获得乙醇。 
在本发明的其中一个方面，所述蓝细菌可以是集胞藻PCC6803； 
在本发明的其中一个方面，可以将所述第一构建体和/或第二构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。 
在本发明的其中一个方面，步骤1)获得的蓝细菌是于2012年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蓝细菌CE03，其保藏号为CGMCC NO.5884。 
在本发明的一个方面，提供了前面定义的构建体和/或前面定义的载体在能够产生乙醇的蓝细菌中提高乙醇产量的用途。 
在本发明的一个方面，提供了前面定义的试剂盒在制备能够产生乙醇的蓝细菌中的用途。 
在本申请中，发明人通过在蓝细菌细胞内构建了一条合成乙醇的途径，实现了在光合微生物蓝细菌细胞内利用太阳能来固定二氧化碳并合成乙醇，其中，合成乙醇的能量来自于太阳能，并且碳源来自于二氧化碳。因此，本发明的技术方案的一个优点在于，利用本发明的方法所制备的生物燃料不会受到原料不足的制约，并且使用这种生物燃料不会增加碳排放，是真正的零排放生物燃料。 
进一步，在本申请中，发明人通过提高蓝细菌内丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因的表达量，提高了蓝细菌中丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量，从而提高了下游产物乙醇的产量，实现了直接利用太阳能高效生物合成燃料乙醇的蓝细菌菌株构建。因此，本发明的技术方案的另一个优点在于，乙醇在蓝细菌中的高效生物合成，为使用蓝细菌来大规模生产生物燃料乙醇提供了有利条件。 
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。 
附图说明
图1为质粒pCE01的基本结构。 
图2为质粒pCE02的基本结构。 
图3为质粒pCE03的基本结构。 
图4为质粒pCE04的基本结构。 
图5为质粒pCE05的基本结构。 
图6为质粒pCE06的基本结构。 
图7为质粒pCE07的基本结构。 
图8为质粒pCE08的基本结构。 
图9为质粒pCE09的基本结构。 
图10为质粒pCE10的基本结构。 
图11为质粒pCE11的基本结构。 
图12为质粒pCE12的基本结构。 
图13为质粒pCE13的基本结构。 
图14为质粒pCE14的基本结构。 
图15为用于蓝藻培养以及所产生乙醇回收装置的示意图。 
图16为蓝藻培养过程中的生长OD曲线变化图。 
图17为蓝藻培养过程中所生产乙醇的含量示意图。 
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将 会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 
除非特别指明，否则本发明中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausube l等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。 
实施例1：用于表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的载体的构建 
为了向蓝细菌中外源引入丙酮酸脱羧酶以及提高蓝细菌中丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量，如下构建了能够表达来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因ZmPDC的质粒pCE03和能够表达来源于蓝藻PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因slr1192的质粒pCE04。 
1、质粒pCE03的构建 
以ZmPDC-F(5′-GCG GCA GCC ATA TGA GTT ATA CTG TCG-3′)和ZmPDC-R(5′-AGC TCG TCT CGA GTC TAG AGG AGC TTG-3′)为引物，以运动发酵单胞菌(Zymomonas Mobilis)基因组DNA为模板进行PCR扩增，并根据生产商的说明书，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pCE01，基本结构示于图1。经测序验证后，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pCE01，并回收约1.7kb的DNA片段。此外，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pET21b(Novagen)，并回收DNA片段。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有ZmPDC基因的质粒pCE03。质粒pCE03的基本结构示于图3中，其包含来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶ZmPDC基因(SEQ ID NO：3)。 
2、质粒pCE04的构建 
以1192-F(5′-GCG GCA GCC ATA TGA TTA AAG CCT ACG-3′)和1192-R(5′-ATT GCA TGT CGA TCT CGA GCT AAT TT-3′)为引物，以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板进行PCR扩增，并根据生产商的说明书，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pCE02，基 本结构示于图2。经测序验证后，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pCE02，并回收约1kb的DNA片段。此外，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pET21b(Novagen)，并回收DNA片段。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有slr1192基因的质粒pCE04。质粒pCE04的基本结构示于图4中，其包含来源于蓝藻PCC6803的乙醇脱氢酶slr1192基因(SEQ ID NO：4)。 
实施例2：用于基因敲入和基因敲除的载体的构建 
为了证实丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶在蓝细菌生产乙醇中的作用，并证实可以通过提高所述酶的表达来提高蓝细菌中乙醇的产量，如下构建了用于将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入蓝细菌基因组slr0168位点的载体pCE09，以及证实通过在产乙醇的蓝细菌中进一步提高丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量从而提高乙醇的产量，如下构建了用于将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入蓝细菌基因组slr1193-1194位点的载体pCE11。 
1、载体pCE09的构建 
以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以Prbc-F(5′-ACC TCC  AGCCAT TAG CGA AAC-3′)和Prbc-R(5′-CTC TCA CAA TTG CCC TAC CT-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到载体pCE05，基本结构示于图5中。经测序验证后，使用Sma I(Takara，CatalogNo.：D1073A)酶切质粒pCE05，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3kb的片段。另外，使用DraI(Takara Catalog No.：D1093A)酶切质粒pRL57(Elhaiand Wolk，1988)，然后回收1.9kb的片段(该片段含有抗性基因)。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE06，基本结构示于图6中。使用SacI和PstI酶切质粒pCE06，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收2.2kb的片段。另外，使用Xba I将酶切质粒pCE01，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收4.4kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE07。使用SacI 和PstI酶切质粒pCE07，基本结构示于图7中，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3.9kb的片段。另外，使用XbaI将酶切质粒pCE02，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3.7kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE08，基本结构示于图8中。 
使用XbaI酶切质粒pHB1567（见高宏等人，2007；该质粒pHB1567转化大肠杆菌DH5α，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5859，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为大肠埃希氏菌，即Escherichia coli）并使用T4DNA聚合酶（Fermentas,Catalog No.:EP0061）将末端补平，然后回收5.4b的片段，该片段包含slr0168位点的上游片段（SEQ ID NO:6）和下游片段（SEQ ID NO:7）。另外，使用SacI和PstI酶切质粒pCE08，并使用T4DNA聚合酶（Fermentas,Catalog No.:EP0061）将末端补平，然后回收5kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE09，基本结构示于图9中。从而完成将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因（ZmPDC）和乙醇脱氢酶基因（slr1192）整合入蓝细菌基因组slr0168位点的载体pCE09。 
2、载体pCE14的构建 
以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr1993-1994-F1(5′-TGG TAC AGG GAT AAA CAC TGG TTA-3′)和slr1993-1994-R1(5′-TTC CAA TGC CAT GGG TTG GGA T-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D 101A)中，从而得到质粒pCE10，其包含有slr1993-1994上游基因片段(SEQ ID NO：8)，基本结构示于图10中。以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr1993-1994-F2(5′-GTA GCC ATG GTA GCT ATG TCA CCG-3′)和slr1993-1994-R2(5′-TGT TGA TGG TGG GTA TCG TGG TG-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pCE11，其包含有slr1993-1994下游基因片段(SEQ ID NO：9)，基本结构示于图11中。经测序正确后，使用SphI酶切质粒pCE10，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收4kb的片段。另外使用NcoI和BamH  I酶切质粒pCE11，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平， 然后回收1kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE12，基本结构示于图12中。 
使用EcoRV和XbaI(Takara Catalog No.：D1040A和Takara Catalog No.：D1093A)酶切质粒pRL271，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收3kb的片段(该片段含有抗性基因)。另外使用Sma I和BamH I酶切质粒pCE08，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收5.7kb片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE13，基本结构示于图13中。 
使用BamH I酶切质粒pCE12，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收5kb的片段。另外使用SacI和SphI酶切质粒pCE13，并使用T4DNA聚合酶将末端补平，回收6kb片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE14，基本结构示于图14中。从而完成进一步将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入产乙醇的蓝细菌基因组slr1993-1994位点的载体pCE14。 
实施例3：蓝细菌的转化以及转化体的筛选 
如下进行蓝细菌的转化以及转化体的筛选： 
1、取处于对数生长期(OD730约为0.5～1.0)的蓝细菌细胞10mL，离心收集细胞；用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mL BG11培养基(1.5g L-1 NaNO3，40mg L-1 K2HPO4·3H2O，36mg L-1 CaCl2·2H2O，6mg/L柠檬酸，6mg/L柠檬酸铁铵，1mg L-1 EDTA二钠盐，20mg L-1 NaCO3，2.9mg L-1H3BO3，1.8mg L-1MnCl2·4H2O，0.22mg L-1ZnSO4·7H2O，0.39mg L-1NaMoO4·2H2O，0.079mg L-1CuSO4·5H2O和0.01mg L-1CoCl2·6H2O)中。 
2、取0.2mL细胞悬液于新的EP管中，加入2～3μg表达质粒，混匀，并置于30℃、30μEm-2s-1光照条件下温育5小时。 
3、将蓝细菌细胞与DNA的混合物涂布于铺在BG11平板(未加抗生素)上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μEm-2s-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有与目的藻株相应的抗生素的BG11平板上，并在30℃、30μEm-2 s-1的条件下继续培养。 
4、培养大约5～7天后，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板(含相应的抗生素)上划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11培养基(含相应的抗生素)中进行培养。 
5、将经转化的蓝细菌细胞在液体BG11培养基(含相应的抗生素)中转接两次到三次，并且在通过基因组测序验证目的构建体的正确导入后，将经转化的细胞用于检测乙醇的产量。 
经过上述步骤转化蓝细菌，得到以下菌株： 
Figure BDA0000150597970000191
藻株的基因型信息 
PCC6803：野生型集胞藻PCC6803，葡萄糖耐受的。 
CE01：slr0168∷Omega Prbc ZmPDC slr1192：含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr0168基因所在的位置），壮观霉素抗性。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5882，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。 
CE02：slr1993-1994∷Omega Prbc ZmPDC slr1192：含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr1993-1994基因所在的位置），卡那霉素抗性。该菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5883，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。 
CE03：slr0168∷omega Prbc ZmPDC slr1192,slr1993-1994∷Sac.B Km PrbcZmPDC slr1192：含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr0168基因所在的位置），壮观霉素抗性。并且含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr 1993-1994基因所在的位置），卡那霉素抗性。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5884，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。
实施例4：经基因工程改造的蓝细菌的乙醇产量 
1、实验步骤： 
(1)培养方式：柱状光照反应器培养。自行设计的300mL柱状光照反应器，装200mL液体BG11培养基(含前面所述的相应抗性)，初始接种浓度为OD730＝1.5，在30℃、30μEm-2s-1光照条件下，通含CO2为5％的空气培养1天后，待藻株状态稳 
定后，加强光照强度到100μEm-2s-1。 
(2)乙醇采收将柱状光照反应器的出气通路连接到100mL的三口烧瓶中，并保证气体通入50mL的水体中，用于乙醇挥发气体的溶解。三口烧瓶上方放置30cm的蛇形冷凝管，三口烧瓶置于5℃中，蛇形冷凝管接入5℃循环水。该冷凝回收装置如图15所示，用于回收由于通气影响而从柱状光照反应器中挥发出来的乙醇。 
(3)乙醇的检测：每两天从柱状光照反应器中取0.5mL的培养液，离心后用于乙醇的检测，另外从相对应的三口烧瓶中取0.5mL的回收液，用于乙醇的检测。将两者测得乙醇结果换算后获得乙醇产量。乙醇检测采用SBA-40生物传感器进行检测。 
2、实验结果 
本发明人分别在四株蓝细菌PCC6803、CE01、CE02和CE03中检测了乙醇产量，野生型蓝细菌PCC6803中未检测到乙醇的产生，CE01、CE02和CE03检测到了乙醇的产生。图16和图17分别展示了蓝细菌PCC6803、CE01、CE02和CE03的生长以及乙醇的生产情况。 
结果显示，野生型的PCC6803本身并不能生产乙醇，经过外源引入运动发酵单胞菌的丙酮酸脱氢酶和过量表达内源的乙醇脱氢酶而获得的CE01和CE02能够生产乙醇，其CE01的乙醇产量在第18天积累浓度为1.597±0.093g/L，产率0.089±0.005gL-1d-1，其CE02的乙醇产量在第18天积累浓度为1.880±0.025g/L，产率0.104±0.001gL-1d-1，随后CE01和CE02的乙醇产量开始下降。进一步在CE01的基础上，再一次过量表达运动发酵单胞菌的丙酮酸脱氢酶和过量表达内源的乙醇脱氢酶而获得的CE03，乙醇产量在第26天积累浓度为5.505±0.585g/L，产率为0.212±0.023gL-1d-1，产率相对CE01提高了238％，相对CE02提高了204％。结果表明，在蓝细菌体内过量表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可有效的增强合成乙醇的能力，提高乙醇的产量，延长了乙醇的生产周期，为使用蓝细菌来大规模生产生物燃料乙醇提供了有利条件。 
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。 
Figure IDA0000150598050000011
Figure IDA0000150598050000021
Figure IDA0000150598050000031
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Figure IDA0000150598050000051

Claims (12)

1.一种构建体，其中，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自：
1)丙酮酸脱羧酶基因；
2)其核苷酸序列与1)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；和
3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中的基因的序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；
以及其中所述第二基因选自：
4)乙醇脱氢酶基因；
5)其核苷酸序列与4)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；和
6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。
2.权利要求1的构建体，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，例如所述启动子是rbc启动子或petE启动子，例如所述启动子具有SEQ ID NO：1所示的序列。
3.权利要求1或2的构建体，其中所述第一基因是丙酮酸脱羧酶基因和第二基因是乙醇脱氢酶基因，其中丙酮酸脱羧酶为：来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的CAA42157；来源于创伤弧菌(Vibro vulnificus)的HM172799，来源于铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa)NIES-843的MAE36750；来源于蓝杆藻(Cyanothece sp.)ATCC51142的cce_3766，cce_4913；来源于巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter Pasteurianus)的AAM21208，以及其中乙醇脱氢酶为：来源于集胞藻PCC6803的sll0990；来源于集胞藻PCC6803的slr0942；来源于集胞藻PCC6803的slr1192；来源于鱼腥藻PCC7120的all0879；来源于鱼腥藻PCC7120的all2810；来源于聚球藻PCC7942的Synpcc7942_0459，
优选的，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有如SEQ ID NO：3所示的序列，和/或其中所述乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO：4所示的序列。
4.权利要求1-3中任一项的构建体，其中所述构建体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，从而所述构建体可以通过同源重组整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置，例如，所述蓝细菌基因为slr0168基因，slr1556基因，sll0945基因，sll1393基因，slr1830基因，slr1829基因，slr0301基因，slr1993基因和slr1994基因，优选的，所述slr0168基因的上游片段具有如SEQ ID NO：6所示的序列以及所述slr0168基因的下游片段具有如SEQ ID NO：7所示的序列，或所述蓝细菌基因的上游片段具有如SEQID NO：8所示的序列以及所述蓝细菌基因的下游片段具有如SEQ ID NO：9所示的序列。
5.一种载体，其包含权利要求1-4中任一项的构建体。
6.包含权利要求1-4中任一项的构建体和/或权利要求5的载体的蓝细菌。
7.一种试剂盒，其包含两种构建体，其中第一构建体是权利要求1-4中任一项的构建体，并且第二构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，所述第一基因选自：
1)丙酮酸脱羧酶；
2)其核苷酸序列与1)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；和
3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中所列基因的序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因，
以及其中所述第二基因选自：
4)乙醇脱氢酶；
5)其核苷酸序列与4)中所列基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；或
6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中所列基因的序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因，
其中，第二构建体所包含的启动子是组成型启动子或诱导型启动子，例如rbc启动子或petE启动子；例如所述第二构建体所包含的启动子具有如SEQ IDNO：1所示的序列；
优选的，第二构建体所包含的丙酮酸脱羧酶基因选自：来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，来源于创伤弧菌(Vibro vulnificus)，来源于铜绿微囊藻(Microcystis Aeruginosa)，来源于蓝杆藻(Cyanothecesp.)和来源于巴斯德醋酸杆菌，和/或第二构建体所包含的乙醇脱氢酶选自：来源于集胞藻PCC6803；来源于鱼腥藻和来源于聚球藻，
优选的，所述第二构建体还包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，例如选自卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因；优选地，第二构建体包含的标记基因与第一构建体包含的标记基因不同。
8.一种试剂盒，其包含两种载体，其中第一载体包含权利要求7所定义的第一构建体，并且第二载体包含权利要求7所定义的第二构建体。
9.一种蓝细菌，其包含权利要求7所定义的第一构建体和/或权利要求8所定义的第一载体，并且包含权利要求7所定义的第二构建体和/或权利要求8所定义的第二载体。
10.蓝细菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5882、CGMCC NO.5883或CGMCC NO.5884。
11.在能够产生乙醇的蓝细菌中提高乙醇产量的方法，其包括将权利要求1-4中任一项的构建体和/或权利要求5的载体导入所述蓝细菌中，其中能够产生乙醇的蓝细菌是指经基因工程改造而能够表达丙酮酸脱羧酶或能够表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，从而能够产生乙醇，优选的，所述权利要求1-4中任一项的构建体和/或权利要求5的载体整合入所述蓝细菌的基因组内。
12.在蓝细菌中生产乙醇的方法，所述方法包括：
1)将权利要求7所定义的第一构建体和/或权利要求8所定义的第一载体，以及权利要求7所定义的第二构建体和/或权利要求8所定义的第二载体导入蓝细菌；和2)培养步骤1)获得的蓝细菌，并从培养物中获得乙醇；
优选的，所述蓝细菌是集胞藻，最优选为集胞藻PCC6803；
优选的，所述第一构建体和/或第二构建体整合入所述蓝细菌的基因组内。
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