CN110724680A

CN110724680A - 一种3-苯基马来酸异构酶及其应用

Info

Publication number: CN110724680A
Application number: CN201911036336.2A
Authority: CN
Inventors: 赵广荣; 刘珍宁
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明公开了一种3‑苯基马来酸异构酶及其应用。本发明提供的3‑苯基马来酸异构酶NsHphCD,其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示，能高效催化L‑高苯丙氨酸生物合成中的羟基异构化反应，减少中间体积累，为L‑高苯丙氨酸的工业化生产奠定了基础。

Description

一种3-苯基马来酸异构酶及其应用

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种3-苯基马来酸异构酶NsHphCD及其在生物合成L-高苯丙氨酸中的应用。

背景技术

由3-苯基马来酸异构酶催化的羟基异构化反应将2-羟基移位至3-羟基，是生物合成L-高苯丙氨酸过程中的限速步骤。L-高苯丙氨酸是一种重要的药物中间体，用于合成血管紧张素转换酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂类药物，如依那普利，赖诺普利，奎那普利，卡非佐米等，具有良好的应用前景。

NsHphCD来源于蓝细菌Nodularia spumigena UHCC 0039，可催化L-高苯丙氨酸合成中间体2-苯基马来酸(2-BMA)的羟基异构化反应生成3-苯基马来酸(3-BMA)，尚未有利用NsHphCD生物合成L-高苯丙氨酸的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种3-苯基马来酸异构酶NsHphCD。

本发明的第二个目的是提供3-苯基马来酸异构酶NsHphCD在生物合成L-高苯丙氨酸中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

3-苯基马来酸异构酶NsHphCD，其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

3-苯基马来酸异构酶NsHphCD在生物合成L-高苯丙氨酸中的应用。

本发明的优点：

本发明提供一种3-苯基马来酸异构酶基因，并成功构建了由该基因和苯基马来酸合成酶基因以及3-苯基马来酸脱氢酶基因组成的重组表达载体，建立生物合成方法以L-苯丙氨酸为底物直接合成了L-高苯丙氨酸。本发明3-苯基马来酸异构酶催化活性高，可解决L-高苯丙氨酸合成过程中的中间体积累问题，有利于工业化生产。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

含有葡萄糖的发酵培养基组成为：16g/L KH₂PO4、14g/L K₂HPO4、2g/L(NH₄)₂SO4、1g/L柠檬酸、5g/L酸水解酪蛋白、10mg/L MnSO₄·5H₂O，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入终浓度为2g/L MgSO₄、50mg/L FeSO₄·7H₂O、10mg/L硫胺素和10g/L葡萄糖。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 3-苯基马来酸异构酶基因NshphCD的获得

根据3-苯基马来酸异构酶NsHphCD的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点，设计全长NshphCD基因，所述核酸序列如SEQ ID No.02示。同时设计全长NphphA基因和NshphB基因。设计将NphphA基因和NshphCD基因连接在第一个Trc启动子下游，将NshphB基因连接在第二个Trc启动子下游，全人工合成两端分别加上XbaI和NdeI酶切位点的P_Trc-NphphA-NshphCD-P_Trc-NshphB基因片段，得到的基因片段命名为Facdb。

将通过化学全合成得到的Facdb片段，通过PCR方法扩增。用高保真DNA聚合酶，建立PCR体系。以Facdb-F(SEQ ID No.3)和Facdb-R(SEQ ID No.4)为引物，Facdb片段为模板大量扩增制备。

PCR过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择55℃退火30s，延伸时间为45s，循环数为30个。扩增Facdb片段，纯化扩增产物后，备用。

实施例2重组表达载体pEF的构建

将Facdb片段使用FastDigest内切酶XbaI和NdeI进行酶切，反应体系为：5μL 10*FDbuffer、2.5μL XbaI内切酶、2.5μL NdeI内切酶、30μL Facdb片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，2h。并用试剂盒纯化回收得到用XbaI和NdeI双酶切的Facdb片段。将用XbaI和NdeI双酶切的Facdb片段与相同酶切线性化的表达载体骨架pETDuet-1的复制子和抗性片段进行连接反应得到pEF质粒。其连接反应体系为：1μL 10*T4 DNA Ligase Buffer、1μLT4DNA Ligase、6μL用XbaI和NdeI双酶切的Facdb片段和2μL相同酶切后的表达载体骨架。连接反应条件为：30℃，0.5h。

实施例3重组大肠杆菌的构建及生物合成L-高苯丙氨酸

1.重组大肠杆菌的构建

将所构建的载体pEF电击转化进入宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌株BZL01。

2.重组菌BZL01生物合成L-高苯丙氨酸

将重组菌BZL01接种在LB培养基中，30℃，220rpm，震荡培养12h，然后转接到含有葡萄糖的发酵培养基中，添加1g/L L-苯丙氨酸底物，发酵36h，合成L-高苯丙氨酸。

发酵结束后，取发酵液500μL，加入等量1M HCl震荡混匀，然后12000r/min离心2分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)系统检测。检测条件为：30％乙腈-70％水-0.1％三氟乙酸；C18(4.6×150mm)色谱柱；流速1mL/min；进样量10μL；柱温室温；紫外检测器，检测波长210nm。

经过检测，重组菌BZL01以1g/L L-苯丙氨酸为底物，可生成894mg/L L-高苯丙氨酸。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

<110> 天津大学

<120> 一种3-苯基马来酸异构酶及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> Nodularia spumigena UHCC 0039

<400> 1

Met Ser Ser Ile Asn Lys Glu Val Thr Lys Lys Val Leu Tyr Leu Gly

1 5 10 15

Asp Asp Ile Asn Thr Asp Asp Ile Ile Pro Ala Asn Arg Ala Thr Thr

20 25 30

Tyr Asp Pro Asp Ile Leu Lys Gln Tyr Ala Leu Glu His Leu Ile Gly

35 40 45

Val Gly Glu Leu Leu Lys Tyr Asn Val Ile Val Ala Gly Glu Asn Phe

50 55 60

Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ile Ala Pro Val Ala Leu Lys Ala Ala

65 70 75 80

Gly Ile Glu Lys Ile Gln Ala Arg Ser Phe Ala Glu Ile Phe Tyr Arg

85 90 95

Asn Ser Ile Asn Ile Gly Leu Asn Leu Glu Ile Leu Glu Glu Lys Gln

100 105 110

Glu Asn Pro Val Val Glu Ala Ile Ala Gln Ala Gly Gly Leu Ile Pro

115 120 125

Phe Asn Gln Met Arg Arg Gln Gly Lys Ile Thr Thr Pro Lys Ser Val

130 135 140

Thr Pro Gln Arg Pro Met Thr Leu Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Ala

145 150 155 160

Ser Gly Asn Thr Tyr Val Arg Pro Gly Glu Val Val Phe Ala Gln Val

165 170 175

Asp Leu Ala Leu Ser His Asp Ala Val Ala Gly Pro Val Ala Thr Thr

180 185 190

Phe Tyr Lys His Tyr Gly Lys Glu Ala Lys Leu Trp Asp Ala Gln Arg

195 200 205

Val Val Leu Val Ala Asp His Phe Ile Gln Val Asn Asp Ile Arg Asn

210 215 220

Asp Gln Lys Ala Asn Val Met Tyr Gln Glu Met Ile Asp Phe Ala Lys

225 230 235 240

Lys Gln Gly Cys His Leu Phe Asp Ile Val Ser Pro Gly Glu Ala Ala

245 250 255

Gly Ile Cys His Val Leu Leu Pro Glu Lys Gly Phe Val Arg Pro Gly

260 265 270

Met Ile Ile Ala Gly Thr Asp Ser His Thr Cys Thr Tyr Gly Ala Leu

275 280 285

Gly Ala Phe Ser Ala Gly Val Gly Thr Thr Asp Met Ala Asn Ile Tyr

290 295 300

Ala Met Gly Asp Met Trp Ile Arg Val Pro Ser Thr Leu Val Phe Glu

305 310 315 320

Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro His Ile Ser Ala Lys Asp Ile Ile Leu

325 330 335

Phe Ile Leu Gly Gln Ile Gly Cys Ala Gly Ala Thr Ser Lys Val Met

340 345 350

Glu Phe Arg Gly Ser Ile Leu Glu Gln Met Pro Phe Asp Glu Arg Leu

355 360 365

Thr Leu Ala Asn Met Ala Ile Glu Cys Gly Ala Ile Cys Gly Leu Ile

370 375 380

Val Pro Asp Glu Thr Thr Arg Asn Tyr Val Arg Ser Arg Ser Asp Gln

385 390 395 400

Glu Phe Glu Glu Leu Ile Ala Asp Pro Asp Ala Glu Tyr Glu Lys Val

405 410 415

Tyr Lys Phe Asp Ile Ser Asn Leu Glu Pro Gln Ile Ala Arg Pro Pro

420 425 430

Lys Pro Asp Gln Val Val Pro Ile Ser Gln Ile Glu Glu Thr Pro Ile

435 440 445

Thr Lys Ala Phe Ile Gly Ser Cys Thr Gly Gly Lys Leu Tyr Asp Leu

450 455 460

Ala Gln Ala Ala Glu Val Leu Gln Asp Arg Gln Val Ala Asp Gly Val

465 470 475 480

Asn Leu Phe Ile Val Pro Ala Ser Val Glu Ile Arg Glu Lys Ala Glu

485 490 495

Ala Leu Gly Tyr Met Asp Ile Phe Ala Gln Ala Gly Ala Lys Ile Leu

500 505 510

Lys Ser Gly Cys Gly Ala Cys Ile Asn Ser Gly Ile Gly Val Leu Asn

515 520 525

Lys Glu Glu Thr Gly Val Tyr Ala Thr Asn Arg Asn Phe Lys Gly Arg

530 535 540

Ser Gly Asp Pro Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Arg Thr Val

545 550 555 560

Ala Ile Ser Ala Val Lys Gly Lys Ile Ser His Ile Leu Asp

565 570

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagcagca tcaacaagga agtgaccaag aaagttctgt acctgggtga cgatattaac 60

accgacgata tcattccggc gaaccgtgcg accacctacg acccggatat cctgaagcag 120

tatgcgctgg aacacctgat tggtgtgggc gagctgctga aatacaacgt gatcgttgcg 180

ggcgaaaact tcggttgcgg cagcagccgt gagatcgcgc cggttgcgct gaaggcggcg 240

ggtatcgaaa aaattcaggc gcgtagcttc gcggaaatct tctaccgtaa cagcatcaac 300

attggcctga acctggagat tctggaggaa aaacaggaaa acccggtggt tgaggcgatt 360

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ccgaaaagcg tgaccccgca gcgtccgatg accctggttg aaaagctgat cgcgaaagcg 480

agcggtaaca cctacgtgcg tccgggcgag gtggttttcg cgcaagttga cctggcgctg 540

agccatgatg cggtggcggg tccggttgcg accacctttt acaagcacta tggcaaggaa 600

gcgaaactgt gggatgcgca gcgtgtggtt ctggtggcgg atcacttcat ccaagttaac 660

gacattcgta acgatcagaa agcgaacgtg atgtatcaag agatgatcga cttcgcgaag 720

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catacctgca cctacggtgc gctgggtgcg tttagcgcgg gtgtgggcac caccgacatg 900

gcgaacatct atgcgatggg tgatatgtgg attcgtgtgc cgagcaccct ggttttcgaa 960

ctgagcggca ccctgccgcc gcacatcagc gcgaaggaca tcattctgtt tatcctgggt 1020

cagattggct gcgcgggtgc gaccagcaaa gttatggagt tccgtggtag catcctggaa 1080

caaatgccgt ttgatgagcg tctgaccctg gcgaacatgg cgattgaatg cggcgcgatc 1140

tgcggtctga ttgtgccgga cgagaccacc cgtaactacg ttcgtagccg tagcgatcag 1200

gagttcgagg aactgatcgc ggacccggat gcggagtacg aaaaggtgta taaatttgac 1260

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agccaaattg aggaaacccc gatcaccaag gcgttcattg gcagctgcac cggtggcaaa 1380

ctgtacgacc tggcgcaagc ggcggaagtt ctgcaagacc gtcaagtggc ggatggtgtt 1440

aacctgttca tcgtgccggc gagcgttgag attcgtgaaa aggcggaggc gctgggttat 1500

atggatatct ttgcgcaagc gggcgcgaag attctgaaaa gcggttgcgg cgcgtgcatc 1560

aacagcggta ttggcgtgct gaacaaagag gaaaccggtg tttacgcgac caaccgtaac 1620

tttaagggcc gtagcggtga cccgaccggc aaaaactatc tggcgagccc gcgtaccgtg 1680

gcgatcagcg cggttaaggg taaaatcagc cacattctgg attaa 1725

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgcagacgt tttgcagcag cagttctaga g 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attgctcagc ggtggcagca gcctacatat g 31

Claims

1.3-苯基马来酸异构酶NsHphCD，其特征是其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1中3-苯基马来酸异构酶NsHphCD在合成L-高苯丙氨酸中的应用。