CN102080064B

CN102080064B - 一种产谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN102080064B
Application number: CN2010105797553A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 马腾博; 张东旭
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN102080064A

Abstract

本发明公开了一种产谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明通过分子生物学的手段，首次得到了吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）的完整基因序列，并根据得到序列构建了pET22b(+)-TAPI重组质粒，使TAPI在大肠杆菌中表达，应用该菌种生产TAPI，产量可达10mg/L。本方法工艺简单、产品产量高等诸多优点，开发了一种安全性、温和性和“绿色性”的新型蛋白质类表面活性剂；并且该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，便于分离纯化。本发明为用基因手段表达蛋白质类表面活性剂提供了参考和依据，也为表面活性剂的发展拓展了方向。

Description

一种产谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种产谷氨酰胺转胺酶（TGase）活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

蛋白质一般是由疏水性氨基酸基和亲水性氨基酸基构成，由于丙氨基酸基的平衡作用，蛋白质显示表面活性。由于极性或非极性氨基酸在每一种蛋白质肽链中分布的不规则性或特异性，以及蛋白质空间结构和空间结构作用力如二硫键等的影响。因此，绝大多数天然蛋白质因非极性基团被包裹在致密稳固的蛋白质分子内部而无法表现出其表面活性功能。但是在一些蛋白质多肽链的某些区段会出现一端是极性氨基酸残基聚集区、而另一端则是非极性氨基酸残基聚集区的结构，如酪蛋白α_s1-Casein N末端肽链23个氨基酸残基序列具有非常突出的表面活性性能。

TGase活化蛋白酶抑制剂（TGase-activating protease inhibitor，简称TAPI）是本实验室发现的一种新型小分子蛋白酶抑制剂，它通过对丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶这两类蛋白酶的抑制来调控TGase活化。由张东旭（DONGXU ZHANG etc.,2008, Surfactant Protein of the Streptomyces Subtilisin Inhibitor Family Inhibits Transglutaminase Activation in Streptomyces hygroscopicus, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 3403–3408 3403）从吸水链霉菌中分离纯化得到，经鉴定TAPI属于链霉菌的SSI蛋白家族，分子量大约12KDa。张东旭还对TAPI（P₁₂）进行了相关性质的研究，发现TAPI能够被疏水柱很牢固的吸附，只有用水才能洗脱下来，这一结果说明TAPI具有很强的疏水性。而同时TAPI又具有水溶性。进一步的研究中，还发现TAPI能够改变水溶液的界面性质，就是一种表面活性蛋白。

随着人们越来越关注各类产品的安全性、温和性和对“绿色性”等要求的提高，研究并开发多功能、高质量和“绿色”新型表面活性剂已经成为表面活性剂行业的主要发展方向。其中，高表面活性和生物降解性、多功能性及生物兼容性优良的“绿色”表面活性剂已成为新型表面活性剂技术进步的主要标志。

由于蛋白质具有生物降解性好、无毒、无污染的优点，非常符合当前表面活性剂的发展要求。因此，蛋白质的表面性能对于研究和开发新一代表面活性剂是非常有意义的。因此被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业，但仍以个人生活用品等传统应用领域为主。用于家用洗涤剂中，能表现出良好的稳泡性和洗涤能力；在香波、沐浴露和洗手液中能表现出良好的洗涤力、发泡力，产生丰富且稳定的泡沫，当皮脂类油状物质存在时也不消泡，是温和型绿色表面活性剂开发的主要方向及研究热点，具有很大的发展潜力。可以单独使用，也可与其他洗涤剂并用。为防止腐败，必须加入防腐剂，此外由于蛋白质类表面活性剂在高温的油-水界面上可形成稳定的分子膜，又是石油化工厂的有效灭火剂。

目前国际上较有影响的蛋白质表面活性剂(Protein·based surfaeants，PBS)产品主要在美国、德国、日本等国家，国内关于PBS的研究却很少，主要依赖进口，因此蛋白质表面活性剂产品的研究，尤其是新型蛋白质类表面活性剂的开发显的极为迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种产谷氨酰胺转胺酶（TGase）活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌。

所述基因工程菌含有TAPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述TAPI基因位于pET22b(+)。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种TGase活化蛋白酶抑制剂基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤：

由于SSI蛋白家族的同源性不是很高，因此需要找相关的氨基酸保守序列（Mahito Terabe etc.,1996,New subtilisin-trypsin inhibitors produced by Streptomyces: primary structures and their relationship to other proteinase inhibitors from Streptomyces, Biochimica et Biophysica Acta 1292 (1996) 233-240），同时根据张东旭测定的N-氨基酸序列（DONGXU ZHANG etc.,2008, Surfactant Protein of the Streptomyces Subtilisin Inhibitor Family Inhibits Transglutaminase Activation in Streptomyces hygroscopicus, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 3403–3408 3403），PCR得到部分基因序列，再通过反向PCR的方法得到完整的TAPI蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示。

ATGCGGTACATCACTGGGGCGGTCGCGCTCGGCGCGGCACTGGTCCTGGGCACGCTCGCCACCACCGCGCAGGCCGCCGCACCGGCGCAGCCCACGCGGACCGGCGGGCTCTACGCCCCCACGGCACTGGTGCTGACGGCCGGCCAGGGCGAAAGCCGCGCGACCGCCACGGTGCAGCGCGCCGTGACGCTCAGCTGTATGCCGGGGGCGACCGGCAGCCACCCGAACCCGAAAGCCGCCTGCGCCGAACTGCGCACGGCGGCCGGTGACTTCAACGCGGTGACCACTGCCCCGTCCGACCGGCTGTGCACCAAGGAGTGGAACCCCTTCGTGGTCACCGCCGACGGCGTGTGGCAGGGCAAGCGGGTCTCGTACACCTACACCTTCGCCAACTCCTGCGCGATGGCCGACGGCATGGGCGCGGTCTTCGACTTCTGA

通过信号肽预测工具SignalP分析得信号肽（斜体部分）。

第一步TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）基因的获得

根据SEQ ID NO.2设计引物，PCR得到扩增不含信号肽TAPI基因序列如SEQ ID NO.1所示。

GCCGCACCGGCGCAGCCCACGCGGACCGGCGGGCTCTACGCCCCCACGGCACTGGTGCTGACGGCCGGCCAGGGCGAAAGCCGCGCGACCGCCACGGTGCAGCGCGCCGTGACGCTCAGCTGTATGCCGGGGGCGACCGGCAGCCACCCGAACCCGAAAGCCGCCTGCGCCGAACTGCGCACGGCGGCCGGTGACTTCAACGCGGTGACCACTGCCCCGTCCGACCGGCTGTGCACCAAGGAGTGGAACCCCTTCGTGGTCACCGCCGACGGCGTGTGGCAGGGCAAGCGGGTCTCGTACACCTACACCTTCGCCAACTCCTGCGCGATGGCCGACGGCATGGGCGCGGTCTTCGACTTCTGA

设计酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ。

第二步TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）蛋白重组质粒的构建

为了使TAPI基因能在大肠杆菌中的可控高效表达，选用带有T7lac启动子的pET表达载体(例如pET22b(+)，美国Invitrogen公司)，利用上述获得的TAPI基因序列5′端的NcoⅠ限制性内切酶位点与3′端的HindⅢ限制性内切酶位点，将TAPI基因克隆入载体pET22b(+)。由于在T7lac强启动子后面有一段信号肽序列，这也为TAPI基因在大肠杆菌中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pET22b(+)载体中含有氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。

将含有TAPI基因的载体与要连接的表达载体pET22b(+)进行NcoⅠ和HindⅢ酶切，连接得到含有TAPI基因的重组质粒pET22b(+) –TAPI。

第三步TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）蛋白基因工程菌的构建

将重组质粒pET22b(+) -TAPI转化大肠杆菌BL21感受态，构建高效表达TAPI蛋白的大肠杆菌重组菌株。

本步骤采用的TAPI蛋白的重组表达质粒pET22b(+) -TAPI可转化大肠杆菌BL21，成为能分泌表达外源TAPI蛋白功能大肠杆菌：由于含TAPI基因的重组表达质粒pET22b(+) -TAPI上有T7lac启动子和信号肽。在外源诱导物IPTG存在的情况下，T7lac启动子启动外源TAPI基因，信号肽指导表达产物进入大肠杆菌的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。大肠杆菌BL21的转化常采用化学转化法，制备BL21感受态细胞，冰上静置，热激，预培养后涂布平板，37℃培养10~14小时，获得转化子。

本发明通过分子生物学的手段，首次得到了吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）的完整基因序列，并根据得到序列构建了pET22b(+)-TAPI重组质粒，使TAPI在大肠杆菌中表达，应用该菌种生产TAPI，产量可达10 mg/L。本发明具有生产工艺简单、产品产量高等诸多优点，开发了一种安全性、温和性和 “绿色性”的新型蛋白质类表面活性剂；并且该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，便于分离纯化。本发明为用基因手段表达蛋白质类表面活性剂提供了参考和依据，也为表面活性剂的发展拓展了方向。

具体实施方式

实施例1：TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）基因的获得

根据TGase活化蛋白酶抑制剂N-氨基酸测序结果设计5’端引物：5’-GGCCTCTACGCCGCCACG-3’；分析SSI蛋白家族氨基酸的保守序列，选取相对保守的氨基酸设计3’端引物：5’-GCGCTTGCCCTGCCAGACG-3’ ，得到TAPI基因的中间一段序列如SEQ ID NO.3所示。

GGCCTCTACGCCGCCACGGCACTGGTGCTGACGGCCGGCCAGGGCGAAAGCCGCGCGACCGCCACGGTGCAGCGCGCCGTGACGCTCAGCTGTATGCCGGGGGCGACCGGCAGCCACCCGAACCCGAAAGCCGCCTGCGCCGAACTGCGCACGGCGGCCGGTGACTTCAACGCGGTGACCACTGCCCCGTCCGACCGGCTGTGCACCAAGGAGTGGAACCCCTTCGTGGTCACCGCCGACGGCGTCTGGCAGGGCAAGCGC

根据上述序列设计反向引物：5'-CGGCATACAGCTGAGCGTCACGGCG-3'，5'-CACCAAGGAGTGGAACCCCTTCGTGGTCA-3'；选取Xho I内切酶，对吸水链霉菌基因组酶切，环化，反向PCR后连PMD18-T vector，测序，得到完整基因序列如SEQ ID NO.2所示。

通过信号肽预测工具SignalP分析得信号肽（斜体部分）。

根据SEQ ID NO.2设计引物（5'-CATGCCATGGATGCCGCACCGGCGCAGCCCA-3'；

5'-CCCAAGCTTTCAGAAGTCGAAGACCGCGCCCATGC-3'），PCR得到扩增不含信号肽TAPI基因，如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：重组质粒pET22b(+)-TAPI的构建

将含有SEQ ID NO. 1序列的载体及表达载体pET22b(+)分别进行NcoI和HindⅢ双酶切，回收后用Takara公司的SolutionI进行连接。连接反应体系为（10 μL）：目的基因片断4 μL，载体DNA 1 μL，SolutionI 5μL。

连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下：

⑴ 将感受态从超低温冰箱中取出，置于冰上融化。将10ul连接液添加至100ul感受态细胞，枪头应伸入至细胞溶中添加，并用手指轻弹混合。

⑵ 将感受态与转化DNA于冰上置30min，使DNA充分吸附到细胞表面。

⑶ 42℃水浴热激90S，迅速插入冰中，静置10min

⑷ 添加600ul LB培养基至感受态细胞中，用手指轻弹，混匀，于37oC摇床培养1h。

⑸ 在平板上做好转化质粒，宿主细胞，日期。一块标记0，用于添加600uL转化原液，另一块标记1，用于添加转化液稀释液（在剩余转化液中添加600uL培养基）。旋转平板，转化液均匀分布至平板表面。于超净台风干，约需10-20min

⑹ 确保涂布平板干燥后，37℃倒置培养。

挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。

实施例3：TGase活化蛋白酶抑制剂（TAPI）基因工程菌的构建

将上述阳性转化子液体培养提取质粒，2-5uL纯化质粒加入Bl21(DE3)感受态中转化，具体方法与转化JM109相似，但BL21(DE3)表达宿主，转化效率较低，质粒拷贝数低，转化子生长速度较慢，需10小时至14小时，甚至更长时间才能长菌落。培养在晚间需进一步延长，但又担心细胞过度生长，可将转化平板于30℃培养箱培养。

实施例4：基因工程的筛选

1、酶切验证

于涂布氨苄青霉素平板上挑选6个单菌落分别接入含10 mL LB液体培养基中，并加入10 μL Amp，摇瓶培养过夜，分别编号为1、2、3、4、5、6，提取转化子质粒。用NcoⅠ单酶切重组质粒（10 μL体系）：转化子质粒 5 ml，NcoⅠ1 μL，Buffer 1 μL，ddH₂O 3 μL。37℃水浴5 h，凝胶电泳筛选转化子。

2、阳性重组质粒PCR验证（25 μL体系）：

体系：重组质粒 1 μL，Buffer 2.5 μL，引物（20 mmol/L）各 2 μL，dNTP (各2.5 mmol/L) 2 μL ，TaqDNA聚合酶 0.4 μL，ddH₂O 18 μL。

反应条件：94℃ 预变性4 min,变性94 ℃ 1 min、退火60℃ 1 min、延伸72℃1min 35个循环，最后72℃延伸10 min。通过2步验证，得到阳性转化子，用于下步发酵。

实施例5：发酵产TAPI

种子培养基LB（g/L）：蛋白胨 10，酵母提取物5，氯化钠10；

发酵培养基TB（g/L）：蛋白胨12，酵母提取物：24，甘油4ml，KH₂PO₄ 2.31g K₂HPO₄ 12.54g。

培养方法：（设对照，同步培养）

种子培养：接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量25mL，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h。

发酵培养：将发酵液体积3%的种子液入装液量为 25mL 的三角瓶（250 mL）中，发酵温度 37℃，摇床转速200 r/min，当OD到1时（转接大约2h后），加1Mm IPTG 25℃诱导（对照不加IPTG）。培养20h后，OD到20左右下摇床。蛋白电泳分别对发酵上清、破壁上清、破壁沉淀、全细胞的对照（无诱导）和诱导检测，对照无TAPI条带而诱导有，说明已表达TAPI。处理后的发酵液经Phenyl Sepharose 6 F. F.柱纯化后，每升发酵液可获得约10 mg纯化的重组蛋白。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

[0044]

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种产谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）

<400> 1

gccgcaccgg cgcagcccac gcggaccggc gggctctacg cccccacggc actggtgctg 60

acggccggcc agggcgaaag ccgcgcgacc gccacggtgc agcgcgccgt gacgctcagc 120

tgtatgccgg gggcgaccgg cagccacccg aacccgaaag ccgcctgcgc cgaactgcgc 180

acggcggccg gtgacttcaa cgcggtgacc actgccccgt ccgaccggct gtgcaccaag 240

gagtggaacc ccttcgtggt caccgccgac ggcgtgtggc agggcaagcg ggtctcgtac 300

acctacacct tcgccaactc ctgcgcgatg gccgacggca tgggcgcggt cttcgacttc 360

tga 363

<210> 2

<211> 438

<212> DNA

<213> 吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）

<400> 2

atgcggtaca tcactggggc ggtcgcgctc ggcgcggcac tggtcctggg cacgctcgcc 60

accaccgcgc aggccgccgc accggcgcag cccacgcgga ccggcgggct ctacgccccc 120

acggcactgg tgctgacggc cggccagggc gaaagccgcg cgaccgccac ggtgcagcgc 180

gccgtgacgc tcagctgtat gccgggggcg accggcagcc acccgaaccc gaaagccgcc 240

tgcgccgaac tgcgcacggc ggccggtgac ttcaacgcgg tgaccactgc cccgtccgac 300

cggctgtgca ccaaggagtg gaaccccttc gtggtcaccg ccgacggcgt gtggcagggc 360

aagcgggtct cgtacaccta caccttcgcc aactcctgcg cgatggccga cggcatgggc 420

gcggtcttcg acttctga 438

<210> 3

<211> 261

<212> DNA

<213> 吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）

<400> 3

ggcctctacg ccgccacggc actggtgctg acggccggcc agggcgaaag ccgcgcgacc 60

gccacggtgc agcgcgccgt gacgctcagc tgtatgccgg gggcgaccgg cagccacccg 120

aacccgaaag ccgcctgcgc cgaactgcgc acggcggccg gtgacttcaa cgcggtgacc 180

actgccccgt ccgaccggct gtgcaccaag gagtggaacc ccttcgtggt caccgccgac 240

ggcgtctggc agggcaagcg c 261

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 4

ggcctctacg ccgccacg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 5

gcgcttgccc tgccagacg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 6

cggcatacag ctgagcgtca cggcg 25

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 7

caccaaggag tggaacccct tcgtggtca 29

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 8

catgccatgg atgccgcacc ggcgcagccc a 31

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。

<400> 9

cccaagcttt cagaagtcga agaccgcgcc catgc 35

Claims

1.一种产谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）根据已知谷氨酰胺转胺酶活化蛋白酶抑制剂基因N-氨基酸序列及SSI蛋白家族保守区设计引物，进行PCR扩增；

2）对PCR产物进行测序，得到SEQ ID NO.3；

3）根据SEQ ID NO.3设计反向引物，通过反向PCR获得SEQ ID NO.2;

4）根据SEQ ID NO.2序列设计引物获得SEQ ID NO.1；

5）将SEQ ID NO.1克隆与pET22b(+)得到重组质粒pET22b(+)-TAPI；

6）重组质粒pET22b(+)-TAPI转化大肠杆菌BL21（DE3）。