CN101395273A

CN101395273A - 利用蓝藻生产乙醇的方法和组合物

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Publication number: CN101395273A
Application number: CNA2007800079045A
Authority: CN
Inventors: 傅鹏程; 杰森·德克斯特
Original assignee: University of Hawaii
Current assignee: University of Hawaii
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2009-03-25
Also published as: WO2007084477A1; AU2007207635B2; KR20080113199A; ES2343776B1; JP2009523424A; US20090155871A1; DE602007012829D1; EP1979481B1; ES2343776A1; CA2637031C; JP5306823B2; US8372613B2; ATE500327T1; EP1979481A4; EP1979481A1; CA2637031A1; AU2007207635A1; MX2008008970A

Abstract

本发明涉及一种利用蓝藻生产乙醇的方法和系统。具体涉及利用通过基因修饰的光反应蓝藻来生产乙醇的方法。

Description

利用蓝藻生产乙醇的方法和组合物

相关申请的交叉引用

[001]本专利申请要求2006年1月13日提交的第60/758,863号美国临时专利申请的优先权，通过全文引用的方式结合到本文中完全公开。

发明背景

现有技术描述

[0002]可再生能源的发展为社会和工业界迅速接受，以满足能源增长和减少废气排放的目标。自工业革命以来，世界经济严重依赖于矿物燃料作为能源来源。依赖这些能源导致了数个具有挑战性的问题，如矿物燃料资源供应的减少、污染环境和相应的全球变暖效应。一种可替代矿物的燃料是乙醇，当今世界生产的乙醇60％来源于糖料作物，33％来自其他作物和7％的是通过化学合成。传统的生物生产乙醇的过程需要大量的耕地和能源投入来满足原料增长的需求。此外，传统的发酵方法释放相当数量的二氧化碳作为发酵过程中的副产品。例如，一个40mmgy(万加仑每年)生物乙醇工厂每年可能会释放121,000吨二氧化碳到环境中(BBI，2003年)，这种温室气体会加剧全球变暖效应。

[0003]生物乙醇生产技术最近已攀升至可再生燃料技术前列，它提供了一种以石油为基础的燃料的替代物，可对生产和消费过程加以调控。此外，考虑到生产和燃料工业，生物系统来源的乙醇，尤其具有吸引力的是因为它可以非常容易地整合许多现有的基础设施。对使用活的生物体来生产乙醇的各种方法已进行了相关研究。大部分研究集中在通过微生物来生产乙醇。如利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和含特有乙醇遗传因子的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。这两种微生物含产生酵素丙酮酸脱羧酶(pdc)和乙醇脱氢酶(adh)的遗传信息，能从丙酮酸中产生乙醇，这是糖酵解途径中的产物。Woods等人(美国专利号6306639和6699696；也见Deng和Coleman，＂Ethanol Synthesis by Genetic Engineering in Cyanobacteria＂Applied and EnvironmentalMicrobiology(1999)65(2)：523-428)揭示了遗传修饰后的蓝藻对乙醇的产生是很有帮助的。Woods等人报道了经过30天的培养乙醇产量是5mM的水平。

[0004]因此，寻求一种简单、有效和成本适宜的用来产生大量乙醇的生物系统是非常必需的。

发明摘要：

[0005]上述技术存在着各种不足。如woods描述的系统存在着乙醇产量低、发酵时间长以及不稳定的不足。

[0006]在一些实施例中，所需要的是一种简单，有效和成本合适的系统来产生大量的乙醇。本发明涉及到了方法，组合物，宿主细胞以及为优化乙醇生产所用的载体和宿主细胞来优化乙醇生产和达到更加经济的乙醇浓度的宿主细胞耐受力。

[0007]根据本发明实施例公开一个核酸结构。核酸序列包括：光反应启动子，编码丙酮酸脱羧(pdc)酶的序列，以及编码乙醇脱氢(adh)酶的序列。

[0008]根据本发明实施例公开一个表达载体。表达载体包括一核酸，该核酸包括光反应启动子、编码丙酮酸脱羧酶(pdc)的序列以及编码乙醇脱氢酶(adh)的序列的核酸组成。

[0009]根据本发明实施例公开一个宿主细胞。宿主细胞包含一个表达载体，表达载体的核酸组份包括光反应启动子，编码丙酮酸脱羧酶(pdc)的序列，以及编码乙醇脱氢酶(adh)的序列。

[0010]根据本发明实施例公开一种经遗传工程修饰的蓝藻，蓝藻包含一个核酸结构，核酸结构包含编码丙酮酸脱羧酶(pdc)以及编码乙醇脱氢酶(adh)的核酸序列，其特征在于经5天发酵后蓝藻能够产生可回收量大于约10mM的乙醇。

[0011]根据本发明实施例公开一种生产乙醇的方法，方法包括：在培养基中培养蓝藻，该蓝藻含一个核酸结构，其包括来源于运动发酵单胞菌pL0I295质粒的编码pdc以及adh酶的DNA片段组成；蓝藻在培养基中经5天发酵后累积的乙醇量能够达到大于约10mM的水平。

附图说明

[0012]图1.为质粒结构图谱(a)pPSBAIIKS和(b)用于构建pMota的pLOI295。

[0013]图2.为反应器中乙醇浓度与时间的关系，乙醇浓度经5天发酵后达到13mM。对照组为未转化的野生型集胞藻(Synechocystis)。

[0014]本申请的主题将通过具体的实施例，并参照附图进行详细描述。在不偏离由从属权利要求部分地定义的本发明主题的真实范围与主旨的情况下，可对描述的实施方案进行改变和修饰。

具体实施方式

I.介绍

[0015]根据本发明优选的实施例公开了核酸序列，载体，宿主细胞和通过蓝藻生产高产量的乙醇方法。

[0016]蓝藻利用阳光，二氧化碳和无机营养盐(可能从废水中获得)产生乙醇，这是获得可再生燃料很具有吸引力的一种途径。将碳固定和乙醇生产途径相结合到一个简单的有机体，由于减少了总输入能量，增加了净输出能量，与植物生长/收获/加工相关的费用也随之避免。对比生物乙醇生产过程，所公开的方法将直接利用大量的二氧化碳作为碳源为燃料来生产，因而将有助于减少大气中温室气体。

[0017]使用光合微生物如集胞藻(Synechocystis)来生产乙醇有许多好处，如：生产生物燃料获得的经济利益，对环境的积极影响，减缓全球气候变暖，以及改善粮食安全。相比基于生物的乙醇生产工业，本方法中由太阳能和CO₂通过利用蓝藻来产生乙醇，极大地节省了的资本和运作成本。开支的减少是通过以下方面来实现的：简化了生产工序，无需农作物和残留物，没有固体废物需要处理，不需要酶等。蓝藻发酵不涉及很难处理的硬纤维素和半纤维素。因此，蓝藻乙醇生产厂将不会排放任何有害的空气污染物和挥发性有机化合物。

[0018]对比较传统的生物生产乙醇方法，本方法和系统将有助于维护农业粮食生产的空间。此外，蓝藻的乙醇生产工厂可以高度分散，没有地域限制，因为它们并不需要将粮食运输到特定地点或预处理原料。考虑到燃料运输和分配平台的平稳整合，本方法和系统描述的乙醇生产所需的基础设施和设备，预计将大大低于酵母发酵技术生产乙醇的设施和设备。

[0019]光合固定二氧化碳的最初产物是3-磷酸甘油酸。在卡尔文循环中3-磷酸甘油酸能再生成1，5-核酮糖磷酸氢盐，这是二氧化碳的受体。卡尔文循环连接到其他代谢途径的中间体有两个主要分支点。一个是6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖和磷酸葡萄糖，这是磷酸戊糖途径的底物，用于合成纤维素(细胞壁的主要组成部分)和合成糖原(碳水化合物储存的主要形式)。另一个分支点是3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸，并分别被磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶和丙酮酸激酶催化。在有氧情况下丙酮酸直接进入三羧酸(TCA)循环合成氨基酸，核苷酸等。丙酮酸也是合成乙醇的底物。

[0020]要使碳水化合储备物转化为乙醇，碳水化合储备物必须进入糖酵解途径。在蓝藻中碳水化合储备物代谢途径可能有糖酵解途径和磷酸葡萄糖酸途径。对于乙醇的形成，糖酵解途径至关重要。虽然还没有一个很好的描述，但在蓝藻中，糖原被认为通过与正磷酸酯葡糖基转移酶和1，6-糖苷酶结合，代谢成1-磷酸葡萄糖。磷酸葡萄糖变位酶，磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶将1-磷酸葡萄糖转换为一分子的1，6-二磷酸果糖。1，6-二磷酸果糖被二磷酸果糖酶和磷酸丙糖异构酶作用后转化成两分子的3-磷酸甘油醛。3-磷酸甘油醛通过连续的一系列反应，分别由3-磷酸甘油醛脱氢酶，磷酸甘油酸酯激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶和丙酮酸激酶催化转化为丙酮酸。

[0021]在黑暗和厌氧条件下，作为发酵产物，一些藻类和蓝藻株能产生少量的乙醇(Vander Oost et al.，＂Nucleotide sequence of the gene proposed to encode the small subunit of thesoluble hydrogenase of the thermophilic unicellular cyanobacterium Synechococcus PCC6716.＂Nucleic Acids Res.1989 Dec 11；17(23)：10098，在此通过全文引用作为本发明的一部分)。不过，黑暗厌氧环境下发酵过程中通常只能产生极低水平的乙醇，且仅仅能够满足此应激条件下有机物的存活。黑暗和厌氧条件下乙醇的合成依赖于如上文所述的糖原储备的降解，此外，厌氧条件下乙醇的合成能够被光完全抑制。因此，光合微生物的乙醇合成是不能同时进行光合作用，而且这种合成能够被光合作用所抑制。[0022]因此，有人指出，蓝藻不能利用二氧化碳来产生乙醇。此外，没有已知的光合微生物，包括基因工程改造的光合微生物，可以产生相对大量的乙醇。更加复杂的是，有研究表明一些光合生物能被乙醇抑制，在培养基中加入乙醇能抑制参与光合作用的基因表达。

[0023]在本发明中已发现，与在厌氧和黑暗条件下利用糖原储备物相反，蓝藻能被成功地进行遗传工程改造，而产生大量的乙醇。通过插入由上述两个酶pdc和adh组成的乙醇产生代谢途径，细胞生长和生产乙醇时能够吸收和利用无机碳。

II.定义

[0024]，除非特别定义，此处使用的所有的技术和科学术语，应当是本发明所属技术领域的技术人员所公知的。所以除非特别指明，在此使用的以下术语的含义应该按照下面描述的内容来理解。

[0025]“丙酮酸脱羧酶”和“pdc”，是指一种催化丙酮酸脱羧为乙醛和二氧化碳的酶。“pdc基因”是指编码一种催化丙酮酸脱羧为乙醛和二氧化碳的酶的基因。“乙醇脱氢酶”和“adh”，是指一种促进乙醇和乙醛或酮之间互变的酶。“adh基因”是指编码促进乙醇和乙醛或酮之间互变的酶的基因。“pdc/adh”是指pdc酶和adh酶的统称。“pdc/adh盒”指的是编码的pdc酶和adh酶的核酸序列。

[0026]“启动子”是一系列核酸调控序列，直接转录相关的核苷酸链，它可以是异源的序列也可以是生物自身的核苷酸链。启动子包括核酸序列起始站点附近的的转录，如聚合酶结合位点。启动子也可以包括远端增强子或遏制子元件，这些元件可以离转录起始位点数千个碱基对。

[0027]“光反应启动子”是指对光有反应的启动子。

[0028]“核苷酸链”和“核酸”，是指核苷酸单位(核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，相关的天然存在的结构变异和其非天然存在的合成类似物)组成的聚合物，这些核苷酸单位以及相关的天然存在的结构变异和其非天然存在的合成类似物通过磷酸二酯键相连。因此，本术语包括核苷酸聚合物，其中的核苷酸和它们之间的连接，包括非天然存在的合成类似物。根据上下文来可以知道，一个核苷酸序列可以是一个DNA序列(即，A，T，G，C)，也可以是一RNA序列(即，A，U，G，C)在这里RNA的“U”代替了DNA的“T”。

[0029]“重组”是指在体外核苷酸链的合成或其他处理方式(“重组核苷酸链”)，及在细胞或其他生物系统使用重组核苷酸链来表达基因产物的方法。表达的基因产物是由重组的核苷酸链编码的。如一个克隆的核苷酸链可插入到一合适的表达载体，如细菌质粒，将质粒转染或转化到一个合适的宿主细胞。包含了重组核苷酸链的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”或“重组菌”。重组宿主细胞的基因得到表达获得产物，如“重组蛋白”。重组核苷酸链也可以作为非编码功能使用(如，启动子，复制起始位点，核糖体结合位点等)。

[0030]术语“同源重组”是指两条序列相似的核酸分子之间进行重组的过程。这个术语包含了相互重组和非相互重组(也称为基因转换)。此外，等量交换和非等量交换事件都能导致重组的发生。等量交换发生在两个等量序列或染色体区域，而非等量交换发生在相同(或大体相同)非等量序列片段或染色体区域。典型的不等量交换通常导致在基因重复和缺失。对于酶的说明和同源重组所涉及到的机制可参见，Watson et al.，MolecularBiology of the Gene pp 313-327，The Benjamin/Cummings Publishing Co.4th ed.(1987).

[0031]术语“非同源或随机整合”是指使DNA整合到基因组而不涉及同源重组的任何过程。它似乎是一个随机过程，因为这种整合可以发生在基因组的任何位置。

[0032]“异源核苷酸链序列”或“异源核酸”是一个相对的术语，指核苷酸链功能上和其他核苷酸链相关，如一个启动序列。从某种意义上说，两条核苷酸链实质上并不以同样的关系相互排列。异源核苷酸链序列包括，如，一个连接到异源核苷酸的启动子，以及一个包含自身启动子可插入到异源载体中转化为重组宿主细胞的核苷酸链。异源核苷酸链序列被看做是“外源性的”，因为它们经过了转化或转染技术进入宿主细胞。然而，异源的核苷酸链能够以内源和外源的方式启动表达。可以对异源的核苷酸链序列进行修饰。如，可以对核苷酸链进行酶切处理以便得到能够连接到调节元件的核苷酸链序列。通过定点突变技术也能够对核苷酸链进行修饰。

[0033]术语“内源性表达”是指核苷酸链是宿主细胞自身的，并在宿主细胞中自然表达。

[0034]“表达盒(expression cassette)”或“构建”是指一系列核苷酸链元件，这些元件能使基因在宿主细胞中转录。通常，表达盒包括一个启动子和一个转录的异源或自身的核苷酸链序列。表达盒或构建同时也可能包括，如，转录终止信号，多聚腺苷酸信号和增强子元件。

[0035]术语“可操作地连接(operably linked)”是指两部分之间的功能关系，一部分的活性(如，调节转录的能力)能对另一部分产生作用(如，序列的转录)。因此，核苷酸链“可操作地连接一个启动子时”是指在核苷酸链表达调控序列(如启动子或其他转录调控序列)和第二个核苷酸链序列(如，一个自身的或异源的核苷酸链)之间存在功能联系。表达调控序列启动核苷酸链的转录。

[0036]“有能力进行表达”是指宿主细胞能提供了充足的细胞环境来表达的内源性和/或外源性核苷酸链。

[0037]表示成分数量、反应条件以及所有用于说明书以及权利要求的数字，应当理解为在实施例中使用“大约”一词来修订。因此，除非出现矛盾的结果，详细说明书和权利要求中提出的数值参数是近视值，这些值非常依赖于通过本发明获得的所需的性质。在最低限度，不能限制权利要求等同方式的应用，每一个有效数字应当包括能够直接获得的数字和估读的数字。

III具体实施方式

[0038]根据本发明实施例公开了为优化乙醇生产所用核酸和重组表达载体。图1是一个系统的实施例。该系统在如下的实施例1中将详细描述。该系统可用于执行不同的方法或程序。为优化乙醇生产构建的pMota重组表达载体序列显示如SEQ ID NO：1所示。该pMota载体包含蓝藻psbAII启动子，位于一个500碱基对的同源性核酸序列的上游区域(SEQ ID NO：2)，来源于PLOI295(SEQ ID NO：2)的编码运动发酵单胞菌pdc核酸序列，以及来源于PLOI295(SEQ ID NO：4)的编码运动发酵单胞菌adhII核酸序列。pMota载体通过pdc/adh盒从PLOI295(图1b)克隆到pPSB AIIKS质粒(图1a)构建。利用pMota载体将受psbAII光反应启动子调控的pdc/adh基因整合于蓝藻基因组中。

[0039]为转化宿主细胞和随后整合目的基因的重组表达载体可由上述第一步获得的核苷酸链序列得到。在一些实施例中，目的基因通过同源整合到宿主细胞基因组中，另外一些实施例中，基因是通过非同源整合到基因组中。优选将目的基因同源整合到Synechocystis的基因组中。在一些实施例中，pMota载体通过双同源重组整合到PsbAII基因组。核苷酸链序列，如受启动子驱动编码pdc/adh酶的核苷酸序列，通过连接构建一个重组表达载体，也就是“pdc/adh构建”，适合于转化为宿主细胞。分离和制备重组核苷酸对本领域的技术人员来说是很公知的。(Sambrook et al.，Molecular Cloning.ALaboratory Manual(2d ed.1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(1995))。以上信息足以为技术人员提供克隆的技术。

[0040]一个获取特异性核苷酸链的优选方法是，合成寡核苷酸引物使用聚合酶对mRNA或DNA模板进行扩增或连接。这种方法如RT，PCR，或LCR扩增想要的核苷酸序列。(参见，U.S.Pat.Nos.4,683,195and 4,683,202)。限制性内切酶位点能够整合到引物中。扩增后的核苷酸链经纯化和连接形成一个表达盒。如要替换野生型的基因序列，可以通过体外突变技术和利用引物进行的PCR技术来构建想要的突变体。另一种获得核苷酸链序列的优选方法是，利用已知的限制性内切酶位点从质粒中酶切下核苷酸片段。目的基因也可以通过本领域公知基于已知基因序列的利用引物的方法来进行分离。[0041]适合本发明的启动子包括任何合适的光反应启动子，如，psbA II启动子和nirA启动子。在一些实施例中，启动子是细胞内自身psbA II i启动子，存在于野生型Synechocystis sp.PCC 6803细胞，介导编码光系统IL₀中的DI亚基的psbA II基因的转录。psbA II光反应启动子直接位于Synechocystis sp.PCC 6803中内源性psbA II基因的上游。在一些实施例中，启动子是nirA启动子，是一个166个碱基对的Synechococcus sp.strain PCC 7942启动序列，该启动子序列由Qi等人(2005)在可诱导表达载体Synechococcus sp.PCC 6803的发展中描述过。

[0042]某些实施例中所使用的启动子由SEQ ID NO：2所示的含有psbAII启动子的核苷酸序列组成。在某些实施例中，启动子由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成。在另外一些实施例中，启动子由SEQ ID NO：6所示的Synechococcus nirA启动子序列组成。在SEQ ID NO：6中，为了在起始密码子处制造NdeI限制性内切酶的识别位点并保持启动子/开放阅读框的完整性，将野生型nirA启动子3’端的TCC改成序列CAT。由此建立起一个诱导表达体系，向培养基中加入硝酸盐可诱导目的基因的表达。氢氧化铵可以作为诱导前培养的氮源(Qi等，2005)。在某些实施例中，采用包含SEQ ID NO：2所示序列的psbAII启动子的500个碱基对的上游同源区来构建重组表达载体。500碱基对的同源区借助载体经双同源重组整合到psbAII位点。

[0043]任何一种能够表达的pdc基因都可以用于本项发明。在某些实施例中，pdc基因是运动发酵单胞菌pdc基因。在某些实施例中，pdc基因是从运动发酵单胞菌质粒pLOI295中获得的。在某些实施例中，pdc基因是由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列构成的。在某些实施例中，pdc基因是编码SEQ ID NO：7所示蛋白质的核苷酸序列。在另外一些实施例中，pdc基因是编码帕尔马发酵杆菌(Zymobacter palmae)的pdc酶的核苷酸序列。完整的Zymobacter palmae的pdc蛋白质序列的NBCI编号是AF474145(SEQID NO：8)。在某些实施例中，pdc基因是编码如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列。此外还有包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisciae)在内的其它pdc和adh的来源。

[0044]任何一种能够表达的adh基因都可以用于本项发明。在某些实施例中，adh基因是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)adhII基因。在某些实施例中，adh基因是从运动发酵单胞菌adhII质粒pLOI295中获得的。在某些实施例中，adh基因是由SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列构成的。在某些实施例中，pdc基因是编码SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

[0045]将分离到的目的核苷酸序列，如由上述启动子序列驱动的pdc或adh基因，插入到一个“表达载体”，“克隆载体”或“载体”中，这些术语通常是指能够在宿主细胞中复制的质粒或其他核酸分子。表达载体可以自主复制或通过整合到宿主细胞基因组进行复制。

[0046]通常我们需要的载体是可以在多种宿主细胞中使用的载体，如可以在E.coli中克隆和构建，可以在Synechocystis中进行表达。其他的载体元件包括如筛选标记，例如卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因，用于检测和/或筛选转化了目的核苷酸链序列的细胞。

[0047]用来运载遗传信息进入细胞的具体的载体不受严格限制。任何一种能用于表达重组蛋白的载体都是适用的。在优选的实施例中，所用的载体最好能够整合到宿主细胞的基因组中。某些实施例中所使用的载体是Lagarde等于2000年构建的pSBAIIKS。典型的表达载体含有一个表达盒，它包含目的核苷酸链在宿主细胞中表达所需的所有元件。典型的表达盒包括与目的核苷酸链可操作地连接的启动子。启动子用于表达前述的pdc/adh，并与一个编码pdc/adh蛋白的序列可操作地连接。优选启动子距转录起始位点的距离与自然情况基本相同。但是，如本领域所知，一些在这种距离上的变化是能够调整的且不会丧失启动子的功能。

[0048]除pdc/adh基因外，为了优化乙醇产出率可以在表达载体上加入相应的基因以提高宿主细胞对达到生产要求浓度的乙醇的耐受力，例如基因omrA、lmrA、lmrCD可以被包含进表达载体中。红酒乳酸菌Oenococcus oeni的OmrA基因和它在Lactococcuslactis中的同源基因LmrA可以将tolC(-)E.Coli对乙醇的耐受力提高100到10,000倍(Bourdineaud等，2004)。所以将基因omrA、lmrA和其他同源基因加入到表达载体中有可能提高宿主细胞的耐受力。在某些实施例中，表达载体包含pdc/adh基因进一步包含omrA基因。在某些实施例中，表达载体包含pdc/adh基因进一步包含lmrA基因。在另外一些实施例中，表达载体包含pdc/adh基因进一步包含lmrCD基因。所有适合在宿主细胞里表达外源基因的启动子都可以用于启动这类提高宿主细胞耐受力的基因的表达，包括那些用于典型的表达盒的启动子。

[0049]构建并提纯表达载体后要将载体转化到宿主细胞中用于乙醇生产。将遗传物质引入到宿主细胞中用于表达某种蛋白的过程没有严格的限定。任何常用的将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法都可以使用。在一些实施例中，宿主细胞可以通过Williams(1988)所描述的方案转化和筛选。这种方法开拓了Synechocystis sp.PCC 6803蓝藻的自然转化能力，该转化通过简单的将纯化的质粒和处与指数生长期的细菌混合孵育就可以发生。

[0050]可用于上文所述的转化重组表达载体的宿主细胞包括各种适合乙醇生产的蓝藻，尤其是集胞藻的部分。适合用在本发明的宿主细胞，举例来说有野生型synechocystissp.PCC 6803和Howitt等(1999)所制造的缺乏一个功能的NDH2型脱氢酶的突变体(NDH-2(-))的.synechocystis 2型脱氢酶可特异性地将NADH转化为NAD+。乙醇通路的通量在该突变体中可能会增加。特定的优选方案中选择以synechocystis作为宿主细胞。转化构建有pdc/adh的宿主细胞是非常有用的可用于生产乙醇的重组蓝藻。优选的synechocystis亚种包括如synechocystis sp.PCC 6803。优选的菌株为synechocystissp.PCC 6803 NDH-2(-)突变体。

[0051]宿主细胞在转化了pdc/adh结构后在适合生产乙醇的条件下孵育。通常情况下，宿主细胞会在BG-II液体培养基中营光合自养，通气率为1升/分钟，pH值设定为8.5，pH值通过通CO2来控制，温度保持在30℃。各种用于蓝藻培养的培养基在本领域中都是公知的。在某些实施例中，synechocystis sp.PCC 6803在BG-11加或未加入(终浓度)5毫摩尔葡萄糖，5％的蔗糖，和/或5微克/毫升，25微克/毫升，或50微克/毫升卡那霉素的标准培养皿中培养。含synechocystis sp.PCC 6803的培养皿在30℃、光照强度为100微因/平方米秒条件下孵育。所有synechocystis液体培养体系均用BG-11培养基中培养，需要时加入50微克/毫升卡那霉素。

[0052]将pdc/adh表达载体转化入用于乙醇生产的宿主细胞并在如上文所述适当的培养条件下培养，其分泌乙醇的能力增强。分泌乙醇能力的增强可以用一种标准方法观测到，这种方法为本领域技术人员所熟知，我们在下面的例子中将做全面的说明。在某些实施例中，宿主细胞的在液体培养基中培养。在某些实施例中，宿主细胞的生长使用光生物反应器发酵。在某些实施例中，宿主细胞在

反应器中培养。某些实施例更换宿主细胞培养基以增加乙醇产量。更换培养基的次数可能不尽相同。经过约2至5天的发酵乙醇的浓度可达到约5mM至15mM左右。在更新培养基的条件下经过5天的发酵乙醇浓度水平可能达到约25mM至100mM。在某些实施例中，经过5天的发酵产出的乙醇浓度约为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8》5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，10.0，10.1，10.2，10.3，10.4，10.5，10.6，10.7，10.8，10.9，11.0，11.1，11.2，11.3，11.4，11.5，11.6，11.7，11.8，11.9，12.0，12.1，12.2，12.3，12.4，12.5，12.6，12.7，12.8，12.9，13.0，13.1，13.2，13.3，13.4，13.5，13.6，13.7，13.8，13.9，14.0，14.1，14.2，14.3，14.4，14.5，14.6，14.7，14.8，14.9或15.0mM。某些实施例中，在更新培养基的条件下经过5天的发酵产出的乙醇浓度约为25.0，25.1，25.2，25.3，25.4，25.5，25.6，25.7，25.8，25.9，26.0，26.1，26.2，26.3，26.5，26.6，26.7，26.8，26.9，27.0，27.1，27.2，27.3，27.5，27.6，27.7，27.8，27.9，28.2，28.2，28.3，28.5，28.6，28.7，28.8，28.9，29.0，29.1，29.2，29.3，29.5，29.6，29.7，29.8，29.9，30.0，30.1，30.2，30.3，30.4，30.5，30.6，30.7，30.8，30.9，31.0，31.1，31.2.31.3，31.4，31.5，31.6，31.7，31.8，31.9，32.0，32.1，32.2，32.3，32.4，32.5，32.6，32.7，32.8，32.9，33.0，33.1，33.2，33.3，33.4，33.5，33.6，33.7，33.8，33.9，34.0，34.1，34.2，34.3，34.4，34.5，34.6，34.7，34.8，34.9，35.0，35.1，35.2，35.3，35.4，35.5，35.6，35.7，35.8，35.9，36.0，36.1，36.2，36.3，36.5，36.6，36，7，36.8，36.9，37.0，37.1，37.2，37.3，37.5，37.6，37.7，37.8，37.9，38.2，38.2，38.3，38.5，38.6，38.7，38.8，38.9，39.0，39.1，39.2，39.3，39.5，39.6，39.7，39.8，39.9，4O.0，40.1，40.2，40.3，40.4，40.5，40.6，40.7，40.8，40.9，41.0，41.1，41.2.41.3，41.4，41.5，41.6，41.7，41.8，41.9，42.0，42.1，42.2，42.3，42.4，42.5，42.6，42.7，42.8，42.9，43.0，43.1，43.2，43.3，43.4，43.5，43.6，43.7，43.8，43.9，44.0，44.1，44.2，44.3，44.4，44.5，44.6，44.7，44.8，44.9，45.0，45.1，45.2，45.3，45.4，45.5，45.6，45.7，45.8，45.9，46.0，46.1，46.2，46.3，46.5，46.6，46.7，46.8，46.9，47.0，47.1，47.2，47.3，47.5，47.6，47.7，47.8，47.9，48.2，48.2，48.3，48.5，48.6，48.7，48.8，48.9，49.0，49.1，49.2，49.3，49.5，49.6，49.7，49.8，49.9或50.0mM。发酵时间可以从2天到30天不等。在某些实施例中，发酵时间约为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25天。

[0053]宿主细胞培养时的通气流量可以从0.1升/分钟到3.0升/分钟不等。在某些实施例中宿主细胞培养时的通气流量约为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或3.0升/分钟。优选通气流量为1升/分钟。用于宿主细胞培养的pH设定值允许的范围为7.0到9.5。在某些实施例中用于宿主细胞培养的PH设定值约为7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，或9.5。宿主细胞培养时的温度允许的范围为25℃到35℃。在某些实施例中用于宿主细胞培养的温度约为25.0，25.1，25.2，25.3，25.4，25.5，25.6，25.7，25.8，25.9，26.0，26.1，26.2，26.3，26.5，26.6，26.7，26.8，26.9，27.0，27.1，27.2，27.3，27.5，27.6，27.7，27.8，27.9，28.2，28.2，28.3，28.5，28.6，28.7，28.8，28.9，29.0，29.1，29.2，29.3，29.5，29.6，29.7，29.8，29.9，30.0，30.1，30.2，30.3，30.4，30.5，30.6，30.7，30.8，30.9，31.0，31.1，31.2.31.3，31.4，31.5，31.6，31.7，31.8，31.9，32.0，32.1，32.2，32.3，32.4，32.5，32.6，32.7，32.8，.32.9，33.0，33.1，33.2，33.3，33.4，33.5，33.6，33.7，33.8，33.9，34.0，34.1，34.2，34.3，34.4，34.5，34.6，34.7，34.8，34.9或35.0℃。

[0054]以下的实施例详细说明了本发明但不构成限制。

例一

构建用于转化的载体pMota

[0055]此例用于说明pMota载体的制备。

[0056]用PCR技术从pLOI295中扩增pdc/adhII表达盒，并同时在5′和3′端分别引入NdeI的BamHI酶切位点。通过Ndel/BamHI双重消化取代aphX/sacB筛选表达盒，然后上述位点允许pdc/adhll亚克隆到pPSBAIIKS质粒骨架中从而得到pMota。以下用于上述PCR反应的引物被(横线标注的是限制性内切酶的识别序列，粗体标注的是引入的突变)：上游引物：5′-ggAgTAAgCATATgAgTTATACTg-3′(SEQ ID NO：10)，下游引物：5′-ggATCTCgACTCTAgAggATCC-3′(SEQ ID NO：11)。PCR的反应条件如下：总反应体系50μl，模板为0.36μg的pLOI295，4单位的

聚合酶，各引物的终浓度为0.5μM，各dNTP终浓度为300μM。在

上运行如下反应程序进行扩增：94℃预变性2分钟，接下来是35个循环的94℃变性10秒，47℃退火1分钟，68℃延伸3.7分钟；最后维持在4℃。

[0057]所有质粒/PCR产物纯化试剂盒和Taq DNA聚合酶均购自所有限制性内切酶，聚合酶和T4 DNA连接，均购自New

质粒pSBAIIKS由亚利桑那州立大学的Wim F.J.Vermaas惠赠。载有Z.mobilis pdc和adhll基因的质粒LOI295，由佛罗里达大学的lonnieO.Ingram惠赠。

例二

转化和筛选以获得用于乙醇生产的稳定表达细胞株

[0058]此例用于说明如何构建用于乙醇生产的稳定表达的蓝藻细胞株

[0059]在构建好pMota(见例一)后，按照Williams(1988)所述的方法先后用pPSBAIIKS和pMota转化和筛选了野生型和NDH-2(-)突变株的synechocystis sp.PCC 6803。在通过pPSBAIIKS转化后，serial replating递增卡那霉素浓度可以将含有aphX/sacB筛选标记的野生型和NDH-2(-)突变株细胞株完全分离出来，可以通过PCR进行验证。接下来用含有50微克/毫升卡那霉素的液体培养基进行培养，随后转化pMota。

[0060]转化后的细胞在含5％蔗糖的BG-11培养皿中进行筛选。筛选的的过程包括串行地划线、挑单克隆，加上初步的基于PCR的对psbAII位点的检测和最后用种子反应器法对在生产乙醇过程中缺乏筛选压力的情况下细胞性能稳定性的检测。PCR检测包括对每样本进行三个聚合酶链反应，检测(1)野生型psbAII基因，(2)aphX/sac筛选表达盒，及(3)pdc/adh乙醇通路基因盒的存在。3个反应共用一种上游引物，其匹配序列在psbAII基因位点以外，而每一个反应的下游引物则分别是以上三个可能的遗传结构的特异性的引物。3个反应共用的上游引物：5′-gTCAgTTCCAATCTgAACATCGA-3′(SEQ ID NO：12)，从psbAII起始密码子上游48bp开始扩增。用于检测野生型psbAII基因的下游引物：5′-AATTTgTAACCgTAgTTCTgggAT-3′(SEQ ID NO：13)，扩增产物为749bp.。用于检测aphX/sacB筛选表达盒的下游引物：5′-TTggTgATTTTgAACTTTTgCTTgC-3′(SEQ ID NO：14)，扩增产物为3.1kb。用于检测pdc/adhII表达盒的下游引物5′-TTgCAAgCgATTTCgAgATAAA-3′(SEQ IDNO：15)，扩增产物为554bp。所有的PCR反应均按照

Taq聚合酶手册中长PCR产物章节进行操作，但没有选用操作手册中推荐的高保真聚合酶。PCR反应程序如下：940C预变性3分钟，接下来是35个循环的94℃变性10秒，48℃退火1分钟，68℃延伸3.5分钟；最后68℃延伸3分钟，接着维持在4℃。

[0061]对某一给定的蓝藻样本进行PCR检测时，用牌

卡快速制备基因组DNA作为上述PCR反应模板。检测液体培养物时，点5微升培养物到

卡上。检测在固体培养皿上划线培养的培养物时，挑出多个克隆将其划到1.5毫升试管内壁上加入10微升BG-11培养基涡流重悬，如上所述取5微升点到

卡上。按照使用

卡从细菌中提取DNA的操作规程制备PCR检测所用模板。

[0062]基于初级种子反应器的检测用来对筛选出的携带乙醇通路元件用于稳定的乙醇生产的克隆进行进一步筛选。从同一个完成了筛选的培养皿中挑出多个克隆接种到种子反应器。细胞培养至OD₇₃₀大于0.1，在室温条件下3220xg离心6分钟，重悬到一个新的种子反应器使其初始OD₇₃₀等于0.025。如此构成了一系列5个中的第一个实验反应器。反应器运行5天后再次离心收集细胞，并用来接种系列中的第二实验反应器得到上述初始的OD730等于0.025。当然，只有一部分细胞培养物用于此串行接种，而其余的被丢弃或用甘油保存。每一天要监测并记录OD₇₃₀，并取出550微升用于乙醇浓度测定(所谓′前′取样)。检测后细胞经离心收集(如上)，弃上清，整个沉淀用25毫升的新鲜BG-11培养基涡旋重悬并重新注入种子反应堆。再次记录OD₇₃₀并再次取样进行乙醇浓度测定(所谓′后′取样)。当筛选到可用于稳定的乙醇生产的细胞株后，再用基于PCR的检测进行最后的确认。

[0063]野生型(WT)Synechocystis sp.strain PCC 6803和缺乏功能性II型NADH氧化脱氢酶的NDH-2(-)突变株由亚利桑那州立大学的Wim F.J.Vermaas惠赠。C600 E.大肠杆菌由夏威夷大学马诺阿分校Monto Kumagai的实验室提供。

[0064]E.大肠杆菌用标准LB液态或固态培养基培养。加入到LB培养皿中的氨苄青霉素和卡那霉素的浓度分别为100微克/毫升和为50微克/毫升。

[0065]所有synechocystis sp.PCC 6803均在加入或不加入(终浓度)5毫摩尔葡萄糖，5％的蔗糖，和/或5微克/毫升，25微克/毫升，或50微克/毫升任一浓度的卡那霉素的标准BG-11培养皿中培养。含synechocystis sp.PCC 6803的培养皿在30℃、光照强度100微因/平方米秒条件下孵育。所有synechocystis液体培养体系均用BG-11培养基中培养，需要时加入50微克/毫升卡那霉素。

例三

分批培养实验

[0066]此例用于说明如何用分批培养实验检测生产率和稳定性。

[0067]建立一个平行的分批培养系统(6个100ml生物反应器)用于培养已构建的生产乙醇的synechocystis菌株。所有的实验均使用BG-11液体培养基。转速设定在400rpm。光照强度设定为200微因/平方米秒照射生物反应器最重要的一面。通过喷射压缩空气以提供CO₂和排出synechocystis所产生的氧。半分批的运作模式用于测试乙醇的产出。细胞总生长期为20天。种子培养物从培养皿开始。在OD₇₃₀等于0.025时，将种子培养物培养得到的处于指数增长期的细胞接种到反应器。分批培养约4天后终止。离心沉淀细胞，用较少量的培养基重悬，取部分接种到含新鲜培养基的生物反应器中。

例四

测定乙醇浓度

[0068]此例用于说明如何测定液态培养物中的乙醇浓度。

[0069]要测定液态培养物中的乙醇浓度，检测前从培养物取550微升样品，12100xg离心5分钟，将500微升(或适当体积)的上清置于一个新的1.5毫升试管中于-20℃存放。鉴于分光光度计的线性范围和乙醇测定的灵敏度，有时需要将样品稀释(多达20倍)。稀释样品时，首先将适量体积的BG-11加入到新的1.5毫升管中，然后加入所需量的上清。该溶液直接用于乙醇含量的测定。样品从-20℃取出后，要进行测定前，需立即再次将样品12100xg离心5分钟，这一步骤可加速样本解冻。

[0070]用Boehringer Mannheim/r-

酶促乙醇检测试剂盒对乙醇浓度进行测定。简单来说，这个方法利用的反应是在乙醇存在的条件下乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶在磷酸盐缓冲液中将NAD⁺转换为NADH。NADH的浓度由测量在340nm波长下的吸光度(A₃₄₀)来测定，由此可以确定乙醇的浓度。按照说明书进行测定操作，并作以下调整：根据说明书第4点，用最大样本量(体积＝0.5毫升)进行测定以得到最高的灵敏度。实际用于测定的所有样本的量(包括上述的体积等于0.5毫升)都可以降为四分之一。这样做可以节约试剂，并可以保留大部分样本以备重复。因此，实际上使用的样本量为0.125毫升，样品与0.75毫升的反应混合物2混合，随后加入12.5微升的(ADH)悬浮溶液3。按照这个保守的比率，体积减少不会影响检测效率BG-11用作空白对照。

例5

光合自养生物反应器的发酵技术

[0071]这例阐述了光合自养生物反应器的发酵技术用于乙醇的生产。

[0072]液体的种子培养液在24℃的孵育摇床(Innova 4230台式，New Brunswick)中培养，伴随最大表面流量光照，强度大约为200微因每平方米每秒，通过磁力搅拌并以大约0.5L每分钟的流速持续喷入压缩空气。初级的种子培养液有25ml体积，放置在标准的100mlPyrex^TM培养瓶中，培养瓶与2支巴斯德吸管相通，作为气体喷入输出的管道.在喷入气体的吸管的上游接有一个0.1μm的

PFTE滤器，输出气体的吸管盖上了一个松散的铝箔。次级的种子培养液有300ml体积，放置在标准的1LPyrex^TM培养瓶中，喷入气体的吸管被替换成了C级孔隙度的喷洒器，孔径在25～50μm，从Ace Glass Inc.引进。光照来自于40W的冷光白炽灯。液体培养基中的细胞生长状况的监测通过Thermo

10-S分光光度计测定730nm波长下的光密度值(OD₇₃₀)完成。比色杯使用

的一次性1.5ml比色杯。

[0073]从初级种子发生器而来的指数式生长的种子培养液用来接种次级种子发生器，它们在随后的时间里长到OD₇₃₀值大于0.31并立即接种光合自养生物发生器。对于接种，OD₇₃₀值被用来决定用于初始生物发生器的种子培养液的体积，使其初始的OD₇₃₀值在0.02(总发酵体积是3.1L)。由确定体积的种子培养液中得来的细胞是通过离心并在50mlBG-11中漩涡重悬得到的。这50种子接种到生物反应器后，用额外的50mlBG-11冲洗接种管。

[0074]用一套7.5L的

110生物发生器系统(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)来完成这些实验。这套系统包括了控制温度、pH值、溶解的氧气浓度(DO)的调节装置。集胞藻的培养过程可以通过一套安装有PCI-MIO-16E-10(National InstrumentsCorp，.Austin，TX)的控制面板的

(233MHz，Windows98)电脑监测和控制。获取数据的程序通过LabVIEW7.1(National Instruments Corp.，Austin，，TX)写入。包括pH值、搅拌强度、温度、溶解的氧气浓度在内的110生物发生器系统运行中产生的数据可以通过电脑控制面板获取。六个General

26W的F26DBX/SPX41/4P灯泡排列在发生器的周围以提供强度大约为1000微因每平方米每秒的最大表面流量光照。在整个发酵过程中，生物反应器通过在照明系统周围提供一个循环的风扇，使温度维持在27-29℃之间。反应器以1L每分钟流速喷洒空气，pH值通过注射CO₂控制在8.5的固定值，搅拌棒转速控制在300rpm。出气口的冷凝器通过热循环水浴箱(C10-K20，Haake，Berlin，Germany)冷凝到8℃。发酵过程维持8天，每八小时抽样一次。抽样时，先从反应器样品出口(清洁样品收获管)倒出约15ml样品，弃掉后去再次收集的15ml样品。对于每个样品，记录其OD730值，并取等分做乙醇浓度检测。乙醇浓度在发酵112小时后变为12mM(图2)。发酵5天后，乙醇浓度达到13mM(图2)。

[0075]在此描述的方法、过程和仪器出现在典型的优选实施例中，具有可效仿性但并不对本发明的范围起限制作用。本领域的技术人员可以通过本发明公开的范围在本发明的主题内做出改变或其他应用。表示成分数量、反应条件以及所有用于说明书以及权利要求的数字，应当理解为在实施例中使用“大约”一词来修订。因此，除非出现矛盾的结果，详细说明书和权利要求中提出的数值参数是近视值，这些值非常依赖于通过本发明获得的所需的性质。在最低限度，不能限制权利要求等同方式的应用，每一个有效数字应当包括能够直接获得的数字和估读的数字。

[0076]显然，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明公开的范围和主旨的前提下，可以本发明进行多样的替换和修改。

[0077]本领域技术人员认为：所提到的本发明的各方面以及实施例可以被单独实现或相结合来实现。因此，单独实施例的组合也包含在这里所述的本发明公开的范畴之内。

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[0092]在这里，所有专利和出版物将被整个应用而作为本发明的一部分，正如每一个单独的出版物被特定并个别地引用。

[0093]在任一不需要在此特别公开的元素和限定存在下，本发明在此举例描述的内容是可以实现的。所运用的术语和表述可以用来描述而非限制的，而且这里也没有意图使用这些术语和表述来排除所描述的技术特征或其部分的等同方式。能够被认同的是，在本发明公开的范围内做出不同的改变是可能的。因此，尽管本发明是通过优选的实施例和可选择的特征来特定公开的，本领域技术人员可根据这里公开的概念做出修改和变化，这些修改和变化被认为是在本发明公开定义的范畴之内。

<110>夏威夷大学

<120>利用蓝藻生产乙醇的方法和组合物

<130>PLH08480

<140>PCT/US2007/001071

<141>2007-01-16

<150>60/758,683

<151>2006-01-13

<160>15

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>7286

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组表达载体pMota

<400>1

<210>2

<211>502

<212>DNA

<213>集胞藻

<400>2

<210>3

<211>1707

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌

<400>3

<210>4

<211>1152

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌

<400>4

<210>5

<211>606

<212>DNA

<213>聚球藻

<400>5

<210>6

<211>166

<212>DNA

<213>聚球藻

<400>6

<210>7

<211>568

<212>PRT

<213>运动发酵单胞菌

<400>7

<210>8

<211>556

<212>PRT

<213>帕尔马发酵杆菌(Zymobacter palmae)

<400>8

<210>9

<211>383

<212>PRT

<213>运动发酵单胞菌

<400>9

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>10

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>11

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>12

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>13

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>14

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人造寡核苷酸探针

<400>15

Claims

1、一个核酸结构，包括一个光敏感启动子，一段编码丙酮酸脱羧酶(pdc)的序列，一段编码乙醇脱氢酶(adh)的序列。

2、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的光反应启动子为psbA II启动子。

3、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码adh酶和pdc酶的序列来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的质粒pLOI295。

4、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码pdc酶的序列来源于帕尔马发酵杆菌(Zymobacter palmae)。

5、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码pdc酶的序列来源于帕尔马发酵杆菌(Zymobacter palmae)并且编码adh酶的序列来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。

6、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码adh酶的序列来源于运动发酵单胞菌的质粒pLOI295。

7、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码pdc酶的序列包含SEQ.IDNO.3，或者是编码pdc酶并且能在蓝藻中表达的基因序列。

8、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码adh酶的序列包含SEQ.IDNO.4，或者是编码adh酶并且能在蓝藻中表达的基因序列。

9、如权利要求1所述的核酸结构，其特征在于所述的编码pdc酶的序列包含一个编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

10、一种表达载体，包含权利要求1所述的核酸结构。

11、一种宿主细胞，包含权利要求10所述的表达载体。

12、如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于所述的表达载体是整合在宿主细胞染色体上的。

13、如权利要求11所述的的宿主细胞，其特征在于所述的表达载体为pMota。

14、如权利要求11所述的的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为蓝藻。

15、如权利要求14所述的的宿主细胞，其特征在于所述的蓝藻为集胞藻(Synechocystis)。

16、如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于所述的蓝藻为集胞藻sp.PCC 6803，或者是集胞藻其他变化的细胞系。

17、如权利要求16所述的宿主细胞，其特征在于所述的蓝藻为野生型，或者是集胞藻sp.PCC 6803的NDH-2(-)突变细胞系。

18、如权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于所述的蓝藻为聚球藻(Synechococcus)PCC 7942，或者是聚球藻其他变化的细胞系。

19、如权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞光照一定时间后产生相当数量的乙醇。

20、如权利要求19所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞能够经5天发酵后回收高于10mM数量的乙醇。

21、如权利要求19所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞能够经5天发酵后回收大约13mM数量的乙醇。

22、一种经基因改造的蓝藻，包括一包含编码丙酮酸脱羧酶(pdc)和乙醇脱氢酶(adh)的核酸序列的结构，所述的蓝藻能够经5天发酵后回收高于10mM数量的乙醇。

23、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码pdc酶和adh酶的核酸序列来源于运动发酵单胞菌质粒pLOI295。

24、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码pdc酶的核酸序列来源于Zymobacter palmae。

25、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码pdc酶的核酸序列来源于Zymobacter palmae，编码adh酶的核酸序列来源于Zymomonas mobilis。

26、如权利要求25所述的蓝藻，其特征在于所述的编码adh酶的核酸序列来源于运动发酵单胞菌质粒pLOI295。

27、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的蓝藻是集胞藻。

28、如权利要求27所述的蓝藻，其特征在于所述的蓝藻是集胞藻sp.PCC 6803，或者是集胞藻其他变化的细胞系。

29、如权利要求28所述的蓝藻，其特征在于所述的蓝藻sp.PCC 6803是为野生型，或者是集胞藻sp.PCC 6803的NDH-2(-)突变细胞系。

30、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码pdc酶的核酸序列包含SEQ.IDNO.3，或者是编码pdc酶并且能在蓝藻中表达的基因序列。

31、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码pdc酶的核酸序列包含SEQ.ID NO：8。

32、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的编码adh酶的核酸序列包含SEQ.IDNO：4。

33、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的结构包括一个光诱导基因。

34、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的结构包括一个psbAII启动子。

35、如权利要求22所述的蓝藻，其特征在于所述的结构为pMota。

36、一种生产乙醇的方法，包括：在培养基中培养的蓝藻；该蓝藻包含有一编码pdc和adh酶来源于Zymomonas mobilis pL0I295质粒的DNA片段的结构；而且在培养基中经5天发酵后乙醇的累计量大于10mM。

37、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的蓝藻能够经5天发酵后回收大约13mM数量的乙醇。

38、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的培养基中的乙醇浓度在5天的培养后至少有约5mM。

39、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的培养基中的乙醇浓度在5天的培养后至少有约13mM。

40、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的蓝藻为集胞藻，结构为pMota。

41、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的结构还包括光敏感基因的DNA片段。

42、如权利要求36所述的方法，其特征在于所述的结构是被整合到蓝藻染色体上的。