JP5306823B2 - エタノールを生産するシアノバクテリアに関する方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本願は、2006年1月13日に出願された米国仮出願第60/758,683号(その開示内容全体が参照により援用される)の利益を主張する。
シアノバクテリアによって高レベルのエタノールを生産するための核酸配列、ベクター、宿主細胞、及び方法は、本発明の好ましい実施形態により開示される。
成される。シアノバクテリア発酵は処理が困難な硬いセルロース及びヘミセルロースを全く含まない。結果として、シアノバクテリアのエタノール生産工場からは有害大気汚染物質及び揮発性有機化合物が全く排出されない。
別段に規定しない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者(当業者)によって共通に理解される意味を有する。本明細書において、別段の定めがない限り、以下の用語はそれらに基づく意味を有する。
して、例えば、「組換えタンパク質」を生産する。組換えポリヌクレオチドは非コード機能(例えば、プロモータ、複製起点、リボソーム結合部位等)も果たし得る。
範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られるように求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲の均等物である原理の適用が制限されないように、各数値パラメータは、有効桁及び通常の四捨五入手法の数字を考慮して解釈されるべきである。
エタノール生産の最適化のための核酸及び組換え発現ベクターを、本発明の幾つかの実施形態により開示する。図1は、多様な方法又は手順を実施するのに使用され得る、下記実施例1においてより完全に説明される、システムの1つの実施形態を示す図である。エタノール生産の最適化のためのpMota組換え発現ベクターの配列を配列番号1に示す。pMotaベクターは、500塩基対の相同的な上流領域核酸配列におけるSynechocystisのpsbAIIプロモータに関する配列(配列番号2)、PLOI295由来のZymomonas mobilisのpdcをコードする核酸配列(配列番号3)、及びPLOI295由来のZymomonas mobilisのadhIIをコードする核酸配列(配列番号4)を含有する。PLOI295(図1b)からpPSBAIIKSプラスミド(図1a)へpdc/adhカセットをサブクローニングすることによってpMotaベクターを作製した。pMotaベクターは、シアノバクテリアのゲノムにおけるpsbAII光応答性プロモータの制御下、これらの遺伝子を組み込むのに使用され得る。
、プロモータは、野生型Synechocystis sp. PCC 6803細胞において、光システムIIのDIサブユニットをコードするpsbAII遺伝子の転写を媒介するin situの天然psbAIIプロモータである。psbAII光応答性プロモータは、Synechocystis sp. PCC 6803において、内因性psbAII遺伝子のすぐ上流に位置している。幾つかの実施形態において、プロモータはnirAプロモータであり、これは、Synechocystis sp. PCC 6803に対する誘導可能な発現ベクターを開発中のQi他(2005)によって記載された166塩基対のSynechococcus sp.株PCC 7942のプロモータ配列である。
しい実施形態において、宿主細胞はSynechocystisである。pdc/adh構築物で形質転換される宿主細胞はエタノール生産のための有用な組換えシアノバクテリアである。好ましいSynechocystisの亜種としては、例えば、Synechocystis PCC 6803が挙げられる。好ましい株はSynechocystis sp. PCC 6803 NDH−2(−)変異体である。
26.3mM、26.5mM、26.6mM、26.7mM、26.8mM、26.9mM、27.0mM、27.1mM、27.2mM、27.3mM、27.5mM、27.6mM、27.7mM、27.8mM、27.9mM、28.2mM、28.2mM、28.3mM、28.5mM、28.6mM、28.7mM、28.8mM、28.9mM、29.0mM、29.1mM、29.2mM、29.3mM、29.5mM、29.6mM、29.7mM、29.8mM、29.9mM、30.0mM、30.1mM、30.2mM、30.3mM、30.4mM、30.5mM、30.6mM、30.7mM、30.8mM、30.9mM、31.0mM、31.1mM、31.2.31.3mM、31.4mM、31.5mM、31.6mM、31.7mM、31.8mM、31.9mM、32.0mM、32.1mM、32.2mM、32.3mM、32.4mM、32.5mM、32.6mM、32.7mM、32.8mM、32.9mM、33.0mM、33.1mM、33.2mM、33.3mM、33.4mM、33.5mM、33.6mM、33.7mM、33.8mM、33.9mM、34.0mM、34.1mM、34.2mM、34.3mM、34.4mM、34.5mM、34.6mM、34.7mM、34.8mM、34.9mM、35.0mM、35.1mM、35.2mM、35.3mM、35.4mM、35.5mM、35.6mM、35.7mM、35.8mM、35.9mM、36.0mM、36.1mM、36.2mM、36.3mM、36.5mM、36.6mM、36.7mM、36.8mM、36.9mM、37.0mM、37.1mM、37.2mM、37.3mM、37.5mM、37.6mM、37.7mM、37.8mM、37.9mM、38.2mM、38.2mM、38.3mM、38.5mM、38.6mM、38.7mM、38.8mM、38.9mM、39.0mM、39.1mM、39.2mM、39.3mM、39.5mM、39.6mM、39.7mM、39.8mM、39.9mM、40.0mM、40.1mM、40.2mM、40.3mM、40.4mM、40.5mM、40.6mM、40.7mM、40.8mM、40.9mM、41.0mM、41.1mM、41.2mM、41.3mM、41.4mM、41.5mM、41.6mM、41.7mM、41.8mM、41.9mM、42.0mM、42.1mM、42.2mM、42.3mM、42.4mM、42.5mM、42.6mM、42.7mM、42.8mM、42.9mM、43.0mM、43.1mM、43.2mM、43.3mM、43.4mM、43.5mM、43.6mM、43.7mM、43.8mM、43.9mM、44.0mM、44.1mM、44.2mM、44.3mM、44.4mM、44.5mM、44.6mM、44.7mM、44.8mM、44.9mM、45.0mM、45.1mM、45.2mM、45.3mM、45.4mM、45.5mM、45.6mM、45.7mM、45.8mM、45.9mM、46.0mM、46.1mM、46.2mM、46.3mM、46.5mM、46.6mM、46.7mM、46.8mM、46.9mM、47.0mM、47.1mM、47.2mM、47.3mM、47.5mM、47.6mM、47.7mM、47.8mM、47.9mM、48.2mM、48.2mM、48.3mM、48.5mM、48.6mM、48.7mM、48.8mM、48.9mM、49.0mM、49.1mM、49.2mM、49.3mM、49.5mM、49.6mM、49.7mM、49.8mM、49.9mM又は50.0mMである。発酵期間は、約2日間の発酵から約30日間の発酵まで変化し得る。幾つかの実施形態において、発酵期間は、約2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日又は25日である。
2.5L/分、2.6L/分、2.7L/分、2.8L/分、2.9L/分又は3.0L/分である。空気スパージ速度は好ましくは、1L/分である。宿主細胞増殖に対するpH設定値は、7.0〜9.5であり得る。幾つかの実施形態において、pH設定値は、約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、又は9.5である。宿主細胞増殖の間の温度は、約25℃〜35℃であり得る。幾つかの実施形態において、温度は、約25.0℃、25.1℃、25.2℃、25.3℃、25.4℃、25.5℃、25.6℃、25.7℃、25.8℃、25.9℃、26.0℃、26.1℃、26.2℃、26.3℃、26.5℃、26.6℃、26.7℃、26.8℃、26.9℃、27.0℃、27.1℃、27.2℃、27.3℃、27.5℃、27.6℃、27.7℃、27.8℃、27.9℃、28.2℃、28.2℃、28.3℃、28.5℃、28.6℃、28.7℃、28.8℃、28.9℃、29.0℃、29.1℃、29.2℃、29.3℃、29.5℃、29.6℃、29.7℃、29.8℃、29.9℃、30.0℃、30.1℃、30.2℃、30.3℃、30.4℃、30.5℃、30.6℃、30.7℃、30.8℃、30.9℃、31.0℃、31.1℃、31.2℃、31.3℃、31.4℃、31.5℃、31.6℃、31.7℃、31.8℃、31.9℃、32.0℃、32.1℃、32.2℃、32.3℃、32.4℃、32.5℃、32.6℃、32.7℃、32.8℃、32.9℃、33.0℃、33.1℃、33.2℃、33.3℃、33.4℃、33.5℃、33.6℃、33.7℃、33.8℃、33.9℃、34.0℃、34.1℃、34.2℃、34.3℃、34.4℃、34.5℃、34.6℃、34.7℃、34.8℃、34.9℃又は35.0℃である。
形質転換ベクターpMotaの作製
本実施例により、形質転換ベクターpMotaの調製について説明する。
5はフロリダ大学のLonnie O. Ingramから入手した。
安定なエタノール生産のための形質転換及びスクリーニング
本実施例により、エタノール生産のための安定なシアノバクテリア株の構築について説明する。
製に従った。
回分増殖実験
本実施例により、生産性及び安定性を検討するための回分増殖実験について説明する。
エタノール濃度アッセイ
本実施例により、液体培養物中のエタノール濃度の決定について説明する。
独立栄養性フォトバイオリアクタ発酵
本実施例により、独立栄養性フォトバイオリアクタ発酵を使用するエタノールの生産について説明する。
その後OD73O>0.31まで増殖させ、独立栄養性フォトバイオリアクタの接種にすぐに使用した。接種では、OD730を計測し、初期のバイオリアクタOD73O=0.02に必要な種培養容量の決定に使用した(合計発酵容量は3.1Lであった)。この決定された容量の種培養由来の細胞を遠心によって回収し、新たなBG−11 50ml中でボルテクスによって再懸濁した。バイオリアクタにこの種50mlを接種した後、さらなる50mlのBG−11を接種チューブの洗い流しに使用した。
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タノール合成(Ethanol Synthesis by Genetic Engineering in Cyanobacteria)」 Applied and Environmental Microbiology 65(2):523-428。
Use in Hawaii)」。ハワイ州産業経済開発観光局エネルギー、資源、及び技術部門向けに作製された。
iron. Microbiol. 71(10): 5678-5684。
6803における2型NADHデヒドロゲナーゼは呼吸よりもむしろ調節に関与する(Type 2 NADH Dehydrogenases in the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 Are Involved in Regulation Rather Than Respiration)」 Journal of Bacteriology 181(13):3994-4003。
Claims (33)
- 発現ベクターを含むSynechocystisであって、
前記発現ベクターは光応答性プロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)酵素をコードする配列、及びアルコールデヒドロゲナーゼ(adh)酵素をコードする配列を含む核酸構築物を含み、前記光応答性プロモーターがpsbAIIプロモーターであることを特徴とするSynechocystis。 - pdc酵素及びadh酵素をコードする配列がZymomonas mobilisのプラスミドpLOI295から得られる、請求項1に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする配列がZymobacter palmaeから得られる、請求項1に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする配列がZymobacter palmaeから得られ、adh酵素をコードする配列がZymomonas mobilisから得られる、請求項1に記載のSynechocystis。
- adh酵素をコードする配列がZymomonas mobilisのプラスミドpLOI295から得られる、請求項1に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする配列が配列番号3、又はpdcをコードし、シアノバクテリアにおいて発現可能な遺伝子配列を含む、請求項1に記載のSynechocystis。
- adh酵素をコードする配列が配列番号4、又はadhをコードし、シアノバクテリアにおいて発現可能な遺伝子配列を含む、請求項1に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする配列が配列番号8で示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載のSynechocystis。
- 前記発現ベクターが染色体に組み込まれた、請求項1〜8のいずれかに記載のSyne
chocystis。 - 前記発現ベクターがpMotaである、請求項1〜9のいずれかに記載のSynechocystis。
- Synechocystis sp. PCC 6803又は他の形質転換可能なSynechocystisの株である、請求項1〜10のいずれかに記載のSynechocystis。
- Synechocystis sp. PCC 6803の野生型又はNDH−2(−)変異株である、請求項11に記載のSynechocystis。
- Synechococcus PCC 7942又は他の形質転換可能なSynechococcusの株である、請求項1〜10のいずれかに記載のSynechocystis。
- エタノールを生産することが可能であり、エタノールが露光期間後、比較的定量化可能な量で生産される、請求項1〜13のいずれかに記載のSynechocystis。
- 5日間の発酵後に10mMよりも多い回収可能な量でエタノールを生産可能である、請求項14に記載のSynechocystis。
- 5日間の発酵後に13mMよりも多い回収可能な量でエタノールを生産可能である、請求項14に記載のSynechocystis。
- ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)酵素をコードする核酸配列及び光応答性プロモーターを含む構築物を含む遺伝子操作されたSynechocystisであって、前記光応答性プロモーターがpsbAIIプロモーターであり、5日間の発酵後に10mMよりも多い回収可能な量でエタノールを生産可能である、遺伝子操作されたSynechocystis。
- pdc酵素及びadh酵素をコードする核酸配列がZymomonas mobilisのプラスミドpLOI295から得られる、請求項17に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする核酸配列がZymobacter palmaeから得られる、請求項17に記載のSynechocystis。
- pdc酵素をコードする核酸配列がZymobacter palmaeから得られ、adh酵素をコードする核酸配列がZymomonas mobilisから得られる、請求項17に記載のSynechocystis。
- adh酵素をコードする核酸配列がZymomonas mobilisのプラスミドpLOI295から得られる、請求項20に記載のSynechocystis。
- Synechocystis sp. PCC 6803又は他の形質転換可能なSynechocystisの株である、請求項17〜21のいずれかに記載のSynechocystis。
- 前記Synechocystis sp. PCC 6803が野生型又はNDH−2
(−)変異Synechocystis sp. PCC 6803株である、請求項22に記載のSynechocystis。 - 前記pdc酵素をコードする核酸配列が配列番号3、又はpdcをコードし、シアノバクテリアにおいて発現可能な遺伝子配列を含む、請求項17に記載のSynechocystis。
- 前記核酸配列が配列番号8を含むpdc酵素をコードする配列である、請求項17に記載のSynechocystis。
- 前記adh酵素をコードする核酸配列が配列番号4を含む、請求項17に記載のSynechocystis。
- 前記構築物がpMotaである、請求項17〜26のいずれかに記載のSynechocystis。
- エタノールを生産する方法であって、Zymomonas mobilisのpL0I295プラスミドから得られるpdc酵素及びadh酵素をコードするDNA断片ならびに光応答性プロモーターを含む構築物を含有するSynechocystisを培養培地中で培養すること、並びに5日間の発酵後に10mMよりも多い量で培養培地中にエタノールを蓄積することを含み、前記光応答性プロモーターがpsbAIIプロモーターである方法。
- 前記Synechocystisが5日間の発酵後に13mMの回収可能な量でエタノールを生産可能である、請求項28に記載の方法。
- 前記培養培地の前記エタノール濃度が5日間の培養後に少なくとも5mMである、請求項28に記載の方法。
- 前記培養培地の前記エタノール濃度が5日間の培養後に少なくとも13mMである、請求項28に記載の方法。
- 前記構築物がpMotaである、請求項28〜31のいずれかに記載の方法。
- 前記構築物が前記Synechocystisの染色体に組み込まれた、請求項28〜32のいずれかに記載の方法。
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