CN102851270A

CN102851270A - 一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其应用

Info

Publication number: CN102851270A
Application number: CN2012102753482A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 令桢民; 堵国成; 康振; 李江华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明公开了一种获得杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其及其在产活性链霉菌胰蛋白酶中的应用，通过将体外所得的胰蛋白酶酶原基因连接到毕赤酵母GS115（Pichia pastoris）染色体上，构建了一株高效分泌表达杂交胰蛋白酶酶原的基因工程菌，发酵3～4天后，可得到杂交胰蛋白酶酶原的表达(图3(A)，解决了基础研究中获得杂交灰色链霉菌胰蛋白酶酶原的问题。并且通过肠激酶切割活化得到具有活性的链霉菌胰蛋白酶，活化后酰胺酶活力可达到1.4U/ml(图3(B))。应用该菌种生产杂交胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于基础研究中胰蛋白酶酶原晶体结构的研究和应用，并且提供了一种通过活化杂交胰蛋白酶酶原获得活性链霉菌胰蛋白酶的方法。

Description

一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其应用

技术领域

本发明涉及一种链霉菌胰蛋白酶酶原，特别是一种杂交胰蛋白酶酶原及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

链霉菌胰蛋白酶(SGT)（E.C.3.4.21.4）是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其在氨基酸编码基因结构上属于pre-pro-protease类型，而通过对灰色链霉菌的基因组测序发现编码SGT的基因SprT中，除去SGT自身信号肽和链霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端还具有一段前导肽(-Ala-Pro-Asn-Pro-)(图1)；通过前人对链霉菌胰蛋白酶在灰色链霉菌中的分泌，纯化，氨基酸测序以及相关生理生化功能的研究，发现在链霉菌气生菌丝和营养菌丝分化时，链霉菌胞外开始出现活性胰蛋白酶，纯化和氨基酸测序也仅能获得活性的胰蛋白酶的信息，而带有前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化机理却未有见到报道。而与其结构及性质较为相似的牛胰蛋白酶的产生是通过胰脏产生肠激酶活化胰蛋白酶酶原来产生活性胰蛋白酶，具体的激活机理：肠激酶特异性识别并切割胰蛋白酶前导肽，而哺乳动物胰蛋白酶酶原前导肽氨基酸序列正好是肠激酶酶切特异性识别序列（-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-）(图1.)。因此，鉴于链霉菌中带有野生前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原激活的具体机理未有相关报道，并且根据链霉菌活性胰蛋白酶和活性牛胰蛋白酶具有相似的氨基酸组成和蛋白质结构，拟通过构建基因工程菌，建立获得在N端具有牛胰蛋白酶酶原前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，对于杂交链霉菌胰蛋白酶酶原晶体结构的研究，以及其激活机理的研究具有至关重要的意义，并且为生产活性链霉菌胰蛋白酶提供了一种方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产杂交胰蛋白酶酶原（hybridizedtryspinogen）的基因工程菌，其特征在于染色体上携带有杂交胰蛋白酶酶原（hybridized tryspinogen）基因（smt）。

所述杂交胰蛋白酶酶原（hybridized tryspinogen）的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种杂交胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图1：

第一步胰蛋白酶酶原基因的获得及分析

首先，化学全合成灰色链霉菌（Streptomyces griseus）胰蛋白酶其次，毕赤酵母（Pichia pastoris）的表达系统有着特殊的密码子偏好性，如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母（Pichia pastoris）可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过类胰蛋白酶基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数（CAI）分析，发现在类胰蛋白酶基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在类胰蛋白酶基因上游加入EcoR I限制性内切酶位点以及来源于牛胰蛋白酶酶原的前导肽编码序列，在其下游部分加入Not I限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为：SEQ ID NO:1；

第二步杂交胰蛋白酶酶原重组质粒的构建

为了使smt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用smt基因序列5′端的EcoRⅠ限制性内切酶位点与3′端的NotⅠ限制性内切酶位点，将smt基因克隆入载体pPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。

将含有smt基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行EcoR I和Not I酶切，连接得到含有SprT基因的重组质粒pPIC9K-smt。

第三步类胰蛋白酶基因工程菌的构建

将重组质粒pPIC9K-smt电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母重组菌株。

本步骤采用的含类胰蛋白酶基因的重组表达质粒pPIC9K-pmt可转化毕赤酵母（Pichia pastoris），成为能分泌表达外源类胰蛋白酶的功能酵母菌：由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-smt上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-smt可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源smt基因，信号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。

毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法:首先接种活化后的毕赤酵母GS115一环于25mL YPD液体培养基中，28℃～30℃振荡培养过夜，然后将上述培养液转入100mLYPD(500mL三角瓶)液体培养基中，28℃～30℃振荡培养，每隔1h测定，培养直至菌体浓度OD₆₀₀为1.3～1.5，在冰水中冷却10min以上，然后在4℃环境下，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置10min，如此重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次，用300μL预冷1mol/L山梨醇悬浮细胞，从而获得受体菌。然后取50～80μL受体菌和5～90μg线性化重组表达质粒DNA混匀，电击(电压：1500V：电容：25μF；电阻：200Ω)处理，然后涂布于卡那霉素（10μg/mL）抗性平板筛选重组子。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的应用方法。

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：

第一步重组菌株的筛选

所述重组表达质粒pPIC9K-smt上含有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经整合到染色体上，重组菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生长；涂布含卡那霉素G418抗性平板，挑取阳性转化子，对转化子进行PCR验证，阳性即为产胰蛋白酶酶原基因工程菌。

第二步菌株经培养分泌杂交胰蛋白酶酶原

培养基组成（g/L）：

种子培养基：蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15；

发酵培养基：酵母氮源基础培养基12～15，生物素0.0002～0.0005，甲醇10～50；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O100，ZnCl₂70，Na₂MoO₄·2H₂O35，H₃BO₃60，CoCl₂·6H₂O200，CuSO₄·5H₂O29，NiCl₂·6H₂O25，37%盐酸0.9mL。

优选培养基组成（g/L）：

种子培养基：蛋白胨15g/L，酵母提取物8g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠10g/L；

发酵培养基：酵母氮源基础培养基12～15g/L，生物素0.0002～0.0005g/L，甲醇10～50g/L；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O100g/L，ZnCl₂70g/L，Na₂MoO₄·2H₂O35g/L，H₃BO₃60g/L，CoCl₂·6H₂O200g/L，CuSO₄·5H₂O29g/L，NiCl₂·6H₂O25g/L，37%盐酸0.9mL。

培养方法：

种子培养：接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28℃～30℃，摇床转速200r/min，培养24h；

发酵培养：离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶（500mL）中，发酵温度30℃，摇床转速200r/min，发酵时间：3～4天。

杂交胰蛋白酶酶原检测方法及其活化后酶活检测：

将诱导获得的胞外上清进行SDS-PAGE检测，并同空白宿主菌作对比，按照理论分子量估算链霉菌胰蛋白酶酶原分子量约为25kDa左右，同空白对照相比在相应蛋白条带处出现的条带即表明链霉菌胰蛋白酶酶原的表达。

胰蛋白酶能够选择性的切断赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，利用人工合成的具有上述肽链的N^α-苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯酰胺（BAPNA）作为底物，在410nm下测定类胰蛋白酶催化BAPNA的产物对硝基苯胺的吸光系数，利用吸光系数在10min内的变化率来反映类胰蛋白酶的酶活大小。酶活定义为：在25℃下，每水解1μg的BAPNA所需的类胰蛋白酶的量，即为类胰蛋白酶的1个BAPNA水解单位。具体测定方法为：将43.5mg BAPNA先溶解于1mL二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于pH8.0的，含有10mM CaCL₂的50mM Tris-HCL缓冲液中，此即为类胰蛋白酶的底物溶液，测定过程为：在25℃下，测定10μL粗酶液同990μL BAPNA溶液在光径1cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化，得到ΔA_410nm/min，之后利用下面的公式计算得到粗酶液酶活：

本发明提供的杂交胰蛋白酶酶原及其基因工程菌，解决了胰蛋白酶酶原无法从野生灰色链霉菌中获得的问题；应用该菌种生产类胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于工业化应用，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产品纯度高，利于下游纯化及后续的晶体结构等基础研究工作。

附图说明：

图1杂交链霉菌胰蛋白酶前体组成结构示意图

图2产杂交胰蛋白酶酶原的基因工程菌整合质粒的构建

图3杂交链霉菌胰蛋白酶酶原的表达检测及其活化后酶活测定

具体实施方式：

实施例1：杂交胰蛋白酶酶原基因的扩增

链霉菌胰蛋白酶（mt）的基因来源于灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中含胰蛋白酶酶原基因的编码序列（GenBankAccession No.M64471），其中第639位到第1307位是编码SprT的基因。在对基因进行密码子偏好性等分析后，在其5′端加上EcoRI酶切位点和牛胰蛋白酶酶原前导肽编码序列，在其3′端加上Not I酶切位点，smt基因其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

实施例2：含杂交链霉菌胰蛋白酶酶原（smt）基因重组质粒pPIC9K-smt的构建

smt基因体外扩增片段的和表达载体pPIC9K分别进行Not I和EcoR I双酶切，回收后用T4连接酶进行连接。连接反应体系为（10μL）：目的基因片断2μL，载体DNA2μL，10×T4连接酶Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH₂O4μL。

连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下：

(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；

(2)每管加入1～2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；

(3)42℃热休克90sec（准确）,不要摇动离心管；

(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1～2min；

(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；

(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。

挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。

实施例3：杂交胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建

将表达载体pPIC9K-smt用Sal I酶切线形化。酶切体系(50μL体系)：重组质粒10μL，Buffer 5μL，Sal I3μL，ddH₂O 32μL。37℃水浴3h，用PCR产物纯化试剂盒对线形化产物进行纯化回收，电击法转化毕赤酵母GS115，具体方法如下：

(1)接种活化后的毕赤酵母GS115一环于25mL YPD液体培养基中，28℃～30℃振荡培养过夜；

(2)将上述培养液转入100mL YPD(500mL三角瓶)液体培养基中，28℃～30℃振荡培养，每隔1h测定，培养直至菌体浓度OD₆₀₀为1.3～1.5；

(3)在冰水中冷却10min以上；

(4)4℃，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置10min；

(5)重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次；

(6)用300μL预冷1mol/L山梨醇悬浮细胞；

(7)加入10μL线形化质粒，在冰水中混匀5min；

(8)放入冰预冷的无菌电转化杯（0.2cm）中，在1500V，电击1～2次；

(9)加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液；

(10)取上述100～200μL涂布YNB平板（或离心涂布100μL）；

(11)28℃～30℃倒置培养1～2天，挑选白色菌落。

实施例4：重组菌株的筛选

1、酵母重组子的G418筛选

接种转化子于25mL YPD液体培养基中，28℃～30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，无菌水悬浮，取100μL分别涂布于含G418终浓度为0.5、1.0、2mg/mL的YPD平板培养基上，筛选转化子。

2、双酶切验证：提取转化子质粒，进行EcoR I和NcoⅠ双酶切，对产物进行电泳验证。

3、胰蛋白酶酶活性测定

(1)重组子和空载体pPIC9K转化的毕赤酵母GS115分别接种于20mL YPD液体培养基，30℃振荡培养过夜（稳定期）；

(2)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入100mL MGY培养基（加入1mL100×生物素）中；30℃，200r/min振荡培养48h；

(3)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入30mL MM液体培养基（加入300μL甲醇，300μL100X生物素）中；30℃，200r/min振荡培养7天；定时进行酶活测定。

杂交胰蛋白酶酶原表达检测方法及其活化后酶活性检测：

实施例5：重组菌株的培养

发酵培养基：酵母氮源基础培养基12～15g/L，生物素0.0002～0.0005g/L，甲醇10～50g/L；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O 100g/L，ZnCl₂ 70g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 35g/L，H₃BO₃ 60g/L，CoCl₂·6H₂O 200g/L，CuSO₄·5H₂O 29g/L，NiCl₂·6H₂O 25g/L，37%盐酸0.9mL。

培养方法：

发酵培养：离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶（500mL）中，发酵温度30℃，摇床转速200r/min，3～4天后，检测发酵液中杂交链霉菌胰蛋白酶酶原表达情况，并将其利用肠激酶进行切割处理测定活化后链霉菌胰蛋白酶酶活。

发酵上清液中酶原经肠激酶处理后，可获酶活力为1.47U/mL，比直接表达成熟酶获得的胞外酶活力0.48U/mL提高了2.1倍，并且胞外总蛋白含量从原来的140μg/mL，提高到表达杂交胰蛋白酶酶原时的243μg/mL，总蛋白含量提高到原来的1.73倍;经相同的纯化方法得到的杂交胰蛋白酶酶原蛋白含量为29μg/mL，与表达成熟胰蛋白酶时纯化得到的胰蛋白酶时的15μg/mL相比，提高到原来的1.93倍。同直接表达成熟链霉菌胰蛋白酶相比，表达杂交酶原可以降低胰蛋白酶对细胞的毒性，增加重组蛋白的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述杂交链霉菌胰蛋白酶酶原的表达载体。

3.表达权利要求1所述杂交链霉菌胰蛋白酶酶原的基因工程菌或转基因细胞系。

4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步：化学全合成得到杂交胰蛋白酶酶原基因；

第二步：将第一步得到的杂交胰蛋白酶酶原基因片段与毕赤酵母常用表达载体pPIC9K双酶切、连接，得到含有类胰蛋白酶基因的重组质粒；

第三步：将重组质粒电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达杂交胰蛋白酶酶原的组成型毕赤酵母重组菌株。