CN102676561B - 一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的角蛋白酶。本发明还公开了利用本发明重组菌制备角蛋白酶的方法，该方法产酶量高，制备的角蛋白酶与天然角蛋白酶的性质类似，克服了现有技术的缺陷，具有工业应用价值。

Description

一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法

技术领域

本发明涉及酶领域，具体涉及一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法。

背景技术

角蛋白是一种坚硬的不溶性蛋白，分为α-角蛋白和β-角蛋白，α-角蛋白是毛发中主要蛋白质，β-角蛋白主要存在于动物的羽毛、皮肤、爪和鳞片中。由于高度交联的胱氨酸残基形成的二硫键、分子间的疏水作用以及氢键作用，角蛋白难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等降解，传统高压水解、酸碱蒸煮降解羽毛的方法耗能高，破坏热敏性氨基酸并污染环境。

角蛋白酶是降解角蛋白的一类酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生，主要是金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，其用于酶降解角蛋白，不存能耗高、污染强的问题，具有巨大的应用价值和研究前景。角蛋白酶不仅可以用于对角蛋白废弃物如羽毛、猪毛、羊毛等的降解，而且在肥料、医药、食品、洗涤剂和制革等工业中广泛应用，具有生产高级营养品、饲料添加剂、美容、软化皮革、嫩化肉类等作用，并可降解引起人类新克雅氏症和疯牛病的Prion蛋白（PrPSc构象），从而消灭朊病毒，更使其成为世界性的研究热点。

角蛋白酶的应用领域十分广泛，但由于天然菌株中角蛋白酶产量较低、生产成本昂贵、难以工业化生产，分离的角蛋白酶作用缓慢、有效性不够好，因此角蛋白酶还没有得到广泛的实际应用。随着基因工程技术的发展，通过现代分子生物学技术，构建具有潜在应用价值的高效角蛋白酶基因工程菌株，并改造现有角蛋白酶基因，提高重组酶表达量及其稳定性，为角蛋白酶的工业化生产、废弃角蛋白的循环利用和饲料蛋白资源开发提供新的有效途径。

王丽华等，“枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究”，四川农业大学，2011-06-01公开了一种利用DNA重组技术将枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因与pPICZαA质粒重组，并成功地在在巴斯德毕赤酵母X-33中表达，但是其产酶能力低，仅为32.31U/ml，不能满足工业应用的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的角蛋白酶及其制备方法。

角蛋白酶，keratinase，是一类可专一地降解角蛋白的蛋白酶。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

其中，所述的重组载体是重组pPICZαA质粒。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。

其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。

还提供了一种角蛋白酶，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

优选地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，它的最适温度范围是50-60℃。

其中，它的最适pH范围为7-10。

还提供了前述角蛋白酶的制备方法，包含如下步骤：

ⅰ、取前述重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为30℃，pH为6，至OD₆₀₀=2~6；

ⅱ、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度为30℃，pH为6，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，每24小时，加甲醇至1％浓度，诱导时间为96~144h；

ⅲ、收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。

还提供了前述角蛋白酶的另一种制备方法，包含如下步骤：

（1）取上述重组菌接种到YPD种子培养基上，pH为5.5，温度为30℃下培养，制备得到种子液；

（2）取步骤（1）制备的种子液，以5％的接种量接种到发酵培养基中发酵，发酵pH为4.9，发酵温度为30℃；

每1L发酵培养基含有如下成分：50g葡萄糖、15g磷酸二氢钾、16g硫酸镁、10g硫酸钾、0.8g氢氧化钾、0.8g硫酸钙、0.5g消泡剂、4g硫酸铵、1g增效剂、生物素0.473mL、微量元素溶液（PTM1）2.2mL；

（3）待碳源耗尽后，补加浓度为25%葡萄糖，流加浓度为25%甘油与甲醇的混合物，诱导表达，25%甘油与甲醇的体积比为8:1，甲醇的浓度维持为1%，直至酶活出现指数增长时终止发酵；

（4）收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。

本发明提供了一种新的表达角蛋白酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌生产角蛋白酶的表达量高，且制备的角蛋白酶与天然角蛋白酶性质相似，适合大规模工业化生产，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1地衣芽孢杆菌S90kerA基因扩增结果，其中，M:DNA标准分子量(DL2000)；1为kerA基因

图2地衣芽胞杆菌角蛋白酶基因T克隆测序结果及其氨基酸序列

图3地衣芽胞杆菌角蛋白酶基因与pPICZαA连接克隆测序结果

图4毕赤酵母菌落PCR鉴定结果，M为DNA标准分子量，1-4：含pPICZαA-kerA的菌落

图5重组毕赤酵母表达产物电泳分析结果

图6重组角蛋白酶基因菌株诱导产酶曲线

图7重组毕赤酵母角蛋白酶分泌量及菌体密度变化曲线

图8重组角蛋白酶最适反应pH

图9重组角蛋白酶最适反应温度

图10重组角蛋白酶温度稳定性

图11重组角蛋白酶热稳定性

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明角蛋白酶的制备

一、角蛋白酶重组菌的构建

（一）角蛋白酶基因片段的制备

1、地衣芽胞杆菌基因组DNA提取；

2、利用RT-PCR及定点突变技术扩增出角蛋白酶除去信号肽的CDS序列，引物（下划线为酶切位点，斜体部分为突变碱基）和反应条件如下：

引物1（F）：5’GCTGGTACCGCTCAACCAGCTAAAAATGT-3’（Kpn I）

引物2（R）：5’-CGAGCGGCCGCTTGAGCAGCAGCTTCGACATTGAT-3’（Not I）

反应条件为：

3、DNA片段回收：割取含目的基因的胶条，用小量柱式凝胶回收试剂盒进行回收；

4、在T4DNA连接酶作用下将回收的目的基因片段与T载体连接，得含目的基因（B.licheniformis角蛋白酶基因）的T克隆载体；

5、琼脂糖凝胶电泳并测序检验扩增得到的目的基因片段。

由图1可知，扩展得到的目的基因片段跟天然角蛋白酶基因片段的大小无差别，由图2可知，测序证明本发明扩增的到的目的基因片段跟地衣芽孢角蛋白酶基因片段核苷酸序列的数量一样，有3个碱基的类型有差异（下划线标记的三个碱基的类型有区别），且这几个碱基差异使该基因片段恰好含有与毕赤酵母偏爱的密码子，有利于角蛋白酶的表达。

结果证明，本发明准确地扩增得到了含有毕赤酵母偏爱密码子的编码角蛋白酶的目的基因片段（KerA基因片段），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

（二）重组表达载体构建：

1、质粒双酶切及片断回收

含目的基因KerA基因片段（B.licheniformis角蛋白酶基因）的T克隆载体与表达载体pPICZαA均用限制性内切酶KpnI和Not I双酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用（胶回收纯化试剂盒，购自天根生物公司）。

双酶切体系如下：

37℃反应2～4小时。

2、DNA连接反应

经凝胶回收的KerA基因片段与pPICZαA载体（限制性内切酶酶切纯化后的片断）连接，采用NEB公司T4连接酶，构建表达载体pPICZαA-kerA。

反应体系如下：

16℃反应4～6小时。

3、大肠杆菌DH5位感受态制作与转化

参考《分子克隆实验指南》（第三版）

1）取-80℃保存的E.coli DH5α，划线接种于LB平板上，37℃培养12～14h；

2）挑取单菌落接种于10mL新鲜的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜；

3）取200μL过夜培养液于20mL LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡生长至OD₆₀₀约为0.6；

4）取培养液约10mL于50mL灭菌离心管中，4℃下6000g/min离心5min，弃上清；

5）加入2mL冷的0.1M的氯化钙溶液，轻轻吹打，使菌体充分悬浮；

6）6000g/min离心5min，弃上清；

7）加入100～200μL预冷的0.1M的氯化钙溶液，轻轻吹打，重新悬浮菌体，加入終浓度为10～15%的甘油混匀，-80℃保存，即为大肠杆菌感受态细胞。

8）吸取含目的基因片断的连接产物10μL加入100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰中放置30min；

9）42℃热激90秒后，再在冰中放置2分钟；

10）加入890μLLB液体培养基，37℃，180r/min振荡培养60min；

11）将离心管内容物混匀，取200μL已转化的感受态细胞加到含有25μg/mL Zeocin的LLB固体培养基上，用无菌歪头玻棒将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养14~18h，观察培养基上菌落形成情况，初步筛选阳性克隆。

4、阳性转换子筛选

挑选在25μg/mL Zeocin平板上正常生长的单菌落，进行PCR、酶切及测序鉴定。

5、重组表达质粒pPICZαA-KerA大量制备及线性化

挑取阳性单菌落扩大培养后提取质粒，以Sac I对其进行线性化处理，回收备用。

反应体系如下：

37℃反应2～4小时。

6、线性化质粒纯化：按照天根DNA纯化试剂盒说明书进行。

测序结果如图3所示，构建的表达载体pPICZαA-kerA中含有步骤（一）扩增得到的毕赤酵母偏爱密码子的编码角蛋白酶的目的基因片段。

实验证明本发明制备得到了pPICZαA-kerA重组载体。

（三）毕赤酵母宿主的转化

1、毕赤酵母感受态细胞制作

1）从斜面上挑取单菌落接种于5mL液体YPD中，30℃振荡培养16～18小时；

2）取0.1～0.5ml过夜培养物，接种含100ml液体YPD的500ml摇瓶，30℃生长至OD₆₀₀约为1.3-1.5（16～18小时），离心收集细胞；

3）4℃下3000g/min离心10min收集细胞，弃上清，并加入50mL预冷的无菌去离子水充分悬浮细胞；

4）4℃下3000g/min离心10min收集细胞，弃上清，并加入25mL预冷的无菌去离子水充分悬浮细胞；

5）4℃下3000g/min离心10min收集细胞，弃上清，并加入10mL预冷的1M山梨醇充分悬浮细胞；

6）4℃下3000g/min离心10min收集菌体，弃上清，并加入5mL预冷的1M山梨醇充分悬浮细胞；

7）4℃下3000g/min离心10min，弃上清，并加入1mL预冷的1M山梨醇，轻轻吹打，充分悬浮细胞，即为毕赤酵母X-33感受态细胞；

8）80μL每管分装后冰浴待用。（注意：-80℃贮存后转化效率会下降很多，最后现配现用）。

2、毕赤酵母X-33电击转化

1）取80ul上述细胞与5～20ug步骤（二）得到的线性化重组表达质粒pPICZαA-KerA（溶于5-10ul TE）混合，转入预冷的2mm电转杯中；

2）冰上放置5～10min后，1800V下电击转化；

3）电击后迅速加入l mL预冷的1M的山梨醇至杯中；

4）将转化后的酵母细胞转移至灭菌离心管中，30℃静置培养60min；

5）取200～400μL转化液均匀涂布于100μg/uL Zeocin的YPDS固体培养基上。

3、阳性转化子筛选与鉴定

（1）采用Zeocin抗性筛选的酵母，在30℃下倒置培养2～3d即可长出肉眼可见的单菌落，进一步采用菌落PCR对其进行鉴定（引物同角蛋白酶基因扩增引物）；操作步骤同角蛋白酶基因片段的制备。

结果如图4所示，四条条带均扩增得到目的基因片段KerA，证明本发明制备的重组毕赤酵母确实含有目的基因片段。

（2）在MD/MM平板上进行快慢斑筛选:用灭菌接种环挑取单菌落，分别点种于MD和MM平板，30℃孵育养2～3d，在MM和MD平板均正常生长的单菌落为Mut⁺型，而在MD平板正常生长，MM平板上生长缓慢或不生长的即为Muts型，本实验结果显示所得单菌落均为Mut⁺型。

实验结果证明本发明成功地将pPICZαA-kerA重组载体导入毕赤酵母中，得到了阳性转化子。

（四）阳性转化子诱导培养

为确定所选菌落为阳性转化子，将其在摇瓶中诱导表达，通过SDS-PAGE及酶活分析检测表达产物。

1、诱导培养

1）挑取单克隆接种至含50mL BMGY的500mL摇瓶中，30℃250r/min培养至OD₆₀₀约为2～6（约16～18h）；

2）用灭菌离心管，室温4000g/min离心10min收集菌体，弃上清，用BMMY重悬细胞至OD₆₀₀=1.0（约100mL）进行诱导培养，选用500ml的摇瓶；

3）每24小时，加甲醇至1％浓度，直至达到最佳诱导时间；

4）收集发酵液上清，按照常规分离纯化方法纯化，即得到目标蛋白。

2、电泳、测序检测

每24小时取1mL培养基至离心管中，4℃5000g/min离心10min，吸取上清至干净的离心管中，用于分析表达水平及诱导后收集细胞的最佳时间，利用SDS-PAGE对其进行检测。所有上清或细胞沉淀贮存于-80℃，纯化后进行氨基酸测序。

如图5所示，诱导24h、48h和72h（泳道1、2、3）后，上清中蛋白浓度低，诱导96h（泳道4）的蛋白量明显高于诱导24、48和72h的蛋白量，且诱导120h、144h（泳道5、6）的蛋白量与96h差别不大，因此，96h为摇瓶培养的最佳诱导时间。

测序可知，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

AQPAKNVERDYIVGFKSGVKTASVKKDIIKESGGKVDKQFRIINAAKAKLDKEALKEVKNDPDVAYVEEDHVAHALAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVDGASFVAGEAYNTDGHGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVEAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ

本发明制备的蛋白质的氨基酸序列与地衣芽胞杆菌分泌的天然角蛋白酶的氨基酸序列相同。

3、酶活测定

（Ⅰ）酶活测定方法

ⅰ、测定原理：天青角蛋白（Sigma公司）由天青与羊毛耦合而成，在一定条件下，角蛋白酶水解天青角蛋白，天青染料释放至上清液，离心后可在595nm波长下进行比色，测定吸光度，吸光度与酶活成正比。

ⅱ、酶反应体系：取20mg天青角蛋白粉碎。以3.6ml不同pH的缓冲液悬浮。取诱导培养步骤4）制备的蛋白，用缓冲液适当稀释，取0.4ml加入含有天青蛋白的缓冲液中，于50℃水浴中220rpm反应1h，之后以8000rpm离心20min，于595nm测定上清液中释放染料的吸光度。

ⅲ、酶活单位：一单位酶活性定义为一定条件（pH 7.5，50℃）下使595nm处校正吸光度增加0.01单位所需的酶量。

（Ⅱ）酶活测定结果

酶活测定结果如表1和图6所示：

表1酶活测定结果

由表1和图6可知，本发明制备的蛋白具有角蛋白酶活性，酶活最高可达到324U/ml，说明本发明制备得到了角蛋白酶。

实验结果证明，本发明制备的含有pPICZαA-kerA重组载体的毕赤酵母表达得到的蛋白质与天然角蛋白酶的氨基酸序列相同，且具有角蛋白酶活性，说明本发明用基因重组地方法，成功地制备得到了角蛋白酶。

实施例2发酵罐发酵制备角蛋白酶

1、诱导表达

一、发酵种子液制备（摇瓶中进行）

取实施例1制备的含有pPICZαA-kerA重组载体的毕赤酵母，加入装有300mL种子培养基（YPD）的500mL摇瓶中，置于200r/min恒温摇瓶柜，30℃振荡培养24h，8层纱布封口，作为发酵用的一级种子。

二、发酵罐发酵（按照GUJS-30×3C型三联自动机械搅拌不锈钢发酵罐操作手册进行）

（1）以5％的接种量接种到葡萄糖基础培养基中（配方见表2），在30℃和300r/min的条件下振荡培养。全程用氨水调节培养基的pH，使之保持在设定值4.9；

表2葡萄糖基础培养基（底料/消后体积17L）

成分	配比
		葡萄糖	5%/850g
磷酸二氢钾	1.5%/255g
		硫酸镁	1.6%/272g
硫酸钾	1%/170g
		氢氧化钾	0.08%/13.6g
硫酸钙	0.08%/13.6g
		消泡剂	0.05%/8.5g
硫酸铵	0.4%/68g
		增效剂	0.1%/17g
PTM1（2倍）	2.2ml/L 37ml
		生物素	0.437ml/L 7.5ml

（2）待碳源耗尽后，补料，加入浓度为25%葡萄糖（850g）3.4L；

（3）补料结束后，流加甲醇和甘油的混合物：浓度为25%甘油：甲醇（v/v）=8：1，甲醇的浓度维持为1%，每隔一段时间取样检测一次酶活，直至酶活出现指数增长时终止发酵；

（4）收集发酵液上清，用常规分离纯化方法纯化，即得到目标蛋白。

2、酶活检测

（Ⅰ）酶活测定方法

ⅰ、测定原理：天青角蛋白（Sigma公司）由天青与羊毛耦合而成，在一定条件下，角蛋白酶水解天青角蛋白，天青染料释放至上清液，离心后可在595nm波长下进行比色，测定吸光度，吸光度与酶活成正比。

ⅱ、酶反应体系：取20mg天青角蛋白粉碎。以3.6ml不同pH的缓冲液悬浮。取步骤4）制备的上清液，用缓冲液适当稀释，取0.4ml加入上述缓冲液中，于50℃水浴中220rpm反应1h，之后以8000rpm离心20min，于595nm测定上清液中释放染料的吸光度。

ⅲ、酶活单位：一单位酶活性定义为一定条件（pH 7.5，50℃）下使595nm处校正吸光度增加0.01单位所需的酶量。

酶活检测结果如表3和图7所示：

表3重组角蛋白酶基因菌株诱导产酶酶活（发酵）

诱导时间（h）	酶活（U/ml）
		12	0.5
24	134.5
		60	340
72	568

由表3和图7可知，本发明角蛋白酶的酶活可以达到568U/mL，显著高于其他重组毕赤酵母分泌的角蛋白酶的酶活。同时，经检测其产量为263mg/L，适于工业化生产。

3、性质测定

ⅰ、最适pH确定：分别以不同pH（5.0~10.0）的缓冲液配制角蛋白底物溶液，在50℃下测定其酶活，确定其最适反应pH；

ⅱ、最适反应温度：以最适pH值的缓冲液配制蛋白底底物溶液，分别在不同温度（30~80℃）下测定相对酶活性，确定其最适反应温度；

ⅲ、温度稳定性：将步骤4）制备的上清液分别在50℃、60℃和70℃下保温30min后，测定其残余酶活（以未保温的酶作为对照）。

ⅳ、热稳定性：步骤4）制备的上清液在其最适反应温度下分别保温30min、40min、50min、60min、90min和120min后，测定其残余酶活。

结果见图8~11所示，本发明中重组酵母生产的角蛋白酶具有较好的稳定性，其适宜的反应温度范围为50-60℃，pH范围为7-10。

实验说明本发明制备角蛋白酶的方法优良，产量大，得到的蛋白酶的酶活高，适宜的反应温度范围为50-60℃，pH范围为7-10该蛋白酶，稳定性良好，与天然的角蛋白酶（KerA）性质类似。

综上，本发明用基因重组的方法成功地制备得到了表达角蛋白酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌表达得到的角蛋白酶与天然角蛋白酶的性质类似，表达量高，适宜工业化生产，具有良好的工业应用前景。

Claims (6)

1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pPICZαA 质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组毕赤酵母。

6.角蛋白酶的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为30℃，pH为6，至OD₆₀₀=2~6；

ⅱ、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度为30℃，pH为6，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，每24小时，加甲醇至1 ％浓度，诱导时间为96~144h；

ⅲ、收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。