CN101363026B

CN101363026B - 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因

Info

Publication number: CN101363026B
Application number: CN2007101435458A
Authority: CN
Inventors: 武波; 胡婷婷; 蒋承建
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2027-08-09
Also published as: CN101363026A

Abstract

本发明提供了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unbgl1B，它通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA是克隆载体pGEM-3Zf(+)部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由838个碱基组成，该基因的GC含量为54.3％。该基因用于生产β-葡萄糖苷酶，以将纤维二糖解离成单个葡萄糖分子。

Description

一种编码β-葡萄糖苷酶的基因

技术领域

本发明涉及从未培养微生物中克隆的酶基因，尤其涉及通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库而筛选得到的酶基因。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×10⁹吨，其中89％尚未被人类利用。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料来生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的三类酶的总称，即内切β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又称纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。这三种酶协同作用能够将纤维素转化成葡萄糖。内切葡萄糖苷酶能随机地在纤维素分子内部降解1，4-β-糖苷键，将长纤维切成短纤维；外切葡萄糖苷酶能从纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键，生成纤维二糖；β-葡萄糖苷酶最终把纤维二糖解离成单个的葡萄糖分子。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，存在于自然界许多植物体，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素质上生长，正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。

β-葡萄糖苷酶的分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、细菌、真菌、链霉等。β-葡萄糖苷酶基因现已从燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黑檀等植物中进行了克隆和表达。但更早对β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达的研究是在微生物体中。Grabnitz F.et al.对芽孢梭菌β-葡萄糖苷酶基因结构的序列分析，表明纤维素酶和包括人体乳糖酶的β-葡萄糖苷酶形成了一个超基因簇。Gonzalez-Candelas L.et al.研究认为，从芽孢杆菌分离出的两个编码β-葡萄糖苷酶基因序列和同源性分析，已知确定了从芽孢杆菌中分离出的编码β-葡萄糖苷酶的两个基因bg1A和bg1B的核苷酸序列。近几年国际上对β-葡萄糖苷酶的研究日趋广泛。2005年，Li X.et al.对来自Volvariella Volvacea(草菇)的一种重组表达后的β-葡萄糖苷酶进行了酶学性质的详细分析。2006年，Di Lauro B.et al.报道了一种来自革兰氏阳性的细菌Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009(嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌ATCC27009)的新型β-葡萄糖苷酶。

现在国际微生物学界广泛认为未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99％以上的资源。因此，自从上个世纪90年代末以来未培养微生物就成为了主要研究热点之一。未培养微生物中蕴含着大量的微生物基因资源。近年来对未培养微生物的研究方法已经日趋成熟，其基本原理就是通过直接提取环境宏基因组DNA，构建宏基因组DNA文库，然后采取活性筛选策略或者直接测序筛选策略筛选文库，以获得所需要的目的基因。当前人们已经利用构建宏基因组DNA文库的方法获得了各种活性物质的编码基因，抗生素等。在未培养微生物β-葡萄糖苷酶研究方面，Walter等人构建老鼠大肠未培养微生物的DNA文库，筛选得到了一批β-葡萄糖苷酶基因。但是目前对污染的碱性土壤环境中的微生物研究比较少，至今没有在这样的极端环境中克隆相关β-葡萄糖苷酶基因的报道。

主要参考文献：

1)Dunla P.C.，Chiang G.C.，Utilization and recycle of agriculture wastes and residues[M].Shuler M L，Boca Raton，Florida.USA：CRC Press Inc，1980，191

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3)Gonzalez-Candelas L.，Ramon D.，Polaina J.，Sequences and homology analysis of two genes encoding beta-glucosidases from Bacillus polymyxa，Gene，1990，95：31-38

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5)Di Lauro B.，Rossi M.，Moracci M.，Characterization of a beta-glycosidase from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius，Extremophiles，2006，10：301-310

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种β-葡萄糖苷酶基因(unbgl1B)，它通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库β-葡萄糖苷酶活性筛选法获得，以此为β-葡萄糖苷酶以及葡萄糖的生产提供一条新的途径。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unbgl1B，来源于碱性污染土壤未培养微生物，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；

2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。

携带该基因的质粒Escherichiacoli Tuner(DE3)pLacI/pGXAG309G已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址标注在后)保存，保存编号为CGMCC No.2015，保存日期为2007年4月23日。

进一步地，序列表中序列1的DNA是克隆载体pGEM-3Zf(+)部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由838个碱基组成，重组质粒所携带的外源DNA片段中包含完整的新型unbgl1B基因；该基因的GC含量为54.3％。

进一步地，序列表中序列1的DNA从5’端第141个核苷酸开始起始密码子GTG到第824个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)，即核苷酸第141位至第824位，自5’端的第141至第143位核苷酸为unbgl1B基因的起始密码子GTG，自5’端的第822至824位核苷酸为unbgl1B基因的终止密码子TAG。

进一步地，开放阅读框一共681个核苷酸，可编码由序列2中的227个氨基酸组成的蛋白。

进一步地，含有序列表中序列1的DNA序列的表达载体。

进一步地，含有序列表中序列1的DNA的细胞系。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从碱性污染土壤样品中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA；

(2)构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库；

(3)从碱性污染土壤未培养微生物的基因组文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶基因的克隆。

进一步地，步骤(1)包括：

(1-1)大量地从土壤样品中直接抽提宏基因组DNA；

(1-2)采用电洗脱法回收纯化粗制宏基因组DNA。

进一步地，步骤(3)包括：

(3-1)获得表达所述unbgl1B基因的阳性克隆；

(3-2)设计合适的引物，用PCR方法扩增所述unbgl1B基因；

(3-3)用合适的限制型内切酶酶切后与表达载体pETBlue-2连接，得到重组质粒pGXAG309G。

进一步地，基因的克隆方法还包括步骤：对所述重组质粒pGXAG309G上表达β-葡萄糖苷酶基因进行测序和分析。

进一步地，基因的克隆方法还包括步骤：对表达β-葡萄糖苷酶酶基因编码的蛋白产物Unbgl1B的氨基酸序列进行分析。

进一步地，基因的克隆方法还包括步骤：对unbgl1B基因重组质粒进行表达。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生成葡萄糖的方法，包括以下步骤：

(a)将混合好的作用体系置于32℃恒温培养箱内；

(b)待30min后取出，经离心处理，用滤膜过滤后取上清液用作检测；

(c)反应完毕的作用体系于-20℃条件下保存。

进一步地，该作用体系为：10mg/mL纤维二糖D-(+)-Cellobiose，2mMMgCI₂，加入0.1ml的0.2mol/l的Na₂HPO₄-Critic acid缓冲液(pH 7.0)，加入目标蛋白25-50μg，最终补充双重蒸馏水至5mL。

进一步地，生成葡萄糖的方法还包括对纤维二糖在蛋白Unbgl1B作用下的合成产物进行分析的步骤，其中采用的分析仪器为HPLC-色谱仪、R401示差检测器和碳水化合物柱(4.6×250mm)，均为美国Waters公司生产；色谱条件为流动相乙腈/水，流量为1.0mL/min，进样量为10微升。

本发明通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法，得到了新的β-葡萄糖苷酶酶基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产β-葡萄糖苷酶，从而将纤维二糖解离成单个的葡萄糖分子，为解决世界能源危机、粮食短缺及环境污染等问题另辟新径，并填补了国内外在污染的碱性土壤这样的极端环境中克隆β-葡萄糖苷酶基因的研究空白。

附图说明

图1为从碱性污染土壤样品中直接提取的未培养微生物的宏基因组DNA；

图2为限制性内切酶EcoR I完全酶切宏基因组DNA以判断宏基因组DNA纯度是否可以进行分子水平的操作；

图3为由碱性污染土壤未培养微生物基因文库克隆的限制性内切酶EcoR I酶切分析以判断文库质量；

图4为碱性污染土壤未培养微生物基因文库克隆的筛选；

图5为β-葡萄糖苷酶文库克隆质粒pGXAG309的EcoR I酶切带型；

图6为unbgl1B基因DNA序列分析图；

图7为重组质粒pGXAG309G所携带unbgl1B基因转化大肠杆菌E.coli Tuner(DE3)pLacI后得到的转化子依旧表达β-葡萄糖苷酶活性；

图8为底物纤维二糖在蛋白Unbgl1B作用以后用HPLC-色谱仪分析产物生成的结果。

具体实施方式

本发明提供的一种编码β-葡萄糖苷酶基因(unbgl1B)是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；

本发明提供的unbgl1B基因是通过以下克隆方法的步骤获得的：

(2)构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库；

以下将通过实施例和附图详细解释本发明的技术方案。在本发明的实施例中所用到的主要材料包括：EcoR I限制性内切酶、T4DNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)及pGEM-Teasy载体，购自Promega公司；胰蛋白胨及PVPP(polyvinpolypyrrolidone)购自Sigma公司。

实施例1、大量地从土壤样品中直接抽提宏基因组DNA。

1)称取4～4.5g碱性土壤，研细磨碎，加入10mL的2份TENS(每份成份为：100mM Tris-HCL，40mM EDTA，200mMNaCI，2％SDS，pH 8.0)，于振荡器上充分混匀；

2)加入25mg/mL蛋白酶-K(Protease-K)100μL，经70℃水浴溶解30min，每10min搅拌混匀一次；

3)然后置于液氮中速冻2.5min，迅速置于-20℃低温冰箱中冷冻5min，取出后迅即经沸水浴完全溶解。步骤3)一共重复3次；

4)再置于室温下静止3min，然后经离心处理，收集上清液置于冰上，沉淀中再加入10mL的Buffer A(成份为：50mM Tris-HCL，25mM EDTA，3％SDS，1.2％PVPP，pH8.0)后，离心收集上清液；将所有的上清液一起混匀，置于冰上；在10至15mL上清液中加入0.1g PVPP，同时加入合适的混匀物质[1.0g SephadexG-200+0.5g酸洗PVPP+20mL1份TE(成份为：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM Na₂EDTA)]，充分混匀；37℃保温2h，每30min混匀一次。离心除去PVPP；

5)将所有的上清液用等体积的苯酚、苯酚-氯仿/异戊醇(V1∶V2＝24∶1)以及氯仿抽提一次；

6)沉淀DNA，每5mL加入等体积的8mol/L醋酸铵、1/10体积的醋酸钾(pH4.8)，并加入3倍体积以上的无水乙醇，于零下80℃放置15min以上；

7)以10,000rpm的转速进行离心收集沉淀10min后，用75％乙醇洗涤2～3次，稍微干燥，溶解于适量的1份TE，得到粗制的宏基因组DNA。

请参见图1，其中，1，2：为回收前的粗制宏基因组DNA；3：为λ/HindIII Marker(片段大小从大到小依次为：23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb)。

实施例2、采用电洗脱法纯化粗制的宏基因组DNA。

本法可回收任意大小的DNA片段，尤以回收大于5kb的DNA片段为佳。而且成功率极高，易纯化。

(1)透析袋的处理

A、切取长10至20cm透析袋；

B、将透析袋在2％(w/v)(质量/体积)碳酸氢钠、1mM EDTA(pH8.0)溶液中煮沸10分钟；

C、取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗；

D、在1mM EDTA液中(pH 8.0)煮沸10min(勿倒掉溶液)；

E、让透析袋自然冷却，4℃贮存(注意在贮存期间，应始终让透析袋浸入溶液，以防干燥；

F、使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁；

注：要带医用乳胶手套操作。

(2)酶切适量的DNA，使得目标片段有1μg左右，电泳分离后染色，确定目标片段的位置；

(3)用手术刀片切下含有目标DNA片段的琼脂糖胶条，将它放在宽平的已被1份TAE(40mmol/L的Tris-acetate，1mmol/L的EDTA，pH8.0)湿润的药匙上；

(4)将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1份TAE，然后用药匙将所切胶条放入透析袋中；

(5)使胶沉到透析袋的底部，去掉多余的缓冲液，使得琼脂糖胶条正好被缓冲液包住，用夹子夹住透析袋的上部，避免产生气泡；

(6)将含有胶的透析袋放在装有1份TAE的电泳槽中电泳2至3hr，通常电泳强度为4～5V/cm，则DNA被电洗脱到袋子的壁上；

(7)更换电极，再反向电泳1min，使DNA从袋壁上返回到透析袋的内腔；

(8)打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一EP管内，然后用少量的1份TAE，加到袋中清洗，并将清洗液一并吸入EP管内；

(9)染胶，检测电洗脱是否完全；

(10)用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿抽提一次，然后用酒精沉淀DNA。干燥后，溶解在10μl 1份TE中。

请参见图2，其中，1：为λ/HindIII Marker(片段大小从大到小依次为：23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb)；2：为酶切前已纯化的宏基因组DNA；3：为EcoR I酶切的宏基因组DNA。

实施例3、碱性污染土壤未培养微生物的基因组文库的构建

首先采用修改的碱变性法大量提取克隆载体pGEM-3Zf(+)质粒DNA，获得较高纯度质粒DNA，其主要形式是超螺旋(CCC)，经过EcoR I酶单酶切，变为线性DNA分子，线性pGEM-3Zf(+)质粒DNA经过CIP去磷酸化酶处理后，直接用来连接部分酶切土壤宏基因组DNA。

用EcoR I对纯化好的宏基因组DNA进行部分酶切，琼脂糖电泳分离酶切产物，将这些片段与经过CIP去磷酸化酶处理过的pGEM-3Zf(+)DNA连接，连接产物用电转化方法导入大肠杆菌DH5α，在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)(40μg/mL)、IPTG(异丙基-B-D硫代半乳糖苷)(40μg/mL)、氨苄青霉素(Ap)(50μg/mL)的Luria-Bertani培养基固体平板上检测含有重组子的白色大肠杆菌菌落。

将阳性单菌落挑板至含有Ap(50μg/mL)的Luria-Bertani固体平板上，37℃培养至菌落为2至3mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔中，37℃恒温培养24h左右，然后保存于-80℃低温冰箱中。最终得到了大约30,000个白色转化子。随机挑取16个转化子提取质粒，然后用EcoR I酶切检测，发现15个有随机插入的外源DNA片段，平均长度为3.5kb。

请参见图3，其中，M：1kb ladder Marker(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp)；其它泳道1～15分别为文库克隆。

实施例4、从碱性污染土壤未培养微生物的基因组文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆

每200mL的Luria-Bertani固体培养基融解后加入400μl的50mg/mL的Ap，将白色转化子挑板至筛选培养基平板(20mL左右)，筛选培养基成分为：胰蛋白胨1％，酵母浸出粉0.5％，氯化钠0.5％，柠檬酸铁铵0.2％，七叶苷0.1％，琼脂粉1.5～2.0％；该培养基的pH值为7.0。

37℃培养24h左右，每12h观测一次转化子生长情况。将分泌胞外酶产生黑色水解圈的转化子挑取出来，再次点板。反复两次后，确认仍旧产生黑色水解圈，初步确证转化子表达β-葡萄糖苷酶活性。可以接种加了Ap的Luria-Bertani液体培养基培养提取质粒DNA检测，用EcoR I酶切检测，将含有正确外源片段的转化子的质粒DNA打入DH5α，挑取适当数量的白色转化子至筛选培养基上，再次确定是否有黑色水解圈，以确定所连接的外源DNA是不是包含β-葡萄糖苷酶基因。用此方法得到了编号为pGXAG309的阳性转化子表达β-葡萄糖苷酶活性，将该克隆外源包含的表达β-葡萄糖苷酶活性的基因命名为unbgl1B，设计合适的引物，用PCR方法扩增unbgl1B基因，用合适的限制型内切酶酶切后与表达载体pETBlue-2连接，得到重组质粒pGXAG309G。

重组质粒Escherichiacoli Tuner(DE3)pLacI/pGXAG309G已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心完成微生物保存，保藏编号为CGMCC No.2015，保存日期为2007年4月23日。

中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市中关村北一条13号2714信箱，邮政编码为100080，电话为010-62542758，E-mail 为cgmcc@sun.im.ac.cn。

请参见图4，其中，1：pGXAC0426/EcoR I；2：1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp)。

请参见图5，其中，再次转化克隆pGXAG309的质粒DNA到大肠杆菌细胞后，随机挑选的转化子在筛选平板上仍旧产生黑色水解圈。

实施例5、重组质粒E.coli Tuner(DE3)pLacI/pGXAG309G上表达β-葡萄糖苷酶活性的基因的测序和开放阅读框(0RF)分析

用双脱氧核苷酸法在ABI 377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。用软件DNAStar对序列进行拼接，用NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

图6为unbgl1B基因DNA序列分析。序列表中序列1的DNA的该外源DNA由838个碱基组成，请参见图6，从5’端第141个核苷酸开始起始密码子GTG到824个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF(核苷酸141～824)，自5’端的第141-143位核苷酸为unbgl1B基因的起始密码子GTG，自5’端的第822-824位核苷酸为unbgl1B基因的终止密码子TAG。在其编码区上游，没有一个典型的σ70所识别的启动子序列(大肠杆菌的保守的σ70所识别的启动子序列为相隔17bp的TTGACA和TATAAT)。经过Blastn软件比较，pGXAG309G携带的外源DNA序列在DNA水平上只是找到和国际上Genbank数据库中的Schistosoma japonicum clone SJCHGC09103 unknown mRNA(日本血吸虫克隆SJCHGC09103未知mRNA)全基因组序列(Genbank索引号：AY915726)中的41个核苷酸有100％的同源性。表达β-葡萄糖苷酶酶基因unbgl1B基因编码一个含227个氨基酸的蛋白质，用简单组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析由DNA序列推测的碱性污染土壤未培养微生物的表达β-葡萄糖苷酶Unbgl1B的组件结构，没有明显的独立催化区域功能结构。该基因所含ORF一共681个核苷酸可编码由227个氨基酸组成的蛋白，用Blastx软件分析该ORF氨基酸序列和AAA ATPase superfamily基因存在81％的相似性，65％的一致性。该氨基酸序列编码的唯一的保守性假定蛋白没有明显的亲疏水性，没有形成明显的跨膜结构区域，不存在一个低复杂度结构。

实施例6、unbgl1B基因重组质粒的表达

使用从美国Novagen公司购买的pET表达系统，设计正向扩增引物FG1：5’-CGACGCGTGTGAAGTCTATCCAGGTGGGG-3’，引入Mlu I酶切位点ACGCGT；反向扩增引物RG1：5’-ATTGCGGCCGCGAGGATCCCCGGGTACCGA-3’(Not I)引入Not I酶切位点CGGCCG；扩增该ORF(核苷酸第141至第824)，一共681个核苷酸。将PCR产物与pETBlue-2载体连接后转化大肠杆菌NovaBlue细胞并在含X-gal和IPTG的LURIA-BERTANI固体平板上筛选正向连接的阳性克隆，将包含重组表达质粒DNA的大肠杆菌细胞命名为pGXAG309G。将pGXAG309G质粒转化至Tuner(DE3)pLacI得菌株Tuner(DE3)pLacI/pGXAG309G。在加了IPTG诱导的，含有柠檬酸铁铵、七叶苷和合适的抗生素的Luria-Bertani培养基固体平板上培养重组表达克隆Tuner(DE3)pLacI/pGXAG309G 24h左右后，发现在克隆的周围产生了清晰的黑色水解圈。这说明pGXAG309G在大肠杆菌中的表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性，pGXAG309G的催化功能域具有独立的催化活性。用ExPASy网站相关软件分析pGXAG309G的Theoretical pI/Mw(理论等电点/分子量)为：7.88/32053.08。

请参考图7，其中空载体pETBlue-2转化得到的转化子(图中CK)不能表达β-葡萄糖苷酶活性。

实施例7、纤维二糖在蛋白Unbgl1B作用下的产物分析

作用体系为10mg/mL D-(+)-Cellobiose(纤维二糖)，2mM MgCI₂，加入0.1ml用0.2mol/l的Na₂HPO₄-Critic acid(磷酸氢二钠-柠檬酸)缓冲液(pH7.0)，目标蛋白(0.95mg/mL in 25mM Tris，1mM EDTA，2mM DTT，pH7.6)25-50μg，补充双重蒸馏水至5mL，将混好的体系置于32℃恒温培养箱，30min后取出，经离心处理，用滤膜(Vivaspin 500，Vivascience)过滤后取上清液用作检测，反应完毕的体系于-20℃条件下保存。使用的分析仪器有：HPLC-色谱仪(600 Controller)，R401示差检测器(美国Waters公司产品)，碳水化合物柱4.6×250mm(美国Waters公司产)。色谱条件为流动相乙腈/水(85+15)，流量1.0mL/min，进样量为10微升。实验结果表明D-(+)-Cellobiose(纤维二糖)在蛋白Unbgl1B催化作用下转化成了葡萄糖。

请参见图8，其中，峰1为作用底物D-(+)-Cellobiose(纤维二糖)出峰图，峰2为D-(+)-Cellobiose(纤维二糖)被水解后即在蛋白Unbgl1B作用下生成产物葡萄糖出峰图。

含有本发明基因的启动子、开放阅读框及其部分序列的表达载体、细胞系以及产物葡萄糖的酶法合成均属于本发明的保护范围。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当以前述权利要求书所界定者为准。

序列表

1、克隆pGXAG309所携带的外源DNA序列及其部分载体序列

1 CGAATTCTAA GCCTGAAGGA GCCGGAGCCC GAGCCTGTTG GTTTGTCGGA GCCACATACG

61 GTGGAACTGA TGATCAGACA CCCCGCTTTC TACAGGAAGG CATTTGGGAA AATGGGTATC

121 AGGACAAATA CCTCGACGCA GTGAAGTCTA TCCAGGTGGG GGACCGCATT GCGATTAAGT

181 CGTCCTATAC GCGAAAGCAC GATCTCCCCT TTGATAACCG AGGCCAAACC GTTTCCGTCA

241 TGGCGATCAA AGCCATTGGC ACGGTAAAAG AGAACCTCGG CGACGGCCGC ACCTTGAAGG

301 TTGACTGGAC ACCTTTCGAT CCTCCGCGTG AGTGGTACTT CTACACCAAT CGAAGCACGG

361 TCTGGCGGGT CTTACCTGGG GACTGGACCA CAGATGCATT GATCGGATTC ACCTTCGAGG

421 AAAAGACACA AGACATCAAC CGGTTCCGCA ATGCTCCTTA CTGGCGTGAA CGCTTCGGTG

481 ATAGTGCTGT CGACAAGCGC CGTTTCAACT GGACCCGCTT TTACGAGGCG GTAGCAGACA

541 AGCTCCTTAC CTTTCGGAAT AGGCGGGATG AGCTGATTGC CGGAATCCAC GTTATTGCCT

601 CGAAGGTGGA TGGCCTCTCC AACCTGCAGG ATCAATTCGC GGATGGTTCC TCTGGTCCCC

661 TGAAGGACAT CTGCCCATTT ACGGCCATGG GCATTTTCAA CAGGGGGATC ACCGATGCAA

721 ATCGCAAAGC TATTGCAAGC GAGCTTGCCA GTCTGCTTGG AGTATCTGAG CCTGTTCCGG

781 ACTCCTTTGA AGGAATTCGA GCTCGGTACC CGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGG

2、unbgl1B基因氨基酸序列

Val Lys Ser Ile Gln Val Gly Asp Arg Ile Ala Ile Lys Ser Ser

5 10 15

Tyr Thr Arg Lys His Asp Leu Pro Phe Asp Asn Arg Gly Gln Thr

20 25 30

Val Ser Val Met Ala Ile Lys Ala Ile Gly Thr Val Lys Glu Asn

35 40 45

Leu Gly Asp Gly Arg Thr Leu Lys Val Asp Trp Thr Pro Phe Asp

50 55 60

Pro Pro Arg Glu Trp Tyr Phe Tyr Thr Asn Arg Ser Thr Val Trp

65 70 75

Arg Val Leu Pro Gly Asp Trp Thr Thr Asp Ala Leu Ile Gly Phe

80 85 90

Thr Phe Glu Glu Lys Thr Gln Asp Ile Asn Arg Phe Arg Asn Ala

95 100 105

Pro Tyr Trp Arg Glu Arg Phe Gly Asp Ser Ala Val Asp Lys Arg

110 115 120

Arg Phe Asn Trp Thr Arg Phe Tyr Glu Ala Val Ala Asp Lys Leu

125 130 135

Leu Thr Phe Arg Asn Arg Arg Asp Glu Leu Ile Ala Gly Ile His

140 145 150

Val Ile Ala Ser Sly Val Asp Gly Leu Ser Asn Leu Gln Asp Gln

155 160 165

Phe Ala Asp Gly Ser Ser Gly Pro Leu Lys Asp Ile Cys Pro Phe

170 175 180

Thr Ala Met Gly Ile Phe Asn Arg Gly Ile Thr Asp Ala Asn Arg

185 190 195

Lys Ala Ile Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Val Ser Glu

200 205 210

Pro Val Pro Asp Ser Phe Glu Gly Ile Arg Ala Arg Tyr Pro Gly

215 220 225

Ile Leu*

227

Claims

1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因(unbgl1B)，其核苷酸序列从序列表中的序列1的5’端第141位核苷酸开始到第824位核苷酸结束；其中，起始密码子GTG为自5’端的第141位至第143位核苷酸，终止密码子TAG为自5’端的第822位至第824位核苷酸；所述unbgl1B基因的GC含量为54.3％。

2.含有权利要求1所述基因的DNA序列的表达载体。

3.一种生成葡萄糖的方法，包括：将纤维二糖D-(+)-Cellobiose经权利要求1所述基因编码的蛋白Unbgl1B的催化合成所述葡萄糖；所述合成具体包括以下步骤：

(a)将混合好的作用体系置于32℃恒温培养箱内；

(c)反应完毕的作用体系于-20℃条件下保存；

(d)对所述纤维二糖在所述蛋白Unbgl1B催化作用下的合成产物进行分析，采用的分析仪器有HPLC-色谱仪、R401示差检测器和碳水化合物柱4.6×250mm，均为美国Waters公司生产；色谱条件为流动相乙腈/水，流量为1.0mL/min，进样量为10微升；

所述作用体系为：10mg/mL纤维二糖D-(+)-Cellobiose，2mM MgCl₂，加入0.1ml的pH 7.0的0.2mol/l的Na₂HPO₄-Critic acid缓冲液，加入所述蛋白Unbgl1B 25-50μg，最终补充双重蒸馏水至5mL。