CN110106154A - 一种柠檬烯合成酶SynLS2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柠檬烯合成酶SynLS2及其应用，柠檬烯合成酶SynLS2的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。本发明成功构建了含有该基因的重组表达载体，建立生物合成柠檬烯的方法以NPP为底物合成了柠檬烯。本发明柠檬烯合成酶催化活性高，能够实现柠檬烯在微生物细胞中的合成，有效的降低了生产成本，有利于工业化生产。

Description

一种柠檬烯合成酶SynLS2及其应用

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种柠檬烯合成酶SynLS2及其在生物合成柠檬烯中的应用。

背景技术

柠檬烯(Limonene)化学名为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，分子式为C₁₀H₁₆，相对分子量为136。柠檬烯是一种单环单萜，无色液体，且不溶于水，与苯、氯仿、乙醚混溶。自然界中的柠檬烯有两种光学异构体，D-柠檬烯和L-柠檬烯。D-柠檬烯具有抗炎、抑菌、抗癌等多种生理及药理活性，在食品工业、医药卫生领域及日化工业等领域都有着广阔的应用，其需求量也日益增大。

D-柠檬烯广泛存在于柑橘类水果(柠檬、甜橙、葡萄柚等)的果肉和果皮中，目前D-柠檬烯主要通过对柑橘类水果的果肉及果皮进行分离提取获得，其产量及产品质量因受到季节及环境等因素的影响而不稳定。基于此，随着近些年合成生物学和代谢工程技术的快速发展，微生物细胞平台为萜类化合物的合成提供了有效的途径。

微生物细胞合成柠檬烯需要引入外源的柠檬烯合成酶，柠檬烯合成酶能够催化底物合成柠檬烯以及少量其他萜类化合物。但目前，柠檬烯合成酶催化活性不高，生产成本高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种活性高，生产成本低的柠檬烯合成酶SynLS2。

本发明的第二个目的是提供柠檬烯合成酶SynLS2的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种柠檬烯合成酶SynLS2，其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

编码一种柠檬烯合成酶SynLS2的基因，所述基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。

一种柠檬烯合成酶SynLS2催化底物橙花基焦磷酸合成柠檬烯的应用。

本发明的优点：

本发明提供一种编码柠檬烯合成酶SynLS2的基因和其编码的柠檬烯合成酶SynLS2，并成功构建了含有该基因的重组表达载体，建立生物合成柠檬烯的方法以NPP为底物合成了柠檬烯。本发明柠檬烯合成酶催化活性高，能够实现柠檬烯在微生物细胞中的合成，有效的降低了生产成本，有利于工业化生产。

附图说明

图1为表达载体pNLS2图谱。

图2为菌株ScLim2发酵液和柠檬烯标品的气相色谱图。其中1:柠檬烯标准品；2：ScLim2发酵液。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coliDH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司。

酿酒酵母菌株yJGZ1来源于已发表文献(JiangGZ,YaoMD,WangY,etal.Manipulation ofGESandERG20forgeranioloverproductioninSaccharomycescerevisiae[J].Metabolic Engineering,2017,41:57-66.)。

LB培养基组成为：10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

SD培养基组成为：20g/L葡萄糖，酵母基本氮源6.7g/L，氨基酸缺省混合粉末2g/L，余量为水，0.1Mpa压力115℃下灭菌15min。SD培养基在使用前根据具体情况添加所需的无菌氨基酸母液。

YPD培养组成为：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力115℃下灭菌15min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1柠檬烯合成酶基因SynLS2的获得

通过在NCBI数据库中检索柠檬烯合成酶，得到CsLS基因，结合酿酒酵母对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点及N端转运肽，通过全人工合成得到柠檬烯合成酶SynLS2基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。该基因编码得到的柠檬烯合成酶的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

将通过化学全合成得到的柠檬烯合成酶SynLS2基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上BsaI酶切位点。用高保真DNA聚合酶，建立PCR体系。

PCR过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择57℃退火30s，72℃延伸1min，循环数为30个。

以SynLS2基因片段为模板，以SynLS2-F(SEQ ID No.3)和SynLS2-R(SEQ ID No.4)为引物，大量扩增制备含BsaI酶切位点序列的SynLS2基因，纯化扩增产物后，备用。

实施例2重组表达载体pCSN的构建

通过在NCBI数据库中检索橙花基焦磷酸合成酶，得到NDPS1基因，结合酿酒酵母对密码子的偏好性，同时去除常用酶切位点及N端转运肽，通过全人工合成得到橙花基焦磷酸合成酶tSlNDPS1基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID No.5所示。

提取酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C的基因组并以该基因组为模板，分别以ENO2-F(SEQID No.6)、ENO2-R(SEQ ID No.7)、GAL10-F(SEQ ID No.8)、GAL10-R(SEQ ID No.9)、GPM1-F(SEQ ID No.10)、GPM1-R(SEQ ID No.11)、GAL7-F(SEQ ID No.12)、GAL7-R(SEQ IDNo.13)、GPD-F(SEQ ID No.14)和GPD-R(SEQ ID No.15)为引物，通过PCR反应分别得到ENO2终止子，GAL10启动子，GPM1终止子，GAL7启动子和GPD终止子片段，这些片段的核苷酸序列依次用SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。PCR反应过程与实施例1相同。

再分别以ENO2终止子，GAL10启动子，tSlNDPS1基因，GPM1终止子，GAL7启动子和GPD终止子为模板，分别以ENO2-F2(SEQ ID No.21)、EG-R(SEQ ID No.22)、EG-F(SEQIDNo.23)、GtS-R(SEQIDNo.24)、GtS-F(SEQIDNo.25)、tSG-R(SEQIDNo.26)、tSG-F(SEQ IDNo.27)、GG-R(SEQ ID No.28)、GG-F(SEQ ID No.29)、GBsaG-R(SEQ ID No.30)、GBsaG-F(SEQ ID No.31)和GPD-R2(SEQ ID No.32)为引物，进行多步重叠延伸PCR反应，得到两端添加了NotI酶切位点的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段。

将得到的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段使用FastDigest内切酶NotI进行酶切，反应体系为：5μL10*FDbuffer，4μLNotI内切酶、30μL T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，1h。将NotI单酶切后的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段连于相同酶切线性化的表达载体骨架pRS426(Addgene，USA)上，通过连接反应得到pCSN质粒。

其连接反应体系为：1μL10*T4DNA连接酶缓冲液,1μLT4DNA连接酶,6μL用NotI单酶切后的T_ENO2-P_GAL10-tSlNDPS1-T_GPM1-P_GAL7-T_GPD片段和2μLNotI单酶切后的表达载体骨架pRS426。连接反应条件为：30℃，30min。

实施例3重组表达载体pNLS2的构建

将实施例1中得到的含BsaI酶切位点序列的SynLS2基因片段使用FastDigest内切酶BsaI进行酶切，反应体系为：5μL10*FDbuffer，4μLBsaI内切酶、30μLSynLS2基因片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，4h。将BsaI单酶切后的SynLS2基因片段连于相同酶切线性化的表达载体pCSN的GAL7启动子下游和GPD终止子上游处，通过连接反应得到pNLS2质粒(图1)。

其连接反应体系为：1μL10*T4DNA连接酶缓冲液,1μLT4DNA连接酶,6μL用BsaI单酶切后的SynLS2基因片段和2μLBsaI单酶切后的表达载体骨架pCSN。连接反应条件为：30℃，30min。

实施例4重组酿酒酵母的构建及生物合成柠檬烯

1.重组酿酒酵母的构建

将所构建的载体pNLS2通过化学转化的方式转入宿主细胞酿酒酵母菌株yJGZ1中，得到重组菌株ScLim2。

2.重组菌株ScLim2生物合成柠檬烯

挑重组菌株ScLim2单菌落接种于不含有尿嘧啶的SD培养基中，30℃，250rpm，震荡培养20h左右，再次转接到新鲜的不含有尿嘧啶的SD培养基中，30℃摇床，250rpm，培养20h左右后转接至50mLYPD发酵培养基中，初始OD₆₀₀为0.2左右，同时添加10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯，其目的是为了防止目的产物柠檬烯的挥发并且缓解柠檬烯对于酵母细胞的毒性，然后放置于30℃摇床，250rpm，培养48h，合成柠檬烯。

经过气相色谱检测，重组菌株ScLim2在50mLYPD培养基中发酵48h能够合成26.4mg/L柠檬烯(图2)。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种柠檬烯合成酶SynLS2及其应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 557

<212> PRT

<213> 甜橙(Citrus sinensis)

<400> 1

Met Asp Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Ile Trp Asp His Asp

1 5 10 15

Phe Leu Gln Ser Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Asp Glu Thr Tyr Lys Arg

20 25 30

Arg Ala Glu Glu Leu Lys Gly Lys Val Lys Thr Ala Ile Lys Asp Val

35 40 45

Thr Glu Pro Leu Asp Gln Leu Glu Leu Ile Asp Asn Leu Gln Arg Leu

50 55 60

Gly Leu Ala Tyr His Phe Glu Pro Glu Ile Arg Asn Ile Leu Arg Asn

65 70 75 80

Ile His Asn His Asn Lys Asp Tyr Asn Trp Arg Lys Glu Asn Leu Tyr

85 90 95

Ala Thr Ser Leu Glu Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Pro Val

100 105 110

Ser Gln Glu Val Phe Ser Gly Phe Lys Asp Asp Lys Val Gly Phe Ile

115 120 125

Cys Asp Asp Phe Lys Gly Ile Leu Ser Leu His Glu Ala Ser Tyr Tyr

130 135 140

Ser Leu Glu Gly Glu Ser Ile Met Glu Glu Ala Trp Gln Phe Thr Ser

145 150 155 160

Lys His Leu Lys Glu Met Met Ile Thr Ser Asn Ser Lys Glu Glu Asp

165 170 175

Val Phe Val Ala Glu Gln Ala Lys Arg Ala Leu Glu Leu Pro Leu His

180 185 190

Trp Lys Ala Pro Met Leu Glu Ala Arg Trp Phe Ile His Val Tyr Glu

195 200 205

Lys Arg Glu Asp Lys Asn His Leu Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu

210 215 220

Phe Asn Thr Leu Gln Ala Ile Tyr Gln Glu Glu Leu Lys Asp Ile Ser

225 230 235 240

Gly Trp Trp Lys Asp Thr Gly Leu Gly Glu Lys Leu Ser Phe Ala Arg

245 250 255

Asn Arg Leu Val Ala Ser Phe Leu Trp Ser Met Gly Ile Ala Phe Glu

260 265 270

Pro Gln Phe Ala Tyr Cys Arg Arg Val Leu Thr Ile Ser Ile Ala Leu

275 280 285

Ile Thr Val Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu

290 295 300

Leu Glu Ile Phe Thr Asp Ala Val Ala Arg Trp Asp Ile Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Leu Lys His Leu Pro Gly Tyr Met Lys Met Cys Phe Leu Ala Leu Tyr

325 330 335

Asn Phe Val Asn Glu Phe Ala Tyr Tyr Val Leu Lys Gln Gln Asp Phe

340 345 350

Asp Met Leu Leu Ser Ile Lys His Ala Trp Leu Gly Leu Ile Gln Ala

355 360 365

Tyr Leu Val Glu Ala Lys Trp Tyr His Ser Lys Tyr Thr Pro Lys Leu

370 375 380

Glu Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Leu Val Ser Ile Thr Gly Pro Leu Ile

385 390 395 400

Ile Thr Ile Ser Tyr Leu Ser Gly Thr Asn Pro Ile Ile Lys Lys Glu

405 410 415

Leu Glu Phe Leu Glu Ser Asn Pro Asp Ile Val His Trp Ser Ser Lys

420 425 430

Ile Phe Arg Leu Gln Asp Asp Leu Gly Thr Ser Ser Asp Glu Ile Gln

435 440 445

Arg Gly Asp Val Pro Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Thr Gly

450 455 460

Ala Ser Glu Glu Val Ala Arg Glu His Ile Lys Asp Met Met Arg Gln

465 470 475 480

Met Trp Lys Lys Val Asn Ala Tyr Thr Ala Asp Lys Asp Ser Pro Leu

485 490 495

Thr Arg Thr Thr Ala Glu Phe Leu Leu Asn Leu Val Arg Met Ser His

500 505 510

Phe Met Tyr Leu His Gly Asp Gly His Gly Val Gln Asn Gln Glu Thr

515 520 525

Ile Asp Val Gly Phe Thr Leu Leu Phe Gln Pro Ile Pro Leu Glu Asp

530 535 540

Lys Asp Met Ala Phe Thr Ala Ser Pro Gly Thr Lys Gly

545 550 555

<210> 2

<211> 1674

<212> DNA

<213> 甜橙(Citrus sinensis)

<400> 2

atggatagaa gatccgctaa ttaccaacca tccatttggg atcatgattt cttgcagtct 60

ctgaactcta actacactga cgaaacttac aaaagaaggg ccgaagaatt gaaaggtaag 120

gttaagactg ccatcaagga tgttactgaa ccattggatc agttggaatt gatcgacaac 180

ttgcaaagat tgggtttagc ctaccatttc gaaccagaaa tcagaaacat cttgaggaac 240

atccataacc acaacaagga ctacaattgg cgtaaagaaa acttgtacgc tacctccttg 300

gaatttcgtt tgttgagaca acatggttac ccagtttctc aagaagtttt ctctggtttc 360

aaggatgata aggtcggttt catctgtgat gatttcaagg gtatcttgtc attgcatgaa 420

gcctcttact attccttgga aggtgaatct attatggaag aagcctggca attcactagc 480

aagcacttga aagaaatgat gattacctcc aactccaaag aagaggacgt ttttgttgct 540

gaacaagcta aaagagcttt ggaattgcca ttgcattgga aagctccaat gttggaagct 600

agatggttca tccatgttta cgaaaagagg gaagataaga accacttgtt gttggaatta 660

gccaagttgg agtttaacac cttgcaagct atctaccaag aagagttgaa ggatatttca 720

ggttggtgga aagatactgg tttgggtgaa aaattgtcct tcgctagaaa tagattggtc 780

gcttcttttt tgtggtctat gggtattgct ttcgaacctc aatttgccta ctgtagaaga 840

gttttgacca tttccattgc cttgatcacc gttatcgatg atatctacga tgtctacggt 900

actttggacg aattggaaat tttcactgat gctgttgcta gatgggatat taactacgcc 960

ttgaaacatt tgccaggtta catgaagatg tgtttcttgg ccttgtacaa ctttgtcaat 1020

gagttcgctt actacgtctt gaagcaacaa gatttcgaca tgctgttgtc tatcaaacat 1080

gcttggttgg gtttgattca agcctatttg gttgaagcca agtggtatca ttctaagtac 1140

accccaaaac tggaagagta cttggaaaac ggtctggttt ctattactgg tccattgatt 1200

atcaccatca gctacttgtc tggtacgaac ccaattatca agaaagagct ggaatttttg 1260

gagagcaacc cagatatagt tcactggtcc tctaagattt tcagattgca agatgacttg 1320

ggcacttcct ctgatgagat tcaaagaggt gacgttccaa agtctattca atgttacatg 1380

cacgaaactg gtgcctctga agaagttgct agagaacata ttaaggacat gatgagacag 1440

atgtggaaga aggttaacgc ttatactgct gataaggatt ctccattgac tagaactacc 1500

gccgaatttt tgttgaactt ggttagaatg tcccacttca tgtacttgca tggtgatggt 1560

catggtgtcc aaaatcaaga aactatcgat gttggtttca ccttgttgtt ccaacctatt 1620

ccattagagg ataaggatat ggcttttact gcttctccag gtactaaggg ttaa 1674

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtctcaatg gatagaagat ccgctaatt 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtctcttta acccttagta cctggagaag c 31

<210> 5

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtctgcta gaggtttgaa caagatttcg tgcagcttga acttgcaaac tgaaaagttg 60

tgttacgaag ataacgataa cgatttggat gaagaattga tgccaaagca cattgctttg 120

atcatggatg gtaacagaag atgggctaag gataagggtt tggaagttta cgaaggtcac 180

aagcacatta ttccaaagtt gaaggaaatt tgtgacattt cttctaagtt gggtatccaa 240

attatcactg ctttcgcttt ctctactgaa aactggaaga gatccaagga agaagttgat 300

ttcttgttgc aaatgttcga agaaatctac gatgaatttt ctcgttcggg tgttagagtt 360

tctattatcg gttgtaagtc cgacttgcca atgactttgc aaaagtgtat cgctttgact 420

gaagaaacta ctaagggtaa caagggtttg cacttggtta ttgctttgaa ctacggtggt 480

tactacgaca tcttgcaagc tactaagtct attgttaaca aggctatgaa cggtttgttg 540

gatgttgaag atatcaacaa gaacttgttc gatcaagaat tggaatctaa gtgtccaaac 600

ccagatttgt tgatcagaac tggtggtgaa caaagagttt ctaacttctt gttgtggcaa 660

ttggcttaca ctgaatttta cttcaccaac actttgttcc cagatttcgg tgaagaagat 720

ttgaaggaag ctatcatgaa cttccaacaa agacacagaa gattcggtgg tcacacttac 780

taa 783

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgctttta actaagaatt attagtc 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggtatcatc tccatctccc a 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tatagttttt tctccttgac gtt 23

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttatattga attttcaaaa attcttactt 30

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtctgaaga atgaatgatt tg 22

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tattcgaact gcccattca 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgccagct tactatcctt 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttttgaggg aatattcaac tgt 23

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgaattta ctttaaatct tgcatt 26

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaatctgtg tatattactg cat 23

<210> 16

<211> 400

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 16

agtgctttta actaagaatt attagtcttt tctgcttatt ttttcatcat agtttagaac 60

actttatatt aacgaatagt ttatgaatct atttaggttt aaaaattgat acagttttat 120

aagttacttt ttcaaagact cgtgctgtct attgcataat gcactggaag gggaaaaaaa 180

aggtgcacac gcgtggcttt ttcttgaatt tgcagtttga aaaataacta catggatgat 240

aagaaaacat ggagtacagt cactttgaga accttcaatc agctggtaac gtcttcgtta 300

attggatact caaaaaagat ggatagcatg aatcacaaga tggaaggaaa tgcgggccac 360

gaccacagtg atatgcatat gggagatgga gatgatacct 400

<210> 17

<211> 669

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

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ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420

agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

gcgtattact gaaagttcca aagagaaggt ttttttaggc taagataatg gggctcttta 540

catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600

aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660

caatataaa 669

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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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agtctgaaga atgaatgatt tgatgatttc tttttccctc catttttctt actgaatata 60

tcaatgatat agacttgtat agtttattat ttcaaattaa gtagctatat atagtcaaga 120

taacgtttgt ttgacacgat tacattattc gtcgacatct tttttcagcc tgtcgtggta 180

gcaatttgag gagtattatt aattgaatag gttcattttg cgctcgcata aacagttttc 240

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caccaattgc aaagggaaaa gctgaatggg cagttcgaat a 401

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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aacacataga tttgctgtat aacgaatttt atgctatttt ttaaatttgg agttcagtga 120

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aagcgcttca gtgaaaaaat cataaggaaa agttgtaaat attattggta gtattcgttt 360

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ttttctgtca ttttccttaa cccaaaaata agggaaaggg tccaaaaagc gctcggacaa 540

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taatgtgtag ctatgttcag ttagtttggc tagcaaagat ataaaagcag gtcggaaata 660

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agtgaattta ctttaaatct tgcatttaaa taaattttct ttttatagct ttatgactta 60

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gcagtaatat acacagattc c 501

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcggccgcag tgcttttaac taagaattat tagtc 35

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taacgtcaag gagaaaaaac tataaggtat catctccatc tcccatat 48

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atatgggaga tggagatgat accttatagt tttttctcct tgacgtta 48

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcttgttcaa acctctagca gacattttat attgaatttt caaaaattct t 51

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagaattttt gaaaattcaa tataaaatgt ctgctagagg tttgaacaag a 51

<210> 26

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcatcaaatc attcattctt cagactttag taagtgtgac caccgaa 47

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

attcggtggt cacacttact aaagtctgaa gaatgaatga tttgatga 48

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcaagaagga tagtaagctg gcaaatattc gaactgccca ttcagctttt 50

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaaagctgaa tgggcagttc gaatatttgc cagcttacta tccttcttga 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttcactttag gagaccggtc tcccattttt tgagggaata ttcaactgtt 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaaaaatggg agaccggtct cctaaagtga atttacttta aatcttgcat 50

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcggccgcgg aatctgtgta tattactgca t 31

Claims (3)

1.一种柠檬烯合成酶SynLS2，其特征是其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1一种柠檬烯合成酶SynLS2的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列用SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1的一种柠檬烯合成酶SynLS2催化底物橙花基焦磷酸合成柠檬烯的应用。