CN103361274A

CN103361274A - 生产乙醇的基因工程微生物

Info

Publication number: CN103361274A
Application number: CN2012100975820A
Authority: CN
Inventors: 范文俊; 郑晓光
Original assignee: ZHEJIANG QICHENG CARBON ENERGY CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG QICHENG CARBON ENERGY CO Ltd
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶。本发明还提供了制备所述基因工程蓝藻的构建体、载体和制备方法，以及使用所述基因工程蓝藻生产乙醇的方法。

Description

生产乙醇的基因工程微生物

技术领域

本发明涉及可再生能源和生物技术领域。具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。

背景技术

进入21世纪以来，原油价格居高不下，太阳能、风能、潮汐能等开发利用成本居高不下，而各国对环境保护的要求在不断的提高，因此，如何开发替代能源的问题受到各国普遍关注。许多国家将加快发展可再生能源作为发展替代能源的重要战略，生物能源是其中发展最快的领域。

目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。

近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。

因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。

对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。

发明名称为“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的中国专利200480019052.8公开了用外源木糖异构酶基因转化酵母细胞。额外的基因修饰增强了所转化的细胞将木糖发酵成乙醇或者其产物的能力。那些修饰包括缺失非特异或特异的醛糖还原酶基因、缺失木糖醇脱氢酶基因和/或超表达木酮糖激酶。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。

发明名称为“大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用”的中国专利200710177003.2公开了一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。经多代的定向筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株，并在所述突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，得到了一种新型耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。该工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。

蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻的细胞质中都有内膜系统。蓝藻的细胞质中具原始的片层结构，片层上分布有光合色素叶绿素和藻胆素(包括藻蓝素和藻红素两种)及类胡萝卜素。蓝藻的叶绿素可以进行光合作用，并且其细胞可以提供光合作用所需的能量，所以蓝藻可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。

但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。

本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等)中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化，乙醛到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase 2，ADHB)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因pdc，因而不具有利用阳光和二氧化碳产生乙醇的能力。

本发明提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造，从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。

发明内容

本发明以蓝藻为宿主，将丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。由于宿主蓝藻没有丙酮酸脱羧酶基因，因此所述丙酮酸脱羧酶基因是外源的乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因。

在本发明的一个方面，提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到蓝藻染色体的整合位点上的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因是串联结构，该串联结构上的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因顺次连接，整合在蓝藻基因组的指定整合位点。串联结构是指两个基因顺次连接。但本领域的技术人员能够理解在两个基因之间(前一基因的终止密码子和后一个基因的起始密码子之间)可以存在一个或数个核苷酸，这些核苷酸可以是无义和/或不对第二个基因表达产生负面影响的序列，也可以是有助蛋白表达的序列例如启动子等。

在本发明的一个方面，其中所述串联结构中含有一个与串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子。在本发明的一个方面，所述串联结构为顺次连接的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，启动子与丙酮酸脱羧酶基因可操作地连接。在本发明另一个方面，所述串联结构为顺次连接的乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因，启动子与乙醇脱氢酶基因可操作地连接。

在本发明的又一个方面，其中所述串联结构中丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因各自独立带有可操作地连接的启动子。

本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因在蓝藻细胞内分别编码具有丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶活性的蛋白。

在本发明的基因工程蓝藻中，其染色体上整合有至少一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，例如一个、两个、三个、四个或五个，优选为一个，两个，或三个。当染色体上整合有两个或三个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构时，所述两个或三个串联结构整合在蓝藻染色体相同或不同整合位点。在本发明的一个方面，蓝藻染色体上整合有两个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，其整合在蓝藻染色体上不同整合位点。

蓝藻染色体上可整合外来的核苷酸序列或基因的位点通常是在插入外来核苷酸序列后不对蓝藻的生长产生负面影响的位点，优选是可以带来有益效果的位点。

本发明的蓝藻，例如集胞藻，特别是集胞藻PCC6803中，可以采用的整合位点包括：slr0168基因(例如参见NC_954899)是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因。前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活动没有影响，所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点(site)。slr1556基因(例如参见NC_952017)是集胞藻PCC6803基因组中编码乳酸脱氢酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。sll0945基因(例如参见NC_952804)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。sll1393基因(例如参见NC_952566)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。slr1993基因(例如参见NC_954541)是集胞藻PCC6803基因组中编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。slr1994基因(例如参见NC_954542)是集胞藻PCC6803基因组中编码聚-β-羟丁酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。slr1830基因(例如参见NC_954053)是集胞藻PCC6803基因组中编码β-酮硫解酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。slr1829基因(例如参见NC_954052)是集胞藻PCC6803基因组中编码聚-β-羟烷酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。slr0301基因(例如参见NC_952236)是集胞藻PCC6803基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。

可以采用的整合位点还可以是上述基因的联合所在的位点。例如slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点(文中可表述为“slr1993-1994基因”或“slr1993-1994位点”)，即整合时替换掉的是slr1993基因和slr1994基因，可以通过用于同源重组的上游片段为slr1993基因的上游片段，用于同源重组的下游片段为slr1994基因的下游片段来实现。

在本发明的一个方面，所述基因工程蓝藻中染色体上整合有一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，优选的，蓝藻为集胞藻 PCC6803，所述串联结构整合在slr0168基因所在的位点或slr1993-1994基因联合所在的位点。

本发明使用的宿主是蓝藻，“蓝藻(Cyanobacterium)”是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝藻也称为蓝细菌。单细胞蓝藻的代表物种是集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803)。在本发明的一个方面，蓝藻可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属(Aphanocaps)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属(Scytonema)或鞭枝藻属(Mastigocladus)。本发明的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystis sp.)。在本发明的一个方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。

本发明的基因工程蓝藻含有整合到染色体上的编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的核酸。丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)广泛存在于豆类植物、麻黄等植物、酿酒酵母属(Saccharomyces species)、曲霉属等真菌中，另外运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、醋杆菌属(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脱羧酶。不同来源的丙酮酸脱羧酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的丙酮酸脱羧酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。其中，如Genebank报道的，运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因具有如SEQID NO.3的核苷酸序列。不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但都具有对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列。

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应：CH₃CH₂OH+NAD+→CH₃CHO+NADH+H⁺。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢。酵母和细菌(乳酸菌，以及某些条件下的大肠杆菌除外)不将葡萄糖发酵为乳酸，而是将葡萄糖发酵为乙醇和二氧化碳。总反应式为：Glucose+2ADP+2Pi→2ethanol+2CO₂+2ATP+2H2O。在酵母和许多细菌中，乙醇脱氢酶在发酵起着重要作用：从糖酵解产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，随后乙醛在ADHI 的作用下转化为乙醇。后一步的目的是重新产生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以继续。不同来源的乙醇脱氢酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的乙醇脱氢酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的乙醇脱氢酶的序列和活性有所区别。其中，如Genebank报道的，集胞藻的其中一种乙醇脱氢酶基因具有如SEQ ID NO.4的核苷酸序列。不同来源的乙醇脱氢酶的序列有所区别，但可具有对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列。

在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌(例如参见Genbank_X59558.1)、醋杆菌、创伤弧菌(例如参见Genbank_HM172799.1)、铜绿微囊藻(例如参见Genbank_AP009552.1)、蓝杆藻(例如参见NC_010546.1)和巴斯德醋酸杆菌(例如参见Genbank_AF368453.1)的丙酮酸脱羧酶基因，优选来源于运动发酵单胞菌。

在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO.3的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQ ID NO.3的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。

在本发明的一个方面，所述基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有：

1)对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

2)其核苷酸序列与SEQ ID NO.3的核苷酸序列具有至少80％同一性，优选地至少95％同一性，最优选至少98％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；或

3)其核苷酸序列在严紧杂交条件能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因。

在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述乙醇脱氢酶基因选自来源于集胞藻、鱼腥藻(例如参见NC_1104473和NC_1106408)和聚球藻(例如参见NC_3773405)的乙醇脱氢酶基因，优选来源于集胞藻，例如来自集胞藻PCC6803的sll0990(例如参见NC_953785)；来源于集胞藻PCC6803的slr0942(例如参见NC_952986)；来源于集胞藻PCC6803的slr1192(例如参见NC_951896)。

在本发明的一个方面，其中乙醇脱氢酶来源于与宿主蓝藻相同。所谓宿主相同是指前述基因工程蓝藻的基因组中整合的的乙醇脱氢酶的来源与宿主属于同一属，优选同一种。例如，宿主为集胞藻PCC6803，则乙醇脱氢酶来源于集胞藻，优选来源于集胞藻PCC6803。

在本发明的一个方面，所述基因工程蓝藻带有的乙醇脱氢酶基因具有：

4)对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

5)其核苷酸序列与SEQ ID NO.4的核苷酸序列具有至少80％同一性，优选地至少95％同一性，最优选至少98％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；或

6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，能够与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。

在本发明的其中一个方面，所述基因工程蓝藻中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO.3的核酸序列，其中所述乙醇脱氢酶基因具有SEQ ID NO.4的核酸序列。

如本发明中所使用的，“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。

如本领域已知的，核酸序列严紧杂交条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0％到至少大约15％v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-3℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少约16％v/v到至少大约30％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31％v/v到至少大约50％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M 到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定：低严紧杂交条件是6xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1xSSC缓冲液，0.1％w/vSDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见Ausubel等人，编辑(1995)CurrentProtocolsin Molecular Biology，第2章(Greene PublishingandWiley-Interscience，NewYork)。还可参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)。

“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位臵的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位臵的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的同源性比对算法。这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology(1995增刊))。

本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60％，或至少大约65％，或至少大约70％，或至少大约75％，或至少大约80％，或至少大约85％，或至少大约90％，或更高，例如大约95％，或大约96％，或大约97％，或大约98％，或大约99％。

本发明对蓝藻进行的基因修饰是通过引入外源基因实现的。引入外源基因是通过制备构建体和转化到蓝藻细胞中，并进一步整合到蓝藻的染色体。制备的构建体包含至少一种调控序列，优选的调控序列是启动子。启动子是基因调控中普遍存在的顺式作用元件，是RNA聚合酶能够识别并与之结合而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因5’端上游。它能决定转录的方向和效率，以及RNA聚合酶类型，并引导RNA聚合酶与模板的正确结合。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他反式作用因子的相互作用是通过基因转录实施基因调控转录的关键。在本发明中，对蓝藻进行的基因修饰还包括导入表达丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶所需启动子，并整合到蓝藻染色体上。所述启动子与丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶可操作地连接。在本发明的一个方面，丙酮酸脱羧酶基因转录起始密码子前具有所述启动子。在本发明的一个方面，乙醇脱氢酶基因转录起始密码子前具有或不具有所述启动子。

多种启动子可用于本发明的构建体，可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在蓝藻中表达的组成型启动子、细胞特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。在本发明的一个方面，本发明使用的所述启动子为来源于藻类的Prbc(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase gene)启动子、光诱导启动子、硝酸盐诱导启动子或温度诱导启动子。

启动子Prbc是蓝细菌体内的强启动子，具备在蓝细菌体内高效表达基因的能力，被成功应用在多种蓝细菌菌株中。具体的，rbc启动子(Prbc)是指集胞藻PCC6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco)的操纵子的启动子。rbc启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

另一种光诱导启动子psbA位于蓝藻光系统蛋白psbA上游。光诱导启动子在蓝藻光合作用和细胞代谢的研究中作为表达外源基因的强启动子使用。硝酸盐启动子位于硝酸盐还原酶(nitrate reductase，NR)上游。硝酸盐还原酶NR是一种诱导酶，硝酸盐对NR的活性有明显诱导作用，而铵则能抑制NR的表达，因此NR的启动子已经成为转基因研究中比较理想的可控性启动子。热诱导启动子PgroESL位于蓝藻热休克基因groESL上游。由于groESL启动子具高效性，人们一直试图利用其提高宿主细胞中外源基因的表达水平。

petE启动子(PpetE)是指编码质体蓝素(Plastocyanin，PC)的基因petE的启动子。质体蓝素是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体。petE启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQ ID NO：4所示的序列。

在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻产生的乙醇由细胞中扩散到培养液中。本发明的基因工程蓝藻的培养液中，溶液中累积生产乙醇可达到0.5g/L，优选的，达到4到10g/L，最优选超过10g/L。

在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5882、CGMCC NO.5883或CGMCC NO.5794。

本发明的制备基因工程藻类包括以下主要步骤。通过PCR或合成的方法获得目的基因或目的核苷酸片段，包括外源丙酮酸脱羧酶基因、外源乙醇脱氢酶基因，启动子和/或抗性标记基因等核苷酸片段。将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和病毒等，以形成重组DNA分子。DNA片断与载体的连接方式主要有同聚末端连接、粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。重组DNA必须进入宿主细胞DNA中，才能得到扩增和表达。根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。应用于蓝藻遗传转化的供体DNA大体可分为三类：第一类是直接利用未修饰的外源质粒，可将外源DNA导入蓝藻。第二类是利用自身染色体或基因组，通过同源重组作为插入突变的有效方法。第三类是使用穿梭载体。穿梭质粒可以含有蓝藻质粒复制起点，能够以复制子形式独立存在。穿梭质粒还可以带有与蓝藻基因组相同的序列，从而在进入蓝藻后与发生染色体同源重组，从而稳定存在和表达。

在本发明的一个方面，本发明提供了利用本发明的基因工程蓝藻制备乙醇的方法。经过上述基因工程的改造，本发明的蓝藻的细胞内能够有效地表达具备了催化丙酮酸到乙醛的反应活性的丙酮酸脱羧酶，以及外源乙醇脱氢酶，从而能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明的基因工程蓝藻在含有碳源(例如二氧化碳)的培养液中，在光照条件下进行繁殖和光反应，产生乙醇，然后进行分离、收集和提纯，例如采取传统蒸馏和气提等工艺。

本发明提供了一种可整合到蓝藻染色体的构建体，其包含顺次连接的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。所述构建体具有整合到蓝藻染色体基因组的能力，例如通过同源重组整合入蓝藻基因组中。

其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有：

1)对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

其中所述乙醇脱氢酶基因具有：

4)对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

在本发明的一个方面，所述构建体中含有一个与串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子，或是丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因各自独立带有可操作地连接的启动子。其中所述启动子选自rbc启动子，petE启动子，psbA启动子，硝酸盐启动子，PgroESL启动子，优选为rbc启动子。

在本发明的又一个方面，所述构建体的两端具有蓝藻染色体基因位点的上游片段和下游片段，可通过同源重组整合入蓝藻基因组中。优选的，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述位点选自slr0168基因所在的位点，slr1556基因所在的位点，sll0945基因所在的位点，sll1393基因所在的位点，slr1830基因所在的位点，slr1829基因所在的位点，slr0301基因所在的位点，slr1993基因所在的位点和slr1994基因所在的位点，更优选的，为slr0168基因所在的位点和slr1993-1994基因所在的位点。

例如，所述蓝藻染色体基因位点的上游片段和下游片段为分别slr0168基因的上游片段具有如SEQ ID NO：6所示的序列，以及slr0168基因的下游片段具有如SEQ ID NO：7所示的序列。

例如，所述蓝藻染色体基因位点的上游片段和下游片段分别为slr1993-1994的上游基因片段具有如SEQ ID NO：8所示的序列，以及slr1993-1994的下游片段具有如SEQ ID NO：9所示的序列。

载体(vector)是指能够将DNA片段(例如，目的基因)插入其中从而允许将DNA片段(例如，目的基因)转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的DNA片段所编码的蛋白获得表达时，载体也称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

在本发明的一个方面，提供了包括前述任意一种构建体的载体。

在本发明的一个方面，提供了一种具有上述特征的载体，所述载体包括抗生素标记，启动子(例如Prbc启动子)，丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因片段。抗生素标记包括，例如，例如卡那霉素抗性基因(例如参见NC_003239.1)，红霉素抗性基因(例如参见NC_015291.1)和壮观霉素抗性基因。此类标记基因是本领域技术人员熟知的。在一个优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因Omega片段，其例如具有如SEQ ID NO：5所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，其例如具有如SEQ ID NO：2所示的序列。

本发明提供的另一种具有上述特征的载体是用于转化蓝藻的穿梭质粒，所述载体带有如前所述的抗生素标记、启动子、丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB。所述载体还可包括如前所述的蓝藻基因组片段，从而使得所述丙酮酸脱羧酶和所述启动子在转换蓝藻后可重组到蓝藻的染色体上。

在本发明的一个方面，本发明提供了制备上述基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因，乙醇脱氢酶基因，并整合到蓝藻染色体上。其中还可包括将表达丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶基因所需启动子导入蓝藻的步骤。

在本发明的其中一个方面，制备上述基因工程蓝藻的方法包括将前述构建体或前述载体导入蓝藻，从而使得所述蓝藻染色体上整合有至少一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，优选为一个、两个或三个有一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构。

在本发明的其中一个方面，制备上述基因工程蓝藻的方法包括将一个前述构建体或一个前述载体导入蓝藻，从而使得所述蓝藻染色体上整合有一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，优选的，蓝藻为集胞藻PCC6803，所述串联结构整合在slr0168基因所在的位点或slr1993-1994基因联合所在的位点。

在本发明的其中一个方面，提供了上述制备基因工程蓝藻的方法，其中所述蓝藻蓝藻染色体上整合有两个或三个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，所述两个或三个串联结构整合在蓝藻染色体相同或不同整合位点。在本发明的其中一个方面，所述制备基因工程蓝藻的方法包括将两个前述构建体或两个前述载体导入所述蓝藻，从而使得所述蓝藻染色体上整合有两个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，其整合在蓝藻染色体上不同整合位点。例如，使用的两个构建体的两端具有不同的两个蓝藻染色体基因位点的上游片段和下游片段，可通过同源重组整合入蓝藻基因组中。例如，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述位点选自slr0168基因所在的位点，slr1556基因所在的位点，sll0945基因所在的位点，sll1393基因所在的位点，slr1830基因所在的位点，slr1829基因所在的位点，slr0301基因所在的位点，slr1993基因所在的位点，slr1994基因和slr1993-1994基因所在的位点中的两个。例如，两个构建体的两端分别具有slr0168基因所在的位点和slr1993-1994基因所在位点的上游片段和下游片段。

附图说明

图1为质粒pCE01的基本结构。

图2为质粒pCE02的基本结构。

图3为质粒pCE03的基本结构。

图4为质粒pCE04的基本结构。

图5为质粒pCE05的基本结构。

图6为质粒pCE06的基本结构。

图7为质粒pCE07的基本结构。

图8为质粒pCE08的基本结构。

图9为质粒pCE09的基本结构。

图10为质粒pCE10的基本结构。

图11为质粒pCE11的基本结构。

图12为质粒pCE12的基本结构。

图13为质粒pCE13的基本结构。

图14为质粒pCE14的基本结构。

图15为用于蓝藻培养以及所产生乙醇回收装置的示意图。

图16为蓝藻培养过程中的生长OD曲线变化图。

图17为蓝藻培养过程中所生产乙醇的含量示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

除非特别指明，否则本发明中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：用于表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的载体的构建

为了向蓝细菌中外源引入丙酮酸脱羧酶以及提高蓝细菌中丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量，如下构建了能够表达来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因ZmPDC的质粒pCE03和能够表达来源于蓝藻PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因slr1192的质粒pCE04。

1、质粒pCE03的构建

以ZmPDC-F(5′-GCG GCA GCC ATA TGA GTT ATA CTG TCG-3′)和ZmPDC-R(5′-AGC TCG TCT CGA GTC TAG AGG AGC TTG-3′)为引物，以运动发酵单胞菌(Zymomonas Mobilis)基因组DNA为模板进行PCR扩增，并根据生产商的说明书，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pCE01，基本结构示于图1。经测序验证后，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pCE01，并回收约1.7kb的DNA片段。此外，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pET21b(Novagen)，并回收DNA片段。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有ZmPDC基因的质粒pCE03。质粒pCE03的基本结构示于图3中，其包含来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶ZmPDC基因(SEQ ID NO：3)。

2、质粒pCE04的构建

以1192-F(5′-GCG GCA GCC ATA TGA TTA AAG CCT ACG-3′)和1192-R(5′-ATT GCA TGT CGA TCT CGA GCT AAT TT-3′)为引物，以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板进行PCR扩增，并根据生产商的说明书，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pCE02，基本结构示于图2。经测序验证后，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pCE02，并回收约1kb的DNA片段。此外，使用NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)和XhoI(Takara，Catalog No.：D1094A)酶切质粒pET21b(Novagen)，并回收DNA片段。然后使用连接酶将所获得的两个DNA片段相连，从而得到携带有slr1192基因的质粒pCE04。质粒pCE04的基本结构示于图4中，其包含来源于蓝藻PCC6803的乙醇脱氢酶slr1192基因(SEQ ID NO：4)。

实施例2：用于基因敲入和基因敲除的载体的构建

为了证实丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶在蓝细菌生产乙醇中的作用，并证实可以通过提高所述酶的表达来提高蓝细菌中乙醇的产量，如下构建了用于将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入蓝细菌基因组slr0168位点的载体pCE09，以及证实通过在产乙醇的蓝细菌中进一步提高丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的产量从而提高乙醇的产量，如下构建了用于将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入蓝细菌基因组slr1193-1194位点的载体pCE11。

1、载体pCE09的构建

以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以Prbc-F(5′-ACC TCC AGCCAT TAG CGA AAC-3′)和Prbc-R(5′-CTC TCA CAA TTG CCC TAC CT-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D 101A)中，从而得到载体pCE05，基本结构示于图5中。经测序验证后，使用Sma I(Takara，CatalogNo.：D1073A)酶切质粒pCE05，并使用T4DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3kb的片段。另外，使用DraI(Takara Catalog No.： D1093A)酶切质粒pRL57(Elhaiand Wolk，1988)，然后回收1.9kb的片段(该片段含有抗性基因)。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE06，基本结构示于图6中。使用SacI和PstI酶切质粒pCE06，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收2.2kb的片段。另外，使用XbaI将酶切质粒pCE01，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收4.4kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE07。使用SacI和PstI酶切质粒pCE07，基本结构示于图7中，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3.9kb的片段。另外，使用XbaI将酶切质粒pCE02，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收3.7kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE08，基本结构示于图8中。

使用XbaI酶切质粒pHB1567（见高宏等人，2007；该质粒pHB1567转化大肠杆菌DH5α，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5859，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为大肠埃希氏菌，即Escherichia coli）并使用T4DNA聚合酶（Fermentas,Catalog No.:EP0061）将末端补平，然后回收5.4b的片段，该片段包含slr0168位点的上游片段（SEQ ID NO:6）和下游片段（SEQ ID NO:7）。另外，使用SacI和PstI酶切质粒pCE08，并使用T4 DNA聚合酶（Fermentas,Catalog No.:EP0061）将末端补平，然后回收5kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE09，基本结构示于图9中。从而完成将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因（ZmPDC）和乙醇脱氢酶基因（slr1192）整合入蓝细菌基因组slr0168位点的载体pCE09。

2、载体pCE14的构建

以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr1993-1994-F1(5′-TGG TACAGG GAT AAA CAC TGG TTA-3′)和slr1993-1994-R1(5′-TTC CAA TGC CAT GGGTTG GGA T-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D 101A)中，从而得到质粒pCE10，其包含有slr1993-1994上游基因片段(SEQ ID NO：8)，基本结构示于图10中。以蓝藻PCC6803基因组DNA为模板，以slr1993-1994-F2(5′-GTAGCC ATG GTA GCT ATG TCA CCG-3′)和slr1993-1994-R2(5′-TGT TGA TGG TGG GTA TCG TGG TG-3′)引物进行PCR扩增，并且根据生产商的说明书，将获得的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D 101A)中，从而得到质粒pCE11，其包含有slr1993-1994下游基因片段(SEQ ID NO：9)，基本结构示于图11中。经测序正确后，使用SphI酶切质粒pCE10，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收4kb的片段。另外使用NcoI和BamH I酶切质粒pCE11，并使用T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)将末端补平，然后回收1kb的片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE12，基本结构示于图12中。

使用EcoRV和XbaI(Takara Catalog No.：D1040A和Takara CatalogNo.：D1093A)酶切质粒pRL271，并使用T4 DNA聚合酶将末端补平，然后回收3kb的片段(该片段含有抗性基因)。另外使用Sma I和BamH I酶切质粒pCE08，并使用T4 DNA聚合酶将末端补平，回收5.7kb片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE13，基本结构示于图13中。

使用BamH I酶切质粒pCE12，并使用T4 DNA聚合酶将末端补平，然后回收5kb的片段。另外使用SacI和SphI酶切质粒pCE13，并使用T4 DNA聚合酶将末端补平，回收6kb片段。然后使用连接酶将所获得的两个片段相连接，从而得到质粒pCE14，基本结构示于图14中。从而完成进一步将由Prbc启动子驱动的丙酮酸脱羧酶基因(ZmPDC)和乙醇脱氢酶基因(slr1192)整合入产乙醇的蓝细菌基因组slr1993-1994位点的载体pCE14。

实施例3：蓝细菌的转化以及转化体的筛选

如下进行蓝细菌的转化以及转化体的筛选：

1、取处于对数生长期(OD730约为0.5～1.0)的蓝细菌细胞10mL，离心收集细胞；用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mL BG11培养基(1.5g L^-1NaNO3，40mg L^-1K₂HPO₄·3H₂O，36mg L^-1CaCl2·2H2O，6mg/L柠檬酸，6mg/L柠檬酸铁铵，1mg L^-1EDTA二钠盐，20mg L^-1NaCO₃，2.9mg L^-1H₃BO₃，1.8mg L^-1MnCl₂·4H₂O，0.22mg L^-1ZnSO₄·7H2O，0.39mg L^-1NaMoO₄·2H₂O，0.079mg L^-1CuSO₄·5H₂O和0.01mg L^-1CoCl₂·6H₂O)中。

2、取0.2mL细胞悬液于新的EP管中，加入2～3μg表达质粒，混匀，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下温育5小时。

3、将蓝细菌细胞与DNA的混合物涂布于铺在BG11平板(未加抗生素)上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有与目的藻株相应的抗生素的BG11平板上，并在30℃、30μEm^-2s^-1的条件下继续培养。

4、培养大约5～7天后，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板(含相应的抗生素)上划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11培养基(含相应的抗生素)中进行培养。

5、将经转化的蓝细菌细胞在液体BG11培养基(含相应的抗生素)中转接两次到三次，并且在通过基因组测序验证目的构建体的正确导入后，将经转化的细胞用于检测乙醇的产量。

经过上述步骤转化蓝细菌，得到以下菌株：

藻株的基因型信息

PCC6803：野生型集胞藻PCC6803，葡萄糖耐受的，中科院水生生物研究所馈赠。

CE01：slr0168∷Omega Prbc ZmPDC slr1192：通过用质粒pCE9转化PCC6803而得，含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr0168基因所在的位置），壮观霉素抗性。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5882，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。

CE02：slr1993-1994∷Omega Prbc ZmPDC slr1192：通过用质粒pCE14转化PCC6803而得，含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr1993-1994基因所在的位置），卡那霉素抗性。该菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5883，保藏时间是2012年3月8日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。

QCS009：slr0168∷omega Prbc ZmPDC slr1192,slr1993-1994∷Sac.B KmPrbcZmPDC slr1192：通过用质粒pCE14转化pCE01而得，含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr0168基因所在的位置），壮观霉素抗性。并且含有由rbc启动子驱动的来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶和PCC6803内源的乙醇脱氢酶基因（整合到slr1993-1994基因所在的位置），卡那霉素抗性。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5794，保藏时间是2012年2月15日,分类命名为集胞藻，即Synechocystis sp。

实施例4：经基因工程改造的蓝藻的乙醇产量

1、实验步骤：

(1)培养方式：柱状光照反应器培养(参见图15)。300mL柱状光照反应器，装200mL液体BG11培养基(含相应抗性)，初始接种浓度为OD730＝1.5，在30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下，通含CO2为5％的空气培养1天后，待藻株状态稳定后，加强光照强度到100μEm^-2s^-1。

(2)乙醇采收：将柱状光照反应器的出气通路连接到100mL的三口烧瓶中，并保证气体通入50mL的水体中，用于乙醇挥发气体的溶解。三口烧瓶上方放置30cm的蛇形冷凝管，三口烧瓶置于5℃中，蛇形冷凝管接入5℃循环水。该冷凝回收装置如图15所示，用于回收由于通气影响而从柱状光照反应器中挥发出来的乙醇。

(3)乙醇的检测：每两天从柱状光照反应器中取0.5mL的培养液，离心后用于乙醇的检测，另外从相对应的三口烧瓶中取0.5mL的回收液，用于乙醇的检测。将两者测得乙醇结果换算后获得乙醇产量。乙醇检测采用SBA-40生物传感器进行检测。SBA-40D型生物传感分析仪利用酶促反应来进行定量分析，测定的关键传感器是固定化酶和H2O2电极复合传感器，分析过程基于以下生化反应：

2、实验结果

在四株蓝细菌PCC6803、CE01、CE02和QCS009中检测了乙醇产量，野生型蓝细菌PCC6803中未检测到乙醇的产生，CE01、CE02和QCS009检测到了乙醇的产生。图16和图17分别展示了蓝细菌PCC6803、CE01、CE02和QCS009的生长以及乙醇的生产情况。

结果显示，野生型的PCC6803本身并不能生产乙醇，经过外源引入运动发酵单胞菌的丙酮酸脱氢酶和过量表达内源的乙醇脱氢酶而获得的CE01和CE02能够生产乙醇。在CE01的基础上，再一次过量表达运动发酵单胞菌的丙酮酸脱氢酶和过量表达内源的乙醇脱氢酶而获得的QCS009，乙醇产率相对CE01和CE02提高了超过两倍。

结果表明，在蓝细菌染色体整合和表达外源丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可有效的合成乙醇的能力，而通过增加整合的外源丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的拷贝数，能大大增强合成乙醇的能力。

本发明以蓝藻为宿主，将乙醇代谢途径基因导入染色体，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株。本发明的基因工程菌株能够利用阳光、二氧化碳生产乙醇这种替代能源产品。本发明为解决传统生物能源技术的规模、产量和成本瓶颈提供了新的方法，有助于达到节能减排目标。

本申请中提到的论文或专利申请的全文或部分通过引用到本申请中而公开，但不形成对本发明的现有技术。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，显然“包括”一词不排除其他单元或步骤，单数不排除复数。

Claims

1.一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到蓝藻染色体的整合位点上的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因是串联结构，所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构上的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因顺次连接，整合在蓝藻基因组的指定整合位点。

2.权利要求1的基因工程蓝藻，其中所述串联结构含有一个与所述串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子，或是所述串联结构上丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因各自独立带有可操作地连接的启动子，优选的，其中所述启动子选自rbc启动子，petE启动子，psbA启动子，硝酸盐启动子，PgroESL启动子，最优选为rbc启动子。

3.权利要求1或2的基因工程蓝藻，其中蓝藻染色体上整合有至少一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，优选为一个、两个或三个。

4.权利要求3的基因工程蓝藻，其中蓝藻染色体上整合有两个或三个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，所述两个或三个串联结构整合在蓝藻染色体相同或不同整合位点，优选的，其中蓝藻染色体上整合有两个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，其整合在蓝藻染色体上不同整合位点。

5.权利要求1-4的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有：

1)对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

3)其核苷酸序列在严紧杂交条件能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因，

优选的，所述丙酮酸脱羧酶基因来源选自运动发酵单胞菌、醋杆菌、创伤弧菌、铜绿微囊藻、蓝杆藻和巴斯德醋酸杆菌，最优选来源于运动发酵单胞菌。

6.权利要求1-5中任一项的基因工程蓝藻，其中

所述乙醇脱氢酶基因具有：

4)对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，能够与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因，

优选的，其中所述乙醇脱氢酶来源于集胞藻、鱼腥藻和聚球藻，最优选为集胞藻。

7.权利要求中1-6任一项的基因工程蓝藻，其选自集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、聚球藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属，优选为集胞藻属，最优选为集胞藻PCC6803。

8.权利要求1-7中任一项的基因工程蓝藻，其中乙醇脱氢酶来源与宿主蓝藻相同，例如，宿主为集胞藻，乙醇脱氢酶也来源于集胞藻。

9.权利要求1-8中任一项的基因工程蓝藻，其中蓝藻为集胞藻PCC6803，所述整合位点选自slr0168基因，slr1556基因，sll0945基因，sll1393基因，slr1830基因，slr1829基因，slr0301基因，slr1993基因，slr1994基因，和slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点，优选的，其中蓝藻为集胞藻PCC6803，两个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构分别整合在slr0168基因所在的位点和slr1993-1994基因所在的位点。

10.权利要求1所述的基因工程蓝藻，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5882、CGMCC NO.5883或CGMCC NO.5794。

11.一种可整合到蓝藻染色体上的构建体，其包含丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，所述串联结构上的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因顺次连接，其中

所述丙酮酸脱羧酶基因具有：

1)对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

3)其核苷酸序列在严紧杂交条件能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；

所述乙醇脱氢酶基因具有：

4)对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

优选的，所述构建体含有一个与所述串联结构中第一个基因可操作地连接的启动子，或是所述串联结构上丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因各自独立带有可操作地连接的启动子例如，其中所述启动子选自rbc启动子，petE启动子，psbA启动子，硝酸盐启动子，PgroESL启动子，优选为rbc启动子，更优选的，所述启动子具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，优选的，所述构建体两端具有蓝藻染色体基因位点的上游片段和下游片段，可通过同源重组整合入蓝藻基因组中，优选的，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述位点选自slr0168基因所在的位点，slr1556基因所在的位点，sll0945基因所在的位点，sll1393基因所在的位点，slr1830基因所在的位点，slr1829基因所在的位点，slr0301基因所在的位点，slr1993基因所在的位点，slr1994基因和slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点，

例如，所述基因位点为slr0168基因所在的位点或slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点，其中所述slr0168基因的上游片段具有如SEQ ID NO：6所示的序列，所述slr0168基因的下游片段具有如SEQ ID NO：7所示的序列，其中所述slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点的上游片段具有如SEQ ID NO：8所示的序列，所述slr1993基因与slr1994基因联合所在的位点的下游片段具有如SEQ ID NO：9所示的序列。

12.制备权利要求1-10中任一项的基因工程蓝藻的方法，其包括将所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入并整合到蓝藻染色体的整合位点上，例如，所述方法包括将权利要求11或12的构建体导入所述蓝藻，从而使得所述蓝藻染色体上整合有至少一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，优选为一个、两个或三个有一个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，

优选的，其中所述蓝藻染色体上整合有两个或三个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，所述两个或三个串联结构整合在蓝藻染色体相同或不同整合位点，例如，其中将两个权利要求11和12中任一项的构建体导入所述蓝藻，从而使得所述蓝藻染色体上整合有两个所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的串联结构，其整合在蓝藻染色体上不同整合位点，

更优选的，所述蓝藻为集胞藻PCC6803，所述位点为选自slr0168基因所在的位点，slr1556基因所在的位点，sll0945基因所在的位点，sll1393基因所在的位点，slr1830基因所在的位点，slr1829基因所在的位点，slr0301基因所在的位点，slr1993基因所在的位点，slr1994基因和slr1993-1994基因所在的位点中的两个，例如分别为slr0168基因所在的位点和slr1993-1994基因联合所在的位点。