CN102719458B

CN102719458B - 一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用

Info

Publication number: CN102719458B
Application number: CN2012100675135A
Authority: CN
Inventors: 杜丽琴; 霍云龙; 黄日波; 庞浩; 王子龙; 韦宇拓
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102719458A

Abstract

本发明公开了一个编码碱性β-葡萄糖苷酶基因和应用，本碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，并提供了所述基因编码碱性β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示。本碱性β-葡萄糖苷酶的活性适应酸碱范围pH值5-10，最佳pH值8.0，当pH值10时酶活性仍保留有最高酶活性的58％，优于已有的碱性β-葡萄糖苷酶的活性，提高了其应用价值，适合在分解纤维寡糖中的应用。

Description

一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，涉及一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，EC3.2.1.21)又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，广泛存在于微生物到脊椎动物的各种生物中。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，如水杨苷(salicin)、纤维二糖(cellobiose)、纤维三糖(cellotriose)、纤维四糖(cellotetrose)和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)等，在食品风味物质的释放和纤维素降解中具有重要作用(SesteloA.B.F，Poza M.，Villa T.C.β-Glucosidase activity in a Lactobacillusplantarum wine strain.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology，2004，20：633～637)。

能源短缺是本世纪面临的重大问题之一。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上含量最丰富的碳水化合物，也是数量最大的一种可再生资源。对于纤维素的利用，是解决能源危机、粮食短缺和环境污染的重要途径。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶复合酶系发挥协同作的关键酶，对纤维素酶系的整体水解活性有很强的促进作用，可以通过提高纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的活性来改善整个纤维素酶系的功用(Bhat K.M.，Bhat S.Cellulose degradingenzymes and their potential industrial applications.Biotechnol Adv，1997，15：583～620)。因此，对β-葡萄糖苷酶进行深入研究是十分必要的，也越来越引起人们的关注。

目前，已有上百个微生物β-葡萄糖苷酶基因得到克隆，许多微生物来源的β-葡萄糖苷酶基因已获得异源表达(韩笑、陈介南、王义强、何钢、刘海波、谭力，β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展。生物技术通报，2008，3：8～13)。目前，研究得较多的是酵母(yeast)和木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等霉菌(Dan S.，Marton I.，Dekel M.，Bravdo BA.，He S.，Withers S.G.，Shoseyov O.Cloning，expression，characterization，and nucleophileidentification of family 3，Aspergillus niger beta-glucosidase.J.Biol.Chem.，2000，275：4973～4980)。但是，由于木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，另是纤维素酶活力较低，尤其是β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。大部分β-葡萄糖苷酶的最适pH都在3.5～5.5酸性范围，也有少数的β-葡萄糖苷酶其pH在碱性范围。

β-葡萄糖苷酶除了在降解纤维素方面有着重要作用外，在其他领域应用也越来越广泛，尤其是在医药、食品、生物转化中具有重要的应用价值[Michael E.H.，Mark F.R.，Charles E.，Cellulase for commodity products from cellulosic biomass.Curr.Opin.Biotechnol.，1999，10(4)：358～364]。在水果、蔬菜、茶叶等食料和中草药中，许多风味前体物质和药理活性成分主要以糖苷形式存在，需要β-葡萄糖苷酶这种风味酶将其转化为苷元或其他形式的高生理活性物质发挥作用(金凤燮，庄子瑜，鱼红闪，等.特异的中草药配糖体苷酶微生物及其发酵与酶学特性.生物工程学报，2009，25(12)：1863～1870)。同时，β-葡萄糖苷酶还具有葡萄糖基转移活性(孟宪文、宋小红、陈历俊等，β-葡萄糖苷酶的研究进展。中国乳业，2009，10：42～44)，可用于低聚龙胆糖的生产(刘玲玲、朱松、朱婷等，重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化。微生物学报，2009，49(5)：597～602)和红景天苷等糖苷类活性物质的酶法合成(刘磷、梅乐和、柳行等，酶催化制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷过程强化。高校化学工程学报，2009，23(1)：87～91；王梦亮、李万丽，固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究。生物技术，2009，19(1)：68～70)。

本发明人以葡萄糖苷酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共检出294项发明专利。其中有19项发明专利是描述编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用，而其他275项是与葡萄糖苷酶在各种领域上的应用有关。在这19项与编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用相关的发明专利中只有一项是描述碱性β-葡萄糖苷酶，专利申请人：南开大学；专利号：ZL200510116748.9；发明名称：一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶及其编码基因。该发明涉及一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因。该酶具有在高温、碱性条件下保持较高酶活性的特点，其最适反应温度约为70℃，最适反应pH值约为8.0，该酶能催化水解β-葡萄糖苷键生成葡萄糖，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。这个碱性β-葡萄糖苷酶是从嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)克隆到的，从专利的说明书附图的图3中可以看出该碱性β-葡萄糖苷酶在pH10.0时的酶活性只有最高时的25％。

发明内容

本发明的目的：提供了一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用，这个碱性β-葡萄糖苷酶在pH值10时，其酶活性仍保留有较高的酶活性。

本发明是这样实现的：

一种碱性β-葡萄糖苷酶基因，其序列的保守区外源DNA是由2277个碱基组成，含有完整的β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Pbgl基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAG，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1为：

agaaacc atacttcaga cacgatcaat aagacagtag aaaccgttcg atacgtaaaa 60

aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120

gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaaata cgaggactgg 180

cggctgtcgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240

gccggtctga tgctgtacag ccgtcatcag tcgatccccg ccctcagtac cggctggttt 300

gcaggcacgt acagcgggaa aacgtatgaa gagagcggag cgaagccttg ggaactgacc 360

gatgagcaga tcgcattttt gaccaaggac catgtgcggc acgtgctcgt aaccacggtg 420

gaaagtccgg aagttgcggc gcgctggaac aacaaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480

gggcttggca ttccggcgaa caacagctcc gatccccgcc acgcttcgga ttcaagctcc 540

gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct cggcctagca 600

gctacttttg atcccgagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660

gcgttagggc ttgctaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720

ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatct ggcccgcgct 780

tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgcggacgg ttggggttat 840

gacagcgtca atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggcg gatcgggcga agccggaagg 900

gacgcccact acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgaacat 960

ctggtgcctt ttgttgacgg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcggcc 1020

gtcatgccgt attacacgat ctccttcggc caggacaccg taaacggcga aaatgtcggc 1080

aactcctata actcgtacct gattaaggat ttgctgcgcg ggaaatacgg gtatgacggc 1140

gtcgtatgca cggactggat gatcacggcc gacgtttccg gcgccaagga ttcttttctg 1200

agcggaaaac catggggcgt ggaggatttg accgtggccg agcgccatta caagctgctg 1260

atggcgggcg ttgaccaatt cggcggcaac aatgagatcg agccggtgtt ggaggcttac 1320

aagatcgggg ttcgcgaaca cggcgaagcc tatatgcggg aacgcttcga gcaatcggcc 1380

gtccggctgc tgaaaaatat gttccgcctc ggcttgtttg aaaatccgta cctcgatcca 1440

caggaaagcg ccaagctggt cgggaacccc gaatttatgc gggaaggtta cgaagcacag 1500

ctaaaatcga tcgtcatgct caaaaacaaa aacggggtgc tcccgcttcg cgcgaaaagc 1560

aaagtttaca tccccaaacg ttttctcccg ccgggaaaag actggttcgg ccatccgacg 1620

ccggagagct atgattatcc ggtcaacctg gaggtcgtct cgaaatattt cgaagtcacc 1680

gaccaaccgg acgaagcgga tttcggcctt gtctttatcg catcaccgaa gtccggcacc 1740

ggctacagcc aggaggacga ggagcagggc gggaacggtt atgtgccgat cagcctgcaa 1800

tacaagccgt atacggcgga gcatgcccgg gaagtcagcc tggccggcga tgaacacggg 1860

aacgaaccgc gaaaccgttc ttataaagga aaaaccgtca ttccgcacaa tacgacggat 1920

ttaaacatgg tgctggagac gaaggaaaaa atgaaaggca aacccgtcat tgtctcgatg 1980

ctattgagca atcccacggt cgtttcggag tttgaagcgg aagtggatgc catcctggcg 2040

aacttcggcg ttcaggatca ggcgatcatg gatgtattga cgggggcggc ggagccgtcc 2100

gggctgctgc cgatgcaaat gcccgcccat atgcgcaccg tcgaagagca gctggaagat 2160

gtcgcgcacg atatggaatg ccatgtcgat tcggacaatc atgtatatga ctttgccttc 2220

gggttgaact ggagcggcgt gatcgaggat gagcgaacca agaaataccg tagaagc

2280

以上所述基因编码的碱性β-葡萄糖苷酶，由759个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.2为：

Met Arg Asn His Thr Ser Asp Thr Ile Asn Lys Thr Val Glu Thr

1 5 10 15

Val Arg Tyr Val Lys Asn Pro Gly Gly Pro Thr Leu Gly Tyr Ser

16 20 25 30

Glu Glu Ser Gly Val Gly Ile Ile Glu Gln Asp Gly Leu Phe Phe

31 35 40 45

Lys Asp Leu Ser Arg Asp Gly Lys Leu Asp Lys Tyr Glu Asp Trp

46 50 55 60

Arg Leu Ser Pro Glu Glu Arg Ala Lys Asp Leu Ala Ser Lys Met

61 65 70 75

Thr Val Glu Gln Ile Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Arg His Gln

76 80 85 90

Ser Ile Pro Ala Leu Ser Thr Gly Trp Phe Ala Gly Thr Tyr Ser

91 95 100 105

Gly Lys Thr Tyr Glu Glu Ser Gly Ala Lys Pro Trp Glu Leu Thr

106 110 115 120

Asp Glu Gln Ile Ala Phe Leu Thr Lys Asp His Val Arg His Val

121 125 130 135

Leu Val Thr Thr Val Glu Ser Pro Glu Val Ala Ala Arg Trp Asn

136 140 145 150

Asn Lys Ile Gln Ala Phe Ala Glu Gly Thr Gly Leu Gly Ile Pro

151 155 160 165

Ala Asn Asn Ser Ser Asp Pro Arg His Ala Ser Asp Ser Ser Ser

166 170 175 180

Glu Phe Asn Ala Gly Ala Gly Gly His Ile Ser Met Trp Pro Glu

181 185 190 195

Thr Leu Gly Leu Ala Ala Thr Phe Asp Pro Glu Ile Thr Lys Lys

196 200 205 210

Phe Gly Met Ile Ala Ser Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gly Leu Ala

211 215 220 225

Thr Ala Leu Ser Pro Gln Ile Asp Ile Ala Thr Glu Pro Arg Trp

226 230 235 240

Phe Arg Phe Asn Gly Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys Leu Ala Ala

241 245 250 255

Asp Leu Ala Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe Gln Thr Ser Glu Gly

256 260 265 270

Glu Arg Glu Ile Ala Asp Gly Trp Gly Tyr Asp Ser Val Asn Ala

271 275 280 285

Met Val Lys His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ala Gly Arg

286 290 295 300

Asp Ala His Tyr Ser Cys Gly Lys Tyr Ala Val Tyr Pro Gly Asn

301 305 310 315

Asn Phe Asp Glu His Leu Val Pro Phe Val Asp Gly Ala Phe Lys

316 320 325 330

Leu Asp Gly Lys Thr Gly Lys Ala Ser Ala Val Met Pro Tyr Tyr

331 335 340 345

Thr Ile Ser Phe Gly Gln Asp Thr Val Asn Gly Glu Asn Val Gly

346 350 355 360

Asn Ser Tyr Asn Ser Tyr Leu Ile Lys Asp Leu Leu Arg Gly Lys

361 365 370 375

Tyr Gly Tyr Asp Gly Val Val Cys Thr Asp Trp Met Ile Thr Ala

376 380 385 390

Asp Val Ser Gly Ala Lys Asp Ser Phe Leu Ser Gly Lys Pro Trp

391 395 400 405

Gly Val Glu Asp Leu Thr Val Ala Glu Arg His Tyr Lys Leu Leu

406 410 414 420

Met Ala Gly Val Asp Gln Phe Gly Gly Asn Asn Glu Ile Glu Pro

421 425 430 435

Val Leu Glu Ala Tyr Lys Ile Gly Val Arg Glu His Gly Glu Ala

436 440 445 450

Tyr Met Arg Glu Arg Phe Glu Gln Ser Ala Val Arg Leu Leu Lys

451 455 460 465

Asn Met Phe Arg Leu Gly Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Leu Asp Pro

466 470 475 480

Gln Glu Ser Ala Lys Leu Val Gly Asn Pro Glu Phe Met Arg Glu

481 485 490 495

Gly Tyr Glu Ala Gln Leu Lys Ser Ile Val Met Leu Lys Asn Lys

496 500 505 510

Asn Gly Val Leu Pro Leu Arg Ala Lys Ser Lys Val Tyr Ile Pro

511 515 520 525

Lys Arg Phe Leu Pro Pro Gly Lys Asp Trp Phe Gly His Pro Thr

526 530 535 540

Pro Glu Ser Tyr Asp Tyr Pro Val Asn Leu Glu Val Val Ser Lys

541 545 550 555

Tyr Phe Glu Val Thr Asp Gln Pro Asp Glu Ala Asp Phe Gly Leu

556 560 565 570

Val Phe Ile Ala Ser Pro Lys Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Glu

571 575 580 585

Asp Glu Glu Gln Gly Gly Asn Gly Tyr Val Pro Ile Ser Leu Gln

586 590 595 600

Tyr Lys Pro Tyr Thr Ala Glu His Ala Arg Glu Val Ser Leu Ala

601 605 610 615

Gly Asp Glu His Gly Asn Glu Pro Arg Asn Arg Ser Tyr Lys Gly

616 620 625 630

Lys Thr Val Ile Pro His Asn Thr Thr Asp Leu Asn Met Val Leu

631 635 640 645

Glu Thr Lys Glu Lys Met Lys Gly Lys Pro Val Ile Val Ser Met

646 650 655 660

Leu Leu Ser Asn Pro Thr Val Val Ser Glu Phe Glu Ala Glu Val

661 665 670 675

Asp Ala Ile Leu Ala Asn Phe Gly Val Gln Asp Gln Ala Ile Met

676 680 685 690

Asp Val Leu Thr Gly Ala Ala Glu Pro Ser Gly Leu Leu Pro Met

691 695 700 705

Gln Met Pro Ala His Met Arg Thr Val Glu Glu Gln Leu Glu Asp

706 710 715 720

Val Ala His Asp Met Glu Cys His Val Asp Ser Asp Asn His Val

721 725 730 735

Tyr Asp Phe Ala Phe Gly Leu Asn Trp Ser Gly Val Ile Glu Asp

736 740 745 750

Glu Arg Thr Lys Lys Tyr Arg Arg Ser

751 755 759

以上所述的碱性β-葡萄糖苷酶同源性最高的是乳酸类芽孢杆菌154(Paenibacillus lactis154)的糖基水解酶家族3的功能域蛋白质(glycoside hydrolase family 3domain protein)，两者的相似性＝731/759(96％)；同源性＝746/759(98％)。

以上所述的碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl表达载体及用于转化基因Pbgl的宿主。

以上所述的碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl，是从广西南宁筛选到的克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因组文库中克隆得到的碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl。

以上所述的碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产β-葡萄糖苷酶，其酶活性最佳pH值8.0，pH值6或pH值10时酶活性均达到最高酶活性的58％。

以上所述的克隆表达采用的引物是：

上游引物：5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3’；

下游引物5’-GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3’。

以上所述的碱性β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达的重组产物Pbgl能够分解纤维二糖，应用于纤维寡糖为原料降解成葡萄糖。

本发明的优点和积极效果：

本碱性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产β-葡萄糖苷酶Pbgl，其酶活性适应酸碱范围pH值5-10，最佳pH值8.0，pH值10时酶活性仍保留有最高酶活性的58％，优于已有的碱性β-葡萄糖苷酶的活性，提高了其应用价值。

附图说明

图1：是筛选含有β-葡萄糖苷酶基因Pbgl重组菌株的七叶苷选择平板图。

图2：是β-葡萄糖苷酶纯化物的SDS-PAGE图。

图3：是β-葡萄糖苷酶活性与pH值关系图。

图4：是β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖的HPLC图。

图中说明：图1中是含有β-葡萄糖苷酶基因Pbbgl重组的菌株能够在七叶苷选择平板上形成黑色圈；图2中β-葡萄糖苷酶纯化物的分子量为84kDa；图3中β-葡萄糖苷酶的最适pH为8.0；图4中的A和B分别是葡萄糖和纤维二糖的标样，C是β-葡萄糖苷酶能将纤维二糖水解成葡萄糖。

具体实施方式

下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-blue、载体pUC19(购自大连TaKaRa公司)；表达载体pSE380购自Stratagene公司，购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。

下面将通过实施例对本发明作详细描述：

1、克氏类芽孢杆菌GX-4基因组文库的构建

克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Biospin Bacteria Genomic DNAExtraction Kit(目录号BSC12S1)的使用说明来提取的。

克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因组文库构建是按照Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl^TM Fosmid Library Production Kit(目录号CCFOS110)的使用说明书来进行的。构建好的克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因组文库涂布到在含氯霉素12.5μg/mL，LA培养基每100ml含：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，琼脂粉1.5g的LA平板上。结果共获得约4231个转化子。

2、β-葡萄糖苷酶基因Pbgl序列的测定

将在含氯霉素12.5μg/mL的LA平板上得到的转化子分别点菌落到含有氯霉素12.5μg/mL，蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，NaCl 0.5g/100mL，七叶苷0.12g/100mL，柠檬酸铁铵0.5g/100mL，琼脂粉1.5g/100mL培养基的LA选择平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养12小时。结果筛选到八个能产黑色透明圈的克隆，本发明只涉及其中一个克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI酶切后，将获得的DNA片段与经BamHI酶切的去磷酸化的pUC19质粒进行连接。再CaCl₂转化方法将连接产物转化到大肠杆菌XL1-blue中，在含氨苄青霉素100μg/mL、七叶苷0.12g/100mL和柠檬酸铁铵0.5g/100mL的LA选择平板上筛选亚克隆转化子。结果共获得约50个产生黑色圈的亚克隆转化子。进一步提取其中6个亚克隆转化子的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全酶切后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果这6个亚克隆转化子都能酶切下一个2.7kb的载体片段外，还给出另外一条DNA片段，大小为5.8kb。于是，对其中一个亚克隆子进行测序，并命名为pUC-Pbgl。pUC-Pbgl送交华大基因公司测定DNA核苷酸序列。

3、β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的核苷酸序列分析

采用NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件如ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对DNA序列进行分析。β-葡萄糖苷酶基因序列的保守区外源DNA是由2277个碱基组成，含有完整的β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Pbgl基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAG，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4、β-葡萄糖苷酶基因Pbgl编码的产物Pbgl的氨基酸序列分析

β-葡萄糖苷酶基因Pbgl编码一个含759个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为84206.29道尔顿。

用简单组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析β-葡萄糖苷酶Pbgl的组件结构，结果是自N端的第157-403位和542-746位氨基酸为家族3糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。

5、β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的克隆和表达

使用上游引物5’-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3’和下游引物5’-GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增β-葡萄糖苷酶基因Pbgl，用限制性内切酶Pag I和HindIII酶切β-葡萄糖苷酶基因Pbgl后，与经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-blue中(转化方法为CaCl₂法)，涂布到含氨苄青霉素100μg/mL的LA平板上。挑取转化得到的单菌落到含氨苄青霉素100μg/mL、七叶苷0.12g/100mL和柠檬酸铁铵0.5g/100mL的LA选择培养基平板上，将平板置于37℃恒温箱培养6小时，然后进行氯仿熏蒸破胞，把平板置于37℃恒温箱使表达的Pbgl酶与七叶苷和柠檬酸铁铵反应2～3小时。观察选择平板。

然后进一步提取能形成黑色圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pSE-Pbgl，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切pSE-Pbgl后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-Pbgl除有一个5.3kb的DNA片段外，还有一条大小约为1.1kb的DNA片段。

将含有质粒pSE-Pbgl重组大肠杆菌XL1-blue菌株接种到600mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD₆₀₀为0.4时，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导10小时。11000rpm离心3min，收集菌体，用4mL pH7.0100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入1mL 50％的镍亲和层析胶体，在4℃用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。在柱子里加入含有50mmol/LNaH₂PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0的冲洗缓冲液1mL，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入含有50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。

6、β-葡萄糖苷酶的最适pH的测定

β-葡萄糖苷酶以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物进行最适pH测定反应：取10μl稀释10倍的纯酶液，分别在116μl的50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 4.6～8.0；50mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 8.0～9.0；50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 9.0～10.0中与10μl 25mmol/L pNPG 50℃作用15分钟，反应时间到后用70μl 1mol/L碳酸氢钠终止反应。在410nm波长中检测生成物的量。

测定的结果是：β-葡萄糖苷酶的最适pH是8.0，并且在pH6.4或pH10.0时还有最高时的58％以上的酶活力。

7、β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖的测定

β-葡萄糖苷酶以纤维二糖为底物、在pH8.0的50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和50℃下作用30分钟。反应时间到后，在100℃加热10分钟终止反应。Pbgl的产物用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。

HPLC条件：仪器：Agilent1100色谱仪；色谱柱：氨基柱；流动相：乙腈∶水＝70∶30；流速：1.0mL/min；检测器：RID折光检测器。

HPLC检测的结果显示：Pbgl能够将纤维二糖水解葡萄糖。以纤维二糖为底物的Pbgl的酶活是92.4U/mg。

序列表

<110>广西大学

<120>一个编码碱性β-葡萄糖苷酶的基因及其应用

<160>2

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>2280

<212>DNA

<213>克氏类芽孢杆菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)

<220>

<221>gene

<222>(1)...(2080)

<223>

<400>1

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