CN103314101A - 通过蛋白质生物质发酵的重组微生物的生物燃料和化学生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了代谢改良的微生物，其特性在于相较野生型生物体有增加的酮酸流，并且包含至少一个编码酶的多核苷酸，相较野生型生物体在表达时引起更高量的化学产物生成。所述重组微生物用于从各种含氮生物质组合物和其他碳源生产大量化学组合物。更特异地，本发明提供了从合适的富氮生物质中生产下列物质的方法：醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、氨基酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。

Description

通过蛋白质生物质发酵的重组微生物的生物燃料和化学生产
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年11月3日提交的美国临时专利申请号61/409,760和2010年11月4日提交的美国临时专利申请序列号61/410,174的优先权，所述申请的公开内容通过引用全文纳入本文。
政府支持
本发明是在美国能源部授予的批准号DE-FC02-02ER63421下由政府资助完成。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
提供了代谢修饰的微生物和生成这种微生物的方法。本发明提供了从蛋白质生物质生成生物燃料的生物燃料反应器系统。也提供了通过使合适底物与代谢修饰或重组的微生物和其酶制剂接触生成生物燃料和化学品的方法。
背景技术
因为对经济和环境的关注，预期对生物燃料作为石油替代物的需求增加。所述常见的生物燃料乙醇不是理想的，因为其相比汽油有更低的能量密度，并且必需与汽油在有限的浓度范围内混合以作为运输燃料。乙醇也是吸湿和腐蚀性的，引起存储和分布系统的问题。
另外，己二酸是用于生成包括例如尼龙6-6在内多种合成品的工业目的以及用于制备多种药物的化合物。
再者，γ氨基丁酸是用于生成包括例如尼龙6-6在内多种合成品的工业目的以及生物学作用例如神经细胞通讯的化合物。
发明内容
本公开描述了使用富含氮的材料(如蛋白材料)作为生成多种化合物例如碳燃料和化学品的粗材料。在多个实施方式中，本公开能涉及使用蛋白质作为任何发酵的主要粗材料的方法。所述方法能包含加热和消化细胞生物质以部分破坏蛋白，并且然后使用处理的细胞生物质在多种微生物发酵中作为单一碳源以生成多种生物产品，包含醇、有机酸和其他化学品。在另一个实施方式中，本公开能包含开发特定微生物株以有效利用所述细胞生物质。所述细胞生物质包含所有种类的细菌、酵母、真菌、蓝藻菌、藻类、和任何包含蛋白生物质的粗材料(干酒糟及其可溶物(DDGS)、藻类食物或滤饼、细菌发酵滤饼等)。
在一个实施方式中，开发特定微生物株以具有降解氨基酸的较强能力，从而能利用蛋白生物质（包含蛋白、多肽、氨基酸和其混合物）作为单一碳源。消化多个氨基酸的代谢通路通过遗传和随机突变来工程改造。在某些实施方式中，蛋白和多肽能消化成小肽，其能转运入重组的微生物并且降解成氨基酸。氨基酸转化成多种2-酮酸。最终，这些2-酮酸转化成所需化学实体例如更长链的醛或醇，通过多种重组通路引入到微生物中。其中，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸直接转化成相应的2-酮酸，这是通过亮氨酸脱氢酶或其他转化这些氨基酸成2-酮酸的酶。丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸和丙氨酸及甘氨酸转化成丙酮酸，再转化成2-酮异戊酸，其能再用于例如异丁醇合成。谷氨酸、谷胺酰胺、精氨酸和脯氨酸转化成2-酮戊二酸，再转化成苏氨酸，其能用于例如1-丙醇生成，或能通过苹果酸酶转化回丙酮酸。所述丙酮酸能用于例如异丁醇生成。或者，转化成丙酮酸的所有蛋白生物质也能转化生成乙醇。工程改造残留的氨基酸以支持生长或作为随机突变的能量来源。
在另一个实施方式中，所述蛋白生物质进行处理并转化成多种化学生成的关键中间体，例如丙酮酸、2-酮戊二酸。所述化学品能包含例如但不限于琥珀酸、苹果酸、富马酸和γ-氨基丁酸(GABA)。本发明不限于仅生成所列举的化学品。
本发明在一个实施方式中提供了重组微生物，其特性为相较野生型生物体有增加的酮酸流，并且包含至少一个编码酶的多核苷酸，其相较野生型生物体在表达时生成更高量的化学产物。更特别地，所述重组微生物包含编码脱氢酶、转氨酶、和/或脱氨酶的异源多核苷酸。在某些实施方式中，所述脱氢酶是谷氨酸盐脱氢酶(E.C.1.4.1.2和E.C.1.4.1.4)、谷氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.3)、缬氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.9)、或苯丙氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.20)。在常见实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶可以是能从中间型嗜热放线菌（Thermoactinomyces intermedius）分离的LeuDH。在某些其他实施方式中，所述重组微生物能包含选自下面的脱氨酶：天冬氨酸解氨酶(4.3.1.1)、L-丝氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.17)、D-丝氨酸解氨酶(4.3.1.18)、苏氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.19)、酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.23)、苯丙氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.24)、和苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.25)。更特异地，所述脱氨酶能是丝氨酸脱氨酶SdaB，能获自例如大肠杆菌（Escherichia coli）、玫瑰杆菌(Rosebacteratrosepticum）、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肠道沙门氏菌（Salmonella enerica）、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、或鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)。再者，所述重组微生物能包含作为L-α-转氨酶(E.C.2.6.1.X，其中X是任意数字)的转氨酶。在特定实施方式中，所述L-α-转氨酶能是L-天冬氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.1)、L-丙氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.12和E.C.2.6.1.47)、L-天冬酰胺转氨酶(E.C.2.6.1.14)、或甘氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.35)。在某些实施方式中，所述L-天冬氨酸转氨酶能是AvtA，能来自例如大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、地中海拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）、曼海姆产琥珀酸菌（Mannheimia succinicproducens）、肠道沙门菌（Salmonella enterica）或鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）。
本公开也提供了重组微生物，与野生型生物体相比，其进一步的特性是降低的氨再摄取活性、降低的2型自诱导物再摄取活性、降低的谷氨酸脱氢酶活性、降低的谷氨酰胺合成酶活性、降低的谷氨酸合成酶活性、降低的群体感应基因活性、和/或降低的整体调节剂活性。在某些实施方式中，所述降低的群体感应活性来自基因luxS或lsrA的缺失、或者降低的表达或功能；所述降低的氨再摄取活性来自基因gdhA和glnA的缺失、或者降低的表达或功能，和降低的整体调节剂活性来自基因CRP、LRP、Fis、和/或IHF的缺失、或者降低的表达或功能。
本发明特别公开的重组微生物是生成化学产物例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯（butyrolactone）、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺（cadeverine）、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。在某些实施方式中，所述醇选自乙醇、1-丙醇（1-proponal）、正丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-丁醇。
再者，本公开提供了所述重组微生物能来自野生型生物体,其是细菌、蓝细菌、丝状真菌、或酵母菌。更特别地，所述野生型微生物来自某一属，例如梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymonomas）、大肠埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella.)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klesiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、枯草芽孢杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、青枯病(Ralstonia)、乳酸球菌属(Lactococcus)、酵母属(Saccharomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、或者微杆菌属（Microbacterium）。更特别地，所述野生型生物体能是例如大肠杆菌、真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）、软化芽孢杆菌（Paenibacillusmacerans）、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胚牙乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarium）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、集胞藻（Synechocystis sp.）、鱼腥藻（Anabaena sp.）、真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、和细长集球藻（Synechococcus elongatus）。
本公开也提供了重组微生物，所述重组微生物从包含2-酮酸的代谢物和使用氨基酸来源生成所需的化学实体。在一个实施方式中，修饰所述微生物以表达或过量表达有选自亮氨酸或缬氨酸脱氢酶活性的多肽。在另一个实施方式中，工程改造所述微生物以表达或过量表达名为glyA、sda、tnaA、dadX、dadA的酶，其分别用于转化Gly到L-Ser到丙酮酸;L-Cys到丙酮酸;L-到D-Ala到丙酮酸。在另一个实施方式中，所述微生物表达或过量表达选自下列的酶：ybaS、yneH、putA、astABCDE，其分别转化谷胺酰胺、脯氨酸和精氨酸到谷氨酸，然后通过酶gdhA代谢成2-酮戊二酸。
在一个实施方式中，所述重组微生物从工程改造到微生物内的一种或多种多肽表达中生成α-己二酸。在谷氨酸通路中，谷氨酸通过有谷氨酸脱氢酶(gdh)活性的多肽转化成2-KG(2-酮戊二酸)。通过有高柠檬酸合成酶(hcs)活性和高乌头酸酶（homoacornitase）(hacAB)活性的多肽连续反应后，2-KG转化成高异柠檬酸（homoisocitrate），其通过有高异柠檬酸脱氢酶(hicDH)活性的多肽还原脱羧成α酮己二酸。本发明多肽的编码多核苷酸可以来自任意数量的微生物，包括例如酿酒酵母、嗜热栖热菌（Thermus Thermophilus），和本领域其他已知的微生物。所述多核苷酸可以是突变的或变异的酶，来自来源生物体并且然后修饰或工程改造成有提高的活性。在一个实施方式中，所述参与谷氨酸通路的酶的编码多核苷酸从多种生物体中克隆，包含例如酿酒酵母（S.cerevisiae）和嗜热栖热菌（T.Thermophilus）。
在本发明的赖氨酸通路中，赖氨酸通过有赖氨酸转氨酶(lat)活性的多肽脱氨成2-氨基己二酸-6-半醛。然后，有哌啶（piperideine）6-羧酸脱氢酶(pcd)活性的多肽催化形成α-氨基己二酸。所述氨基基团然后通过有2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)活性的多肽脱胺。本发明多肽的编码多核苷酸可以来自任意数量的微生物，包括例如黄杆菌（Flavobacterium lutescens）、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）、智人(Homosapiens)、和本领域其他已知的微生物。所述多核苷酸可以是突变或变异的酶，来自来源生物体并且然后修饰或工程改造成具有提高的活性。在一个实施方式中，所述酶的编码多核苷酸能克隆自多种生物体，包含例如黄杆菌（F.lutescens）、棒状链霉菌、智人等。
对从中间体α酮己二酸生成己二酸而言，工程改造两个生物途径(CoA非依赖性通路和CoA依赖性通路)与一个化学途径，如图3所示。对生物转化而言，α酮己二酸通过各种有脱氢酶活性的多肽转化成α-羟基己二酸，所述多肽包含来自各种微生物的有亮氨酸脱氢酶(ldhA)活性的多肽、有苹果酸脱氢酶(mdh)活性的多肽、和有羟基异己酸（hydroxyisocaproate）脱氢酶(hdh)活性的多肽。在CoA非依赖性通路中，工程改造天然还原性TCA循环的模仿通路，其在厌氧条件下通过苹果酸和富马酸将草酰乙酸盐转化成琥珀酸盐。富马酸还原酶(fumA或fumB)的突变能提供促进α-羟基己二酸脱水的多肽。能通过来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutyricum）的丁烯酸脱氢酶突变体来构建下一步骤。在CoA依赖性通路中，艰难梭菌（Clostridiumdifficille）中异己酸的生成通路能用于衍生将α羟基己二酸转化成己二酸的多肽。第一步是通过有CoA转移酶(hadA)活性的多肽催化生成R-2-羟基异己酰-CoA。然后，R-2-羟基异己酰-CoA通过脱水酶活化剂复合物(如hadBC hadI)的脱水生成2-异己烯酰（Isocaprenoyl）-CoA，其通过有酰基CoA脱氢酶(acdB etfBA)活性的多肽还原成异己酰-CoA。最终，CoA部分通过CoA转移酶(hadA)除去以生成己二酸。使用包含铂的多种金属催化剂也可能将α酮己二酸化学还原成己二酸。
在一个实施方式中，本公开提供通过引入表达选自下面多肽的异源多核苷酸来修饰的重组细菌：有谷氨酸脱氢酶(gdh)活性的多肽、有高柠檬酸合成酶(hcs)活性的多肽、有高乌头酸酶(hacAB)活性的多肽、有高异柠檬酸脱氢酶(hicDH)活性的多肽、编码前述任意组合的多核苷酸或多种多核苷酸。
在一个实施方式中，本公开提供通过引入表达选自下组多肽的异源多核苷酸来修饰的重组细菌：有赖氨酸转氨酶(lat)活性的多肽、有哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)活性的多肽、有2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)活性的多肽、编码前述任意组合的多核苷酸或多种多核苷酸。
在其他实施方式中，相同或不同的细菌可以重组修饰以表达有脱氢酶活性的多肽，包含来自多种微生物的有亮氨酸脱氢酶(ldhA)活性的多肽、有苹果酸脱氢酶(mdh)活性的多肽、和有羟基异己酸脱氢酶(hdh)活性的多肽。
在另一个实施方式中，本公开提供通过引入表达选自下组多肽的异源多核苷酸来修饰的重组细菌：有CoA转移酶(hadA)活性的多肽、有脱水酶活化剂复合物(如hadBC hadO)活性的多肽、有酰基CoA脱氢酶(acdB etfBA)活性的多肽、有CoA转移酶(hadA)活性的多肽、和任意上述组合，从而从α酮己二酸生成己二酸。
此外，本公开提供另外从包含蛋白、多肽或氨基酸的生物质生成化学产品的工艺，所述工艺通过使生物质在有益于生成化学产品的条件下接触任意上述重组微生物，其中生成的化学产品数量大于野生型生物体生成的数量。所述用于培养重组微生物的生物质能是例如藻类、干酒糟及其可溶物(DDGS)、细菌、动物残留、植物、蛋白、多肽、氨基酸或其混合物、和其任意组合。在本文所述的某些实施方式中，所述生物质能是绿藻、红藻、蓝绿藻、蓝细菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。在所述特定实施方式中，所述生物质是小球藻(Chorella vulgaris)、紫球藻（Porphyridium purpureum）、纯顶螺旋藻（Spirulina platensis）、或蓝藻（Synechococcus elongates）。再者，所述生物质能在接触重组微生物前部分降解。在某些实施方式中，所述生物物质能用蛋白酶和/或加热处理。例如，所述生物质通过加热如在温度范围60-100°C内加热，和用蛋白酶处理水解。在某些实施方式中，公开了某一工艺，其中所述生物质能与将赖氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸转化成全部20种氨基酸残基混合物的第二微生物接触。特定地，所述第二微生物在接触重组微生物前接触所述生物质。所述第二微生物能是假单胞菌（Pseudomonas）和或芽孢杆菌（Bacillus）。
在附图和以下描述中详细列出了本发明的一个或多个实施方式。通过说明书、附图和权利要求书，可清楚了解其它的特征、目的和优点。
附图简要说明
结合在本说明书中并构成说明书一部分的附图说明了本发明的一个或多个实施方式，并与详细描述一起用来说明本发明的原理和实施。
图1A-E显示了多种生物燃料生产工艺的比较。(A)纤维素植物工艺。(B)藻类脂质工艺。(C)多种生物燃料生产工艺的能量消耗和富N生物质的积累。详细计算见下文。(D)这个研究中开发了藻类蛋白转化成燃料的工艺。(E)来自蛋白的生物燃料的理论产率(产物克数/原材料克数)。实心柱:由排除原材料中的氨基基团计算的净产率。斜纹柱:用原材料中氨基基团计算的总产率。详见表3。图2A-C显示了群体感应失活对生物燃料生产的影响。误差棒表示标准偏差。(A)来自包含不同基因敲除的20个株的相对生物燃料生产效价。野生型株的生物燃料生产效价用作标准化基础。(B和C)YH19(改进氨基酸利用的株)的生物燃料生产(B)和OD(C)，及其群体感应基因敲除衍生物，有和没有过量表达所述异丁醇生成通路基因(芽孢杆菌(Bacillus subtilis)alsS、大肠杆菌ilvCD、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）kivd和adhA)。
图3A-E描述了氮中心代谢工程改造策略的整体设计。氨的释放用于驱动氨基酸降解反应以生成2-酮酸。删除gdhA和glnA基因以阻断氨的再摄取。黑色指示过量表达的基因。(A)氨基酸通过直接脱氨和生成NH3来降解。(B)氨基酸通过转氨和生成谷氨酸降解。(C-E)通过IlvE和LeuDH(C)，IlvE、AvtA、DadX和DadA(D)，和SerC、SerB、SdaB、PpsA、Eno和GpmA(E)设计转氨和脱氨循环。
图4A-D描述了生物燃料生产率的总体设计和优化。(A)开放培养池藻类培养到生物燃料的总体工艺的流程图(600亿加仑（gal）/年，是美国运输燃料消耗的约30%)。在流旁边列举了每个流中C(黑色)、N(灰色)和S(浅灰色)的元素质量流，没有H和O的相关质量。除非另外说明，所有值的单位是百万吨/年。富N生物质意在包含蛋白和糖，尽管使用蛋白到更高级醇的转化率计算。假设藻类物种的脂质含量是10%。正方形盒指示了主要的加工步骤，而椭圆形表示流的成分。每年数十亿加仑表示为Bgal/年。(B)藻类生物质产率作为脂质含量的函数。所述数据(11)从g/L/天转化成g/m2/天，假设培养池深度是0.2m。所述趋势线是图中所示指数函数的最好拟合。(C)考虑到(B)中的生物质生存率和蛋白到生物燃料的理论转化产率，脂质含量对整体生物燃料生产率的影响通过组合的蛋白-脂质工艺(实线)或仅脂质工艺(虚线)来计算。注意到蛋白-脂质工艺的总体生产率随着脂质含量的增加而降低，提示了蛋白部分更有效。(D)组合蛋白-脂质工艺中的最优脂质含量随着作为蛋白到更高级醇转化产率的函数变化。只要蛋白到生物燃料的转化大于理论产率的61%，那么所述工艺的蛋白加工部分比脂质加工更有效。假设从脂质到燃料的碳转化是100%。
图5显示了不同藻类物种、酵母提取物和两个传统蛋白来源之间氨基酸概况的相似性。
图6A-B显示了从各种氨基酸生成更高级醇的碳流驱动策略。(A)碳流驱动更高级醇生成的的代谢网络。氨基酸降解成各种2-酮酸，其通过2-酮酸脱羧酶(KivD)和醇脱氢酶(YqhD)转化成更高级醇。红色指示过量表达的基因。(B)轴下指示了在有过量表达基因的经工程改造大肠杆菌中异丁醇生成的结果。误差棒表示标准偏差。
图7显示了使用氮中心策略工程改造的大肠杆菌中生成生物燃料的链长分布。所述株是YH83(=alsS、ilvC、ilvD、avtA、leuDH、kivD、yqhD、ilvE、ilvA和sdaB的YH19Δg1nAΔLgdhAΔlsrA/过量表达)。
图8显示了使用藻类或细菌细胞水解产物在生长于烧瓶的经工程改造大肠杆菌株YH83中生成的生物燃料(EtOH、iBOH、2MB、3MB)。小的实验室级别的反应器(1升或30升)用于分别培养细菌和藻类细胞。所述藻类生物质混合物包含小球藻(C.vulgaris)、紫球藻（P.purpureum）、纯顶螺旋藻（S.platensis）、或蓝藻（S.elongates）。所有蛋白来源调整为包含21.6g/l的肽和氨基酸，这等同于4%酵母提取物的蛋白量。误差棒表示标准偏差(n=3)。
图9显示了酮酸转化成异丁醇和3-甲基-1-丁醇的总体示意图。
图10显示了酮酸转化成更高级醇的总体示意图。
图11A-C描述了生成己二酸的示意图。
发明详述
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个多核苷酸”包括多个这种多核苷酸，提及“所述微生物”包括一种或多种微生物，等等。
除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明所公开方法和组合物的实施中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了示例性的方法、设备和材料。
提供了上面和本文通篇讨论的出版物仅用于其在本申请提交日之前的任何公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
本文提供的特定实施例用于显示在生成各种2-酮酸中底物的变化和应用，所述底物包含例如蛋白生物质、蛋白水解物、氨基酸混合物、和单个游离氨基酸等。如下更充分描述，所述2-酮酸然后能进一步代谢成除了生物燃料以外的其他化学实体。
既然植物和藻类不能固定氮，通过植物或藻类的大规模生物燃料生成需要以铵或硝酸盐的形式固定氮，然后主要作为蛋白和少量核酸掺入生物质中。生物氮固定是由一些共生细菌例如根瘤菌和一些独立存活的微生物如鱼腥藻属进行的缓慢和能源密集型过程。非生物氮固定通过已知为哈伯博斯制氨法（Haber Bosch process）的催化方法实现，这也是能源密集型并且有害环境的。生成1摩尔NH3需要8摩尔ATP和4还原当量（通过生物氮固定）或者0.8MJ（通过哈伯博斯制氨法）(57MJ/Kg氮)。
为了生成生物燃料，植物生物质或藻类脂质转化成碳燃料，并且所述剩余富氮生物质用作动物饲料(图1A和1B)。在这些示例中，哈伯博斯制氨法需要固定氮的净输入(图1C)。目前氮肥料的化学合成已经达到每年10000万吨，并且消耗全球初级能量供应的约1.2%，并且如果所述生物燃料工艺按比例增加，所述合成会显著（substantially）增加。用作动物饲料的富氮残留物通过动物废料直接生成温室气体(GHG)。尽管动物饲料现在要求更高的价格，市场不久就会饱和(图1C)。美国畜牧业对富氮生物燃料残留物(即干酒糟及其可溶物，DDGS)的全部潜在需求是约4千2百万吨，对应植物燃料的154亿加仑副产品或者藻类生物燃料的43亿加仑副产品，分别是美国总共液体燃料使用的约7.7%或2.1%。因此，没有氮再循环时，超过上面水平的大规模生物燃料生产会造成地球上还原的氮或GHG的净积累，并且所述实践变成不可持续。
生物燃料生成的两个主要方案之间(图1A和1B)，藻类通常比植物长得更快(倍增时间小于24小时)，并且不与食物生成竞争。然而，藻类生物质包含大量蛋白(图5)，这需要较大净氮输入。另外，快速生长物种包含更高量的蛋白和更低量的液体。通常，氮限制用于以生长速率为代价而提高脂质积累。因此，所述脂质生成物种必需在封闭生物反应器中培养，或者面对被富蛋白天然物种占据的可能性。这种情况产生悖论：或者使用昂贵的封闭培养系统，或者使用有低脂质含量的物种。为了解决这个问题，在氮再循环的开放培养池中使用天然、快速生长藻类物种是理想的，因为这些物种适应局部盐度、温度和pH。既然所述快速生长物种通常含高蛋白和低脂质，就燃料生成和固定氮再循环使用富蛋白生物质能显著降低氨合成的能量成本和间接GHG排放(图1D)，而享用低成本开放培养系统。
不像与木质素形成顽固复合物的纤维素，单细胞蛋白能容易被蛋白酶水解成短肽和氨基酸，其已经有各种工业应用。肽键解离能(308KJ/mol)低于纤维素中的β-糖苷键(360KJ/mol)，并且更容易断裂。另外，不需要完全蛋白水解，因为短肽能被微生物利用。蛋白酶(量级为100-1000s-1的Kcat是比纤维素酶(甚至就预处理后的可溶底物而言，Kcat是0.1-10s-1量级)更有效的酶，并且很多微生物能天然分泌蛋白酶，提供了一个步骤中最终固结的生物加工的可能性。如下更充分描述，本发明显示了包含微生物蛋白生物质的底物能易于被预处理和酶促水解的简单过程水解。作为示例，预处理能由水中煮沸10分钟组成。酶促水解能通过37°C最小加载蛋白酶4小时完成。这种蛋白生物质水解工艺不需要任何高压、高温、化学加载、更长的预处理、或更长的酶促水解时间，其在纤维素水解工艺中是常见的。
为了将作为底物的肽和氨基酸转化成生物燃料而同时再循环氮，能通过酶如脱氨酶、氨基转移酶或脱氢酶催化的脱胺反应从氨基酸剪切氨基以形成铵。这些反应的很多产物是2-酮酸，其能转化成多种化学产品。其他氨基酸降解成TCA循环中间体，能通过葡萄糖异生作用酶如苹果酸酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶定向成丙酮酸，并且然后通过乙酰羟酸合成酶或异丙基苹果酸合成酶链延长通路转化成更长酮酸。
所有氨基酸能通过多种生物体组装的通路全部降解，并且所述单个氨基酸到醇(C2-C5)的最大理论产率是35-84%(表1A)。如果蛋白而不是所述水解产物用作计算基础，或者如果在计算净产率中排除所述氨基，所述产率甚至会更高(表1B和C)。通过使用常见藻类氨基酸组合物(图5)，来自藻类蛋白的组合醇的最大理论产率计算为60%(图1E;表2A和B)或73%(净产率，计算中排除氮)，高于来自糖的乙醇的产率(50%)。]
不幸的是，肽或氨基酸是较差的发酵底物，因为微生物偏好使用氨基酸用于生长而不是形成产物。氨基酸为微生物提供碳和氮。类似地，多种调节系统在适当位置以确保就细胞或微生物群落益处而言的最优营养物消耗。把氨基酸转化成更高级醇的天然通路仅支持少量产物形成。这种低效很大程度归因于不利的热力学梯度，所述梯度驱动转氨反应趋向氨基酸生物合成方向。因此，细菌中所述氨基酸代谢网络需要工程改造。
表1A。来自单个氨基酸的单个生物燃料的理论最大产率（每克氨基酸的醇克数）。来自游离氨基酸的总产率。
Figure BDA00003450444900111
表1B。来自单个氨基酸的单个生物燃料的理论最大产率（每克氨基酸的醇克数）。来自游离氨基酸的总产率。一分子肽基氨基酸获得一分子水以形成水解中的游离氨基酸。
Figure BDA00003450444900121
表1C来自单个氨基酸的单个生物燃料的理论最大产率（每克氨基酸的醇克数）。来自肽基氨基酸的净产率。在计算净产率时，因为氨要再循环，所述氨分子的分子量从各肽基氨基酸中推断得到。
Figure BDA00003450444900131
表2A。来自常见微生物质量的理论最优产物分布。小球藻的氨基酸概况用作输入质量流以计算达到最大醇生成时单个产物的质量生成。
Figure BDA00003450444900141
表2B。来自不同蛋白来源的理论生物燃料质量产率。在最右边一列，所述14aa指示了能转化成生物燃料经工程改造大肠杆菌的氨基酸。
Figure BDA00003450444900142
本公开提供了利用本公开重组微生物的化学生成系统，作为整体化学生成系统的一部分。例如，本公开提供了图4所示的生物燃料生成系统，其中在开放培养池中日光下产生藻类以生成生物质。利用所述生物质的脂质含量以生成生物柴油，而水解富氮生物质作为本公开重组微生物的底物。所述水解的富氮生物质然后加入包含本公开重组微生物的反应器系统。所述重组微生物代谢富氮生物质以生成多种化学品(依赖于特定重组通路，例如生成醇（例如更高级醇、己二酸等）的酶通路)。所述铵、CO2和副产品然后加回在开放培养池中生长的藻类以支持藻类生长。残留蛋白(如残留的富N生物质)然后能加入第二生物反应器系统以进一步再循环多种代谢物。图4的氮和碳中性生物燃料工艺的示意图利用日光作为能量来源，并且所述氮源是CO2。所述氮和硫来源是工艺中循环的氨和硫酸盐。频繁或持续收获条件下的天然选择通常会偏好快速生长的和稳健的生物体。收获后，首先加工所生成的生物质以就传统生物柴油生成获得脂质。水解蛋白部分，并且加入到第一阶段转换器以生成更高级醇。来自第一阶段的残留氨基酸然后加入第二阶段以生成循环返回所述水解单位的其他生物质。在两阶段转化中生成的CO2能返回藻类培养以富集获自大气的CO2。
在系统的一个实施方式中，所述藻类是富含蛋白或任何其他富含蛋白的光合自养薇生物的藻类。
这个设计的好处是其利用快速生长藻类物种和富N生长条件，促进高蛋白的生长和低脂质的积累(图4B)。理论衍生也显示了高蛋白产率物种有更高的生长速率。确实，所述高蛋白物种的生物质产率比高脂质物种高约10倍(图4B)，主要是因为蛋白呈指数式复制，而脂质是线性增加。使用藻类生物质产率和脂质含量之间的关系以及脂质和蛋白转化的理论燃料产率，能计算生物燃料的整体产率(图4C)。如果仅仅利用藻类生物质的脂质部分，随着脂质含量从0增加到20%，整体产率增加，但是当脂质含量增加超过20%时则下降(图4C,虚线)。当认为藻类物种的脂质含量增加实际上并不增加整体燃料产率时，此结果恒定。如果使用藻类生物质的脂质和蛋白部分，然后随着脂质含量增加，所述整体产率实际降低，指示了所述蛋白处理相比脂质处理在整体产率方面更有效。
本公开提供了经代谢工程改造、或重组的微生物，所述微生物包含从合适底物生成各种化合物的生物化学通路，所述底物例如包含单个氨基酸残基的底物、氨基酸残基混合物以及富N生物质。本发明的经代谢工程改造微生物包含生物体基因组内或生物体基因组外部的一个或多个重组多核苷酸。所述微生物包含编码脱氢酶、脱氨酶和/或转氨酶的多核苷酸序列。
所述微生物的特性还能是与野生型生物体相比时，有降低的氨再摄取活性，降低或破坏的群体感应系统例如降低或破坏的2型自诱导物(AI-2)的再摄取，降低的整体调节剂活性。这种降低能通过降低破坏或阻断与氨再摄取、群体感应例如2型自诱导物、和/或整体调节剂活性有关的基因完成。同样，所述微生物能包含选自下组的基因降低、破坏或敲除：在野生型生物体内发现的glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF基因或其任意组合，并且也能包含引入异源多核苷酸。
在一个实施方式中，本公开提供了重组微生物，所述微生物包含与母体微生物相比至少一个靶标酶表达的增加，或者所述微生物编码母体生物体中未发现的酶。所述微生物能包含参与下列的多肽的至少一个编码基因的下降、破坏或敲除：氨再摄取、2型自诱导物(AI-2)再摄取、整体调节剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、和/或谷氨酸合成酶，所述基因选自glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、Lrp、Fis、IHF或其任意组合。
上述实施方式的重组微生物生成增加的酮酸流，并且因此生成参与生物合成通路的至少一个代谢物，所述生物合成与野生型微生物相比时生成化合物的水平增加。所述化合物能是例如但不限于醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。所述醇能是来自合适底物的更高级醇，包含例如异丁醇、1-丁醇、1-丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯乙醇。通常，所述重组微生物包含至少一个重组代谢通路，所述通路包含靶标酶和可选还能包含选自下组酶的活性或表达下降：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF或其任意组合。所述通路用于修饰在生成上面所提供化学组合物中的底物或代谢中间体。所述靶标酶由衍生自合适生物来源的多核苷酸编码或表达。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含来自细菌或酵母来源和重组工程改造到本公开微生物中的基因。
本文使用的术语"经代谢工程改造的"或"代谢工程改造"涉及生物合成基因、操纵子相关基因、和这种多核苷酸控制元件的合理通路设计和组装，以用于生成所需代谢物如2-酮酸中增加的流。微生物中，能设计其他通路且生物合成基因、操纵子相关基因和这种多核苷酸的控制元件组装用于在微生物中增加生成和从头生成多种化合物，所述化合物包含例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。"经代谢工程改造的"还能包含通过调节和优化转录、翻译、蛋白稳定性和蛋白功能来优化代谢流，使用基因工程改造和合适的培养条件，包含降低、破坏或敲除与引起所需通路的中间体竞争的竞争性代谢通路。生物合成基因能对宿主微生物异源，这或是通过对宿主外源，或是通过突变、重组、和/或与内源宿主细胞中的异源表达控制序列相关联来修饰。一方面，当所述多核苷酸对宿主生物体是自然发生时，所述多核苷酸可以是密码子优化的。
术语"生物合成通路"也称为"代谢通路"，指转化（转变）一种化学物质到另一种的一组合成代谢或分解代谢的生物化学反应。如果其平行或顺序作用于相同的底物、生成相同的产物、或作用于或生成相同底物和代谢终产物之间的代谢中间体（即代谢物），那么基因产物属于相同的"代谢通路"。
例如，所述leuABCD操纵子包含leuA、leuB、leuC和leuD基因。其中，leuA编码α-异丙基苹果酸合成酶，leuB编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，leuC和leuD编码α-异丙基苹果酸异构酶。这些酶中，α-异丙基苹果酸合成酶催化从α-酮异戊酸到α-异丙基苹果酸的合成反应，α-异丙基苹果酸异构酶催化从α-异丙基苹果酸到β-异丙基苹果酸的异构化反应，和β-异丙基苹果酸脱氢酶催化从β-异丙基苹果酸到α-酮异己酸的脱氢反应，α-酮异己酸是L-亮氨酸生物合成的最终中间体。埃希氏菌（Escherichia）有四种转氨酶，即aspC基因编码的转氨酶A(天冬氨酸谷氨酸氨基转移酶)，由ilvGMEDA操纵子所含ilvE基因编码的转氨酶B(BCAA氨基转移酶)，avtA基因编码的转氨酶C(丙氨酸缬氨酸氨基转移酶)和tyrB基因编码的转氨酶D(酪氨酸氨基转移酶)。这些酶参与多种氨化反应。这些酶中，转氨酶B和转氨酶D催化上述从α-酮异己酸到L-亮氨酸的氨化反应，反之亦然。转氨酶C和转氨酶D催化L-缬氨酸生物合成通路的最终步骤，所述通路包含L-缬氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成之间的共有通路。
同样，leuABCD操纵子的表达被L-亮氨酸抑制。编码乙酰羟酸合酶I的ilvBN基因的表达受到L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，编码乙酰羟酸合酶II的ilvGM基因的表达受到L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，和编码乙酰羟酸合酶III的ilvIH基因的表达受到L-亮氨酸的抑制。
术语"底物"或"合适底物"指通过酶作用转化成或意味着要转化成另一化合物的任何物质或化合物。所述术语不仅包含单个化合物，也包含化合物的组合，例如包含至少一个底物或其衍生物的溶液、混合物和其他材料。另外，所述术语"底物"不仅包含提供适用作起始材料的碳源的化合物，例如来自糖或CO2的任意生物质，而且也包含用于本文所述经代谢工程改造微生物相关通路的中间体和终产物代谢物。"生物质衍生糖"包括但不限于分子例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。术语"生物质衍生糖"包含微生物通常使用的合适碳底物，例如6碳糖，包括但不限于葡萄糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，所有都是D或L型；或6碳糖组合，例如葡萄糖和果糖；和/或6碳糖酸，包括但不限于2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(IA)、葡糖酸(GA)、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮-D-葡糖酸(2-KDG)、5-酮-D-葡糖酸、2-酮葡萄糖磷酸、2,5-二酮-L-古洛糖酸、2,3-L-二酮古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸(EA)和D-甘露糖酸。富氮生物质指在能水解和纳入氮的例如蛋白、肽、氨基酸、氨基酸混合物、核酸或其他分子富集的生物质。这种富氮生物质包含大蛋白以及更小的肽(如二、三或更长的肽)、氨基酸和氨基酸混合物。
术语"醇"包含例如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯乙醇。
本文提供的重组微生物能表达多种靶标酶，所述酶参与使用合适的碳底物和/或氮源生成例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。在特定实施方式中，所述重组微生物包含选自glnA、gdhA、lsrA、luxS或其任意组合的基因或同源物的敲除。这种敲除使微生物的代谢流从氨基酸积累移向生成更多量酮酸、增加的酮酸流、并且然后生成所需上述化合物。
因此，代谢"工程改造"、"修饰"、或"重组"微生物通过将遗传材料引入到宿主或所选母体微生物来生成，因而修饰或改变微生物的细胞生理学和生物化学。通过引入遗传材料，所述母体微生物获得新的属性，如能生成新的、更高量的胞内代谢物。在示例性实施方式中，引入遗传材料到母体微生物产生新的或改良能力以生成所需化合物，这是通过代谢或由富氮生物质到2-酮酸，并且最终到例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。引入母体微生物的遗传材料包含一种或多种酶的编码基因、或基因部分，所述一种或多种酶参与生成任何上面化合物的生物合成通路，并且也可以包含表达和/或调控这些基因的其他元件，如启动子序列。
如上所述，所述工程改造或修饰的微生物除了引入遗传材料到宿主或母体微生物外，包含破坏、删除或敲除基因或多核苷酸以改变微生物的细胞生理学和生物化学。通过降低、破坏或敲除基因或多核苷酸，所述微生物获得新的或改善的特性(如能生成新的或更多数量的胞内代谢物，提高代谢物例如酮酸的流，下调所需通路，和/或降低不需要副产物的生成)。
例如，本公开显示了有异源kivd、yqhD，或其他醇脱氢酶和ilvA、leuA、leuB、leuC、leuD(或Leu操纵子，如leuABCD)、ansB、aspC、rocG、putA、ybaS、ilvA、glyA、sdaA、tnaA、alsS、ilvCD、ilvE的过量表达或异源表达，能从包含N或蛋白生物质中获得更高级醇的生成。从蛋白材料中生成2-酮酸也能引起从2-酮酸生成感兴趣的其他化学实体，例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。某些实施方式能包含任何一种或多种上述基因的表达或过量表达，所述一种或多种基因伴随着减少或敲除氨再摄取、群体感应基因活性例如2型自诱导物(AI-2)再摄取、和/或整体调节剂基因等。在特定实施方式中，任何一种或多种上述基因的表达或过量表达也能伴随敲除或降低选自下组的基因或同源物表达：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF、或其任意组合。生成例如醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等涉及多种2-酮酸中间体。
本公开也显示了编码下面多肽的一种或多种异源多核苷酸的表达或一种或多种内源多核苷酸的过量表达用于生成代谢通路以产生任何数目的其他所需化合物。例如，在谷氨酸通路中，谷氨酸通过有谷氨酸脱氢酶(gdh)活性的多肽转化成2-KG(2-酮戊二酸)。通过有高柠檬酸合成酶(hcs)活性和高异乌头酸酶(hacAB)活性的多肽连续反应后，2-KG转化成高异柠檬酸，其通过有高异柠檬酸脱氢酶(hicDH)活性的多肽还原脱羧成α酮己二酸。本发明多肽的编码多核苷酸可以来自任意数量的微生物，包含酿酒酵母、嗜热栖热菌、和本领域其他已知的微生物。所述多核苷酸可以是突变或变异的酶，来自来源生物体并且然后修饰或工程改造成具有提高的表达和/或活性。在一个实施方式中，所述参与谷氨酸通路的酶的编码多核苷酸从多种生物体中克隆，包含酿酒酵母和嗜热栖热菌。
在本发明的赖氨酸通路中，赖氨酸通过有赖氨酸转氨酶(lat)活性的多肽脱氨成2-氨基己二酸-6-半醛。然后，有哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)活性的多肽催化形成α-氨基己二酸。所述氨基团然后通过有2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)活性的多肽脱胺。本发明多肽的编码多核苷酸可以来自任意数量的微生物，包含黄杆菌（F.lutescens)、棒状链霉菌、智人、和本领域其他已知的微生物。所述多核苷酸可以是突变或变异的酶，来自来源生物体并且然后修饰或工程改造成具有提高的表达和/或活性。在一个实施方式中，所述酶的编码多核苷酸能克隆自多种生物体，包含黄杆菌（F.lutescens)、棒状链霉菌、智人、和本领域其他已知的生物体。
例如对从中间体α酮己二酸生成己二酸而言，工程改造两个生物途径(CoA非依赖性通路和CoA依赖性通路)与一个化学途径，如图3所示。对生物转化而言，α酮己二酸转化成α-羟基己二酸，所示转化通过各种有脱氢酶活性的多肽，包含来自各种微生物的有亮氨酸脱氢酶(ldhA)活性的多肽、有苹果酸脱氢酶(mdh)活性的多肽、和有羟基异己酸脱氢酶(hdh)活性的多肽。在CoA非依赖性通路中，工程改造天然还原性TCA循环的模仿通路，其在厌氧条件下通过苹果酸和富马酸将草酰乙酸盐转化成琥珀酸盐。富马酸还原酶基因(例如fumA或fumB)的突变能提供促进α-羟基己二酸脱水的多肽。能通过来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutyricum）的丁烯酸脱氢酶突变来构建下一步骤。在CoA依赖性通路中，艰难梭菌（Clostridium difficille）中异己酸的生成通路能用于衍生将α羟基己二酸转化成己二酸的多肽。第一步是通过有CoA转移酶(hadA)活性的多肽催化生成R-2-羟基异己酰CoA。然后，R-2-羟基异己酰-CoA通过脱水酶活化剂复合物(如hadBC hadI)的脱水生成2-异己烯酰-CoA，其通过有酰基CoA脱氢酶(acdB etfBA)活性的多肽还原成异己酰-CoA。最终，CoA部分通过CoA转移酶(hadA)除去以生成己二酸。使用包含铂的多种金属催化剂也可能将α酮己二酸化学还原成己二酸。在其他实施方式中，所述微生物包含内源谷氨酸生成通路。例如，有谷氨酸生成通路的有用生物体包含来自诸如短杆菌属(Brevibacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、微杆菌属（Microbacterium）、棒状杆菌属(Corynebacterium)等属的那些细菌或酵母物种。
有谷氨酸脱氢酶(gdh)的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有谷氨酸脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:1)有80%-99%相同性。例如，谷氨酸脱氢酶能包含来自酿酒酵母或解朊假丝酵母变种（Candida famata var.）的SEQ IDNO:2，有示于GenBank登录号CAQ53143的序列(通过引用纳入本文)。用于本公开方法和组合物的其他合适谷氨酸脱氢酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有高柠檬酸合成酶的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有高柠檬酸合成酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:4所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:3)有80%-99%相同性。例如，高柠檬酸合成酶能包含来自酿酒酵母或嗜热栖热菌的SEQ ID NO:4，有示于GenBank登录号BAA33785的序列(通过引用纳入本文)。用于本公开方法和组合物的其他合适高柠檬酸合成酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有高乌头酸酶活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有高乌头酸酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:6所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:5)有80%-99%相同性。例如，高乌头酸酶能包含来自酿酒酵母或皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)的SEQ ID NO:6，有示于GenBank登录号XP_002620204的序列(通过引用纳入本文)。用于本公开方法和组合物的其他合适高柠檬酸合成酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有高异柠檬酸脱氢酶活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有高异柠檬酸脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQ IDNO:8所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:7)有80%-99%相同性。例如，高异柠檬酸脱氢酶多肽能包含来自嗜热栖热菌的SEQ ID NO:8。用于本公开方法和组合物的其他合适高柠檬酸合成酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有赖氨酸转氨酶活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有赖氨酸转氨酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:10所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:9)有80%-99%相同性。例如，赖氨酸转氨酶多肽能包含来自棒状链霉菌的SEQ ID NO:10。用于本公开方法和组合物的其他合适赖氨酸转氨酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:12所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:11)有80%-99%相同性。例如，哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)多肽能包含来自黄杆菌（Flavobacterium lutescens）的SEQID NO:12。用于本公开方法和组合物的其他合适哌啶6-羧酸脱氢酶(pcd)能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:14所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:13)有80%-99%相同性。例如，2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)多肽能包含来自智人的SEQID NO:14。用于本公开方法和组合物的其他合适2-氨基己二酸氨基转移酶(aadat)使能用例如BLAST算法容易鉴定。
有亮氨酸脱氢酶(ldh)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有亮氨酸脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:16所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:15)有80%-99%相同性。例如，亮氨酸脱氢酶多肽能包含来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的SEQ IDNO:16。用于本公开方法和组合物的其他合适亮氨酸脱氢酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有苹果酸脱氢酶(mdh)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有苹果酸脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:18所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:17)有80%-99%相同性。例如，苹果酸脱氢酶多肽能包含来自大肠杆菌的SEQ ID NO:18。用于本公开方法和组合物的其他合适苹果酸脱氢酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有羟基异己酸脱氢酶(hdh)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有羟基异己酸脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQID NO:20所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:19)有80%-99%相同性。例如，羟基异己酸脱氢酶多肽能包含来自烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的SEQ ID NO:20。用于本公开方法和组合物的其他合适羟基异己酸脱氢酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
两个膜结合的含FAD酶负责催化富马酸和琥珀酸的互变;所述富马酸还原酶用于厌氧生长，而所述琥珀酸脱氢酶用于好氧生长。富马酸还原酶包含多个亚基(如大肠杆菌中的frdA、frdB、和frdC)。任意一个亚基的修饰能产生本文所需活性。例如，敲除frdB、frdC或frdBC用于本公开的方法。已知Frd的同源物和变体。例如，同源物和变体包含例如富马酸还原酶亚基D(富马酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD_ECOLI(67463543);富马酸还原酶亚基C(富马酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC_PROVU(1346037);富马酸还原酶亚基D(富马酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|120499|sp|P20924.1|FRDD_PROVU(120499);富马酸还原酶亚基C(富马酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|67463538|sp|POA8Q0.1|FRDC_ECOLI(67463538);富马酸还原酶铁硫亚基(大肠杆菌)gi|145264|gb|AAA23438.1|(145264);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(大肠杆菌)gi|145263|gb|AAA23437.1|(145263);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU(37538290);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120489|sp|P00363.3|FRDA_ECOLI(120489);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU(120490);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(Flavocytochrome c)(Flavocytochrome c3)(Fcc3)gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA_SHEFN(119370087);富马酸还原酶铁硫亚基gi|81175308|sp|POAC47.2|FRDB_ECOLI(81175308);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(Flavocytochrome c)(Flavocytochrome c3)(Fcc3)gi|119370088|sp|POC278.1|FRDA_SHEFR(119370088);Frd操纵子未表征的蛋白C gi|140663|sp|P20927.1|YFRC_PROVU(140663);frd操纵子可能的（probable）铁硫亚基A gi|140661|sp|P20925.1|YFRA_PROVU(140661);富马酸还原酶铁硫亚基gi|120493|sp|P20921.2|FRDB_PROVU(120493);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|2494617|sp|006913.2|FRDA_HELPY(2494617);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(铁(III)诱导的flavocytochrome C3)(Ifc3)gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2_SHEFN(13878499);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54041009|sp|P64174.1|FRDA_MYCTU(54041009);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54037132|sp|P64175.1|FRDA_MYCBO(54037132);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|12230114|sp|Q9ZMP0.1|FRDA_HELPJ(12230114);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|1169737|sp|P44894.1|FRDA_HAEIN(1169737);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes))gi|13160058|emb|CAA04214.2|(13160058);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(flavocytochrome c)(FL cyt)gi|25452947|sp|P83223.2|FRDA_SHEON(25452947);富马酸还原酶铁硫亚基(产琥珀酸沃廉菌)gi|2282000|emb|CAA04215.1|(2282000);和富马酸还原酶细胞色素b亚基(产琥珀酸沃廉菌)gi|2281998|emb|CAA04213.1|(2281998)，与登录号有关的各序列通过引用全文纳入本文。
有羟基异己酸CoA转移酶(hadA)活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有羟基异己酸CoA转移酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:22所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:21)有80%-99%相同性。例如，羟基异己酸CoA转移酶多肽能包含来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的SEQ ID NO:22。用于本公开方法和组合物的其他合适羟基异己酸CoA转移酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有2-羟基异己酰-CoA脱水酶活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有2-羟基异己酰-CoA脱水酶活性的示例性多肽与SEQ ID NO:24(对应核苷酸序列示于SEQ ID NO:23)和SEQ ID NO:26(对应核苷酸序列示于SEQ ID NO:25)所示序列能有80%-99%相同性。例如，2-羟基异己酰-CoA脱水酶活性多肽能包含来自艰难梭菌的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26。用于本公开方法和组合物的其他合适2-羟基异己酰-CoA脱水酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
2-羟基异己酰-CoA激活剂多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有2-羟基异己酰-CoA脱水酶活性的示例性多肽能与SEQID NO:27所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:26)有80%-99%相同性。例如，2-羟基异己酰-CoA脱水酶活化多肽能包含来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的SEQID NO:27。用于本公开方法和组合物的其他合适2-羟基异己酰-CoA脱水酶活化酶能使用例如BLAST算法容易鉴定。
有酰基CoA脱氢酶活性的多肽为本领域已知或能重组生产，包含有增加或改善活性的非天然产生的多肽。有酰基CoA脱氢酶活性的示例性多肽能与SEQ ID NO:29所示序列(相应核苷酸序列示于SEQ ID NO:28)有80%-99%相同性。例如，酰基CoA脱氢酶多肽能包含来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的SEQ ID NO:29。用于本公开方法和组合物的其他合适酰基CoA脱氢酶使用例如BLAST算法容易鉴定。
改进本文提供的微生物以生成母体微生物中无法得到数量的代谢物。"代谢物"指任何代谢产生的物质，或者对特定代谢过程必需或者参与其中的物质。代谢物能是作为代谢起始材料的有机化合物(如葡萄糖、蛋白/肽、氨基酸、氨基酸混合物或丙酮酸)、中间体(如2-酮酸)、或终产物(如醇(如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-苯乙醇)、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和/或S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。代谢物能用于构建更复杂的分子，或其能降解成更简单的分子。中间体代谢物可以从代谢物合成获得，可用于生产更复杂的物质，或降解成更简单的化合物，经常释放化学能。
示例性代谢物包含蛋白、肽、富氮生物材料、葡萄糖、丙酮酸、1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯乙醇和2-酮酸。如图12所示，示例性2-酮酸中间体包含2-丁酮酸、2-酮异戊酸、2-酮戊酸、2-酮-3-甲基戊酸(2-keto-3-methyvalerate)、2-酮-4-甲基-戊酸和苯丙酮酸。图12显示的示例性2-酮酸可以用作生产下列物质的代谢中间体：醇(如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-苯乙醇)、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和/或S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。例如，代谢工程改造成提供由例如Leu操纵子(如LeuABCD)编码的2-异丙基苹果酸合成酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶和异丙基苹果酸异构酶表达提高的重组微生物从2-丁酮酸生成2-酮戊酸。所述2-酮戊酸代谢物可以用于通过由代谢改性微生物生成的其他酶生成1-丁醇。另外，1-丙醇和2-甲基-1-丁醇能通过重组微生物从2-丁酮酸和2-酮-3-甲基-戊酸生成，所述重组微生物代谢工程改造成表达或过量表达由例如i1vIHDC、kdc和adh基因编码的乙酰羟酸合酶、α-酮酸脱羧酶、和醇脱氢酶。再者，所述代谢物2-酮异戊酸能由重组微生物生成，所述重组微生物代谢工程改造成表达或过量表达能由例如i1vIHCD基因编码的乙酰羟酸合酶。所述代谢物然后能用于生成异丁醇或3-甲基-1-丁醇。另外，所述代谢物2-酮异戊酸能由重组微生物生成，所述重组微生物代谢工程改造成表达或过量表达除了氨基酸/蛋白代谢酶以外的由例如i1vIHCD基因编码的乙酰羟酸合酶。所述代谢物然后能用于生成异丁醛、3-甲基-1-丁醛和缬氨酸。所述代谢物丙酮酸和/或苯丙酮酸能由重组微生物生成，所述重组微生物通过代谢工程改造成表达或过量表达能由例如kdc和yqhD编码的α-酮酸脱羧酶、和醇脱氢酶。相似地，丙酮酸能用于生成2-苯乙醇、乙酸、乙醛、异丁醛、正丁醛、2,3-丁二醇、L-乳酸、D-乳酸、芳香化合物(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、莽草酸)、聚羟基丁酸(PHB)、甲羟戊酸、类异戊二烯和脂肪酸。
因此，本文提供了重组微生物，所述重组微生物生成醇例如异丁醇，并且在某些方面除了将氨基酸或中间体转化成丙酮酸或2-酮酸的酶以外，还可包含表达提高的靶标酶例如乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮-酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc)、和醇脱氢酶(如ADH2或YQHD)。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及选自下组的基因或同源物：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氨基氮积累到释放。在一些方面，所述重组微生物可以包含表达提高的乙酰乳酸合酶(如alsS)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc)、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及微生物中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
也提供了重组微生物，所述重组微生物生成例如2-甲基-1-丁醇，并且在一些方面除了将氨基酸或中间体转化成丙酮酸或2-酮酸的酶以外，还可包含表达提高的靶标酶例如苏氨酸脱水酶(如ilvA或tdcB)、乙酰羟酸合成酶(如ilvIH操纵子)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮-酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd、和/或pdc、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及选自下组的基因或同源物：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氮积累到释放。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及微生物中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
也提供了重组微生物，所述重组微生物生成例如3-甲基-1-丁醇，和在一些方面除了将氨基酸或中间体转化成丙酮酸或2-酮酸的酶以外，还包含表达提高的靶标酶例如乙酰乳酸合酶(如alsS)、乙酰羟酸合酶(如ilvIH)、乙酰乳酸合酶(如ilvMG或ilvNB，例如有SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64、或SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示核苷酸和氨基酸序列的ilvNB)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-异丙基苹果酸合成酶(leuA)、异丙基苹果酸异构酶(如leuC、D或leuCD操纵子)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、2-酮酸脱羧酶(如kivd、PDC6或THI3)、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及选自下组的基因或同源物：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHF，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氮积累到释放。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及生物素中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
再者，本文提供了重组微生物，所述重组微生物生成乙酸盐、乙醛、异丁醛、正丁醛、2,3-丁二醇、L-乳酸、D-乳酸、芳香化合物(例如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、莽草酸)、PHB(聚羟基丁酸)、甲羟戊酸、类异戊二烯、脂肪酸、GABA(4-氨基丁酸)、谷氨酸、琥珀酸、苹果酸、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、苏氨酸、甲硫氨酸、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)、2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸、高丙氨酸、异丁醛、3-甲基-l-丁醛、缬氨酸、3-甲基-l-丁醛、亮氨酸、2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸，和在一些方面除了将氨基酸或中间体转化成丙酮酸或2-酮酸的酶以外，还包含表达提高的靶标酶例如乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc)、和醇脱氢酶(如ADH2或YQHD)。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及参与氨再摄取、2型自诱导物(AI-2)再摄取、和/或全局调控例如基因或同源物的多肽表达的缺失或抑制，所述基因或同源物选自下组：ginA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHP，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氨基氮积累到释放。在一些方面，所述重组微生物可以包含提高的乙酰乳酸合酶(如alsS)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc)、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)表达。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及微生物中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
在另一个实施方式中，能出现所述靶标酶例如苏氨酸脱水酶(如ilvA或tdcB)、乙酰羟酸合酶(如ilvIH操纵子)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd、和/或pdc、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)表达的升高。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及参与氨再摄取、群体感应如2型自诱导物(AI-2)再摄取、和/或全局调控例如基因或同源物的多肽表达的缺失或抑制，所述基因或同源物选自下组：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHP，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氮积累到释放。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及微生物中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
在另一个实施方式中，能出现所述靶标酶例如乙酰乳酸合酶(如alsS)、乙酰羟酸合酶(如ilvIH)、乙酰乳酸合酶(如ilvMG或ilvNB)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-异丙基苹果酸合成酶(leuA)、异丙基苹果酸异构酶(如leuC、D或leuCD操纵子)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、2-酮酸脱羧酶(如kivd、PDC6、或THI3)、和醇脱氢酶(如ADH2、YQHD)表达的升高。所述微生物还可以包含下列表达的缺失或抑制：乙醇脱氢酶(如adhE)、ldh(如ldhA)、frd(如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB或pta基因，或其任意组合，以及参与氨再摄取、群体感应如2型自诱导物(AI-2)再摄取、和/或全局调控例如基因或同源物的多肽表达的缺失或抑制，所述基因或同源物选自下组：glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、和/或IHP，或其任意组合，从而增加丙酮酸可用性或减少与代谢物在所需生物合成通路中竞争的酶或者改变代谢流从氮积累到释放。关于醇脱氢酶，尽管乙醇脱氢酶是醇脱氢酶，合成乙醇是所述生物代谢通路中不需要的副产品。因而，提及微生物中醇脱氢酶活性或表达的增加特异性排除乙醇脱氢酶的活性。
如前所述，本公开通篇所述的靶标酶通常生成代谢物。例如，所述酶2-异丙基苹果酸合成酶(leuA)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(leuB)、和异丙基苹果酸异构酶(leuC、leuD或leuCD操纵子)可以从包含2-丁酮酸的底物生成2-酮戊酸。另外，本公开通篇所述的靶标酶由多核苷酸编码。例如，苏氨酸脱水酶能由来自ilvA基因的多核苷酸编码。乙酰羟酸合酶能由来自ilvIH操纵子的多核苷酸编码。乙酰羟酸同分异构体还原酶能由来自ilvC基因的多核苷酸编码。二羟酸脱水酶能由来自ilvD基因的多核苷酸编码。2-酮-酸脱羧酶能由来自PDC6、ARO10、THI3、kivd、和/或pdc基因的多核苷酸编码。醇脱氢酶能由来自ADH2或YQHD基因的多核苷酸编码。本申请也描述了其他酶和示例性基因。各种多肽和多核苷酸的同源物能来自提供合适酶的合适编码多核苷酸的任何生物来源。例如同源物能通过参照各种数据库来鉴定。
本公开鉴定了用于本公开所述方法、组合物和生物体的特定基因;然而，应认识到并不需要与这些基因绝对的相同性。例如，能进行对包含多肽或酶编码序列的特定基因或多核苷酸的改变，并且筛选活性。通常这种改变包含保守性突变和沉默突变。能使用本领域已知方法就功能酶活性的表达来筛选这种修改或突变的多核苷酸和多肽。
由于遗传编码的固有简并性，也能使用编码基本相同或功能等同多肽的其它多核苷酸来克隆和表达编码这些酶的多核苷酸。
本领域技术人员应理解，修改编码序列以增加在特定宿主中的表达是有利的。所述遗传密码是冗余的，有64个可能的密码子，但是大部分生物通常使用这些密码子的一个亚组。在物种中最经常使用的密码子称为最优密码子，而那些不经常利用的分类为罕见或低使用密码子。能取代密码子以反映宿主的优选密码子使用，这个过程有时称为"密码子优化"或"物种密码子偏好控制"。
能制备特定原核或真核宿主偏好的包含密码子的优化编码序列(也参见Murray等，(1989)Nucl.Acids Res.17:477508)，与非优化序列生成的转录本相比，例如增加翻译速率或生成有所需属性例如更长半衰期的重组RNA转录本。翻译终止密码子也能进行修饰以反映宿主偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌共用UAA作为终止密码子(Dalphin等(1996)Nucl.Acids Res.24:216218)。就植物中表达优化核苷酸序列的方法提供于例如美国专利号6,015,891和其中引用的参考文献。
本领域技术人员应认识到由于遗传密码的简并特性，在其核苷酸序列上不同的多种DNA化合物能用于编码本公开给定的酶。本文引用的编码上述生物合成酶的天然DNA序列仅用于说明本公开的实施方式，并且本公开包含编码本公开方法所用酶的多肽和蛋白氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。采用相似的方式，多肽能通常耐受其氨基酸序列上的一个或多个氨基酸取代、缺失和插入，而不损失或显著损失所需活性。本公开包含氨基酸序列不同于本文所述特定蛋白的这种多肽，只要改性或变异的多肽有参照多肽的酶学合成代谢或分解代谢活性。再者，由本文所示DNA序列编码的所述氨基酸序列仅仅说明本公开的实施方式。
另外，用于生成代谢物(如酮硫解酶、乙酰CoA乙酰基转移酶、羟基丁酰基CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁烯酰CoA还原酶、丁酰基CoA脱氢酶、醇脱氢酶(ADH))的酶的同源物包含在本文提供的微生物和方法中。涉及第一家族或物种的原始酶或基因使用的所述术语"同源物"指第二家族或物种的不同酶或基因，其通过功能、结构或基因组分析测定是与第一家族或物种的原始酶或基因对应的第二家族或物种的酶或基因。通常，同源物有功能、结构或基因组相似性。通过已知技术，酶或基因的同源物能易于使用基因探针和PCR克隆。鉴定克隆的序列为同源物能使用功能分析和/或基因的基因组作图来证实。
如果所述编码蛋白的核酸序列与所述编码第二蛋白的的核酸序列有相似的序列，那么蛋白有"同源性"或对第二蛋白是"同源的"。或者，如果两个蛋白有"相似的"氨基酸序列，蛋白对第二蛋白有同源性。(因此，所述术语"同源蛋白"定义成指两个蛋白有相似的氨基酸序列)。
如本文所用，当所述氨基酸序列有至少约30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同性时，两个蛋白(或所述蛋白区域)基本同源。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分数，比对序列以用于最优比较目的(例如，缺口能引入到优化比对的第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者，并且能出于比较目的忽略非同源序列)。在一个实施方式中，出于比较目的比对的参照序列长度是参照序列长度的至少30%、通常至少40%、更通常至少50%、甚至更通常至少60%、和甚至更加通常至少70%、80%、90%、100%。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位点被第二序列对应位点的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位点相同(本文使用的氨基酸或核酸"相同性"等同于氨基酸或核酸"同源性")。两个序列间的相同性百分数是序列间共享的相同位置数量的函数，并考虑到为两个序列的最优比对而需要引入的缺口数量和各缺口的长度。例如，提及kivd基因包含来自编码有基本相似酶活性的酶的其他生物的同源物(如pdc6、aro10、thI3、pdc、kdcA、pdc1、pdc5)，以及与参照基因有至少30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、或99%相同性，并且其编码的酶有与参照基因基本相似酶活性的基因。例如，乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的丙酮酸脱羧酶与Kivd在氨基酸水平有37%相同性；kivd和thI3在核酸水平有32%相同性；粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的醇脱氢酶与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ADH2在氨基酸序列水平有52%相同性；酿酒酵母adh2和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的adh有49%相同性；KIVD(乳酸乳球菌(SEQ ID NO:31和32))和PDC6(酿酒酵母(SEQ ID NO:33和34))共有36%相同性(阳性=322/562(57%),缺口=24/562(4%));KIVD(乳酸乳球菌和THI3(酿酒酵母)共有32%相同性(阳性=307/571(53%),缺口=35/571(6%));kivd(乳酸乳球菌)和ARO10(酿酒酵母(SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36))共有30%相同性(阳性=296/598(49%),缺口=65/598(10%));ARO10(酿酒酵母)和PDC6(酿酒酵母)共有34%相同性(阳性=320/616(51%),缺口=61/616(9%));ARO10(酿酒酵母)和THI3(酿酒酵母(SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38))共有30%相同性(阳性=304/599(50%),缺口=48/599(8%));ARO10(酿酒酵母)和丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC824)共有30%相同性(阳性=291/613(47%),缺口=73/613(11%));PDC6((酿酒酵母)和THI3(酿酒酵母)共有50%相同性(阳性=402/561(71%),缺口=17/561(3%));PDC6(酿酒酵母)和丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40))共有38%相同性(阳性=328/570(57%),缺口=30/570(5%));和THI3(酿酒酵母)和丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)共有35%相同性(阳性=284/521(54%),缺口=25/521(4%))。本文列举的各基因和多肽/酶的序列能易于使用互联网上可用的数据库鉴定(参见例如韩国科学技术院（Korea Advanced Institute of Science and Technology）的化学和分子生物工程学系维护的大肠杆菌蛋白数据库)。另外，使用本领域熟知的常用算法能就相同性容易比较氨基酸序列和核酸序列。
当"同源"涉及蛋白或肽使用时，应认识到不一致的残基位点经常由于保守性氨基酸取代而不同。"保守性氨基酸取代"是一个氨基酸残基由另一个有相似化学属性(如电荷或疏水性)侧链(R基团)的氨基酸残基取代。通常，保守性氨基酸取代基本不改变蛋白的功能属性。当两个或多个氨基酸序列通过保守取代互相不同的示例中，序列相同性或同源性程度的百分比可以调整以校正所述取代的保守特性。完成这种调整的方法为本领域技术人员熟知(参见例如Pearson等，(1994),Meth.Mol.Biol.25:365-389，此处通过引用纳入本文)。
以下六组各自含有可互相保守取代的氨基酸：
1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
多肽的序列同源性也称为序列相同性百分比，通常使用序列分析软件测量。参见例如遗传计算机组(GCG)的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊53705的威斯康星大学生物技术中心。蛋白分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰（包含保守氨基酸取代）的同源性量度来匹配相似序列。例如，GCG包含程序例如"Gap"和"Bestfit"，能用默认参数测定紧密相关多肽之间的序列同源性或序列相同性，所述紧密相关多肽例如来自不同生物种类或野生型蛋白和其突变体之间的同源多肽。参见，例如GCG6.1版。
用于比较分子序列与包含大量不同生物体序列的数据库的通常算法是计算机程序BLAST(Altschul,(1990)J.Mol.Biol.215:403-441;Gish,(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402;Zhang,(1997)Genome Res.7:649-656)，特别是blastp或tblastn(Altschul,(1997)Nucl.Acids Res.25:3389-3402)。通常BLASTp的参数是:期望值:10(默认);过滤器:seg(默认);打开缺口的成本:11(默认);延伸缺口的成本:1(默认);最大比对:100(默认);字长:11(默认);描述数目:100(默认);罚分矩阵:BLOWSUM62。
表3和本公开提供了有本领域技术人员可用多核苷酸和多肽序列的各基因的基因和同源物的非限定性示例。
表3：就生成各种更高级醇描述重组通路("+"=表达，增加表达或活性/"-"=降低表达或活性或敲除*)。
Figure BDA00003450444900341
·在合成产物中可以任选敲除或减少表达，然而，这种敲除增加多种底物中间体和提高产率。
本公开提供了用于生成本文所述重组微生物的多种基因、同源物和变体。应理解本文所述同源物和变体是示例性和非限定的。使用各种数据库，包含例如互联网上可用的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，其他同源物、变体和序列对本领域技术人员是可用的。
乙醇脱氢酶(也称为醛-醇脱氢酶)在大肠杆菌中由adhE编码。adhE包含三种活性：醇脱氢酶(ADH)；乙醛/乙酰-CoA脱氢酶(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶（deactivase）(PFL失活酶);PFL失活酶活性催化铁、NAD和CoA依赖性反应中丙酮酸-甲酸-裂合酶催化剂的淬灭。同源物为本领域已知(参见例如醛-醇脱氢酶(Polytomella sp.pringsheim198.80)gi|40644910|emb|CAD42653.2|(40644910);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌（Clostridium botulinums）A型株ATCC3502)gi|148378348|ref|YP_001252889.1|(148378348);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌（Yersiniapestis）CO92)gi|16122410|ref|NP_405723.1|(16122410);醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）IP32953)gi|51596429|ref|YP_070620.1|(51596429);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）CO92)gi|115347889|emb|CAL20810.1|(115347889);醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森菌（Yersiniapseudotuberculosis）IP32953)gi|51589711|emb|CAH21341.1|(51589711);醛-醇脱氢酶(大肠杆菌CFT073)gi|26107972|gb|AAN80172.1|AE016760_31(26107972);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）生物型田鼠型菌株（biovar Microtus str.）91001)gi|45441777|ref|NP_993316.1|(45441777);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型田鼠型菌株91001)gi|45436639|gb|AAS62193.1|(45436639);醛-醇脱氢酶(产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）ATCC13124)gi|110798574|ref|YP_697219.1|(110798574);醛-醇脱氢酶(内德斯希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1)gi|24373696|ref|NP_717739.1|(24373696);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌（Clostridiumbotulinums）A型株ATCC19397)gi|153932445|ref|YP_001382747.1|(153932445);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型古典型(Antiqua)菌株E1979001)gi|165991833|gb|EDR44134.1|(165991833);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌（Clostridiumbotulinums）A型株Hall)gi|153937530|ref|YP_001386298.1|(153937530);醛-醇脱氢酶(产气荚膜梭菌ATCC13124)gi|110673221|gb|ABG82208.1|(110673221);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌A型株Hall)gi|152933444|gb|ABS38943.1|(152933444);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）生物型东方型菌株F1991016)gi|165920640|gb|EDR37888.1|(165920640);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型东方型菌株IP275)gi|165913933|gb|EDR32551.1|(165913933);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌Angola)gi|162419116|ref|YP_001606617.1|(162419116);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌（Clostridium botulinums）F型株Langeland)gi|153940830|ref|YP_001389712.1|(153940830);醛-醇脱氢酶(大肠杆菌HS)gi|157160746|ref|YP_001458064.1|(157160746);醛-醇脱氢酶(大肠杆菌E24377A)gi|157155679|ref|YP_001462491.1|(157155679);醛-醇脱氢酶(小肠结肠炎耶尔森菌小肠结肠炎亚种(Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica)8081)gi|123442494|ref|YP_001006472.1|(123442494);醛-醇脱氢酶(聚球藻属(Synechococcus sp.)JA-3-3Ab)gi|86605191|ref|YP_473954.1|(86605191);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)株4b F2365)gi|46907864|ref|YP_014253.1|(46907864);醛-醇脱氢酶(粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）V583)gi|29375484|ref|NP_814638.1|(29375484);醛-醇脱氢酶(无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603V/R)gi|22536238|ref|NP_687089.1|(22536238);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌A型株ATCC19397)gi|152928489|gb|ABS33989.1|(152928489);醛-醇脱氢酶(大肠杆菌E24377A)gi|157077709|gb|ABV17417.1|(157077709);醛-醇脱氢酶(大肠杆菌HS)gi|157066426|gb|ABV05681.1|(157066426);醛-醇脱氢酶(肉毒梭菌F型株Langeland)gi|152936726|gb|ABS42224.1|(152936726);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌CA88-4125)gi|149292312|gb|EDM42386.1|(149292312);醛-醇脱氢酶(小肠结肠炎耶尔森菌小肠结肠炎亚种8081)gi|122089455|emb|CAL12303.1|(122089455);醛-醇脱氢酶(莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))gi|92084840|emb|CAF04128.1|(92084840);醛-醇脱氢酶(聚球藻属JA-3-3Ab)gi|86553733|gb|ABC98691.1|(86553733);醛-醇脱氢酶(内德斯希瓦氏菌MR-1)gi|24348056|gb|AAN55183.1|AE015655_9(24348056);醛-醇脱氢酶(粪肠球菌V583)gi|29342944|gb|AAO80708.1|(29342944);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌株4b F2365)gi|46881133|gb|AAT04430.1|(46881133);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌株1/2a F6854)gi|47097587|ref|ZP_00235115.1|(47097587);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌株4b H7858)gi|47094265|ref|ZP_00231973.1|(47094265);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌株4b H7858)gi|47017355|gb|EAL08180.1|(47017355);醛-醇脱氢酶(单核细胞增生利斯特菌株1/2a F6854)gi|47014034|gb|EAL05039.1|(47014034);醛-醇脱氢酶(无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2603V/R)gi|22533058|gb|AAM98961.1|AE014194_6(22533058)p;醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型古典型(Antiqua)菌株E1979001)gi|166009278|ref|ZP_02230176.1|(166009278);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型东方型菌株IP275)gi|165938272|ref|ZP_02226831.1|(165938272);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌生物型东方型菌株F1991016)gi|165927374|ref|ZP_02223206.1|(165927374);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌Angola)gi|162351931|gb|ABX85879.1|(162351931);醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森菌IP31758)gi|153949366|ref|YP_001400938.1|(153949366);醛-醇脱氢酶(假结核耶尔森菌IP31758)gi|152960861|gb|ABS48322.1|(152960861);醛-醇脱氢酶(鼠疫耶尔森菌CA88-4125)gi|149365899|ref|ZP_01887934.1|(149365899);乙醛脱氢酶(乙酰化)(大肠杆菌CFT073)gi|26247570|ref|NP_753610.1|(26247570);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶;乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC1.2.1.10)(acdh);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(pfl失活酶))(肉毒梭菌A型株ATCC3502)gi|148287832|emb|CAL81898.1|(148287832);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152980|sp|P0A9Q7.2|ADHE_ECOLI(71152980);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶和乙醛脱氢酶、和丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)SCRI1043)gi|50121254|ref|YP_050421.1|(50121254);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，和丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种SCRI1043)gi|49611780|emb|CAG75229.1|(49611780);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH))gi|19858620|sp|P33744.3|ADHE_CLOAB(19858620);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152683|sp|P0A9Q8.2|ADHE_ECO57(71152683);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶;乙醛脱氢酶(乙酰化);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(艰难梭菌630)gi|126697906|ref|YP_001086803.1|(126697906);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶;乙醛脱氢酶(乙酰化);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(艰难梭菌(Clostridium difficile)630)gi|115249343|emb|CAJ67156.1|(115249343);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(PFL失活酶))(发光杆菌laumondii亚种(Photorhabdus luminescens subsp.laumondii)TTO1)gi|37526388|ref|NP_929732.1|(37526388);醛-醇脱氢酶2(包含：醇脱氢酶;乙醛脱氢酶)(酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）株Manfredo)gi|134271169|emb|CAM29381.1|(134271169);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(PFL失活酶))(发光杆菌laumondii亚种TTO1)gi|36785819|emb|CAE14870.1|(36785819);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(艰难梭菌630)gi|126700586|ref|YP_001089483.1|(126700586);醛-醇脱氢酶(包含：醇脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂合酶失活酶(艰难梭菌(Clostridium difficile)630)gi|115252023|emb|CAJ69859.1|(115252023);醛-醇脱氢酶2(酿脓链球菌株Manfredo)gi|139472923|ref|YP_001127638.1|(139472923);醛-醇脱氢酶E(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)株13)gi|18311513|ref|NP_563447.1|(18311513);醛-醇脱氢酶E(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)株13)gi|18146197|dbj|BAB82237.1|(18146197);醛-醇脱氢酶ADHE1(丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC824)gi|15004739|ref|NP_149199.1|(15004739);醛-醇脱氢酶,ADHE1(丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC824)gi|14994351|gb|AAK76781.1|AE001438_34(14994351);醛-醇脱氢酶2(包含：醇脱氢酶(ADH);乙醛/乙酰-CoA脱氢酶(ACDH))gi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI(2492737);醇脱氢酶(肠道沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp.enterica）伤寒血清型（serovar）Typhi株CT18)gi|16760134|ref|NP_455751.1|(16760134);和醇脱氢酶(肠道沙门氏菌肠亚种伤寒血清型Typhi)gi|16502428|emb|CAD08384.1|(16502428))，与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
乳酸脱氢酶(也称为D-乳酸脱氢酶和发酵脱氢酶（fermentive dehydrognase）)在大肠杆菌中由ldhA编码，并且催化丙酮酸到D-乳酸的NADH依赖性转化。已知ldhA的同源物和变体。实际上NCBI中当前有1664种细菌乳酸脱氢酶。例如，这种同源物和变体包含例如D-乳酸脱氢酶(D-LDH)(发酵型乳酸脱氢酶)gi|1730102|sp|P52643.1|LDHD_ECOLI(1730102);D-乳酸脱氢酶gi|1049265|gb|AAB51772.1|(1049265);D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌APEC O1)gi|117623655|ref|YP_852568.1|(117623655);D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌CFT073)gi|26247689|ref|NP_753729.1|(26247689);D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|15801748|ref|NP_287766.1|(15801748);D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌APEC O1)gi|115512779|gb|ABJ00854.1|(115512779);D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌CFT073)gi|26108091|gb|AAN80291.1|AE016760_150(26108091);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌K12)gi|16129341|ref|NP_415898.1|(16129341);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌UTI89)gi|91210646|ref|YP_540632.1|(91210646);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌K12)gi|1787645|gb|AAC74462.1|(1787645);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌W3110)gi|89108227|ref|AP_002007.1|(89108227);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌W3110)gi|1742259|dbj|BAA14990.1|(1742259);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌UTI89)gi|91072220|gb|ABE07101.1|(91072220);发酵型D-乳酸脱氢酶,NAD-依赖性(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|12515320|gb|AAG56380.1|AE005366_6(12515320);发酵型D-乳酸脱氢酶(大肠杆菌O157:H7株Sakai)gi|13361468|dbj|BAB35425.1|(13361468);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌101-1)gi|83588593|ref|ZP_00927217.1|(83588593);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌53638)gi|75515985|ref|ZP_00738103.1|(75515985);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌E22)gi|75260157|ref|ZP_00731425.1|(75260157);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌F11)gi|75242656|ref|ZP_00726400.1|(75242656);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌E110019)gi|75237491|ref|ZP_00721524.1|(75237491);COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌B7A)gi|75231601|ref|ZP_00717959.1|(75231601);和COG1052:乳酸脱氢酶和相关脱氢酶(大肠杆菌B171)gi|75211308|ref|ZP_00711407.1|(75211308),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
两个膜结合的含FAD酶负责催化富马酸和琥珀酸的互变;所述富马酸还原酶用于厌氧生长，而所述琥珀酸脱氢酶用于好氧生长。富马酸还原酶包含多个亚基(如大肠杆菌中的frdA、B和C)。任意一个亚基的修饰能产生本文所需活性。例如，敲除frdB、frdC或frdBC用于本公开的方法。已知Frd的同源物和变体。例如，同源物和变体包含例如富马酸还原酶亚基D(富马酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD_ECOLI(67463543);富马酸还原酶亚基C(富马酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC_PROVU(1346037);富马酸还原酶亚基D(富马酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|120499|sp|P20924.1|FRDD_PROVU(120499);富马酸还原酶亚基C(富马酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|67463538|sp|P0A8Q0.1|FRDC_ECOLI(67463538);富马酸还原酶铁-硫亚基(大肠杆菌)gi|145264|gb|AAA23438.1|(145264);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(大肠杆菌)gi|145263|gb|AAA23437.1|(145263);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU(37538290);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120489|sp|P00363.3|FRDA_ECOLI(120489);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU(120490);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(Flavocytochrome c)(Flavocytochrome c3)(Fcc3)gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA_SHEFN(119370087);富马酸还原酶铁-硫亚基gi|81175308|sp|P0AC47.2|FRDB_ECOLI(81175308);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(Flavocytochrome c)(Flavocytochrome c3)(Fcc3)gi|119370088|sp|P0C278.1|FRDA_SHEFR(119370088);Frd操纵子未表征的蛋白Cgi|140663|sp|P20927.1|YFRC_PROVU(140663);Frd操纵子可能的（probable）铁-硫亚基A gi|140661|sp|P20925.1|YFRA_PROVU(140661);富马酸还原酶铁-硫亚基gi|120493|sp|P20921.2|FRDB_PROVU(120493);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|2494617|sp|O06913.2|FRDA_HELPY(2494617);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(铁(III)诱导的flavocytochrome C3)(Ifc3)gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2_SHEFN(13878499);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54041009|sp|P64174.1|FRDA_MYCTU(54041009);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54037132|sp|P64175.1|FRDA_MYCBO(54037132);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|12230114|sp|Q9ZMP0.1|FRDA_HELPJ(12230114);富马酸还原酶黄素蛋白亚基gi|1169737|sp|P44894.1|FRDA_HAEIN(1169737);富马酸还原酶黄素蛋白亚基(产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes))gi|13160058|emb|CAA04214.2|(13160058);富马酸还原酶黄素蛋白亚基前体(Flavocytochrome c)(FL cyt)gi|25452947|sp|P83223.2|FRDA_SHEON(25452947);富马酸还原酶铁-硫亚基(产琥珀酸沃廉菌)gi|2282000|emb|CAA04215.1|(2282000);和富马酸还原酶细胞色素b亚基(产琥珀酸沃廉菌)gi|2281998|emb|CAA04213.1|(2281998),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
乙酸激酶在大肠杆菌中由ackA编码。AckA参于乙酰-coA到乙酸的转化。特定地，ackA催化乙酰磷酸到乙酸的转化。已知AckA的同源物和变体。NCBI数据库列举了作为细菌乙酸激酶的约1450种多肽。例如所述同源物和变体包含乙酸激酶(天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3(2))gi|21223784|ref|NP_629563.1|(21223784);乙酸激酶(天蓝色链霉菌A3(2))gi|6808417|emb|CAB70654.1|(6808417);乙酸激酶(酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）M1GAS)gi|15674332|ref|NP_268506.1|(15674332);乙酸激酶(空肠弯曲杆菌空肠亚种（Campylobacter jejuni subsp.jejuni）NCTC11168)gi|15792038|ref|NP_281861.1|(15792038);乙酸激酶(酿脓链球菌M1GAS)gi|13621416|gb|AAK33227.1|(13621416);乙酸激酶(波罗地红小梨形菌（Rhodopirellulabaltica SH1）)gi|32476009|ref|NP_869003.1|(32476009);乙酸激酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32472045|ref|NP_865039.1|(32472045);乙酸激酶(空肠弯曲杆菌空肠亚种NCTC11168)gi|112360034|emb|CAL34826.1|(112360034);乙酸激酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32446553|emb|CAD76388.1|(32446553);乙酸激酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32397417|emb|CAD72723.1|(32397417);AckA(克鲁维梭菌(Clostridiumkluyveri)DSM555)gi|153954016|ref|YP_001394781.1|(153954016);乙酸激酶(长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NCC2705)gi|23465540|ref|NP_696143.1|(23465540);AckA(克鲁维梭菌DSM555)gi|146346897|gb|EDK33433.1|(146346897);乙酸激酶(白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae))gi|38200875|emb|CAE50580.1|(38200875);乙酸激酶(长双歧杆菌NCC2705)gi|23326203|gb|AAN24779.1|(23326203);乙酸激酶(乙酰激酶)gi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA_ECOLI(67462089);和AckA(地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DSM13)gi|52349315|gb|AAU41949.1|(52349315),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
磷酸转乙酰酶在大肠杆菌中由pta编码。PTA参于乙酸到乙酰-coA的转化。特定地，PTA催化乙酰coA到乙酰磷酸的转化。已知PTA的同源物和变体。NCBI中有约1075种细菌磷酸转乙酰酶可用。例如所述同源物和变体包含例如磷酸转乙酰酶Pta(猫立克次体（Rickettsia felis）URRWXCal2)gi|67004021|gb|AAY60947.1|(67004021);磷酸转乙酰酶(蚜虫内共生菌（Buchneraaphidicola）株Cc(雪松长足大蚜（Cinara cedri）))gi|116256910|gb|ABJ90592.1|(116256910);pta(蚜虫内共生菌株Cc(雪松长足大蚜（Cinara cedri）))gi|116515056|ref|YP_802685.1|(116515056);pta(短须舌蝇（Glossinabrevipalpis）的Wigglesworthia glossinidia内共生体)gi|25166135|dbj|BAC24326.1|(25166135);Pta(出血败血性巴斯德氏菌多杀亚种（Pasteurella multocida subsp.multocida）株Pm70)gi|12720993|gb|AAK02789.1|(12720993);Pta(深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）)gi|25989720|gb|AAN75024.1|(25989720);pta(威氏利斯特菌（Listeria welshimeri）血清型6b株SLCC5334)gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418);Pta(鸟结核分支杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis）K-10)gi|41398816|gb|AAS06435.1|(41398816);磷酸转乙酰酶(pta)(布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)B31)gi|15594934|ref|NP_212723.1|(15594934);磷酸转乙酰酶(pta)(布氏疏螺旋体B31)gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508);磷酸转乙酰酶(pta)(流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）Rd KW20)gi|1574131|gb|AAC22857.1|(1574131);磷酸转乙酰酶Pta(立克次氏体（Rickettsia bellii）RML369-C)gi|91206026|ref|YP_538381.1|(91206026);磷酸转乙酰酶Pta(Rickettsia belliiRML369-C)gi|91206025|ref|YP_538380.1|(91206025);磷酸转乙酰酶pta(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)F11)gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131);磷酸转乙酰酶pta(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)株Haarlem)gi|134148886|gb|EBA40931.1|(134148886);磷酸转乙酰酶pta(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)C)gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819);磷酸转乙酰酶Pta(立克次氏体（Rickettsia bellii）RML369-C)gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570);磷酸转乙酰酶pta(立克次氏体（Rickettsiabellii）RML369-C)gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569);磷酸转乙酰酶(pta)(苍白密螺旋体苍白亚种（Treponema pallidum subsp.pallidum）株Nichols)gi|15639088|ref|NP_218534.1|(15639088);和磷酸转乙酰酶(pta)(苍白密螺旋体苍白亚种株Nichols)gi|3322356|gb|AAC65090.1|(3322356),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
丙酮酸-甲酸-裂合酶(甲酸转乙酰酶)是催化丙酮酸向乙酰coA和甲酸转化的酶。这通过pfl-活化酶在厌氧条件由生成有机自由基诱导，并且在磷酸盐限制中显著降低。甲酸转乙酰酶在大肠杆菌中由pflB编码。已知PFLB的同源物和变体。例如所述同源物和变体包含例如甲酸转乙酰酶1(丙酮酸-甲酸-裂合酶1)gi|129879|sp|P09373.2|PFLB_ECOLI(129879);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌CO92)gi|16121663|ref|NP_404976.1|(16121663);甲酸转乙酰酶1(假结核耶尔森菌IP32953)gi|51595748|ref|YP_069939.1|(51595748);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌生物型田鼠型菌株91001)gi|45441037|ref|NP_992576.1|(45441037);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌CO92)gi|115347142|emb|CAL20035.1|(115347142);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌生物型田鼠型菌株91001)gi|45435896|gb|AAS61453.1|(45435896);甲酸转乙酰酶1(假结核耶尔森菌IP32953)gi|51589030|emb|CAH20648.1|(51589030);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型株CT18)gi|16759843|ref|NP_455460.1|(16759843);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种甲型副伤寒血清型株ATCC9150)gi|56413977|ref|YP_151052.1|(56413977);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型)gi|16502136|emb|CAD05373.1|(16502136);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种甲型副伤寒血清型株ATCC9150)gi|56128234|gb|AAV77740.1|(56128234);甲酸转乙酰酶1(痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）Sd197)gi|82777577|ref|YP_403926.1|(82777577);甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）2a型株2457T)gi|30062438|ref|NP_836609.1|(30062438);甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌（Shigella flexneri）2a型株2457T)gi|30040684|gb|AAP16415.1|(30040684);甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌5型株8401)gi|110614459|gb|ABF03126.1|(110614459);甲酸转乙酰酶1(痢疾志贺氏菌Sd197)gi|81241725|gb|ABB62435.1|(81241725);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|12514066|gb|AAG55388.1|AE005279_8(12514066);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌KIM)gi|22126668|ref|NP_670091.1|(22126668);甲酸转乙酰酶1(无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）A909)gi|76787667|ref|YP_330335.1|(76787667);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌KIM)gi|21959683|gb|AAM86342.1|AE013882_3(21959683);甲酸转乙酰酶1(无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）A909)gi|76562724|gb|ABA45308.1|(76562724);甲酸转乙酰酶1(小肠结肠炎耶尔森菌小肠结肠炎亚种(Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica)8081)gi|123441844|ref|YP_001005827.1|(123441844);甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌5型株8401)gi|110804911|ref|YP_688431.1|(110804911);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌UTI89)gi|91210004|ref|YP_539990.1|(91210004);甲酸转乙酰酶1(鲍氏志贺菌(Shigellaboydii）Sb227)gi|82544641|ref|YP_408588.1|(82544641);甲酸转乙酰酶1(宋内志贺杆菌（Shigella sonnei）Ss046)gi|74311459|ref|YP_309878.1|(74311459);甲酸转乙酰酶1(肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae)MGH78578)gi|152969488|ref|YP_001334597.1|(152969488);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型Ty2)gi|29142384|ref|NP_805726.1|(29142384)甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌（Shigella flexneri）2a型株301)gi|24112311|ref|NP_706821.1|(24112311);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|15800764|ref|NP_286778.1|(15800764);甲酸转乙酰酶1(肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种MGH78578)gi|150954337|gb|ABR76367.1|(150954337);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌CA88-4125)gi|149366640|ref|ZP_01888674.1|(149366640);甲酸转乙酰酶1(鼠疫耶尔森菌CA88-4125)gi|149291014|gb|EDM41089.1|(149291014);甲酸转乙酰酶1(小肠结肠炎耶尔森菌小肠结肠炎亚种(Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica)8081)gi|122088805|emb|CAL11611.1|(122088805);甲酸转乙酰酶1(宋内志贺杆菌Ss046)gi|73854936|gb|AAZ87643.1|(73854936);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌UTI89)gi|91071578|gb|ABE06459.1|(91071578);甲酸转乙酰酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型Ty2)gi|29138014|gb|AAO69575.1|(29138014);甲酸转乙酰酶1(鲍氏志贺菌Sb227)gi|81246052|gb|ABB66760.1|(81246052);甲酸转乙酰酶1(弗氏志贺菌2a型株301)gi|24051169|gb|AAN42528.1|(24051169);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌O157:H7株Sakai)gi|13360445|dbj|BAB34409.1|(13360445);甲酸转乙酰酶1(大肠杆菌O157:H7株Sakai)gi|15830240|ref|NP_309013.1|(15830240);甲酸转乙酰酶I(丙酮酸-甲酸-裂合酶1)(发光杆菌laumondii亚种TTO1)gi|36784986|emb|CAE13906.1|(36784986);甲酸转乙酰酶I(丙酮酸-甲酸-裂合酶1)(发光杆菌laumondii亚种TTO1)gi|37525558|ref|NP_928902.1|(37525558);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)Mu50)gi|14245993|dbj|BAB56388.1|(14245993);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu50)gi|15923216|ref|NP_370750.1|(15923216);甲酸转乙酰酶(丙酮酸-甲酸-裂合酶)gi|81706366|sp|Q7A7X6.1|PFLB_STAAN(81706366);甲酸转乙酰酶(丙酮酸-甲酸-裂合酶)gi|81782287|sp|Q99WZ7.1|PFLB_STAAM(81782287);甲酸转乙酰酶(丙酮酸-甲酸-裂合酶)gi|81704726|sp|Q7A1W9.1|PFLB_STAAW(81704726);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3)gi|156720691|dbj|BAF77108.1|(156720691);甲酸转乙酰酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种SCRI1043)gi|50121521|ref|YP_050688.1|(50121521);甲酸转乙酰酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种SCRI1043)gi|49612047|emb|CAG75496.1|(49612047);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种株Newman)gi|150373174|dbj|BAF66434.1|(150373174);甲酸转乙酰酶(内德斯希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1)gi|24374439|ref|NP_718482.1|(24374439);甲酸转乙酰酶(内德斯希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1)gi|24349015|gb|AAN55926.1|AE015730_3(24349015);甲酸转乙酰酶(胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）血清3型株JL03)gi|165976461|ref|YP_001652054.1|(165976461);甲酸转乙酰酶(胸膜肺炎放线杆菌血清3型株JL03)gi|165876562|gb|ABY69610.1|(165876562);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MW2)gi|21203365|dbj|BAB94066.1|(21203365);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种N315)gi|13700141|dbj|BAB41440.1|(13700141);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种株Newman)gi|151220374|ref|YP_001331197.1|(151220374);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3)gi|156978556|ref|YP_001440815.1|(156978556);甲酸转乙酰酶(聚球藻属(Synechococcus sp.)JA-2-3B'a(2-13))gi|86607744|ref|YP_476506.1|(86607744);甲酸转乙酰酶(聚球藻属JA3-3Ab)gi|86605195|ref|YP_473958.1|(86605195);甲酸转乙酰酶(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)D39)gi|116517188|ref|YP_815928.1|(116517188);甲酸转乙酰酶(聚球藻属JA-2-3B'a(2-13))gi|86556286|gb|ABD01243.1|(86556286);甲酸转乙酰酶(聚球藻属JA3-3Ab)gi|86553737|gb|ABC98695.1|(86553737);甲酸转乙酰酶(诺非氏梭菌（Clostridiumnovyi）NT)gi|118134908|gb|ABK61952.1|(118134908);甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49482458|ref|YP_039682.1|(49482458);和甲酸转乙酰酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49240587|emb|CAG39244.1|(49240587),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
α-异丙基苹果酸合成酶(EC2.3.3.13，有时称为2-异丙基苹果酸合成酶，α-IPM合成酶)催化乙酰-CoA的乙酰基团与3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)的缩合反应以形成3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸(2-异丙基苹果酸)。α-异丙基苹果酸合成酶在大肠杆菌中由leuA编码。已知LeuA的同源物和变体。例如所述同源物和变体包含例如2-异丙基苹果酸合成酶(谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）)gi|452382|emb|CAA50295.1|(452382);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌K12)gi|16128068|ref|NP_414616.1|(16128068);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌K12)gi|1786261|gb|AAC73185.1|(1786261);2-异丙基苹果酸合成酶(拟南芥(Arabidopsisthaliana))gi|15237194|ref|NP_197692.1|(15237194);2-异丙基苹果酸合成酶(拟南芥gi|42562149|ref|NP_173285.2|(42562149);2-异丙基苹果酸合成酶(拟南芥gi|15221125|ref|NP_177544.1|(15221125);2-异丙基苹果酸合成酶(天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3(2))gi|32141173|ref|NP_733575.1|(32141173);2-异丙基苹果酸合成酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32477692|ref|NP_870686.1|(32477692);2-异丙基苹果酸合成酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32448246|emb|CAD77763.1|(32448246);2-异丙基苹果酸合成酶(Akkermansiamuciniphila ATCC BAA-835)gi|166241432|gb|EDR53404.1|(166241432);2异丙基苹果酸合成酶(橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)ATCC23779)gi|159900959|ref|YP_001547206.1|(159900959);2-异丙基苹果酸合成酶(稻瘟病菌(Dinoroseobacter shibae)DFL12)gi|159043149|ref|YP_001531943.1|(159043149);2异丙基苹果酸合成酶(海洋放线菌(Salinispora arenicola)CNS-205)gi|159035933|ref|YP_001535186.1|(159035933);2-异丙基苹果酸合成酶(密执安棍状杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）NCPPB382)gi|148272757|ref|YP_001222318.1|(148272757);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌B)gi|124530643|ref|ZP_01701227.1|(124530643);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌C株ATCC8739)gi|124499067|gb|EAY46563.1|(124499067);2-异丙基苹果酸合成酶(百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)Tohama I)gi|33591386|ref|NP_879030.1|(33591386);2-异丙基苹果酸合成酶(必需多核杆菌(Polynucleobacter necessarius)STIR1)gi|164564063|ref|ZP_02209880.1|(164564063);2-异丙基苹果酸合成酶(必需多核杆菌STIR1)gi|164506789|gb|EDQ94990.1|(164506789);和2-异丙基苹果酸合成酶(韦氏芽胞杆菌（Bacillus weihenstephanensis）KBAB4)gi|163939313|ref|YP_001644197.1|(163939313)，与登录号相联的任意序列通过引用全文纳入本文。
BCAA氨基转移酶催化支链氨基酸的形成(BCAA)。很多这种氨基转移酶已知，在大肠杆菌中的示例是ilvE。示例性同源物和变体包含由下列登录号指定的序列:ilvE(铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7806)gi|159026756|emb|CAO86637.1|(159026756);IlvE(大肠杆菌)gi|87117962|gb|ABD20288.1|(87117962);IlvE(大肠杆菌)gi|87117960|gb|ABD20287.1|(87117960);IlvE(大肠杆菌)gi|87117958|gb|ABD20286.1|(87117958);IlvE(弗氏志贺菌（Shigella flexneri）)gi|87117956|gb|ABD20285.1|(87117956);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117954|gb|ABD20284.1|(87117954);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117952|gb|ABD20283.1|(87117952);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117950|gb|ABD20282.1|(87117950);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117948|gb|ABD20281.1|(87117948);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117946|gb|ABD20280.1|(87117946);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117944|gb|ABD20279.1|(87117944);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117942|gb|ABD20278.1|(87117942);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117940|gb|ABD20277.1|(87117940);IlvE(弗氏志贺菌)gi|87117938|gb|ABD20276.1|(87117938);IlvE(痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）)gi|87117936|gb|ABD20275.1|(87117936);IlvE(痢疾志贺氏菌)gi|87117934|gb|ABD20274.1|(87117934);IlvE(痢疾志贺氏菌)gi|87117932|gb|ABD20273.1|(87117932);IlvE(痢疾志贺氏菌)gi|87117930|gb|ABD20272.1|(87117930);和IlvE(痢疾志贺氏菌)gi|87117928|gb|ABD20271.1|(87117928),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
酪氨酸氨基转移酶催化二羧基和芳族氨基酸底物的氨基转移。大肠杆菌的酪氨酸氨基转移酶由基因tyrB编码。已知TyrB的同源物和变体。例如，这种同源物和变体包含tyrB(百日咳博行特氏菌（Bordetella petrii）)gi|163857093|ref|YP_001631391.1|(163857093);tyrB(百日咳博行特氏菌)gi|163260821|emb|CAP43123.1|(163260821);氨基转移酶gi|551844|gb|AAA24704.1|(551844);氨基转移酶(慢生根瘤菌属（Bradyrhizobiumsp.）BTAi1)gi|146404387|gb|ABQ32893.1|(146404387);酪氨酸氨基转移酶TyrB(肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）)gi|4775574|emb|CAB40973.2|(4775574);酪氨酸氨基转移酶(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)LT2)gi|16422806|gb|AAL23072.1|(16422806);和酪氨酸氨基转移酶gi|148085|gb|AAA24703.1|(148085),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
丙酮酸氧化酶催化丙酮酸转化成乙酸和CO2。大肠杆菌中，丙酮酸氧化酶由poxB编码。PoxB和其同源物及变体包含例如丙酮酸氧化酶;PoxB(大肠杆菌)gi|685128|gb|AAB31180.1||bbm|348451|bbs|154716(685128);PoxB(荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）)gi|32815820|gb|AAP88293.1|(32815820);poxB(大肠杆菌)gi|25269169|emb|CAD57486.1|(25269169);丙酮酸脱氢酶(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型)gi|16502101|emb|CAD05337.1|(16502101);丙酮酸氧化酶(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))gi|41691702|gb|AAS10156.1|(41691702);丙酮酸脱氢酶(大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum))gi|20257167|gb|AAM12352.1|(20257167);丙酮酸脱氢酶(鼠疫耶尔森菌KIM)gi|22126698|ref|NP_670121.1|(22126698);丙酮酸脱氢酶(细胞色素)(鼠疫耶尔森菌生物型古典型菌株B42003004)gi|166211240|ref|ZP_02237275.1|(166211240);丙酮酸脱氢酶(细胞色素)(鼠疫耶尔森菌生物型古典型菌株B42003004)gi|166207011|gb|EDR51491.1|(166207011);丙酮酸脱氢酶(丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tomato)株DC3000)gi|28869703|ref|NP_792322.1|(28869703);丙酮酸脱氢酶(鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)LT2)gi|16764297|ref|NP_459912.1|(16764297);丙酮酸脱氢酶(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型株CT18)gi|16759808|ref|NP_455425.1|(16759808);丙酮酸脱氢酶(细胞色素)(伯纳特氏立克次体(Coxiella burnetti)Dugway5J108-111)gi|154706110|ref|YP_001424132.1|(154706110);丙酮酸脱氢酶(密执安棍状杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）NCPPB382)gi|148273312|ref|YP_001222873.1|(148273312);丙酮酸氧化酶(嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM)gi|58338213|ref|YP_194798.1|(58338213);和丙酮酸脱氢酶(鼠疫耶尔森菌CO92)gi|16121638|ref|NP_404951.1|(16121638),与各登录号相联的序列通过引用纳入本文。
L-苏氨酸-3-脱氢酶(EC1.1.1.103)催化L-苏氨酸转化成L-2-氨基-3-氧代丁酸。基因tdh编码L-苏氨酸-3-脱氢酶。NCBI认可有来自细菌生物的约700种L-苏氨酸-3-脱氢酶。Tdh的各种同源物和变体包含例如L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|135560|sp|P07913.1|TDH_ECOLI(135560);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227854|sp|A4TSC6.1|TDH_YERPP(166227854);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227853|sp|A1JHX8.1|TDH_YERE8(166227853);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227852|sp|A6UBM6.1|TDH_SINMW(166227852);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227851|sp|A1RE07.1|TDH_SHESW(166227851);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227850|sp|A0L2Q3.1|TDH_SHESA(166227850);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227849|sp|A4YCC5.1|TDH_SHEPC(166227849);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227848|sp|A3QJC8.1|TDH_SHELP(166227848);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227847|sp|A6WUG6.1|TDH_SHEB8(166227847);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227846|sp|A3CYN0.1|TDH_SHEB5(166227846);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227845|sp|A1S1Q3.1|TDH_SHEAM(166227845);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227844|sp|A4FND4.1|TDH_SACEN(166227844);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227843|sp|A1SVW5.1|TDH_PSYIN(166227843);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227842|sp|A5IGK7.1|TDH_LEGPC(166227842);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227841|sp|A6TFL2.1|TDH_KLEP7(166227841);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227840|sp|A4IZ92.1|TDH_FRATW(166227840);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227839|sp|A0Q5K3.1|TDH_FRATN(166227839);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227838|sp|A7NDM9.1|TDH_FRATF(166227838);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227837|sp|A7MID0.1|TDH_ENTS8(166227837);和L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227836|sp|A1AHF3.1|TDH_ECOK1(166227836),与各登录号相关的序列通过引用纳入本文。
乙酰羟酸合酶(如ilvH)和乙酰乳酸合酶(如alsS、ilvB、ilvI)催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的生成。IlvH编码大肠杆菌中的乙酰羟酸合酶(参见例如乙酰羟酸合酶AHAS III(IlvH)(大肠杆菌)gi|40846|emb|CAA38855.1|(40846)，通过引用纳入本文，也参见SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46)。包含ilvH的同源物和变体以及操纵子已知，并且包含例如ilvH(铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7806)gi|159026908|emb|CAO89159.1|(159026908);IlvH(解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42)gi|154686966|ref|YP_001422127.1|(154686966);IlvH(解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42)gi|154352817|gb|ABS74896.1|(154352817);IlvH(嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdusnematophila）)gi|131054140|gb|ABO32787.1|(131054140);IlvH(鼠伤寒沙门菌)gi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227_2(7631124),ilvN(英诺克李斯特菌(Listeriainnocua))gi|16414606|emb|CAC97322.1|(16414606);ilvN(单核细胞增生利斯特菌)gi|16411438|emb|CAD00063.1|(16411438);乙酰羟酸合酶(新月柄杆菌（Caulobactercrescentus）)gi|408939|gb|AAA23048.1|(408939);乙酰羟酸合酶I,小亚基(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型)gi|16504830|emb|CAD03199.1|(16504830);乙酰羟酸合酶,小亚基(惠普尔养障体(Tropheryma whipplei TW08/27))gi|28572714|ref|NP_789494.1|(28572714);乙酰羟酸合酶,小亚基(惠普尔养障体)gi|28410846|emb|CAD67232.1|(28410846);乙酰羟酸合酶I,小亚基(肠道沙门氏菌肠道亚种甲型副伤寒血清型株ATCC9150)gi|56129933|gb|AAV79439.1|(56129933);乙酰羟酸合酶小亚基;乙酰羟酸合酶,小亚基gi|551779|gb|AAA62430.1|(551779);乙酰羟酸合酶I,小亚基(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型Ty2)gi|29139650|gb|AAO71216.1|(29139650);乙酰羟酸合酶小亚基(肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis))gi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526_1(5733116);乙酰羟酸合酶大亚基;和乙酰羟酸合酶,大亚基gi|400334|gb|AAA62429.1|(400334),与登录号相关的序列通过引用纳入本文。乙酰乳酸合酶基因包含alsS和ilvI。ilvI和alsS的同源物已知，并且包含例如乙酰乳酸合酶小亚基(长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NCC2705)gi|23325489|gb|AAN24137.1|(23325489);乙酰乳酸合酶小亚基(嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）)gi|19918933|gb|AAL99357.1|(19918933);乙酰乳酸合酶(固氮弧菌属(Azoarcus sp.)BH72)gi|119671178|emb|CAL95091.1|(119671178);乙酰乳酸合酶小亚基(白喉棒状杆菌)gi|38199954|emb|CAE49622.1|(38199954);乙酰乳酸合酶(固氮弧菌属BH72)gi|119669739|emb|CAL93652.1|(119669739);乙酰乳酸合酶小亚基(杰氏棒杆菌（Corynebacterium jeikeium）K411)gi|68263981|emb|CAI37469.1|(68263981);乙酰乳酸合酶小亚基(枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）)gi|1770067|emb|CAA99562.1|(1770067);乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基(AHAS-I)(乙酰羟酸合成酶I小亚基)(ALS-I)gi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI(83309006);乙酰乳酸合酶大亚基(嗜热脂肪地芽孢杆菌)gi|19918932|gb|AAL99356.1|(19918932);和乙酰乳酸合酶,小亚基(腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4)gi|20806556|ref|NP_621727.1|(20806556),与登录号相关的序列通过引用纳入本文。NCBI中列举了约1120种ilvB的同源物和变体。乙酰羟酸同分异构体还原酶是生物合成异亮氨酸和缬氨酸的平行通路中的第二个酶。IlvC编码大肠杆菌中的乙酰羟酸同分异构体还原酶(参见例如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)。ilvC的同源物和变体已知，并且包含例如乙酰羟酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）972h-)gi|162312317|ref|NP_001018845.2|(162312317);乙酰羟酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）)gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142);乙酰羟酸还原异构酶(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YJM789)gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879);Ilv5p:乙酰羟酸还原异构酶(酿酒酵母)gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403);ACL198Wp(棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）ATCC10895)gi|45185490|ref|NP_983206.1|(45185490);ACL198Wp(棉阿舒囊霉ATCC10895)gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208);乙酰羟酸同分异构体还原酶;Ilv5x(酿酒酵母)gi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbs|165406(957238);乙酰羟酸同分异构体还原酶;Ilv5g(酿酒酵母)gi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405(957236);和酮-酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母)gi|2696654|dbj|BAA24000.1|(2696654),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
二羟酸脱水酶催化异亮氨酸和缬氨酸的生物合成的第四步，即2,3-二羟基-异戊酸脱水形成α-酮异戊酸。IlvD在例如大肠杆菌(参见SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50)中和ilv3一起编码二羟酸脱水酶。二羟酸脱水酶的同源物和变体已知，并且包含例如IlvD(麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）)gi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594);二羟酸脱水酶(惠普尔养障体TW08/27)gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848);二羟酸脱水酶(麻风分枝杆菌)gi|13093837|emb|CAC32140.1|(13093837);二羟酸脱水酶(波罗地红小梨形菌SH1)gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871);和推定的二羟酸脱水酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408),与登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
2-酮酸脱羧酶催化2-酮酸转化成各自的醛。例如，2-酮异戊酸脱羧酶催化2-酮异戊酸转化成异丁醛。很多2-酮酸脱羧酶已知，示例是pdc、pdc1、pdc5、pdc6、aro10、thI3、kdcA和kivd基因。用于将2-酮酸转化成各自醛的示例性同源物和变体包含下面登录号指定的序列和鉴定的酶活性：gi|44921617|gb|AAS49166.1|支链α-酮酸脱羧酶(乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）);gi|15004729|ref|NP_149189.1|丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC824);gi|82749898|ref|YP_415639.1|可能的丙酮酸脱羧酶(金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）RF122);gi|77961217|ref|ZP_00825060.1|COG3961:丙酮酸脱羧酶和相关硫胺素焦磷酸必需酶（requiring enzymes）(莫氏耶尔森氏菌(Yersiniamollaretii)ATCC43969);gi|71065418|ref|YP_264145.1|推定的丙酮酸脱羧酶(北级嗜冷杆菌(Psychrobacter arcticus)273-4);gi|16761331|ref|NP_456948.1|推定的脱羧酶(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型株CT18);gi|93005792|ref|YP_580229.1|丙酮酸脱羧酶(嗜冷杆菌(Psychrobacter cryohalolentis)K5);gi|23129016|ref|ZP_00110850.1|COG3961:丙酮酸脱羧酶和相关硫胺素焦磷酸必需酶(点形念珠藻（Nostocpunctiforme）PCC73102);gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297_1丙酮酸脱羧酶(胃八叠球菌（Sarcina ventriculi）);gi|15607993|ref|NP_215368.1|可能的（probable）丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶pdc(结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv);gi|41406881|ref|NP_959717.1|pdc(鸟结核分支杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis）K-10);gi|91779968|ref|YP_555176.1|推定的丙酮酸脱羧酶(伯克霍尔德菌(Burkholderia xenovorans）LB400);gi|15828161|ref|NP_302424.1|推定的(或吲哚丙酮酸)脱羧酶(麻风分枝杆菌TN);gi|118616174|ref|YP_904506.1|推定的或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶Pdc(溃疡分支杆菌（Mycobacterium ulcerans）Agy99);gi|67989660|ref|NP_001018185.1|假拟蛋白SPAC3H8.01(粟酒裂殖酵母972h-);gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847_1丙酮酸脱羧酶PdcB(米根霉(Rhizopus oryzae));gi|69291130|ref|ZP_00619161.1|丙酮酸脱羧酶:丙酮酸脱羧酶(耐辐射动孢菌(Kineococcus radiotolerans)SRS30216);gi|66363022|ref|XP_628477.1|丙酮酸脱羧酶(小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)Iowa II);gi|70981398|ref|XP_731481.1|丙酮酸脱羧酶(烟曲霉（Aspergillusfumigatus）Af293);gi|121704274|ref|XP_001270401.1|丙酮酸脱羧酶,推定的(棒曲霉（Aspergillus clavatus）NRRL1);gi|119467089|ref|XP_001257351.1|丙酮酸脱羧酶,推定的(费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）NRRL181);gi|26554143|ref|NP_758077.1|丙酮酸脱羧酶(穿透支原体（Mycoplasma penetrans）HF-2);gi|21666009|gb|AAM73539.1|AF282846_1丙酮酸脱羧酶PdcA(米根霉(Rhizopus oryzae))。
醇脱氢酶(adh)催化氨基酸代谢的最终步骤，即醛转化成长链或复合醇。本领域已知各种adh基因。本文所示adh1同源物和变体包含例如adh2、adh3、adh4、adh5、adh6和sfa1(参见例如SFA(酿酒酵母)gi|288591|emb|CAA48161.1|(288591);与登录号相关的各序列通过引用纳入本文，也参见SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41)。
柠草酸合酶催化丙酮酸和乙酸的缩合。CimA编码例如詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)(SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62)或肾脏钩端螺旋体（Leptospira interrogans）(SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74)中的柠草酸合酶。同源物和变体已知，并且包含例如柠草酸合酶(双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa)Patoc血清型)gi|116664687|gb|ABK13757.1|(116664687);柠草酸合酶(双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa)Monteralerio血清型)gi|116664685|gb|ABK13756.1|(116664685);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体（Leptospira interrogans）七日热(Hebdomadis)血清型)gi|116664683|gb|ABK13755.1|(116664683);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体（Leptospirainterrogans）波摩拿(Pomona)血清型)gi|116664681|gb|ABK13754.1|(116664681);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体南方(Australis)血清型)gi|116664679|gb|ABK13753.1|(116664679);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体秋季(Autumnalis)血清型)gi|116664677|gb|ABK13752.1|(116664677);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体致热(Pyrogenes)血清型)gi|116664675|gb|ABK13751.1|(116664675);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体犬(Canicola)血清型)gi|116664673|gb|ABK13750.1|(116664673);柠草酸合酶(肾脏钩端螺旋体Lai血清型)gi|116664671|gb|ABK13749.1|(116664671);CimA(钩端螺旋体(Leptospira meyeri)Semaranga血清型)gi|119720987|gb|ABL98031.1|(119720987);(R)-柠草酸合酶gi|2492795|sp|Q58787.1|CIMA_METJA(2492795);(R)-柠草酸合酶gi|22095547|sp|P58966.1|CIMA_METMA(22095547);(R)-柠草酸合酶gi|22001554|sp|Q8TJJ1.1|CIMA_METAC(22001554);(R)-柠草酸合酶gi|22001553|sp|O26819.1|CIMA_METTH(22001553);(R)-柠草酸合酶gi|22001555|sp|Q8TYB1.1|CIMA_METKA(22001555);(R)-柠草酸合酶(海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)S2)gi|45358581|ref|NP_988138.1|(45358581);(R)-柠草酸合酶(海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)S2)gi|44921339|emb|CAF30574.1|(44921339);和与(R)-柠草酸合酶(候选种CandidatusKuenenia stuttgartiensis)gi|91203541|emb|CAJ71194.1|(91203541)相似,与前述登录号相关的各序列通过引用纳入本文。
本发明的脱氨酶包含例如：天冬氨酸解氨酶(4.3.1.1)、L-丝氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.17)、D-丝氨酸解氨酶(4.3.1.18)、苏氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.19)、酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.23)、苯丙氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.24)、和苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.25)。同源物和变体已知，并且包含例如分离自例如变形杆菌属(Proteus)、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）、包特氏菌属（Bordetella）、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）、青枯菌属（Ralstonia）、根瘤菌属(Rhizobium)、鲁杰氏菌属（Ruegeria）、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、玫瑰杆菌属（Roseobacter）、诺卡氏菌属（Nocardia）、硫碱弧菌(Thioalkalivibrio)、动球菌（Kineococcus）、束村氏菌（Tsukamurella）、埃希氏菌属（Escherichia）等的同源物和变体。在特定实施方式中，所述脱氨酶基因是sdaB。大肠杆菌的sdaB基因的核苷酸序列和其对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118。
本发明的脱氢酶包含例如谷氨酸盐脱氢酶(E.C.1.4.1.2和E.C.1.4.1.4)、谷氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.3)、缬氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.9)、和/或苯丙氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.20)。在某些实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶是能来自中间型嗜热放线菌（Thermoactinomyces intermedius）的LeuDH(SEQ ID NO:119和SEQID NO:120。其他的同源物和变体在本领域是众所周知的。
本发明转氨酶包含例如L-α-转氨酶(E.C.2.6.1.X，其中X是任意数字)。在某些实施方式中，所述L-α-转氨酶能是L-天冬氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.1)、L-丙氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.12和E.C.2.6.1.47)、L-天冬酰胺转氨酶(E.C.2.6.1.14)、或甘氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.35)。在某些实施方式中，L-天冬氨酸转氨酶是AvtA。所述AvtA基因能来自大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、地中海拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）、曼海姆产琥珀酸菌（Mannheimia succinicproducens）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）或鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）.来自大肠杆菌中AvtA的核苷酸序列和氨基酸序列作为SEQID NO:121和SEQ ID NO:122提供。
在一个实施方式中，本发明的微生物能定性为包含rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(有从XL-1blue转导的F'以提供lacIq)、ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdBC、Δfnr、Δpta和ΔpflB和包含pSA55和pSA69质粒的大肠杆菌，其中质粒pSA55是有pLlacO1控制下kivd(乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），SEQ ID NO:31和SEQID NO:32)和adh2(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SEQ ID NO:41和42))基因及氨苄青霉素抗性基因的ColE1来源衍生质粒，并且质粒pSA69是有pLlacO1控制下alsS(枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86)、ilvC(大肠杆菌;SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)和ilvD(大肠杆菌;SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50)基因和卡那霉素抗性基因的p15A来源衍生质粒。
在另一个实施方式中，本发明的微生物能定性为包含rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(有从XL-1blue转导的F'以提供lacIq)、有质粒pCS49、pSA62和pSA55I的ΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvI和ΔadhE的大肠杆菌，其中质粒pSA55I包含有pLlacO1控制下kivd(乳酸乳球菌)和adh2(酿酒酵母)基因和氨苄青霉素抗性基因的ColE1来源衍生质粒，氨苄青霉素抗性基因后有lacI，质粒pSA62是有pLlacO1控制下ilvA(大肠杆菌;SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52)和leuABCD(大肠杆菌)基因(leuA、leuB、leuC和leuD的单个核苷酸和氨基酸序列作为SEQ ID NO:53-SEQ ID NO:60，和SEQ ID NO:75-80提供)和卡那霉素抗性基因的p15A来源衍生质粒，并且质粒pCS49是有pLlacO1控制下thrA(fbr)BC(大肠杆菌)基因和壮观霉素抗性基因的pSC101*来源衍生质粒。
但检索包含来自大量不同生物体的数据库时，通常比较氨基酸序列。使用氨基酸序列检索数据库能通过本领域已知的blastp以外的算法来测量。例如，可使用GCG6.1版中的程序FASTA来比较多肽序列。FASTA提供查询和检索序列之间最优重叠区域的比对和序列相同性百分比(Pearson,(1990),Meth.Enzymol.l83:63-98通过引用纳入本文)。例如，可使用GCG6.1版（通过引用纳入本文）提供的FASTA及其默认参数(字长为2和PAM250评分矩阵)来确定氨基酸序列之间的序列相同性百分比。
应理解能修改一定范围的微生物以包含适于生成例如多种化学实体的重组代谢通路。也理解各种微生物能作为适用于本文所提供重组微生物的靶标酶编码遗传材料的"来源"。术语"微生物"包含来自古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)的真核和原核微生物物种，后者包含酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或更高等的原生生物。术语"微生物细胞"和"细菌"可与术语微生物互换使用。
术语"原核生物"为本领域认可，并且指不包含细胞核或其他细胞器的细胞。所述原核生物通常分类为两个域：细菌域和古菌域。细菌域和古菌域的生物之间的明显差异是基于16S核糖体RNA中核苷酸碱基序列的基础差异。
术语"古菌域"指分裂疵壁菌（Mendosicute）的生物分类，通常在非惯常环境中发现，并且与其他原核生物有几个标准的不同，包含核糖体蛋白的数量和缺乏细胞壁中的胞壁酸。基于ssrRNA分析，所述古菌域由2个系统发生上不同的组组成：圆齿古细菌（Crenarchaeota）和广古菌门(Euryarchaeota)。基于其生理学，所述古菌域能分成三种类型：产甲烷菌(生成甲烷的原核生物);极端嗜盐菌(在非常高浓度的盐((NaCl)下生活的原核生物);和极端(超)嗜热菌(在非常高温度下生活的原核生物)。除了统一使其区别于细菌(如细胞壁中没有胞壁质、酯连接膜脂质等)的古细菌特性外，这些原核生物显示了使其适应其他特定习惯的独特结构或生物化学属性。所述圆齿古细菌主要由超嗜热硫依赖性原核生物组成，并且所述广古菌门包含产甲烷菌和极端嗜盐菌。
"细菌"或"真细菌"指原核生物域。细菌包含如下至少11个不同的组：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，有两个主要的亚组：(1)高G+C组(放线菌、分枝杆菌、微球菌等)(2)低G+C组(芽孢杆菌、梭菌、乳杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体);(2)变形菌，如紫光合+非光合革兰氏阴性(包含最"常见"革兰氏阴性菌);(3)蓝细菌，如含氧光能利用菌;(4)螺旋体和相关物种;(5)浮霉状菌;(6)拟杆菌、黄杆菌;(7)衣原体;(8)绿色硫细菌;(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光能利用菌);(10)抗放射性的球菌和相关物;(11)栖热袍菌（Thermotoga）和嗜热热袍菌（Thermosiphothermophiles）。
"革兰氏阴性菌"包含球菌、非肠道杆菌和肠道杆菌。所述革兰氏阴性菌的属包含例如奈瑟球菌属（Neisseria）、螺菌属（Spirillum）、巴斯德菌属（Pasteurella）、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属（Francisella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、包特氏菌属（Bordetella）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、弧菌属（Vibrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）、拟杆菌属（Bacteroides）、醋酸杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属（Aerobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、固氮菌属（Azotobacter）、螺旋菌属（Spirilla）、沙雷氏菌属（Serratia）、弧菌属（Vibrio）、根瘤菌属（Rhizobium）、衣原体（Chlamydia）、立克次体(Rickettsia)、螺旋体(Treponema)和梭形杆菌属（Fusobacterium）。
"革兰氏阳性菌"包含球菌、非孢子杆菌和孢子杆菌。革兰氏阳性菌的属包含例如放线菌属（Actinomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、乳杆菌属（Lactobacillus）、李斯特菌属（Listeria）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、黏球菌属（Myxococcus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Streptococcus）、和链霉菌属（Streptomyces）。
术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"在本文中互换使用，并且指遗传修饰成表达或过量表达内源多核苷酸或表达非内源序列如载体所含的那些，或有内源基因表达降低的微生物。所述多核苷酸通常编码参与生成本文所述需要代谢物的代谢通路的靶标酶。因此，本文所述重组微生物经基因工程改造以表达或过量表达母体微生物事前没有表达或过量表达的靶标酶。应理解术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"不仅指特定重组微生物，而且指这种微生物的后代或可能的后代。
"母体微生物"指用于生成重组微生物的细胞。术语"母体微生物"描述了天然产生的细胞，如没有遗传改性的"野生型"细胞。术语"母体微生物"也描述了经遗传改性但是不表达或过量表达靶标酶的细胞，如参与生成所需代谢物的生物合成通路的酶。例如，野生型微生物能遗传改性成表达或过量表达第一靶标酶，如硫解酶。这种微生物能作为母体微生物用于生成改性以表达或过量表达第二靶标酶如羟基丁酰基CoA脱氢酶的微生物。所述改性成表达或过量表达如硫解酶和羟基丁酰基CoA脱氢酶的微生物能进而改性成表达或过量表达第三靶标酶，如巴豆酸酶。因此，母体微生物作为持续遗传改性事件的参照细胞。各改性事件能通过把核酸分子引入到参照细胞完成。所述引入帮助靶标酶的表达或过量表达。应理解术语"帮助"包含母体微生物中通过遗传改良如启动子序列来活化编码靶标酶的内源多核苷酸。还应理解术语"帮助"包含把编码靶标酶的外源多核苷酸引入到母体微生物中。
在另一个实施方式中，提供了生成把合适碳底物转化成例如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯乙醇的重组微生物。所述方法包含用一个或多个编码多肽的重组多核苷酸转化微生物，所述多肽包含例如乙酰羟酸合酶(如ilvIH操纵子)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、2-酮-酸脱羧酶(如PDC6、ARO10、THI3、kivd或pdc)、2-异丙基苹果酸合成酶(如leuA)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、异丙基苹果酸异构酶(如leuCD操纵子)、苏氨酸脱水酶(如ilvA)、α-异丙基苹果酸合成酶(如cimA)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、异丙基苹果酸异构酶(如leuCD操纵子)、苏氨酸脱水酶(如ilvA)、乙酰乳酸合酶(如ilvMG或ilvNB)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(如ilvC)、二羟酸脱水酶(如ilvD)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶(如pheA，例如核苷酸和氨基酸序列示于SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82)、分支酸变位酶T/预苯酸脱水酶(如tyrA，例如核苷酸和氨基酸序列示于SEQ ID NO:83和SEQ IDNO:84))、2-酮-酸脱羧酶(如kivd、PDC6或THI3)、和醇脱氢酶活性。用于生成包含同源物、变体、片段、相关融合蛋白或其功能等同物在内的代谢物的酶的编码多核苷酸用于指导这种多肽在合适宿主细胞如细菌或酵母细胞中表达的重组核酸分子。应理解加入不改变多核苷酸编码活性的序列如加入非功能性或非编码序列，也是基本核酸的保守性变异。酶"活性"是其催化反应生成代谢物的能力，即其"功能"的量度，并且可以表示为反应代谢物生成的速率。例如，酶活性能表示为每单位时间或每单位酶生成的代谢物量(如浓度或重量)，或以亲和性或解离常数表示。在特定实施方式中，所述方法也包含敲除选自下组的基因的表达：glnA、gdhA、lsrA、luxS或其任意组合。
在其他实施方式中，提供了生成把合适碳底物转化成如己二酸、γ-氨基丁酸的重组微生物。所述方法包含用一种或多种重组多核苷酸转化微生物。在某些实施方式中，所述方法也包含敲除选自下组的基因的表达：glnA、gdhA、lsrA、luxS或其任意组合。
本文互换使用的术语"蛋白"或"多肽"，包含一条或多条由称为氨基酸的化学结构单元通过称为肽键的化学键连接起来的链。"酶"指以或多或少特异性催化或提高一种或多种化学或生物化学反应，全部或大部分由蛋白组成的任何物质。术语"酶"也能指催化性多核苷酸(如RNA或DNA)。"天然"或"野生型"蛋白、酶、多核苷酸、基因或细胞指天然产生的蛋白、酶、多核苷酸、基因、或细胞。
应理解上述多核苷酸包含"基因"，并且上述核酸分子包含"载体"或"质粒"。例如，编码酮硫解酶的多核苷酸能通过atoB基因或其同源物，或fadA基因或其同源物编码。因此，术语"基因"也称为"结构基因"，指编码包含全部或部分的一种或多种蛋白或酶的特定氨基酸序列的多核苷酸，并且可以包含确定例如基因表达条件的调节(非转录)DNA序列，例如启动子序列。基因的转录区可以包含非翻译区域，包含内含子、5'-非翻译区(UTR)、和3'-UTR，以及编码序列。术语"核酸"或"重组核酸"指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及适当的核糖核酸(RNA)。涉及基因序列的术语"表达"指基因的转录，和适当的所得mRNA转录本翻译成蛋白。因此，如上下文中清楚所见，开放阅读框序列的转录和翻译引起蛋白的表达。
术语"操纵子"指来自共同启动子作为单个转录单位转录的两个或更多个基因。在一些实施方式中，包含操纵子的基因是毗连基因。应理解整个操纵子的转录能通过修饰共同启动子来改进(如增加、降低或消除)。或者，操纵子中任何基因或基因组合能修饰以改变所编码多肽的功能和活性。所述修饰能引起所编码多肽活性的增加。再者，所述修饰能赋予所编码多肽新的活性。示例性的新型活性包含使用替代底物和/或在替代环境条件下起作用的能力。"载体"是核酸能增殖和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移的任何方法。载体包含病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子、和人工染色体如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、和PLAC(植物人工染色体)等，其是"附加体"，即是自体复制或能整合到宿主细胞染色体中。载体也能是裸露RNA多核苷酸、裸露DNA多核苷酸、相同链内由DNA和RNA构成的多核苷酸、聚赖氨酸偶联的DNA或RNA、肽偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA等，其不是天然的附加体，或其能是包含一种或多种上述多核苷酸构建物的生物体，如农杆菌或细菌。
"转化"指载体引入到宿主细胞的过程。转化(或转导、或转染)能通过很多方法中的任何一种来完成，所述方法包含电穿孔、微注射、生物射弹(或颗粒轰击介导的递送)或农杆菌介导的转化中。
本领域技术人员应认识到由于密码子的简并特性，在其核苷酸序列上不同的多种DNA化合物能用于编码本公开给定的氨基酸序列。本文引用的编码上述生物合成酶的天然DNA序列仅仅说明本公开的实施方式，并且本公开包含编码本公开方法所用酶的多肽和蛋白氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。采用相似的方式，多肽能通常耐受其氨基酸序列上的一个或多个氨基酸取代、缺失和插入，而不损失或显著损失所需活性。本公开包含有替代氨基酸序列的所述多肽，并且由本文所示DNA序列编码的氨基酸序列仅仅说明本发明的实施方式。
本公开提供了如下更详细所述的编码一种或多种靶标酶的采用重组DNA表达载体或质粒形式的核酸分子。通常，这种载体能在宿主微生物的细胞质中复制，或者整合到宿主微生物的染色体DNA中。在任何情况中，所述载体能是稳定性载体(如载体在很多细胞分裂后，甚至仅在选择压力下仍存在)或短暂载体(如随着细胞分裂数目的增加，宿主微生物逐渐丧失载体)。本公开提供了分离(如不纯，但是以天然未发现的丰度和/或浓度在制品中存在)和纯化的(如基本没有污染材料或基本没有天然发现对应DNA的材料)形式的DNA分子。
本文提供参与下面的一种或多种生物合成基因的异源表达方法：醇(如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-苯乙醇)、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和/或S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)，和所述方法中使用的类似生物合成和重组DNA表达的载体。因此，本发明范围提供了包含所述核酸的重组表达载体。术语"表达载体"指能引入宿主微生物或无细胞转录和翻译系统的核酸。表达载体可永久或暂时保持在微生物内，作为染色体一部分或是微生物内或任何细胞区室内的其它DNA，例如细胞质中的复制载体。表达载体还可包括驱动RNA表达的启动子，RNA通常在微生物或细胞提取物中翻译成多肽。为了将RNA有效翻译成蛋白质，表达载体通常还含有位于待表达基因编码序列起始密码子上游的核糖体结合位点序列。表达载体内也可存在其它元件，例如，增强子，分泌信号序列，转录终止序列，和包含所述载体的宿主微生物能得以鉴定和/或选择的一种或多种标记基因。可使用选择标记即赋予抗生素抗性或敏感性的基因，并当所述细胞生长于适当的选择性培养基时在经转化细胞上提供可选择表型。
表达载体的各种组分能根据载体和宿主细胞（其中所述载体意在复制或驱动表达）的预期应用而广泛变化。适于在大肠杆菌、酵母、链霉菌和其他常用细胞中表达基因和维持载体的的表达载体组分为本领域广泛已知且市售可得。例如，用于纳入本公开表达载体的合适启动子包括在真核或原核宿主微生物中起作用的那些启动子。启动子可包含调节序列，使得能相对宿主微生物的生长调节表达或引起响应化学或物理刺激而打开或关闭的基因表达。对于大肠杆菌和某些其它细菌宿主细胞，可使用衍生自用于生物合成酶、赋予抗生素抗性酶和噬菌体蛋白的基因的启动子，包括例如，半乳糖、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β-内酰胺酶(bla)、噬菌体λPL和T5启动子。此外，也可使用合成启动子如tac启动子(美国专利号4,551,433)。对于大肠杆菌表达载体，包括大肠杆菌复制起点如来自pUC、p1P、p1I和pBR的复制起点是有益的。
因此，重组表达载体可含有至少一种表达系统，该系统进而可由操作性连接启动子并可选连接终止序列的至少部分PKS和/或其它生物合成基因编码序列组成，其在相容宿主细胞内运行以影响编码序列的表达。所述宿主细胞通过用本公开的重组DNA表达载体转化来改良以包含作为染色体外元件或整合到染色体中的表达系统序列。
本公开核酸能使用cDNA、mRNA或替代的基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术和下面实施例部分所述过程来扩增。如此扩增的核酸能克隆到合适的载体，并且通过DNA序列分析定性。再者，对应核苷酸序列的寡核苷酸能通过标准合成技术如使用自动DNA合成器制备。
也应理解编码与本文所述酶同源的多肽的经分离核酸分子能通过引入一个或多个核苷酸取代、加入或缺失到编码特定多肽的核苷酸序列中生成，从而将一个或多个氨基酸取代、加入或缺失引入到编码蛋白中。突变可通过标准技术引入到多核苷酸，例如定点诱变和PCR介导的诱变。与可能需要生成非保守氨基酸取代(见上)的那些位点对相反，在一些位点中，优选生成保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似侧链的氨基酸残基取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括，具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在另一个实施方式中，提供了生成下列物质的方法：如醇(如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-苯乙醇)、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和/或S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。所述方法包含在合适底物(如富氮生物质)存在下培养本文提供的重组微生物，培养条件适于将底物转化成下面物质：醇(如1-丙醇、异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-苯乙醇)、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和/或S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)等。所述方法可以包含作为更大生成系统一部分的生物反应器系统中的重组微生物，所述生成系统含有来自藻类脂质的生物燃料生产。本文所提供微生物生成的产物能通过技术人员已知的任何方法检测。适于本文所提供重组微生物生长和维持的培养条件在下面实施例中描述。所述技术人员应认识到能改良这种条件以适应各微生物的需求。
如上所述，描述本文所用分子生物学方法技术（包含使用载体、启动子和很多其他相关话题）的通用教材包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology(《分子克隆技术指南，酶学方法》)第152卷加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社公司（Academic Press,Inc.）(Berger)；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(《分子克隆-实验室手册》)(第三版)，第13卷，纽约冷泉港的冷泉港实验室（Cold Spring Harbor），1989(“Sambrook”)和CurrentProtocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols(《实验室指南》)，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates，Inc)和约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)合资公司(从1999年补充)(“Ausubel”)。指导技术人员通过体外扩增方法的示例性操作方案包含聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR),Qβ-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)，例如生成本发明同源核酸可参见Berger、Sambrook和Ausubel以及Mullis等(1987)美国专利号4,683,202;Innis等编(1990)PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications（《PCR方案：方法和应用指南》）(加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社有限公司)("Innis");Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47;TheJournal of NIH Research(1991)3:81-94;Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatelli等(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA87:1874;Lomell等(1989)J.Clin.Chem35:1826;Landegren等(1988)Science241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;Barringer等(1990)Gene89:117;和Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563-564。体外扩增核酸克隆的改良方法描述于Wallace等，美国专利号5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法概括于Cheng等(1994)Nature369:684-685和其中的参考文献，其中生成多达40kb的PCR扩增子。技术人员应理解基本上任何RNA能使用逆转录酶和聚合酶转化成适于限制性消化、PCR扩增和测序的双链DNA。参见例如Ausubel、Sambrook和Berger，同上。
合适的培养条件是培养基pH、离子强度、营养含量等;温度;氧/CO2/氮含量;湿度的条件;和允许宿主微生物生成化合物（如通过微生物的代谢反应）的其他培养条件。就能用作宿主细胞的微生物而言熟知合适培养条件。
用于从2-酮酸中合成醇的方法、载体和多核苷酸公开于例如美国专利申请公开号20100221800和20100209986、20090081746，所述公开通过引用纳入本文。本公开提供了从蛋白生物质中生成各种有用中间体的方法，这些中间体能随后代谢成各种醇和化学组合物。
本公开的重组微生物能修饰成将含氮生物质例如蛋白生物质转化成各种中间体，并且那些中间体能进而转化成其他化学品和/或生物燃料，如下所示：丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸===>丙酮酸;
谷氨酸、谷胺酰胺、脯氨酸、精氨酸====>2-KG(2-酮戊二酸);
天冬氨酸、天冬酰胺===>OAA(草酰乙酸盐);
苏氨酸===>2-KB(2-丁酮酸);
缬氨酸===>2-KIV(2-酮异戊酸);
亮氨酸====>2-KIC(2-酮异己酸);和
异亮氨酸===>2-KMV(2-酮-3-甲基戊酸)。
通过上面中间体从生物质生成的产物能进一步通过重组微生物或野生型生物素如下代谢：
丙酮酸到:乙醇、乙酸、乙醛、异丁醇、异丁醛、正丁醇、正丁醛、2,3-丁二醇、L-乳酸、D-乳酸、芳族(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、莽草酸)、PHB(聚羟基丁酸)、甲羟戊酸、类异戊二烯、脂肪酸和下面列举的所有化学物(来自其他中间体);
2-KG(2-酮戊二酸)到:GABA(4-氨基丁酸)、谷氨酸、琥珀酸、苹果酸;
OAA(草酰乙酸盐)到:天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、苏氨酸、甲硫氨酸、SAM(S-腺苷甲硫氨酸);
2-KB(2-丁酮酸)到:2-甲基-1-丁醇、2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸、高丙氨酸;
2-KIV(2-酮异戊酸)到:异丁醇、异丁醛、3-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醛、缬氨酸;
2-KIC(2-酮异己酸)到:3-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醛、亮氨酸;和
2-KMV(2-酮-3-甲基戊酸)到:2-甲基-l-丁醇、2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸。
本公开在下面实施例中描述，其通过举例方式提供而不意在限制。
实施例
选择大肠杆菌作为工程改造的宿主生物，因为这种生物显示了多用性。为了测试大肠杆菌利用藻类氨基酸的效率，所示细胞在酵母提取物或20种氨基酸混合物（用于模仿藻类提取物）上生长。如预期，大肠杆菌在这些富集培养基上生长良好。然而，氨基酸的利用是不完全的，可能是由于氨基酸的不平衡和支链氨基酸(BCAA)降解通路的缺乏。野生型大肠杆菌会仅各自利用氨基酸中的四种(Ala、Asp、Pro和Gln)作为单一碳源以形成克隆。将异丁醇合成通路(过量表达alsS、ilvC、ilvD、KivD和AdhA基因)引入到大肠杆菌中时，所述细胞可以从补充有M9盐的含4%酵母提取物的培养基中仅生成0.17g/L异丁醇(下表4)，表示2.3%的理论产率。
表4：在包含21.6g/L氨基酸的酵母膏培养基中大肠杆菌内更高级醇(C≥4)的生成，其中14种氨基酸能通过大肠杆菌转化成更高级醇。理论上最大效价是7.24克/升。产物通过GC-MS鉴定和通过GC-FID定量。
Figure BDA00003450444900641
Figure BDA00003450444900651
为了提高氨基酸利用，进行一系列化学突变，然后在单个或者多个氨基酸上生长。多轮诱变、富集和选择后，获得菌株(YH19)，其能利用多至13种氨基酸单独作为唯一碳源。所述株可以在异丁醇通路基因存在下相较有相同通路基因的野生型宿主生成更高量的异丁醇。为了进一步提高氨基酸利用，通过在大肠杆菌中过量表达单个氨基酸降解基因使用碳流驱动方法。然而，这种方法仅仅获得少量成功(图6A和6B)，大概是由于控制碳和氮流的各种调节基制。
为了灭活大肠杆菌中的天然调节和竞争通路从而能从氨基酸中更好生成更高级醇，进行其他基因操作。根据其对碳和氮代谢的潜在影响，选择敲除20个靶标基因，并且就生成改善进行筛选(图2A)。这些敲除株中，所述群体感应阴性突变体Δ1srA和ΔluxS显示在异丁醇通路存在下生成增加(图2A)。LuxS是2型自诱导物(AI-2)合成酶，以及LsrA是AI-2转运蛋白(LsrABCD)亚基之一。所述转运蛋白在转化到静止期中参与胞外AI-2的再摄取。从YH19缺失LuxS或AI-2转运蛋白亚基的编码基因增加了生物燃料生成(图2B和2C)。如所预期，由于葡萄糖抑制AI-2的摄取，这些缺失在葡萄糖培养基中没有影响。所述缺失也未在没有异丁醇通路的细胞中显示明显表型。这些结果提示生长晚期时的AI-2再摄取可以参与碳和氮的调节。AI-2系统在氨基酸利用和燃料生成中的作用有待确定。
由于所述碳流驱动方案仅达到有限的成功，测试了除了灭活群体感应以外的氮中心方案。这种方案使用氨而不是碳化合物的分泌以驱动热力学梯度趋向所需方向。为了阻封氨的再摄取，删除所述两个氨同化基因gdhA和glnA以驱动氮流趋向脱氨。这种方法提高了降解期间直接生成氨的数种氨基酸(Thr、Gly、Ser、Cys、Asn、Arg和Gln)的降解(图3A)。确实，缺失gdhA和glnA增加了在异丁醇通路存在下醇的生成(表4)。然而，其他氨基酸(Asp、Ala、Leu、Ile、Val)通过氨基转移降解，并且所述氨基转移到2-酮戊二酸以形成谷氨酸(图3B)。另外，脱氨或还原后，一些氨基酸的碳骨架直接转化成谷氨酸(Gln和Pro)(图3A)。谷氨酸上的氨基重新分布到BCAA。确实，由于细菌培养过程中的氨基转移，培养基中积累谷氨酸和BCAA。似乎这些氨基酸基团在细胞中作为氮储库以保持细胞内还原的氮。
为了引流胞内氮储库，设计了数种氨基转移/脱氨循环。第一，IlvE和LeuDH形成循环(图3C)以引流谷氨酸库(与Asp和Ala一起)从而通过Leu和Ile分泌氨。第二，IlvE、AvtA、DadX和DadA形成另一个循环以通过Val、L-Ala和D-Ala引流谷氨酸库到氨(图3D)。最终，SerC、SerB、SdaB、PpsA、Eno、和GpmA形成第三循环以通过Ser排出氨(图3E))。当Thr、Glu和Ser耗尽时，不需要过量表达所述基因ilvA(图3A)、ilvE(图3C)和sdaB(图3E)，这在接近转化到静止期时发生。因而，这些基因从rrnB启动子表达，所述启动子是σ70依赖性启动子，并且由于σs的竞争，在静止期中没有发挥全部功能，其主导静止期中核心聚合酶的结合。这个方案成功地增加生物燃料的产率(异丁醇,2MB,3MB)到4.0g/L，理论产率的55.7%(表4;图10)。
剩余氨基酸(rAA)包含Lys、Met、His，和三种芳香族氨基酸。降解所述rAA的代谢条件与所述14种燃料可转化的氨基酸(fcAA)相比有很大不同。因此，对转化所述rAA使用另一个方案是有利的。这种第二方案涉及所述rAA重新分布到包含全部20种氨基酸的蛋白中，然后加回到要循环的蛋白生物质流中。为此，所述rAA用作培养生物如假单胞菌(Pseudomonas)的碳和氮源。这个细菌生长工艺转化rAA到全部20种AA，并且生成氨和甲硫醇，其能作为N和S源再循环以支持加工后的藻类生长。使用这6种rAA以培养假单胞菌的理论产率是41.4%，其包含77.9%的fcAA(表8)。因此，所述第一生物(如大肠杆菌)把14种氨基酸转化成燃料，并且所述第二生物(如长假单胞菌(Pseudomonas)或芽孢杆菌（Bacillus）)把rAA转化回14种fcAA。使用两阶段转化有优势，因为所述两个过程需要不同量的曝气。另外，一些rAA可以用作化学原料或其他应用。将所述过程分成两个会增加灵活性。
由于藻类的最小脂质含量是约10%，这个情况用于对工艺的全部质量流作图(图4A)。基于这种蛋白富集种类的藻类生物质产率而生成600亿加仑生物燃料所需的开放池最小尺寸(图4A)是约21,420平方千米，等于美国农业土地的1.6%。因为能使用高蛋白天然藻类物种，这些生物适应局部盐度、温度和pH，并且不需要封闭的光生物反应器。这种情况下，就藻类生长而言再循环5630万吨氮、和210万吨硫。生物转化和燃料燃烧中生成的碳最终被藻类物种再捕获。
植物工艺情况的计算：
1)需要通过植物工艺生成600亿加仑乙醇的肥料N=940万吨。
600亿(加仑乙醇)乘以3.785(升/加仑)，乘以0.789(kg/升(乙醇密度))=植物情况生成的1791.8亿千克乙醇。
1791.8亿(千克乙醇]除以0.5(克乙醇/克葡萄糖(或50%产率))，然后除以60%(玉米的葡萄糖产率)=需要的5972.7亿千克玉米。
为了计算肥料加入，5972.73亿(千克玉米)乘以9.8%(玉米的蛋白含量)，并且然后乘以16%(蛋白中氮的重量百分比)。最终乘法给出了9.4x109千克氮，等于940万吨。
2)生成940万吨肥料N的能量成本=536x1012千焦。
9.4x109(千克氮)乘以57(生成1千克肥料N需要的兆焦耳)=536x1012千焦。
3)乙醇生产的肥料N能量输入与乙醇能量含量的比率=11.2%。
乙醇能量含量等于600亿(加仑乙醇)乘以79.9(兆焦耳/加仑(乙醇的更低热值))，生成4,794x1012(千焦)。536x1012(肥料合成需要的千焦)除以这个数字=11.2%。
当前乙醇生产的肥料N能量输入以另一个方法计算。肥料N的能量成本计算为57MJ/Kg，并且N利用率是150kg/ha。其生成肥料N的能量成本是8,550MJ/ha。乙醇能量产率/土地面积计算为73,424MJ/ha。因此，乙醇生产的肥料N能量输入与乙醇能量含量之比是11.64%。这个数字与前面计算相比稍高，证实了我们的假设是合理的。
4)当植物工艺生成600亿加仑乙醇时，积累的富N生物物质=16400万吨DDGS。
600亿(加仑乙醇)乘以2.73(每加仑乙醇生成的千克DDGS)=16400万吨DDGS。
5)16400万吨富N生物质与潜在的每年美国DDGS市场之比=390%。
16400万(吨DDGS)除以4200万(吨DDGS(潜在的每年美国DDGS市场))=390%。
6)满足潜在的每年美国DDGS市场的每年乙醇产量=154亿加仑。
600亿(加仑乙醇/年)除以390%=154亿加仑乙醇以满足美国DDGS市场。7)154亿加仑乙醇占美国每年燃料消耗的百分比=7.7%。
154亿(加仑乙醇)除以2000亿(加仑(每年美国燃料消耗))=7.7%。
计算没有氮再循环的藻类工艺情况(脂质含量30%)。
8)通过藻类工艺生成600亿加仑生物柴油所需的肥料N=3550万吨。
600亿(加仑生物柴油)乘以3.785(升/加仑)，乘以0.88(千克/升(生物柴油密度))=1998.48亿千克生物柴油。
1998.48亿(千克生物柴油)除以90%(脂质向生物柴油的转化比率)生成222.1(千克脂质)。在氮压力条件下，脂质和蛋白各构成藻类生物质重量的30%，因而生成222.1千克蛋白。
2221亿(千克蛋白)乘以16%(蛋白中氮的重量百分比)生成355亿千克氮，等于3550万吨。
9)生成3550万吨肥料N的能量成本=2,024x1012千焦。
355亿(千克氮)乘以57(兆焦耳，需要生成1千克肥料N)=2,024x1012千焦。
10)生物柴油生产的肥料N能量输入与生物柴油能量含量之比=25.8%。
生物柴油能量含量等于600亿(加仑生物柴油)乘以130.7(兆焦耳/加仑(生物柴油的更低热值))，生成7,842x1012(千焦)。2,024x1012(肥料合成需要的千焦)除以这个数字=25.8%。
11)当藻类工艺生成600亿加仑生物柴油时，积累的富N生物质=58900万吨DDGS。
600亿(加仑生物柴油)乘以3.785(升/加仑)，并且然后除以90%(脂质向生物柴油的转化比率)生成252.3升脂质。252.3(升脂质)除以30%(生物质的脂质含量百分比)，并且然后乘以70%(生物质的富氮含量百分比)生成5890亿千克或58900吨DDGS。
12)58900万吨富N生物质与潜在的每年美国DDGS市场之比=1,402%。
58900万(吨DDGS)除以4200万(吨DDGS(潜在的每年美国DDGS市场)]=1,402%。
13)满足潜在的每年美国DDGS市场的每年生物柴油产量=43亿加仑。
600亿(加仑生物柴油/年)除以1,402%=43亿加仑生物柴油以满足美国DDGS市场。
14)43亿加仑生物柴油占美国每年燃料消耗的百分比=2.1%。
43亿[加仑生物柴油]除以2000亿(加仑(每年美国燃料消耗))=2.1%。
15)生成600亿加仑生物燃料所需的开放培养池最小尺寸=21,420平方千米。
20500万[吨(生成600亿加仑生物燃料所需的碳)]除以52.443%(生物质的碳含量百分比)生成39100万吨生物质/年。39100万(吨生物质/年)除以50(克/平方米/天(开放培养池中藻类的生物质产量)(2))生成面积，其乘以用于天到年、克到百万吨、和平方米到平方千米的转化生成21,420平方千米。
16)加利福尼亚百分比等于21,420平方千米=1.6%。
21,420(平方千米)除以1.3(百万平方千米)(美国总作物土地的面积)=1.6%。
限制性酶与Antarctic磷酸酶来自NEB公司（New England Biolabs）。KOD DNA聚合酶来自EMD化学品公司（EMD Chemicals）。快速DNA连接试剂盒来自罗氏公司（Roche）。酵母膏来自BD。氨基酸、2-丁酮酸、2-酮异戊酸、2-酮戊酸、2-酮-3-甲基-戊酸和2-酮-4-甲基-戊酸来自西格玛公司（Sigma）。寡核苷酸来自IDT。氨基酸标准(0.25nmol/μL)和邻苯二甲醛(OPA)来自安捷伦技术公司（AgilentTechnologies）。
所述JCL16株是有转导自XL-1蓝(blue)的F'的BW25113(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78)衍生物以提供lacIq。使用如图2A所示的20种Keio收集株。通过N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的全基因组随机诱变用于获得可以从nBCAA生成更高级醇的菌株。每轮NTG处理后，在包含一个单独nBCAA作为唯一碳源的琼脂平板上就生长筛选突变。另外，加入L-缬氨酸类似物DL-正缬氨酸(2g/L)，其对细胞有毒性，部分是由于其整合到多肽上。一些突变株可以通过过量生成L-缬氨酸以就多肽生物合成竞争超过所述类似物，而在这种攻击下存活。由于L-缬氨酸的前体2-酮-异戊酸(KIV)也是异丁醇生成的前体，某些正缬氨酸抗性株可以在异丁醇通路基因存在下有相较野生型株生成更高异丁醇浓度的能力。多轮NTG诱变和筛选后，获得株YH19。有某些基因缺失(如ΔluxS、Δ1srA、Δ1srD、ΔlsrB、ΔglnA、ΔgdhA、ΔilvE)的株YH19衍生物通过P1转化生成。包含ΔglnA和ΔgdhA的株能使用氨基酸，但不是铵盐作为生长的唯一氮来源。噬菌体从Keio收集中制备。质粒pCP20转化进入包含正确缺失的单个菌落以除去卡那霉素抗性标记。
使用的质粒列表示于表5。下面描述质粒的构建，和使用的引物列于表6。
表5：质粒列表
Figure BDA00003450444900701
Figure BDA00003450444900711
1US2009/0081746
2Atsumi等，2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.85:651-657
3Atsumi等，2009,Nature451:86-89
表6：引物列表
Figure BDA00003450444900712
为了克隆pYX41，引物YX278(SEQ ID NO:97)和YX279(SEQ ID NO:98)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增yqhD。PCR产物用SphI消化，并且克隆到用相同酶消化的pSA65中。选择有正确方向的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX45，引物YX340(SEQ ID NO:112)和YX341(SEQ ID NO:113)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增dadX。PCR产物用XbaI和AvrII消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX41中。选择正确的菌落，并且用测序确证。BamHI和SalI的限制性位点通过引物YX341(SEQ ID NO:113)引入到pYX45中。
引物YX342(SEQ ID NO:114)和YX283(SEQ ID NO:99)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增dadA。PCR产物用BamHI和SalI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX45中。选择正确的克隆，并且用测序确证，生成pYX46。作为克隆的结果，pYX46中缺失所述T1终止子。引物YX344(SEQ ID NO:115)和YX345(SEQ IDNO:116)用于从pYX45中扩增T1终止子和ColE1。这个PCR产物用SpeI和Sa1I消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX46中。选择正确的菌落，并且用测序确证，生成pYX47。
为了克隆pYX51，引物YXH01(SEQ ID NO:124)和YXH02(SEQ ID NO:125)用于从中间型嗜热放线菌（Thermoactinomyces intermedius）基因组DNA中扩增leuDH。所述PCR产物用Acc65I和SalI消化，并且克隆到用相同酶消化的空质粒pYK(pSA40衍生物)上。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX52，引物YX274(SEQ ID NO:95)和YX275(SEQ ID NO:96)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增avtA。所述PCR产物用SalI和PstI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX51中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX54，引物YX346(SEQ ID NO:117)和YX347(SEQ ID NO:118)用于从pYX52中扩增pL1ac01:1euDH-avtA。所述PCR产物用SalI和SpeI消化，并且克隆到用相同酶消化的pKS103中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX60，引物YX284(SEQ ID NO:100)和YX285(SEQ ID NO:101)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增ilvE。PCR产物用Acc65I和NsiI消化，并且克隆到用相同酶消化的pSA74'中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX61，引物YX326(SEQ ID NO:110)和YX327(SEQ ID NO:111)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增ilvA。所述PCR产物用NsiI和PstI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX60中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX62，引物YX288(SEQ ID NO:102)和YX289(SEQ ID NO:103)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增tdcB。所述PCR产物用PstI和BamHI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX61中。选择正确的菌落，并且用测序确证。XbaI和EagI的限制性位点通过引物YX289(SEQ ID NO:103)引入到pYX61中。
为了克隆pYX64，引物YX290(SEQ ID NO:104)和YX291(SEQ ID NO:105)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增tdcG，并且引物YX292(SEQ ID NO:106)和YX293(SEQ ID NO:107)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增sdaB。包含tdcG的PCR片段用XbaI和EagI消化，和包含sdaB的PCR片段用EagI和BamHI消化。所述两个消化的片段克隆到用XbaI和BamHI消化的pYX62中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX67，引物YX294(SEQ ID NO:108)和YX295(SEQ ID NO:109)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增rrnB。PCR产物用XhoI和Acc65I消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX64中。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX68，引物YX382(SEQ ID NO:121)和YX293(SEQ ID NO:107)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增sdaB。所述PCR产物用PstI和BamHI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX67(用PstI和BamHI消化pYX67引起从pYX67中去除tdcB、tdcG和sdaB)。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX75，引物YX355(SEQ ID NO:119)和YX356(SEQ ID NO:120)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增ilvA。所述PCR产物用Acc65I和PstI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX64(用Acc65I和PstI消化pYX64引起从pYX64中去除ilvE和ilvA)。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX79，引物YX382(SEQ ID NO:121)和YX293(SEQ ID NO:107)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增sdaB。所述PCR产物用PstI和BamHI消化，并且克隆到用相同酶消化的pYX75(用PstI和BamHI消化pYX75引起从pYX75中去除tdcB、tdcG和sdaB)。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX90，引物YX397(SEQ ID NO:122)和YX398(SEQ ID NO:123)用于从大肠杆菌K-12基因组DNA中扩增avtA。PCR产物用MluI消化，并且克隆到用相同酶消化的pKS103中。选择有正确方向的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pYX97，生成三个片段。用Acc65I和SalI消化质粒pYX51以获得包含leuDH的片段。引物YXH03(SEQ ID NO:126)和YXH04(SEQ ID NO:127)用与从pYX41中扩增kivD和yqhD，和所述PCR片段用SalI和BamHI消化。质粒pSA40用Acc65I和BamHI消化。上述三个片段连接在一起以生成质粒。质粒然后用AatII和SpeI消化，和将包含leuDH、kivD、yqhD和Co1E1的片段克隆到用相同酶消化的pSA55I中，生成pYX97。选择正确的菌落，并且用测序确证。
为了克隆pKS103，所述pSA69的Kan抗性盒通过AatII和SacI酶消化除去。pSA69的剩余部分与用相同酶消化的壮观霉素盒连接。选择正确的菌落，并且用测序确证。
除非另有表述，细胞生长使用1X改性M9盐(31.5g/L NaHPO4、15g/L KH2PO4、2.5g/L NaCl、120mg/L MgSO4、11mg/L CaC12和10mg/L维生素B1/升水)，所述盐含有40g/L BD bactoTM酵母膏(含有21.64g/L氨基酸、4.48g/L灰分、3.05g/L各种盐、1.24g/L H2O以及6.53g/L不能被大肠杆菌降解的糖)。适当时加入氨苄青霉素(100μg/m1)、卡那霉素(50μg/ml)、氯霉素(30μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)。在包含3ml培养基的试管中预培养于37°C回转摇床(250r.p.m.)上过夜进行。过夜培养物1:100稀释到250ml螺帽锥形瓶的20ml新鲜培养基中。细胞在37°C生长2小时，然后加入0.1mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)。培养在37°C回转摇床(250r.p.m.)上进行。在某些示例中，按(Connor等，2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.86:1155–1164)所述进行两阶段发酵以降低产物对大肠杆菌细胞的毒性影响。为了获得图8使用的生物质，所述大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在LB培养基上生长。所述普通小球藻(ATCC13482)、紫球藻(ATCC50161)、纯顶螺旋藻(UTEX LB2340)和蓝藻PCC7942分别在ATCC培养基5、ATCC培养基1495、UTEX螺旋藻培养基和BG-11培养基上生长。收获后，一些生物质用研磨珠均质器（mini beadbeater）处理1min或热0.5N NaOH处理30min以释放蛋白，通过布拉德福德(Bradford)试验测定浓度。剩余的蛋白生物质水解是通过在60或80-100°C水中加热10-20min，然后50°C蛋白酶水解过夜。蛋白酶的量是生物质干重的1-3%(0.3-0.9mg/ml)。蛋白酶处理前和后的游离氨基浓度通过茚三酮试验试剂盒(西格玛公司)测量。所有经蛋白酶处理的蛋白生物质然后进行过滤以制备培养基。气相色谱–质谱(GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测仪(GC-FID)和高效液相层析(HPLC)用于分析底物和产物。
我们的菌株生成的醇化合物通过GC-MS如上所述(Atsumi等，2008,Nature451:86-89和Connor等，2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.86:1155–1164)鉴定，并且通过GC-FID定量。醇化合物的分离通过DB-FFAP毛细管柱(30m,0.32mm内径,0.25μm膜厚度;安捷伦技术公司)进行。GC烘箱温度起始保持于40°C持续2min，然后按5°C min-1梯度升高，直到45°C，并且保持4min。然后按15°C min-1梯度升高，直到230°C，并保持4min。氦气用作运载体气体，有14p.s.i.进口压力。注射器和检测器维持在225°C。注射0.5μl样品。1-丙醇用作内部标准。氨基酸(除了L-脯氨酸)使用有OPA(邻苯二甲醛)衍生方法的ZORBAX Eclipse AAA柱(安捷伦技术公司)定量。L-脯氨酸用FMOC(9-芴基甲基-氯甲酸酯)衍生。衍生氨基酸使用HPLC的PDA检测器(338nm,262nm(L-Pro))分析。
为了计算生物燃料生成的理论产率，涉及生产的所述单个代谢物的材料平衡能如下表示：Sv=B,当S是化学计量矩阵时，每列对应网络中的反应，和每行包含特定反应中各代谢物的化学计量系数。向量v包含各反应的摩尔流，并且其产物B包含各代谢物的积累/消耗率。S构建成表示由中心碳代谢、氨基酸生物合成、氨基酸降解、生物燃料生成和产物输出组成的代谢网络，并且B是0的列向量，除了对应氨基酸的行，所述氨基酸等于其输入流的负数，从而表示有恒定氨基酸输入的系统，但是在稳定状态。由于S包含比代谢物更多的反应(列多于行)，其被低估，并且能因此进行优化以发现方法。为了优化生物燃料生成系统，目标函数如下定义：min(fv),其中，f是包含目标函数中各流的系数的行向量。由于需要生物燃料的最大质量产率，f赋值为全部的0，除了对应要优化的生物燃料的输出反应的系数，其中其被赋值为对应生物燃料的分子量的负数。定义此线性优化问题后，其用作MATLAB函数"linprog"的输入，所述函数输出系统的最优摩尔流分布。另外，已知给出0的下限的不可逆反应，而所有其他反应的下限是-200。氨基酸降解通路和更高级醇生物合成通路概括于图9A和表7。
表7：氨基酸降解通路。
L-丙氨酸+泛醌→泛醇+氨+丙酮酸
L-缬氨酸+丙酮酸→L-丙氨酸+2-酮异戊酸
L-亮氨酸+NAD+→氨+NADH+2-酮异己酸(通过过量表达LeuDH)
L-异亮氨酸+NAD+→氨+NADH+2-酮-3-甲基-戊酸(通过过量表达LeuDH)
L-丝氨酸→H++氨+丙酮酸
L-脯氨酸+FAD+2H2O+NAD+→FADH2+NADH+H++L-谷氨酸
L-谷氨酸+草酰乙酸盐→L-天冬氨酸+2-酮戊二酸
L-天冬氨酸→H++氨+富马酸
L-半胱氨酸+H2O→氨+H2S+H++丙酮酸
L-精氨酸+琥珀酰-CoA+4H2O+2-酮戊二酸+NAD→CoA+3H++CO2+2氨+2L-谷氨+NADH+琥珀酸
L-谷胺酰胺+H2O→氨+H++L-谷氨酸
L-天冬酰胺+H2O→氨+H++L-天冬氨酸
L-苏氨酸→氨+H++2-丁酮酸
甘氨酸+5,10亚甲基-THF+H2O→L-丝氨酸+四氢叶酸酯+2H+
甘氨酸+四氢叶酸酯+H++NAD+→氨+CO2+NADH+5,10亚甲基-THF
L-苯丙氨酸+H++O2+NADH→L-Tryrosine[酪氨酸?]+NAD++H2O
L-酪氨酸+2O2+H2O+琥珀酰-CoA+2-酮戊二酸→富马酸+L-谷氨酸+CO2+2H++2乙酰基-CoA+琥珀酸
L-色氨酸+3O2+3H2O+NADH+CoA→甲酸+丙氨酸+NAD++CO2+琥珀酸+氨+3H++乙酰基-CoA
L-组氨酸+4H2O→L-谷氨酸+甲酸+2氨+2H+
L-甲硫氨酸+H2O→2-丁酮酸+甲硫醇+氨+H+
L-赖氨酸+O2+酮戊二酸+NADP++NAD++ATP+2CoA+FAD+H2O[H2O?]→2CO2+氨+L-谷氨酸+NADPH+NADH+2H++FADH2+ADP+Pi+2乙酰基-CoA
为了计算6rAA通过假单胞菌（Pseudomonas）转化回20AA的理论产率，使用上述方案，但是用于假单胞菌代谢网络。所述网络由中心碳代谢、氨基酸生物合成、氨基酸降解和生物质输出反应通路组成。对于简单化目的，除了那些氨基酸合成外，对生物质形成没有额外的能量要求。所述生物质反应由有化学计量系数的氨基酸代谢反应组成，所述系数作为假单胞菌生物质中氨基酸的质粒比率。这种情况下，所述f矩阵全是0，除了对应给定值-1的生物质反应的系数。
为了计算通过整体工艺设计的理论流，如图4A所示，独立考虑各单位。需要详细计算的有4个主要的亚基，如下所示：
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脂质/富N生物质分离
假定所述要加工的藻类生物质由脂质(C19H34O2)和蛋白(平均组成/肽基氨基酸C4.51N1.24O1.49S0.02H7.10)组成，有来自斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）的氨基酸组成(表5)。
表8：6个剩余氨基酸通过假单胞菌向蛋白生物质的理论最优转化。大肠杆菌发酵后的氨基酸质量用作输入流以计算假单胞菌蛋白生物质中20个氨基酸的质量产
Figure BDA00003450444900781
尽管来自栅藻(Scenedesmu)的藻类生物质也包含10-17%碳水化合物，这些碳水化合物能在预处理后降解成糖（sugar），并且变成常见的大肠杆菌发酵底物。简单说，计算中假设所有富N生物质是蛋白。为此，所述生物质的摩尔组成如下计算：
Figure BDA00003450444900782
摩尔脂质=摩尔生物质-摩尔蛋白
使用这些数字和数据，能计算输入水解单元的反应池中氨基酸的摩尔流。另外，脂质流用于计算生成的生物柴油量。脂质转化成生物柴油的效率设为100%。
富N生物质水解
这个单位水解蛋白(肽基氨基酸)成游离氨基酸或小肽。所述计算中，其表示开放培养池藻类生物质中蛋白与来自生物反应器2的再循环蛋白一起的总和。
大肠杆菌发酵(14AA到更高级醇)
这个单元利用水解单元的输出，并且进行如“理论生成产率”所述更高级醇计算的最大理论产率。各输出流（flux）分离成图表中其相应的物流（stream）。
假单胞菌的生物质生成
这个单元利用生物反应器1的氨基酸输出(6rAA)，并且进行如“理论生成产率”所述蛋白生物质计算的最大理论产率。这个过程中的碳流少于工艺2中碳流的10%。此工艺的效率对整体效率没有显著影响。对简单化而言，除了合成氨基酸的那些外，就生成生物质而言对细胞没有能量需求。
有了数学定义的各单位，当加工1摩尔生物质(10%脂质)时，计算通过各个流（stream）的所述流（flux）。由于所述工艺包含再循环物流（stream），使用迭代计算。假设来自生物反应器2的再循环物流（stream）是空的，并且以1、2、3和4的级数进行计算，开始所述迭代过程。计算各单元的流（flux）后，考虑所述通过再循环物流（stream）的流（flux），并且重新计算单元2、3和4的值。重复这个过程直到所述流（flux）通过各物流（stream）会聚(约6次迭代)。使用各化合物的分子式和各元素的分子量把所有值转化成元素质量流（flux）。为了就每年燃料生成通过体积提高所述工艺规模，使用下式：
其中C用于表示缩放前所述工艺中通过特定物流（stream）的碳流（flux），MW定义下标物流的分子量，CW指示下标物流的的碳原子质量，并且ρ指示密度。使用此公式，测定总碳质量要求，并且以相同因子缩放所有物流（stream）从而有等于经测定所需碳流的总生物质碳。所得流程图表示生成了所需量的燃料(图4A中的600亿加仑)。
为了计算系统中藻类生长的最优脂质含量，定义了下列变量：
α=克碳/克脂质生物质=0.7752
β=克碳/克蛋白生物质=0.5244
ρ=生成的醇中碳的最大质量/加入大肠杆菌的蛋白中碳的质量=0.46
Y0=生物质产率相关性的Y截距=92.46(见图4B)
k=生物质产率相关性的指数系数=0.0425(见图4B)
ε=工艺操作的最大产率的百分比
Y=生物质产率
X=藻类生物质中脂质百分比
使用这些变量，我们能将生物燃料中的碳产率(图4)表示为：
C燃料=YXα/100+Y(1-X/100)βρε
C燃料=Y[(α-βρε)X/100+βρε]
假设总生物质生成是脂质百分比的指数函数：
C燃料=(Y0e-kX)[(α-βρε)X/100+βρε]
C燃料=(α-βρε)Y0Xe-kX/100+Y0βρεe-kX
表示能最大化C燃料的X值出现在：
C'燃料=-(α-βρε)Y0kXe-kX/100+(α-βρε)Y0e-kX/100-Y0kβρεe-kX=0
因此，
Figure BDA00003450444900801
用其相应值取代变量和分析ε的函数X最优，测定了当醇产率高于理论产率的61%时，脂质含量应该保持最小。
为了计算生物燃料中的碳产率而不纳入上面公开的方法，衍生了下式：
C燃料=YXα/100,
其中，纳入生物质产率数据的图使用Y=Y0e-kx，并且假设恒定生物质产率的图使用Y=Y0。脂质含量是图4A中的10%。
实践中，蛋白向燃料的转化不会达到理论产率的100%。为了说明这种缺陷，计算了作为理论产率百分比函数的由蛋白-燃料转化实际实现的最优脂质含量，而保持理论产率上的脂质-燃料转化(图4D)。结果显示了蛋白-更高级醇的产率超过理论值的38%，脂质含量能低于10%(其是藻类中的最小脂质含量)以实现最优燃料产率。注意到本公开的方法和系统实现了蛋白-更高级醇产率大于理论最大值的50%（表4）。这个结果提示了甚至在当前次理论蛋白-燃料转化产率下，脂质产生不是必需的。
这种蛋白-燃料转化技术也能利用由其他工艺生成的富N单个细胞生物质，例如CO2直接转化成燃料、纤维素醇发酵、或任何其他工业全细胞生物反应。除了更高级醇生产，能利用所述蛋白转化方案以生产乙醇、或其他燃料和化学品，因而提供最终取代石油的途径。
描述了本发明的许多实施方式。然而，应理解，可进行各种改进而不背离本发明的精神和范围。因此，其他实施方式包括在下列权利要求书的范围内。
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Claims (46)

1.一种重组微生物，其特性在于相较野生型生物体有增加的酮酸流，并且包含至少一个编码酶的多核苷酸，相较野生型生物体在表达时引起更高量的化学产物生成。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物包含编码脱氢酶、转氨酶、和/或脱氨酶的异源多核苷酸。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述脱氢酶选自谷氨酸盐脱氢酶(E.C.1.4.1.2和E.C.1.4.1.4)、谷氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.3)、缬氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.9)和苯丙氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.20)。
4.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶是LeuDH。
5.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶LeuDH来自中间型嗜热放线菌。
6.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述脱氨酶选自下组：天冬氨酸解氨酶(4.3.1.1)、L-丝氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.17)、D-丝氨酸解氨酶(4.3.1.18)、苏氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.19)、酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.23)、苯丙氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.24)、和苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(E.C.4.3.1.25)。
7.如权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述脱氨酶是丝氨酸脱氨酶SdaB。
8.如权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，所述丝氨酸脱氨酶SdaB来自大肠杆菌、玫瑰杆菌、白喉棒状杆菌、肠道沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、或鼻疽伯克霍尔德氏菌。
9.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述转氨酶是L-α-转氨酶(E.C.2.6.1.X，其中X是任意数字)。
10.如权利要求9所述的重组微生物，其特征在于，所述L-α-转氨酶选自L-天冬氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.1)、L-丙氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.12和E.C.2.6.1.47)、L-天冬酰胺转氨酶(E.C.2.6.1.14)、和甘氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.35)。
11.如权利要求10所述的重组微生物，其特征在于，所述L-天冬酰胺转氨酶是AvtA。
12.如权利要求11所述的重组微生物，其特征在于，所述AvtA来自大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、菠萝泛菌、地中海拟无枝菌酸菌、曼海姆产琥珀酸菌、肠道沙门菌、或鼠疫耶尔森菌。
13.如权利要求2-12中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物的特征还在于是与野生型生物体相比时降低的氨再摄取活性、降低的2型自诱导物再摄取活性、降低的谷氨酸脱氢酶活性、降低的谷氨酰胺合成酶活性、降低的谷氨酸合成酶活性、降低的群体感应基因活性、和/或降低的整体调节剂活性。
14.如权利要求13所述的重组微生物，其特征在于，所述降低的群体感应活性来自基因luxS或lsrA表达或功能的缺失或降低。
15.如权利要求13所述的重组微生物，其特征在于，所述降低的氨再摄取活性来自基因gdhA或glnA表达或功能的缺失或降低。
16.如权利要求13所述的重组微生物，其特征在于，所述降低的整体调节剂活性来自基因CRP、LRP、Fis和/或IHF表达或功能的缺失或降低。
17.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学产物选自醇、乙醛、乙酸、异丁醛、异丁酸、正丁醛、正丁酸、2-甲基-1-丁醛、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁酸、氨、铵、谷氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二醇、2-甲基-1,4-丁二胺、异丁烯、衣康酸盐、乙偶姻、丙酮、异丁烯、1,5-二氨基戊烷、L-乳酸、D-乳酸、莽草酸、甲羟戊酸、聚羟基丁酸(PHB)、类异戊二烯、脂肪酸、高丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、对羟基-肉桂酸、四氢呋喃、3-甲基-四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、正甲基吡咯烷酮、天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)。
18.如权利要求17所述的重组微生物，其特征在于，所述醇选自乙醇、1-丙醇、正丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-丁醇。
19.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学产物从丙酮酸生成。
20.如权利要求19所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品选自乙醛、乙酸、异丁醛、正丁醛、2,3-丁二醇、L-乳酸、D-乳酸、芳族化合物、聚羟基丁酸(PHB)、甲羟戊酸、类异戊二烯、乙醇、异丁醇、正丁醇、和脂肪酸。
21.如权利要求20所述的重组微生物，其特征在于，所述芳族化合物选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、和莽草酸。
22.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学产物从2-酮戊二酸生成。
23.如权利要求22所述的重组微生物，其特征在于，所述化学产物选自GABA(4-氨基丁酸)、谷氨酸、琥珀酸和苹果酸。
24.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品从草酰乙酸盐生成。
25.如权利要求24所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品选自天冬氨酸、赖氨酸、尸胺、2-酮己二酸、苏氨酸、甲硫氨酸、和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
26.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品从2-丁酮酸生成。
27.如权利要求26所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品是2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸、高丙氨酸、和2-甲基-1-丁醇。
28.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品从2-酮异戊酸生成。
29.如权利要求28所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品选自异丁醛、3-甲基-l-丁醛、异丁醇、3-甲基-l-丁醇、和缬氨酸。
30.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品从2-酮异己酸生成。
31.如权利要求30所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品选自3-甲基-l-丁醛、亮氨酸、和l-丁醇。
32.如权利要求1-16中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述化学产物从2-酮-3-甲基戊酸生成。
33.如权利要求32所述的重组微生物，其特征在于，所述化学品选自2-甲基-l-丁醛、异亮氨酸、和2-甲基-1-丁醇。
34.如权利要求1-33中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述野生型生物选自细菌、蓝细菌、丝状真菌、和酵母菌。
35.如权利要求34所述的重组微生物，其特征在于，所述野生型生物选自由以下组成的属：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymonomas）、大肠埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella.)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klesiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、枯草芽孢杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、青枯病(Ralstonia)、乳酸球菌属(Lactococcus)、酵母属(Saccharomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、和微杆菌属（Microbacterium）。
36.如权利要求35所述的重组微生物，其特征在于，所述野生型生物选自大肠杆菌、真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）、软化芽孢杆菌（Paenibacillusmacerans）、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胚牙乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarium）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、集胞藻（Synechocystis sp.）、鱼腥藻（Anabaenasp.）、真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、和细长集球藻（Synechococcus elongatus）。
37.一种通过在有益于生成化学产品的条件下将生物质接触权利要求1-36中任一项所述的重组微生物来从生物质中生产包含蛋白、多肽或氨基酸的化学产物的工艺，其中，生成的化学产品的数量大于野生型生物体生成的数量。
38.如权利要求37所述的工艺，其特征在于，所述生物质选自藻类、干酒糟及其可溶物(DDGS)、细菌、动物残留物、植物、蛋白、多肽、氨基酸或其混合物、和其任意组合。
39.如权利要求38所述的工艺，其特征在于，所述生物质是绿藻、红藻、蓝绿藻、蓝细菌、大肠杆菌、或枯草芽孢杆菌。
40.如权利要求39所述的工艺，其特征在于，所述生物质是小球藻(Chorellavulgaris)、紫球藻（Porphyridium purpureum）、纯顶螺旋藻（Spirulina platensis）、或蓝藻（Synechococcus elongates）。
41.如权利要求37-40中任一项所述的工艺，其特征在于，所述生物质在接触重组微生物前部分降解。
42.如权利要求41所述的工艺，其特征在于，所述生物质用蛋白酶和/或热处理。
43.如权利要求42所述的工艺，其特征在于，所述生物质通过在温度范围60-100℃内加热和通过蛋白酶处理来水解。
44.如权利要求37-43中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包含使所述生物质与所述重组微生物接触、使所述生物质与第二微生物接触，所述第二微生物将赖氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸转化成全部20种氨基酸残基的混合物。
45.如权利要求44所述的工艺，其特征在于，所述第二微生物在接触所述重组微生物前与所述生物质接触。
46.如权利要求44或45所述的工艺，其特征在于，所述第二微生物是假单胞菌和/或芽孢杆菌。
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