CN104379734A - 具有改进的转化效率的细菌突变体 - Google Patents
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Abstract
在此提供了具有改进的转化效率的乳杆菌突变体,该突变体包括对编码限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。还描述了用于产生这些突变体的方法、用于使用这些突变体产生转化体的方法、以及用于使用这些突变体产生多肽或发酵产物的方法。
Description
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背景
由于它缺乏宿主样甲基化模式,抑或由于相对于宿主DNA的稀有碱基修饰的存在,对于给定细胞,被识别为外源的DNA可以被靶向于在细胞内降解(Bair(贝尔)和Black(布莱克),2007,J Mol Biol(分子生物学杂志)(366:768-778)。据报道,随后被限制性内切核酸酶降解构成了将DNA引入细菌中的有效屏障(Briggs(布里格斯)等人Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)1994,60,2006-2010;Accetto(阿奇托)等人FEMS Microbiol.Lett.(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)2005,247,177-183;(贝尔)和Black(布莱克),J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2007,366,768-778;Corvaglia(科尔瓦利亚)等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊)2010,107,11954-11958;Monk(蒙克)等人,2012,mBio 3(2):e00277-11.doi:10.1128/mBio.00277-11)。
通过多种标准,这些基于核酸酶的系统被分为四种主要类型,I型至IV型(Roberts(罗伯茨)等人Nucleic Acids Res.(核酸研究)2003,31,1805-1812)。I型至III型系统涵盖了成对的甲基转移酶和内切核酸酶活性,降解缺乏适当甲基化模式的外源DNA,而IV型酶是仅切割已经被修饰的DNA底物的内切核酸酶(Tock(托科)和Dryden(德莱登),Curr.Opin.Microbiol.(微生物学新见)2005,8,466-472)。
对于多种工业上相关的过程(例如代谢工程和生化生产)而言,细菌转化体提供了关键平台。然而,将外源DNA引入一些细菌宿主(例如乳杆菌)会是一个无效率的过程,生成的转化体极少,如果有的话。在本领域中,对于将DNA引入细菌宿主细胞来改进所得转化体的效率的新方法存在需要。本发明满足了这些和其他需要。
概述
在此描述了具有改进的转化效率的分离的乳杆菌突变体。在一个方面,是亲本乳杆菌菌株的突变体,包含对编码I型限制修饰系统亚基(例如限制性亚基(restriction subunit)或特异性亚基(specificitysubunit))的内源基因的破坏,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体具有改进的转化效率。在一些方面,乳杆菌突变体是路氏乳杆菌突变体。
还描述了用于获得乳杆菌突变体的方法,这些方法包括在亲本乳杆菌菌株中破坏编码I型限制修饰系统亚基(例如限制性亚基或特异性亚基)的内源基因。
还描述的是用于获得乳杆菌转化体的方法,这些方法包括将异源多核苷酸转化进入乳杆菌突变体。
还描述的是产生多肽的方法,这些方法包括:(a)培养包含编码该多肽的异源多核苷酸的乳杆菌转化体;以及(b)回收该多肽。
还描述的是产生发酵产物的方法,这些方法包括:(a)培养包含编码这一发酵通路的多肽的异源多核苷酸的乳杆菌转化体;以及(b)回收该发酵产物。在一些方面,发酵产物是丙醇(正丙醇或异丙醇)。
附图简要说明
图1示出了与来自路氏乳杆菌SJ11400的相应的突变的特异性结构域相比,来自路氏乳杆菌SJ10655的限制修饰系统特异性结构域LAR0818(SEQ ID NO:2)的比对。
图2示出了与来自路氏乳杆菌SJ10655的相应的特异性结构域相比,来自路氏乳杆菌JCM1112的限制修饰系统特异性结构域LAR1344(SEQ ID NO:14)的比对。
图3示出了与来自路氏乳杆菌SJ10655的相应的特异性结构域相比,来自路氏乳杆菌JCM1112的限制修饰系统特异性结构域LAR1346(SEQ ID NO:12)的比对。
图4示出了pSJ10600的质粒图。
图5示出了pJP042的质粒图。
图6示出了pSJ10762的质粒图。
图7示出了pTRGU1065的质粒图。
图8示出了pTRGU1073的质粒图。
图9示出了pBKQ357的质粒图。
定义
破坏:术语“破坏”是指参比基因的编码区和/或控制序列被部分地或完全地修饰(例如通过删除、插入、和/或取代一个或多个核苷酸,或通过与RNAi或反义技术关联),导致表达缺失(失活)或降低,和/或编码的多肽的酶活性缺失或/降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏的效果,例如使用来自在此引用的无细胞提取物测量来检测酶活性的缺失或降低;或通过相应的mRNA的缺失或降低(例如至少25%降低、至少50%降低、至少60%降低、至少70%降低、至少80%降低、或至少90%降低);具有酶活性的相应多肽的量的缺失或降低(例如至少25%降低、至少50%降低、至少60%降低、至少70%降低、至少80%降低、或至少90%降低);或具有酶活性的相应多肽的特定活性的缺失或降低(例如至少25%降低、至少50%降低、至少60%降低、至少70%降低、至少80%降低、或至少90%降低)。可以通过本领域已知的方法产生感兴趣的具体基因的破坏,例如通过直接同源重组(参见Methodsin Yeast Genetics(酵母遗传实验方法)(1997版),Adams(亚当斯)、Gottschling(戈特施林)、Kaiser(凯泽)、和Stem(斯提姆),Cold SpringHarbor Press(冷泉港出版社)(1998))。
亲本:术语“亲本”或“亲本乳杆菌菌株”是指对其做出破坏来产生在此描述的突变体乳杆菌菌株的乳杆菌菌株。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或预先修饰的乳杆菌菌株。
突变体:术语“突变体”是指在对亲本乳杆菌菌株做出破坏后,生成的乳杆菌菌株。
I型限制修饰系统:术语“I型限制修饰系统”是指包含至少一个限制性亚基(HsdR)、至少一个修饰性亚基(modification subunit)(HsdM)以及至少一个说明性亚基(specification subunit)(HsdS)的多功能酶复合物,其中该复合物发挥内切核酸酶和甲基转移酶活性(参见Murray(穆雷),Microbiol.Mol.Biol.Rev.(微生物学与分子生物学评论)2000,64:412-434)。
HsdR亚基包括用于ATP水解的活性位点和对于内切核酸酶活性而言所必需的其他序列。HsdM亚基包括用于DNA甲基化的活性位点和用于AdoMet(S-腺苷甲硫氨酸)的结合位点。HsdS亚基包括赋予复合物的限制性活性和修饰性活性这二者靶序列特异性的两个靶识别结构域。
改进的转化效率:术语“改进的转化效率”是指当在相同条件下转化并且培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,参比乳杆菌突变体菌株能够产生增加量的转化体。可以通过用至少一种适合的DNA,例如在此引用的质粒中的任一种(例如pSJ10762、pTRGU1065、pTRGU1073),使用如在以下实例中描述的电穿孔,产生增加量的转化体,由此来证明改进的转化效率。在一些方面,与亲本乳杆菌菌株相比,该乳杆菌突变体菌株能够产生至少2倍的,例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少20000倍、至少50000倍、或至少100000倍更多的转化体。
分离的:术语“分离的”意思指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种参比物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质,(2)任何物质,包括但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子;(3)相对于自然中发现的物质,由人手工修饰的任何物质;或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分,增加物质的量而修饰的任何物质(例如,宿主细胞中的重组产生;编码该物质的基因的多个拷贝;以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
成熟多肽序列:术语“成熟多肽序列”是指在任何翻译后序列修饰(例如N末端加工和/或C末端截短)之后的参比多肽序列部分。例如基于信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,Protein Engineering(蛋白质工程)1997,10,1-6)或InterProScan程序(The EuropeanBioinformatics Institute(欧洲生物信息学研究所)),可以预测成熟多肽序列。在一些实例中,成熟多肽序列可以与整个参比多肽序列相同。本领域已知,宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽序列的混合物(即,具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。
编码序列:术语“编码序列”是指明确一种多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定,该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始,并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”是指编码成熟多肽序列的参比多核苷酸序列部分。例如基于信号P(SignalP)程序(同上)或InterProScan程序(同上),可以预测成熟多肽编码序列。在一些实例中,成熟多肽编码序列可以与整个参比多核苷酸序列相同。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于在此描述的目的,使用Needleman(尼德曼)-Wunsch(翁施)算法来确定在两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施),J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1970,48,443-453),如在EMBOSS软件包的Needle(尼德尔)程序所实现的(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice(赖斯)等人,Trends Genet.(遗传学趋势)2000,16,276-277),优选的是版本3.0.0或更新的版本。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作一致性百分比并且计算如下:
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于在此描述的目的,使用Needleman(尼德曼)-Wunsch(翁施)算法来确定在两种脱氧核苷酸序列之间的序列一致性的程度(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施),1970,同上),如在EMBOSS软件包的Needle(尼德尔)程序所实现的(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice(赖斯)等人,2000,同上),优选的是版本3.0.0或更新的版本。使用的任选参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下:
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
异源多核苷酸:在此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸:对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸;已经对编码区做出一种或多种(例如,两种,若干种)结构修饰的天然多核苷酸;由于通过重组DNA技术对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸,例如,将一种不同的(外源的)启动子连接至该多核苷酸;或通过向该宿主细胞中引入该多核苷酸的一个或多个另外的拷贝而定量改变其表达的天然多核苷酸。
内源基因:术语“内源基因”是指对于亲本乳杆菌菌株是原生(native)的基因。
核酸构建体:术语“核酸构建体”是指一种包括一个或多个(例如,两个、若干个)控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的或双链的,并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰来以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段,或可以是合成的。
控制序列:术语“控制序列”是指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的,并且彼此可以是原生的或外源的。此类控制序列包括但不局限于,前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的,这些控制序列可以提供有多个接头。
可操作地连接:术语“可操作地连接”是指一种配置,其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处,以使得控制序列指引编码序列的表达。
表达:术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤,包括但不局限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量—例如,来检测增加的表达—通过本领域已知的技术,例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
表达载体:术语“表达载体”是指一种线性或环形的DNA分子,该分子包括编码一种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列,其中这些控制序列提供编码该多肽的多核苷酸的表达。最低限度上,该表达载体包括启动子序列,以及转录和翻译终止信号序列。
宿主细胞:术语“宿主细胞”是指对于用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
转化:术语“转化”是指将异源多核苷酸引入乳杆菌细胞,这样使得该DNA维持为染色体整合体或维持为自主复制的染色体外载体。转化后生成的乳杆菌细胞在此被描述为“转化体”。
等位基因变体:术语“等位基因变体”是指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生,并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如,提及“约X”的描述包括方面“X”。当与测量值组合使用时,“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围,并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
如在此和所附权利要求书中所使用,单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物,除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明,在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。
详细说明
乳杆菌突变体
除其他以外,在此描述的是亲本乳杆菌菌株的突变体,例如分离的突变体,包括对内源限制修饰系统基因(例如编码I型限制修饰系统亚基的基因)的破坏,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,这些突变体具有改进的转化效率。如在以下实例部分中所示,申请人已经出乎意料地发现对内源限制修饰系统基因的破坏可以改进乳杆菌宿主的转化效率。此类破坏可以防止转化体DNA被宿主细胞的限制修饰系统降解,由此改进了用于生物技术应用的宿主细胞的转化效率和总体有用性。
突变体和相关方法的亲本菌株可以是任何乳杆菌菌株,例如野生型乳杆菌或其突变体。在一些方面,亲本乳杆菌菌株是植物乳杆菌、食果糖乳杆菌、或路氏乳杆菌菌株。在一个方面,亲本菌株是植物乳杆菌菌株。在另一方面,亲本菌株是食果糖乳杆菌菌株。在另一方面,亲本菌株是路氏乳杆菌菌株。
设想的另外的亲本乳杆菌菌株包括但不局限于耐酸乳杆菌、一种乳杆菌(L.acidifarinae)、马里乳杆菌、嗜酸乳杆菌、敏捷乳杆菌、低温乳杆菌、消化乳杆菌、解淀粉乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、一种乳杆菌(L.amylotrophicus)、食淀粉乳杆菌、动物乳杆菌、胃窦乳杆菌、一种乳杆菌(L.apodemi)、一种乳杆菌(L.aquaticus)、亚利桑纳乳杆菌、鸟乳杆菌、巴伐利亚乳杆菌、双发酵乳杆菌、巴博乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、可可乳杆菌、一种乳杆菌(L.camelliae)、多毛乳杆菌、一种乳杆菌(L.carni)、干酪乳杆菌、链状乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、一种乳杆菌(L.ceti)、一种乳杆菌(L.coleohominis)、丘状菌落乳杆菌、一种乳杆菌(L.composti)、曲面乳杆菌、一种乳杆菌(L.confusus)、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、一种乳杆菌(L.crustorum)、弯曲乳杆菌、一种乳杆菌(L.cypricasei)、德氏乳杆菌、糊精乳杆菌、一种乳杆菌(L.diolivorans)、一种乳杆菌(L.divergens)、一种乳杆菌(L.durianis)、一种乳杆菌(L.equi)、一种乳杆菌(L.equicursoris)、一种乳杆菌(L.equigenerosi)、一种乳杆菌(L.fabifermentans)、香肠乳杆菌、一种乳杆菌(L.farraginis)、一种乳杆菌(L.ferintoshensis)、发酵乳杆菌、一种乳杆菌(L.fornicalis)、食果糖乳杆菌、果糖乳杆菌、一种乳杆菌(L.frumenti)、一种乳杆菌(L.fuchuensis)、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、一种乳杆菌(L.gastricus)、一种乳杆菌(L.ghanensis)、草乳杆菌、一种乳杆菌(L.halotolerans)、一种乳杆菌(L.hammesii)、哈氏乳杆菌、一种乳杆菌(L.harbinensis)、一种乳杆菌(L.hayakitensis)、瑞士乳杆菌、异型腐酒乳杆菌、希氏乳杆菌、同型腐酒乳杆菌、一种乳杆菌(L.hordei)、一种乳杆菌(L.iners)、一种乳杆菌(L.ingluviei)、肠乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、一种乳杆菌(L.kalixensis)、一种乳杆菌(L.kandleri)、马乳酒样乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、高加索酸奶粒乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、一种乳杆菌(L.kimchii)、一种乳杆菌(L.kisonensis)、一种乳杆菌(L.kitasatonis)、一种乳杆菌(L.kunkeei)、一种乳杆菌(L.lactis)、一种乳杆菌(L.leichmannii)、林氏乳杆菌、坏发酵乳杆菌、苹果乳杆菌、麦芽香乳杆菌、食木薯乳杆菌、一种乳杆菌(L.mindensis)、一种乳杆菌(L.minor)、一种乳杆菌(L.minutus)、黏膜乳杆菌、鼠乳杆菌、一种乳杆菌(L.nagelii)、一种乳杆菌(L.namurensis)、一种乳杆菌(L.nantensis)、一种乳杆菌(L.nodensis)、一种乳杆菌(L.oeni)、一种乳杆菌(L.oligofermentans)、口乳杆菌、一种乳杆菌(L.otakiensis)、面包乳杆菌、美洲虎乳杆菌、一种乳杆菌(L.parabrevis)、类布氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、一种乳杆菌(L.paracollinoides)、一种乳杆菌(L.parafarraginis)、类高加索酸奶乳杆菌、一种乳杆菌(L.paralimentarius)、一种乳杆菌(L.paraplantarum)、戊糖乳杆菌、一种乳杆菌(L.perolens)、一种乳杆菌(L.piscicola)、植物乳杆菌、一种乳杆菌(L.pobuzihii)、桥乳杆菌、一种乳杆菌(L.psittaci)、一种乳杆菌(L.rapi)、一种乳杆菌(L.rennini)、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、一种乳杆菌(L.rimae)、罗氏乳杆菌、一种乳杆菌(L.rossiae)、瘤胃乳杆菌、一种乳杆菌(L.saerimneri)、一种乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌、一种乳杆菌(L.sanfranciscensis)、一种乳杆菌(L.satsumensis)、一种乳杆菌(L.secaliphilus)、一种乳杆菌(L.senmaizukei)、沙氏乳杆菌、一种乳杆菌(L.siliginis)、一种乳杆菌(L.similis)、一种乳杆菌(L.sobrius)、一种乳杆菌(L.spicheri)、一种乳杆菌(L.sucicola)、一种乳杆菌(L.suebicus)、一种乳杆菌(L.sunkii)、一种乳杆菌(L.suntoryeus)、一种乳杆菌(L.taiwanensis)、一种乳杆菌(L.thailandensis)、一种乳杆菌(L.thermotolerans)、发状乳杆菌、一种乳杆菌(L.tucceti)、齿龈乳杆菌、一种乳杆菌(L.ultunensis)、一种乳杆菌(L.uvarum)、牛痘乳杆菌、阴道乳杆菌、一种乳杆菌(L.versmoldensis)、绿色乳杆菌、犊乳杆菌、一种乳杆菌(L.xylosus)、果汁乳杆菌、玉米乳杆菌、和一种乳杆菌(L.zymae)。
破坏的基因可以是编码I型限制修饰系统亚基(例如I型限制修饰系统的限制性亚基、I型限制修饰系统的特异性亚基、和/或I型限制修饰系统的修饰性亚基)的任何适合的内源基因。
靶基因的实例包括编码包含SEQ ID NO:2、4、和/或6的特异性亚基;SEQ ID NO:8的限制性亚基;以及SEQ ID NO:10的修饰性亚基的路氏乳杆菌多功能酶复合物的那些。另外的靶包括编码包含SEQID NO:12和/或14的特异性亚基(specificity subunit);SEQ ID NO:16的限制性亚基;以及SEQ ID NO:18的修饰性亚基的路氏乳杆菌多功能酶复合物的基因。靶基因的另外的实例包括在此描述的那些,例如表4中描绘的那些。
在一些方面,编码限制性亚基的内源基因和编码特异性亚基的内源基因这二者被破坏。在一些方面,编码限制性亚基的内源基因被破坏,编码特异性亚基的内源基因被破坏,并且编码修饰性亚基内源基因被破坏。
在突变体和相关方法的一些方面,破坏的基因是编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因。编码特异性亚基的内源基因的实例包括具有SEQ ID NO:1、3、5、11、或13中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因,SEQ ID NO:1、3、5、11、或13分别编码具有SEQ ID NO:2、4、6、12、和14的氨基酸序列的亚基。在一些方面,内源基因编码与SEQ ID NO:2、4、6、12、14、表4中描绘的任何特异性亚基的序列、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码具有与SEQ ID NO:2、4、6、12、14或表4中标绘的任何特异性亚基的序列差别不大于十个氨基酸,例如不大于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于三个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:2或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:4或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:4的成熟多肽序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:6或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:6的成熟多肽序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:12或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ IDNO:12的成熟多肽序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:14或由其组成的特异性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:14的成熟多肽序列或由其组成的特异性亚基。
在突变体或相关方法的其他方面,编码特异性亚基的内源基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、13、编码表4中描绘的特异性亚基的任何基因序列、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:1或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:3或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:5或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:11或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:13或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或由其组成。
在突变体或相关方法的其他方面,在至少低严谨度条件下,中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下,编码特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、13,或编码表4中描绘的特异性亚基的任何基因序列的全长互补链杂交。
在突变体和相关方法的一些方面,破坏的基因是编码I型限制修饰系统的限制性亚基的内源基因。编码限制性亚基的内源基因的实例包括具有SEQ ID NO:7和15中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因,SEQID NO:7和15分别编码具有SEQ ID NO:8和16的氨基酸序列的亚基。在一些方面,内源基因编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、表4中描绘的任何限制性亚基的序列、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的限制性亚基。在一些方面,内源基因编码具有与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16或表4中描绘的任何限制性亚基的序列差别不大于十个氨基酸,例如不大于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于三个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的限制性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:8或由其组成的限制性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:8的成熟多肽序列或由其组成的限制性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:16或由其组成的限制性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:16的成熟多肽序列或由其组成的限制性亚基。
在突变体和相关方法的其他方面,编码限制性亚基的内源基因的编码序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、编码表4中描绘的限制性亚基的任何基因序列、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:7或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:15或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或由其组成。
在突变体和相关方法的其他方面,在至少低严谨度条件下,中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下,编码限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:15,或编码表4中描绘的限制性亚基的任何基因序列的全长互补链杂交。
在突变体和相关方法的一些方面,破坏的基因是编码I型限制修饰系统的修饰性亚基的内源基因。编码修饰性亚基的内源基因的实例包括具有SEQ ID NO:9和17中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因,SEQID NO:9和17分别编码具有SEQ ID NO:10和18的氨基酸序列的亚基。在一些方面,内源基因编码与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、表4中描绘的任何修饰性亚基的序列、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的修饰性亚基。在一些方面,内源基因编码具有与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18或表4中标绘的任何修饰性亚基的序列差别不大于十个氨基酸,例如不大于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于三个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的修饰性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:10或由其组成的修饰性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:10的成熟多肽序列或由其组成的修饰性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQ IDNO:18或由其组成的修饰性亚基。在一些方面,内源基因编码包括SEQID NO:18的成熟多肽序列或由其组成的修饰性亚基。
在突变体或相关方法的其他方面,编码修饰性亚基的内源基因的编码序列与NO:9、SEQ ID NO:17、编码表4中描绘的修饰性亚基的任何基因序列、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:9或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:17或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列或由其组成。
在突变体或相关方法的其他方面,在至少低严谨度条件下,中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下,编码修饰性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:17,或编码表4中描绘的编码修饰性亚基的任何基因序列的全长互补链杂交。
在突变体和相关方法的一些方面,破坏的基因是编码非I型限制修饰系统蛋白的内源基因。如在此使用的非I型限制修饰系统是指不是I型分类的限制修饰系统蛋白(例如II型、III型、或IV型)。编码非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的实例包括具有SEQ ID NO:19和21中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因,SEQ ID NO:19和21分别编码具有SEQ ID NO:20和22的氨基酸序列的蛋白。在一些方面,内源基因编码与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的蛋白。在一些方面,内源基因编码具有与SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:22差别不大于十个氨基酸,例如不大于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于三个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的蛋白。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:20或由其组成的蛋白。在一些方面,内源基因编码包括SEQ ID NO:22的成熟多肽序列或由其组成的蛋白。在一些方面,内源基因编码包括SEQID NO:20或由其组成的蛋白。在一些方面,内源基因编码包括SEQ IDNO:22的成熟多肽序列或由其组成的蛋白。
在突变体和相关方法的其他方面,内源基因的编码序列与SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:19或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:21或由其组成。在一些方面,内源基因的编码序列包括SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或由其组成。
在突变体和相关方法的其他方面,在至少低严谨度条件下,中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下,编码非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交。
在此披露的多核苷酸序列,或其子序列;连同在此描述的氨基酸序列,或其片段;可以根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的、I型限制修饰系统的同源亚基。具体而言,可以根据标准DNA印迹程序,使用这样的探针与来自感兴趣的乳杆菌物种的DNA杂交,以便鉴定和分离其中的对应基因。这样的探针可以大大短于整个序列,例如长度至少为14个核苷酸,至少25个核苷酸、至少35个核苷酸、至少70个核苷酸。这些探针可以更长,例如长度至少为100个核苷酸,至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸。可以使用甚至更长的探针,例如长度至少为600个核苷酸,至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸。DNA和RNA探针这二者都可使用。典型地将探针进行标记,用于检测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。
可以针对与以上描述的探针杂交的DNA,来筛选由这样的其他菌株制备的DNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为鉴定与在此描述的多核苷酸序列或其子序列同源的克隆或DNA,可以在DNA印迹法中使用载体材料。对以上描述的探针的目的,杂交是指,在非常低至非常高的严谨度下,多核苷酸杂交至与这些多核苷酸序列或其全长互补链、或以上项的子序列对应的标记核酸探针上。在这些条件下,核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言,非常低至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/mL剪切并变性的鲑鱼精子DNA中,以及对于非常低和低严谨度在25%甲酰胺中,对于中和中-高严谨度在35%甲酰胺中,或对于高和非常高严谨度在50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严谨度)、在50℃(低严谨度)、在55℃(中严谨度)、在60℃(中-高严谨度)、在65℃(高严谨度)、以及在70℃(非常高严谨度)洗涤三次,每次持续15分钟。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短的探针而言,严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序,在比使用根据Bolton(博尔顿)和McCarthy(麦卡锡)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)1962,48,1390)的计算而计算的Tm低约5℃至约10℃下,在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及0.2mg的酵母RNA/mL中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的Tm以下5℃至10℃,在6X SCC加0.1%SDS中洗涤1次持续15分钟并且使用6X SSC洗涤2次,每次15分钟。
来自不同属或种的菌株的在此描述的I型限制修饰系统亚基的同系物一般具有是次要性质的氨基酸变化,即并不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地具有一个至约30个氨基酸的小删除;小氨基末端或羧基-末端延伸,例如一种氨基-末端甲硫氨酸残基;具有至多约20-25个残基的一种小连接肽;或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸,例如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合结构域。
保守取代的实例处于以下组内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸以及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的,并且例如由H.Neurath(H.诺伊拉特)和R.L.Hill(R.L.希尔)1979年描述于The Proteins(蛋白质)中,Academic Press(学术出版社),纽约。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可以根据本领域已知的程序来鉴定必需氨基酸,例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁安)和Wells(威尔斯),Science(科学)1989,244,1081-1085)。在后一种技术中,在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变,并且测试所得突变分子的活性以鉴定对该分子的活性关键的氨基酸残基。还参看Hilton(希尔顿)等人,J.Biol.Chem(生物化学杂志)1996,271,4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变,如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析,从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参看例如de Vos(德沃斯)等人,Science(科学)1992,255,306-312;Smith(史密斯)等人,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1992,224,899-904;Wlodaver(沃尔达韦尔)等人,FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯)(FEBS Lett.)1992,309,59-64。还可以从与其他相关酶的一致性分析来推断必需氨基酸的一致性。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试,这些相关的筛选程序例如由Reidhaar(里德哈尔)-Olson(奥尔森)和Sauer(萨奥尔),Science(科学)1988,241,53-57;Bowie(博维)和Sauer(萨奥尔),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊)1989,86,2152-2156;WO 95/17413;或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括:易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman(洛曼)等人,Biochemistry(生物化学)1991,30,10832-10837;美国专利号5,223,409;WO 92/06204),以及区域定向诱变(Derbyshire(德比希尔)等人,Gene(基因)1986,46,145;Ner(内尔)等人,DNA 1988,7,127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness(内斯)等人,NatureBiotechnol.(自然生物技术)1999,17,893-896)。可以使用本领域的标准方法,从宿主细胞回收编码活性酶的诱变的DNA分子,并且对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
I型限制修饰系统亚基基因的破坏和产生乳杆菌突变体的方法
可以通过使用本领域已知的方法(包括在此描述的那些方法)破坏编码I型限制修饰系统亚基的参比基因,来构建在此描述的乳杆菌突变株。可以破坏基因的一部分,例如编码区或表达编码区所需的控制序列。这样的控制序列可以是启动子序列或其功能部分,即足以影响该基因的表达的部分。例如,可以使启动子序列灭活,导致没有表达,或者可以用更弱启动子取代天然启动子序列来减少编码序列的表达。用于可能的修饰的其他控制序列包括但不局限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子、和转录激活因子。
可以通过基因删除技术来构建乳杆菌突变株,以消除或减少基因表达。基因删除技术使得能够部分或完全除去基因,由此消除它们的表达。在这样的方法中,通过使用已经被构建为连续地包含侧翼于该基因的5'和3'区域的质粒,用同源重组来完成基因的删除。
还可以通过引入、取代、和/或除去该基因或其转录或翻译所需的它的控制序列中的一个或多个(若干个)核苷酸,来构建乳杆菌突变株。例如,可以插入或除去核苷酸,用于终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的框移。这样一个修饰可以根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。参见例如Botstein(博特斯坦)和Shortle(肖特尔),Science(科学)1985,229,4719;Lo(卢)等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊)1985,81,2285;Higuchi(樋口)等人,Nucleic Acids Res(核酸研究)1988,16,7351;Shimada(岛田),Meth.Mol.Biol.(分子生物学方法)1996,57,157;Ho(何)等人,Gene(基因)1989,77,61;Horton(霍顿)等人,,Gene(基因)1989,77,61;以及Sarkar(萨卡尔)和Sommer(索姆),BioTechniques(生物技术)1990,8,404。
还可以通过将一个破坏的核酸构件体插入该基因,用基因破坏技术构建乳杆菌突变株,这一破坏的核酸构建体包含与将产生同源区的复制并且合并这些复制的区域之间的构建体DNA的基因同源的核酸片段。如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分开或中断编码序列,这样使得非功能基因产物生成,则这样一个基因破坏可以消除基因表达。破坏构建体可以简单地是伴随与该基因同源的5’和3’区域的一个选择性标记基因。选择性标记使得能够鉴定包含破坏的基因的转化体。
还可以通过基因转换的过程,构建乳杆菌突变株(参见例如Iglesias(伊格莱西亚斯)和Trautner(特劳特纳),Molecular General Genetics(分子遗传学和普通遗传学)1983,189,73-76)。例如,在基因转化方法中,将对应于该基因的核苷酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核苷酸序列,然后将其转化到亲本乳杆菌菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组,该缺陷的核苷酸序列替换内源基因。希望的是该缺陷的核苷酸序列还包括用于选择包含该缺陷基因的转化体的标记。
还可以使用与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列,用建立的反义技术构建乳杆菌突变株(Parish(帕里什)和Stoker(斯托克),FEMS Microbiol.Lett.(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)1997,154,151-157)。更确切,用乳杆菌突变株的该基因的表达可以通过引入与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列来减少或灭活,其中该核苷酸序列可在菌株中转录并能与菌株中所产生的mRNA发生杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA发生杂交的条件下,所翻译蛋白的量由此降低或消除。
还可以通过建立的RNA干扰(RNAi)技术构建乳杆菌突变株(参见例如WO 2005/056772和WO 2008/080017)。
可以通过使用本领域熟知的方法的随机诱变或专一诱变进一步构建乳杆菌突变株,这些诱变包括但不局限于化学诱变(参见例如Hopwood(霍普伍德),The Isolation of Mutants in Methods inMicrobiology(微生物学方法中突变体的分离)(J.R.Norris(诺里斯)和D.W.Ribbons(里邦斯)编辑)363-433页,Academic Press(学术出版社),纽约,1970)。该基因的修饰可以通过使亲本菌株经受诱变,并且筛选该基因的表达已经被减少或灭活的突变株来进行。诱变可以是专一的或随机的,可以例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过使DNA序列经PCR产生的诱变来进行。此外,诱变可以通过使用这些诱变方法的任意组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射,羟胺,N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG),邻甲基羟胺,亚硝酸,乙基甲磺酸(EMS),亚硫酸氢钠,甲酸和核苷酸类似物。当使用这样的试剂时,诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展示基因表达减少或不表达的突变体来进行的。
可以使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核苷酸序列来破坏所选的乳杆菌菌株中的相应的基因。
在一个方面,乳杆菌突变体中基因的修饰未用选择性标记进行标记。可以通过在反选择培养基上培养这些突变体来完成选择性标记基因的除去。在选择性标记基因包含侧翼于其5'和3'端的重复的情况下,当突变株经受反选择时,这些重复将通过同源重组促进选择性标记基因的环出。还可以通过将一个核酸片段(该核酸片段包括缺陷基因的5'和3'区域,但是缺乏选择性标记基因)引入该突变株,随后在反选择培养基上进行选择,用同源重组除去选择性标记基因。通过同源重组,包含选择性标记基因的缺陷基因被替换为缺乏选择性标记基因的核酸片段。也可使用本领域已知的其他方法。
还描述的是产生在此描述的乳杆菌突变体的方法。在一个方面,描述的是用于获得在此描述的乳杆菌突变体的方法,该方法包括在亲本乳杆菌菌株中,破坏编码I型限制修饰系统亚基的内源基因。在另一方面,描述的是用于获得在此描述的乳杆菌突变体的方法,该方法包括:(a)培养亲本乳杆菌菌株;(a)在(a)的亲本乳杆菌菌株中,破坏编码I型限制修饰系统亚基的内源基因;以及(c)分离生成自(b)的突变株。
转化的DNA和相关方法
对于产生乳杆菌转化体,在此描述的乳杆菌突变体是有用的。在一个方面,描述的是获得乳杆菌转化体的方法,该方法包括将异源多核苷酸转化进在此描述的乳杆菌突变体。在另一方面,描述的是获得乳杆菌转化体的方法,该方法包括:(a)培养在此描述的乳杆菌突变体;(b)将异源多核苷酸转化进(a)的乳杆菌突变体;以及(c)分离生成自(b)的转化体菌株。
在此描述的转化的DNA可以是任何感兴趣的DNA。DNA可以是基因组来源的、cDNA来源的、半合成来源的,合成来源的、或它们的任何组合。DNA可以是编码具有感兴趣的生物活性的任何多肽的异源多核苷酸或可以是在具有生物活性的多肽的表达中涉及的DNA,例如启动子。
具有生物活性的多肽可以是任何感兴趣的多肽。多肽对于感兴趣的乳杆菌宿主细胞而言可以是原生的或外源的。多肽可以是下述多肽和杂合多肽的天然发生的等位基因变体和基因工程变体。
术语“多肽”在此并非指特定长度的编码产物,因此涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”还涵盖杂合多肽,其包含获得自至少两种不同多肽的部分的或完整的多肽序列的组合,其中一种或多种对于乳杆菌细胞而言可以是外源的。多肽还包括多肽的天然出现的等位变体和工程化变体。
在一个方面,多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫放大介质(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白以及转录因子。
在另一方面,多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或者连接酶。在一个最优选的方面,多肽是α-葡糖苷酶,氨肽酶,淀粉酶,碳水化物酶,羧肽酶,过氧化氢酶,纤维素酶,几丁质酶,角质酶(cutinase),环糊精糖基转移酶,脱氧核糖核酸酶,酯酶,α-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,葡糖脑苷脂酶,α-葡糖苷酶,β-葡萄苷酶,转化酶,漆酶,脂肪酶,甘露糖苷酶,变聚糖酶(mutanase),氧化酶,果胶分解酶(pectinolytic enzyme),过氧化物酶,磷脂酶,肌醇六磷酸酶,多酚氧化酶,蛋白水解酶,核糖核酸酶,谷氨酰胺转移酶,尿激酶,或木聚糖酶。
在另一个方面,多肽是白蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶。
在另一方面,多肽是杂合多肽,其包含获得自至少两种不同多肽的部分的或完整的多肽序列的组合,其中一种或多种对于乳杆菌宿主细胞而言可以是外源的。
在另一方面,多肽是融合多肽,其中另一多肽融合在该多肽或其片断的N-末端或C-末端。通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合于编码另一种多肽的核苷酸序列(或其一部分)来生产融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域中已知的,并且包含连接编码多肽的编码序列,以使得它们同框,并且融合多肽的表达受到相同的一种或多种启动子和终止子的控制。
编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸可以获得自任何原核的、真核的、或其他来源。出于本发明的目的,如在此使用,术语“获得自”与给定来源一起使用时应指该多肽是由该来源或由其中已经插入了来自该来源的基因的细胞产生的。
用于分离或克隆编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或其组合。自此类基因组DNA克隆感兴趣的DNA可以通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)来实现。参见,例如,Innis(英尼斯)等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Application(PCR实验方案:方法和应用的指南),Academic Press(学术出版社),纽约,1990。克隆程序可以涉及切除和分离包含编码多肽的核酸序列的希望的核酸片段,将该片段插入载体分子,并将该重组载体掺入乳杆菌突变体,其中将会复制多个拷贝或克隆的该核酸序列。DNA可以是基因组来源的、cDNA来源的、RNA来源的、半合成来源的,合成来源的、或它们的任何组合。
可以按多种方式操作编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸,以提供该多肽在突变乳杆菌菌株中的表达。取决于表达载体,在其插入载体以前操作多核苷酸序列可以是希望的或必需的。利用重组DNA方法修飾核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
可以将包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列,在与这些控制序列相容的条件下,这些控制序列能够指导突变乳杆菌菌株中编码序列的表达。
控制序列可以是适当的启动子序列、由本发明的突变乳杆菌菌株识别的核苷酸序列,用于表达编码该多肽的多核苷酸。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在突变乳杆菌菌株中示出转录活性的任何核苷酸序列,包括突变型、截短型及杂合型启动子,并且可以获得自编码与该突变乳杆菌菌株原生抑或外源的细胞外或细胞内多肽的基因。
在突变乳杆菌菌株中,适合指导核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操作子、大肠杆菌trc启动子(Egon(埃贡)等人,Gene(基因)1988,69,301-315),天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa(维拉)-Kamaroff(卡玛诺夫)等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)1978,75,3727-3731),连同tac启动子(DeBoer(德波尔)等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)1983,80,21-25)。另外的启动子描述于(Gilbert(吉尔伯特)等人,Scientific American(科学美国人)1980,242,74-94)中的“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”;以及Sambrook(萨姆布鲁克)等人,1989,同上中。
控制序列也可以是适合的转录终止子序列,由突变乳杆菌菌株识别的序列,以终止转录。该终止子序列可操作地连接至编码该异源多肽的核苷酸序列的3’末端。可以使用在乳杆菌菌株中具有功能的任何终止子。
控制序列也可以是适合的前导子序列,对突变乳杆菌菌株翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导子序列可操作地连接至编码该异源多肽的核苷酸序列的5’末端。可以使用在突变乳杆菌菌株中具有功能的任何前导子序列。
控制序列也可以是信号肽编码序列,该编码序列编码与多肽氨基末端相连的氨基酸序列,并且指导编码的多肽进入细胞的分泌通路。核苷酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含信号肽编码序列,该信号肽编码序列在翻译读码框中与编码分泌的多肽的编码序列天然连接。可替代地,编码序列的5’端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下,可能需要外源信号肽编码序列。可替代地,外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而,将表达的多肽引入突变乳杆菌菌株的分泌通路(即分泌进入培养基)的任何信号肽编码序列可以用于本发明。
包含核苷酸序列、启动子、以及转录和翻译停止信号的重组表达载体可以用于重组产生感兴趣的多肽。可以将在此描述的不同核酸和控制序列连接起来以产生重组表达载体,该重组表达载体可包括一个或多个(例如两个、若干个)方便的限制位点,来允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可替代地,可以通过将核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入用于表达的适当的表达载体,来表达核苷酸序列。在产生表达载体时,编码序列是位于该载体中,以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起核苷酸序列表达的任何载体(例如,质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于它与有待引入该载体的突变乳杆菌菌株的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体,即,作为一种染色体外实体存在的一种载体,该载体的复制独立于染色体复制,例如一种质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地,该载体可以是这样一种载体,当它被引入突变乳杆菌菌株中时,被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外,可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到突变乳杆菌菌株的基因组中的总DNA)、或转座子。
该载体可以包含一个或多个(例如两个、若干个)选择性标记,这些选择性标记允许容易选择转化的突变乳杆菌菌株。选择性标记是一种基因,该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
用于在突变乳杆菌菌株中使用的选择性标记的实例包括但不局限于来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。
这些载体可以包含允许载体整合到乳杆菌基因组中或者允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个(例如两个、若干个)元件。
对于整合到突变乳杆菌菌株的基因组中,该载体可以依靠编码感兴趣的多肽的多核苷酸的序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地,载体可包含另外的核苷酸序列用于指导通过同源重组在一个或多个染色体中的一个或多个确定位置整合进入突变乳杆菌菌株基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性,整合元件应优选包含足够数目的核酸,例如如100-1,500碱基对、优选400-1,500碱基对和最优选800-1,500碱基对,其与相应的靶序列具有高的一致性程度以增强同源重组的概率。这些整合元件可以是与突变乳杆菌菌株的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面,该载体可以通过非同源重组整合到突变乳杆菌菌株的基因组中。
对于自主复制,载体可以进一步包含使该载体能够在突变乳杆菌菌株中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在此定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。在突变乳杆菌菌株中有用的细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于连接在此描述的元件来构建重组表达载体的程序是本领域普通技术人员熟知的(参见例如J.Sambrook(萨姆布鲁克),E.F.Fritsch(弗里奇),和T.Maniatus(曼尼亚特斯),1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,冷泉港,纽约)。
该DNA还可以是控制序列,例如启动子,用于操作感兴趣的基因的表达。以上描述了控制序列的非限制性实例。
该DNA可以进一步是用于在乳杆菌细胞中灭活感兴趣的基因的核酸构建体。
该DNA不局限于以上披露的特定实例的范围,因为这些实例旨在作为本发明若干方面的说明。
可以使用本领域已知的技术,例如,如在以下实例部分中描述的电穿孔,进行该DNA进入突变乳杆菌菌株的转化。
可以使用本领域熟知的标准技术,这些技术包括但不局限于划线平板分离、在富集培养基或选择培养基中生长、温度生长选择、过滤、或单细胞分离技术(例如流式细胞术和微流体技术),来分离在此描述的转化体。
在此描述的乳杆菌突变体的一些方面中,在转化后修复了对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏。I型限制修饰系统亚基基因的修复使对于识别和降解会是例如细胞稳定性的有害物的外源DNA而言是重要的天然保护系统得到恢复。如在此使用,“修复对I型限制修饰系统亚基基因的破坏”是指增加破坏的基因的表达,和/或增加由这一破坏的基因编码的多肽的活性。可以使用本领域已知的技术,连同在此描述的那些,例如用于直接修饰破坏的基因的技术(例如将破坏的基因反转回它的原生基因序列),和/或用于将功能基因转化进入乳杆菌宿主的技术(例如宿主基因组中在不同基因座的基因的整合),进行由该基因编码的多肽的增加的基因表达和增加的活性。因此,在一个方面,获得在此描述的乳杆菌转化体的方法进一步包括修复对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏。
产生多肽和发酵产物的方法
多肽
如以上提到,在此描述的乳杆菌突变体可以增加在产生乳杆菌转化体方面的效率,这些乳杆菌转化体例如在产生具有生物活性的多肽方面是有用的。因此,在一个方面,产生具有生物活性的多肽的方法包括:(a)在有助于产生该多肽的条件下,培养用编码该多肽的异源多核苷酸转化的乳杆菌宿主细胞,其中该乳杆菌宿主细胞是在此描述的乳杆菌突变体(例如包含对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏的乳杆菌突变体);以及(b)回收该多肽。
在另一方面,描述的是产生多肽的方法,该方法包括:(a)培养在此描述的乳杆菌转化体(例如用编码该多肽的异源多核苷酸转化的在此描述的乳杆菌突变体);以及(b)回收该多肽。
这些感受态乳杆菌宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如,可以通过摇瓶培养,在实验室或工业发酵罐中于适合的培养基中并且在允许感兴趣的多肽表达和/或分离的条件下进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序,在一种适合营养培养基中发生,该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合培养基是自商业供应商可获得的,或可以根据公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。感兴趣的分泌物质,例如多肽或发酵产物,可以直接回收自培养基。
可以使用本领域已知的、对于该物质是特异性的方法来检测具有生物活性的多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如,酶试验可用来确定具有酶活性的多肽的活性。确定酶活性的方法在本领域中对许多酶都是已知的(参见,例如,D.Schomburg(施姆堡)和M.Salzmann(萨尔兹曼;)(编辑),Enzyme Handbook(酶手册),Springer Verlag(施普林格出版公司),纽约,1990)。
可以通过本领域已知的方法分离具有生物活性的生成的多肽。例如,感兴趣的多肽可以用常规程序从培养基中分离,常这些规程序包括但不局限于离心,过滤,提取,喷雾干燥,蒸发,或沉淀。分离的多肽可进一步用本领域已知的多种程序纯化,这些程序包括但不局限于层析(例如离子交换层析,亲和层析,疏水层析,聚焦层析、以及大小排阻层析),电泳程序(例如制备级等点聚焦电泳(IEF)),溶解度差异(例如硫酸按沉淀),或提取(参见例如,Protein Purification(蛋白纯化),J.-C.Janson(詹森)和Lars Ryden(拉尔斯赖登),编辑,VCH Publishers(VCH出版社),纽约,1989)。
发酵产物
在此描述的乳杆菌突变体可以用于代谢工程,例如用于产生发酵产物。增加的突变体的转化效率可以提供超过现存宿主的使用乳杆菌的工具,并且可以允许针对现存的和新的代谢通路的过表达异源基因的迅速筛选。
“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和酒)、乳品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业、烟草工业、和精细化学工业或散装化学工业的发酵过程。
在一个方面,描述的是产生发酵产物的方法,该方法包括:(a)在有助于产生发酵产物的条件下,培养在此描述的乳杆菌转化体(例如用编码发酵通路的一种或多种多肽的一种或多种异源多核苷酸转化的在此描述的乳杆菌突变体);以及(b)回收发酵产物。
乳杆菌转化体可以是用一个或多个异源发酵通路基因转化的在此描述的任何乳杆菌突变体,导致增加产生希望的发酵产物。用于多种希望的发酵产物的发酵的代谢通路基因和相应的工程化转化体是本领域已知的,例如产生异丙醇和正丙醇(WO 2012/058603)、3-羟基丙酸(WO 2005/118719)、苹果酸(WO 2011/028643)、1,4-丁二醇(WO2008/115840)、1,3-丁二醇(WO 2010/127319)、2-丁醇(WO2010/144746)、THF(WO 2010/141920)、己内酰胺(WO 2010129936)、己撑二胺(WO 2010129936)、乙酰丙酸(WO 2010129936)、2/3-羟基异丁酸(WO 2009/135074)、甲基丙烯酸(WO 2009/135074)、己二酸(WO 2009/151728)、丁二烯(WO 2011/140171)、粘康酸盐(酯)(WO2011/017560)和4-羟基丁醛(WO 2011/047101)(这些申请的内容通过引用结合在此)。在此描述的乳杆菌突变体可以提供用来进一步改进以上参考文献中发酵产物生产的工具。
可以在包含任何一种或多种(例如,两种、若干种)糖的可发酵培养基中进行用于产生发酵产物的方法,这些糖是例如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶的低聚糖。在一些情况下,这种发酵培养基源自天然来源,例如甘蔗、淀粉、或纤维素;并且可以来自这种来源的酶水解(糖化作用)的预处理。
除了来自一种或多种(例如,两种、若干种)糖的适当的碳源之外,该可发酵的培养基可以包含本领域普通技术人员已知的其他营养素或刺激物,例如大量营养素(如,氮源)以及微量营养素(如,维生素、矿物盐、以及金属辅因子)。在一些方面中,碳源优先地可以补充有至少一种碳源,例如酵母提取物、N2、蛋白胨(例如,BactoTM蛋白胨)、或大豆蛋白胨(例如,BactoTM大豆蛋白胨)。维生素的非限制性实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、以及维生素E。矿物盐和金属辅因子的实例包括,但不局限于,Na、P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、以及Cu。
典型地将发酵微生物添加至发酵培养基,并且进行发酵,持续约8至约96小时,例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间,例如约32℃或50℃,并且pH为约pH 3至约pH 8,例如pH 4-5、6、或7。
视情况而定,可以在厌氧、基本上厌氧(微好氧)、或好氧条件下进行培养。简言之,厌氧的是指一种缺少氧气的环境,基本上厌氧的(微好氧的)是指一种其中氧气的浓度比空气低的环境,并且好氧是指一种其中氧气浓度大致等于或大于空气的氧气浓度的环境。基本上厌氧条件包括例如使得在培养基中的溶氧浓度保持在小于10%的饱和度的培养、分批发酵或连续发酵。基本上厌氧条件还包括使细胞在维持有小于1%氧气的气氛的密封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静止。例如可以通过向培养物鼓吹N2/CO2混合物或其他一种或多种适合的非氧气体来维持氧气的百分比。在一些实施例中,在厌氧条件或基本上厌氧条件下进行培养。
用于产生发酵产物的方法可以采用任何适合的发酵操作模式。例如,分批模式发酵可以与一个封闭系统一起使用,其中培养基和宿主微生物(在发酵的开始设置的)除了试剂(某些例如用于pH控制、泡沫控制或过程支持所需的其他试剂)之外,没有另外的投入。在此描述的过程还可以在补料分批模式或连续模式中利用。
可以在若干生物反应器构型中实践用于产生发酵产物的方法,这些生物反应器构型例如是搅拌槽、鼓泡塔、气升式反应器以及本领域普通技术人员已知的其他反应器。视情况而定,能以游离细胞培养或固定化细胞培养的方式执行这些方法。可以使用任何用于支持固定化细胞培养的材料,例如藻酸盐、纤维床、或菱形材料,例如温石棉、蒙脱石KSF和蒙脱石K-10。
发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是而不局限于:醇(例如,阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨糖醇、以及木糖醇);烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷);环烷烃(例如,环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷);烯烃(例如,戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯);氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸);气体(例如,甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO));异戊二烯;酮(例如,丙酮);有机酸(例如,乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸);以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白。
在一个方面,发酵产物是一种醇。将理解,术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。醇可以是任何醇,包括而不局限于:丙醇、正丁醇、异丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、阿拉伯糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油(glycerin)、丙三醇(glycerol)、1,3-丙二醇、山梨糖醇、或木糖醇。参见例如,Gong(宫)等人,1999,Ethanol production fromrenewable resources(由可再生资源生产乙醇),in Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology(在生化工程/生物技术进展中),Scheper,T.(斯卡皮尔),编辑,Springer-Verlag(施普林格出版社)柏林海德堡,德国,65:207-241;Silveira(西尔维拉)M.M.,和Jonas(乔纳斯),R.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学与生物技术)2002,59:400-408;Nigam,P.(尼加姆)和Singh,D.(辛格),ProcessBiochemistry(加工生物化学)199530:117-124;Ezeji(埃塞吉)等人,World Journal of Microbiology and Biotechnology(微生物与生物技术世界杂志)200319:595-603。
在一个方面,发酵产物是丙醇,例如异丙醇和/或正丙醇(参见WO 2012/058603,其内容通过引用结合在此)。
在另一方面,发酵产物是一种烷烃。烷烃可以是任何无支链的或支链的烷烃,包括而不局限于:戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。
在另一个方面,发酵产物是一种环烷,例如环戊烷、环己烷、环庚烷、或环辛烷。
在另一方面,发酵产物是一种烯烃。烯烃可以是任何无支链的或支链的烯烃,包括而不局限于:戊烯、己烯、庚烯、或辛烯。
在另一方面,发酵产物是一种氨基酸。氨基酸可以是任何氨基酸,包括而不局限于:天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如Richard,A.(理查德),和Margaritis,A.(马加里蒂斯),Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)2004,87,501-515。
在另一个优选方面,发酵产物是一种气体。气体可以是任何气体,包括而不局限于:甲烷、H2、CO2、或CO。参见例如Kataoka(片冈)等人,Water Science and Technology(水科学和技术)1997,36,41-47;以及Gunaseelan V.N.(古那森兰),Biomass and Bioenergy(生物质和生物能),1997,13,83-114。
在另一方面,发酵产物是异戊二烯。
在另一方面,发酵产物是一种酮。应理解的是,术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在一个方面,该酮是丙酮。
在另一方面,发酵产物是有机酸。有机酸可以是任何有机酸,包括而不局限于:乙酸、醋酮酸(acetonic acid)、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。参见,例如,Chen,R.(陈,R.),和Lee,Y.Y.(李,Y.Y.),Appl.Biochem.Biotechnol.(应用生物化学和生物技术)1997,63-65,435-448。在一些方面,发酵产物是一种氨基酸。氨基酸可以是任何氨基酸,包括而不局限于:天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如Richard,A.(理查德,A.),和Margaritis,A.(马加里蒂斯,A.),Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)2004,87,501-515。
在另一方面,发酵产物是聚酮化合物。
可以使用本领域已知的方法,如以上描述对多肽进行的描述,进行用来测试发酵产物的产生的适合试验。例如,可以通过多种方法(例如HPLC(高效液相层析法)、GC-MS(气相层析-质谱法)和LC-MS(液相层析-质谱法))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对发酵产物(以及其他有机化合物,例如副产物)进行分析。还可以用培养上清液测试发酵液中的发酵产物的释放。可以使用例如针对葡萄糖和醇类的折光率检测器、以及针对有机酸的UV检测器通过HPLC(Lin(林)等人,Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)2005,90,(775-779))、或使用本领域熟知的其他适合的试验和检测方法量化在发酵培养基中的副产物和残余的糖(例如,葡萄糖)。
可以使用本领域已知的任何程序从发酵培养基中回收发酵产物,这些程序包括,但不限于层析法(例如,尺寸排阻层析法、吸附层析法、离子交换层析法)、电泳程序、溶解度差异、蒸馏、萃取(例如,液液萃取)、渗透蒸发、萃取过滤、膜过滤、膜分离、反渗透、超滤、或结晶化。
通过说明的方式提供以下实例而不是旨在限制本发明。
实例
用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
宿主菌株
路氏乳杆菌SJ10655(O4ZXV)
描述为路氏乳杆菌DSM20016的菌株获得自一个公共菌株保藏处。这一菌株在MRS培养基中继代培养,并且整分试样被冷冻为SJ10468。将SJ10468接种进MRS培养基,在37℃增殖(不摇动)持续一天,并且涂布在MRS琼脂平板上,以获得单菌落。在37℃生长两天后,在MRS琼脂平板上重新分离单菌落,该平板在37℃孵育持续三天,并且在该平板上刮去细胞生长,并且在该菌株保藏处中被储存为SJ10655(别名:O4ZXV)。
相同的细胞生长用于接种10ml MRS培养基,在37℃,将其孵育(不摇动)持续3天,随后通过离心收获细胞,并且使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国)制备基因组DNA并且发送用于基因组测序。
基因组测序揭示,分离的SJ10655(O4ZXV)具有与JCM1112的基因组(而不是与紧密相关的菌株DSM20016的基因组)基本一致的基因组。JCM1112和DSM20016源自相同的原分离物,路氏乳杆菌F275(Morita(莫里塔)等人DNA research(DNA研究),2008,15,151-161。)
大肠杆菌SJ2(参见Diderichsen(迪德里希森)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1990,172,4315-4321)。
大肠杆菌MG1655(参见Blattner(布拉特纳)等人Science(科学)1997,277,1453-1462)。
大肠杆菌TG1
TG1是常用克隆菌株并且获得自商业供应商;它具有以下基因型:F’[traD36lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+]glnV(supE)thi-1Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-McrB-)thiΔ(lac-proAB)。
培养基
LB平板由以下构成:37g LB琼脂(Sigma公司cat no.L3027),以及至1L的双蒸水。
LBPGS平板由以下构成:37g LB琼脂(Sigma公司cat no.L3027),0.5%淀粉(Merck公司cat.no.101252),0.01M K2PO4,0.4%葡萄糖,以及至1L的双蒸水。
TY肉汁培养基由以下构成:20g胰蛋白胨(Difco公司cat no.211699),5g酵母提取物(Difco公司cat no.212750),7*10-3g氯化亚铁(ferrochloride),1*10-3g氯化锰(II),1.5*10-3g硫酸镁,以及至1L的双蒸水。
基本培养基(MM)由以下构成:20g葡萄糖,1.1g KH2PO4,8.9g K2HPO4;1.0g(NH4)2SO4;0.5g Na-柠檬酸盐;5.0g MgSO4·7H2O;4.8mg MnSO4·H2O;2mg硫胺素;0.4mg/L生物素;0.135g FeCl3·6H2O;10mg ZnCl2·4H2O;10mg CaCl2·6H2O;10mg Na2MoO4·2H2O;9.5mgCuSO4·5H2O;2.5mg H3BO3;以及至1L的双蒸水,用HCl将pH调节至7。
MRS培养基获得自DifcoTM,为DifcoTM乳杆菌MRS琼脂抑或DifcoTM乳杆菌MRS液体培养基,具有以下构成—DifcoTM乳杆菌MRS琼脂:朊蛋白胨No.3(10.0g),牛肉提取物(10.0g),酵母提取物(5.0g),右旋糖(20.0g),聚山梨醇酯80(1.0g),柠檬酸铵(2.0g),乙酸钠(5.0g),硫酸镁(0.1g),硫酸锰(0.05g),磷酸氢二钾(2.0g),琼脂(15.0g)以及至1L的水。DifcoTM乳杆菌MRS液体培养基:由相同成分组成而没有琼脂。
LC(携带乳杆菌的)培养基(LCM)由以下构成:胰蛋白酶(10g),胰蛋白胨(3g),酵母提取物(5g),KH2PO4(3g),吐温80(1ml),乙酸钠(1g),柠檬酸铵(1.5g),半胱氨酸-HCl(Cystein-HCl)(0.2g),MgSO4.7H2O(12mg),FeSO4.7H2O(0.68mg),MnSO4.2H2O(25mg),以及至1L的双蒸水,pH调节至7.0。在高压灭菌后添加无菌葡萄糖至1%(5ml的20%葡萄糖母液/100ml培养基)。
实例1:转化实验方案
乳杆菌菌株
除非另外指明,如制造商所述,使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国),从在TY培养基中生长的、并且补充有适当抗生素的2ml的过夜培养物纯化大肠杆菌中构建的质粒DNA。在50微升的体积中回收质粒DNA,并且一微升的这一质粒制剂用于乳杆菌的电穿孔。
通过电穿孔,将质粒DNA转化进入乳杆菌菌株。用于电穿孔的路氏乳杆菌菌株制备如下:将来自冷冻储用培养物的菌株接种进LCM培养基,并且在37℃,将其孵育(不摇动)过夜。将5ml整分试样移入500ml LCM培养基,并且在37℃,将其孵育(不摇动),直至OD600达到大致0.8。如以上通过离心收获细胞,在室温下,在50ml的离子交换的无菌水中重新悬浮并且洗涤2次,并且通过离心进行收获。最终在2.5ml的30%PEG1500中轻轻重新悬浮这些细胞,并且在醇/干冰浴中将50微升整分试样快速冷冻,并且储存在-80℃直至使用。以下在各自实例中描述了对电穿孔程序的改编。
电穿孔程序A:在冰上解冻冷冻细胞,并且添加在TE缓冲液中的2微升的DNA悬浮液。将40微升的混合物转移至冰冷的2mm电穿孔比色皿,保持在冰上1-3分钟,并且在BioRad Gene PulserTM中进行电穿孔,其中设置为1.5kV;25微法;400欧姆。添加500微升的LCM,并且在涂板前,在37℃,将该混合物孵育(不摇动)持续2小时。在补充有所需抗生素的LCM琼脂平板(用%琼脂固化的LCM培养基)抑或MRS琼脂平板上将细胞涂板,并且在厌氧培养室(Oxoid公司,配备有不产气菌小袋)中孵育。
电穿孔程序B:在冰上解冻冷冻细胞,并且添加在TE缓冲液中的1微升的DNA悬浮液。将40微升的混合物转移至冰冷的1mm电穿孔比色皿,保持在冰上1-3分钟,并且在BioRad Gene PulserTM中进行电穿孔,其中设置为1.2kV;25微法;400欧姆。添加500微升的LCM,并且在37℃将该混合物孵育(不摇动)持续4小时,之后在补充有所需抗生素的MRS琼脂平板上涂板,并且在厌氧培养室中孵育。
大肠杆菌菌株
通过如制造商所述,使用BioRad Gene PulserTM(BioRad公司,Hercules(赫拉克勒斯),加利福尼亚州,美国)的电穿孔,抑或通过使用按本领域普遍知道的普通教科书程序制备的用化学方法的感受态细胞,进行大肠杆菌的转化。
实例2:质粒构建。
pSJ10600
基于质粒pVS2(von Wright(冯赖特)等人,Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)1987,53,1584-1588)和Rud(路德)等人所述的启动子(Rud(路德)等人Microbiology(微生物学)2006,152,1011-1019)构建一组组成型表达载体。由Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)化学合成包含P11启动子(具有选择的侧翼限制位点的)的DNA片段,以及包含P27(具有选择的侧翼限制位点的)的另一片段。
包含具有侧翼限制位点的P11的DNA片段,以及包含具有侧翼限制位点的P27的DNA片段分别示出于SEQ ID NO:506和507中。以DNA制剂的形式获得这两个DNA片段,其中已经将这些片段插入标准Geneart载体,pMA。将包含P11的载体转化进大肠杆菌SJ2细胞,并且将转化体保持为包含质粒pSJ10560的SJ10560。将包含P27的载体转化进大肠杆菌SJ2细胞,并且将转化体保持为包含质粒pSJ10561的SJ10561。
从Geneart载体切下处于176bp HindIII片段形式的含启动子片段,并且连接至HindIII消化的pUC19。从由SJ10560制备的载体切下含P11片段,连接至pUC19,并且将大肠杆菌SJ2的正确转化体保持为分别包含pSJ10585和pSJ10586的SJ10585和SJ10586。从由SJ10561制备的载体切下含P27片段,连接至pUC19,并且将大肠杆菌SJ2的正确转化体保持为分别包含pSJ10587和pSJ10588的SJ10587和SJ10588。
在植物乳杆菌NC8(保持为SJ10491的一个菌株)中获得质粒pVS2,通过本领域已知的质粒制备程序从这一菌株提取,并且转化进大肠杆菌MG1655,在37℃,在LB琼脂平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml)。两个这样的转化体被保持为SJ10583和SJ10584。
为了将P11插入pVS2,通过琼脂糖凝胶电泳,从pSJ10585切下含P11的176bp HindIII片段并且纯化,并且连接至HindIII消化的、已经制备自SJ10583的pVS2。通过电穿孔将连接混合物转化进大肠杆菌MG1655,在LB琼脂平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml),并且将两个转化体(二者都容纳质粒,其中启动子插入物在两个可能的方向中具体的一个中)保持为包含pSJ10600(图4)和pSJ10601的SJ10600和SJ10601。
pSJ10795
在三种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中,将在费氏丙酸杆菌中鉴定的硫解酶基因的1152bp编码序列(不具有终止密码子)针对表达进行优化,并且合成地构建进入pSJ10676。包含密码子优化的CDS的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之前的序列5’-AAGCTTTC-3’(用来添加HindIII位点并且将起始区转化为NcoI相容的BspHI位点)以及紧密地在下游的序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’(SEQ ID NO:459)(用来添加终止密码子、和限制位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。
然后将生成的序列提交至Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)并由该公司进行合成,并且以包含β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体交付。通过电穿孔,将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml),并且两个转化体保持为SJ10676(SJ2/pSJ10676)和SJ10677(SJ2/pSJ10677)。
费氏丙酸杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推断的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:460和461。编码序列是包括终止密码子的1155bp,并且编码的预测蛋白是384个氨基酸。使用信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,1997,Protein Engineering(蛋白质工程),10:1-6),预测在该序列中没有信号肽。基于这一程序,预测的成熟蛋白包含384个氨基酸,具有39.8kDa的预测分子量和6.1的等电pH。
用BspHI和EcoRI消化质粒pSJ10676,并且使用凝胶电泳纯化生成的1.17kb片段。用NcoI和EcoRI消化质粒pSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5.2kb片段。混合、连接纯化的片段,并且将连接混合物转化进TG1电感受态细胞,在37℃,在LB平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml)。通过使用NsiI的限制性分析,分析生成的菌落中的四个并且将它们视为包含希望的重组质粒,并且通过DNA测序进一步证实了这些中的一个,将其保持,由此产生SJ10795(TG1/pSJ10795)。
pSJ10798
设计在丙酮丁醇梭杆菌中鉴定的硫解酶基因的1176 bp编码序列(不具有终止密码子),用于在三种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中优化表达,并且合成地构建进入pSJ10705。包含密码子优化的编码序列的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之前的序列5’-AAGCTTTC-3’(用来添加HindIII位点并且将起始区转化为NcoI相容的BspHI位点)以及紧密地在下游的序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’(SEQ ID NO:459)(用来添加终止密码子、和限制位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。
然后将生成的序列提交至Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)并由该公司进行合成,并且以包含β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体交付。通过电穿孔,将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml),并且两个转化体保持为SJ10705(SJ2/pSJ10705)和SJ10706(SJ2/pSJ10706)。
丙酮丁醇梭杆菌硫解酶基因的野生型核苷酸序列(WT)、密码子优化的核苷酸序列(CO)、和推断的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:462、463、和464。编码序列是包括终止密码子的1179bp,并且编码的预测蛋白是392个氨基酸。使用信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,Protein Engineering(蛋白质工程),1997,10,1-6),预测在该序列中没有信号肽。基于这一程序,预测的成熟蛋白包含392个氨基酸,具有41.4kDa的预测分子量和7.08的等电pH。
用BspHI和EcoRI消化质粒pSJ10705,而用NcoI和EcoRI消化pSJ10600。使用凝胶电泳各自纯化产生的pSJ10705的1193bp片段和pSJ10600的5147bp片段,并且随后如在此概述的进行连接。
通过电穿孔,将连接混合物的整分试样用于转化大肠杆菌TG1,并且在LB平板上,用200微克/ml红毒素选择转化体。通过使用NsiI的限制性分析连同DNA测序,分析了4个菌落中3个,并且将它们视为包含希望的重组质粒,并且将这些中的两个保持,由此产生SJ10798(TG1/pSJ10798)和SJ10799(TG1/pSJ10799)。
pSJ10743
在三种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中,将在短乳杆菌中鉴定的硫解酶基因的1167bp编码序列(不具有终止密码子)优化表达,并且合成地构建进入pSJ10699。包含密码子优化的CDS的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之前的序列5’-AAGCTTCC-3’(用来添加HindIII位点并且将起始区转化为NcoI位点)以及紧密地在下游的序列5’-TAGTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC-3’(SEQ ID NO:459)(用来添加终止密码子、和限制位点XbaI-XhoI-EcoRI-KpnI)。
然后将生成的序列提交至Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)并由该公司进行合成,并且以包含β-内酰胺酶编码基因blaTEM-1的pMA骨架载体交付。通过电穿孔,将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml),并且两个转化体保持为SJ10699(SJ2/pSJ10699)和SJ10700(SJ2/pSJ10700)。
短乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推断的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:465和466。编码序列是包括终止密码子的1170bp,并且编码的预测蛋白是389个氨基酸。使用信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,1997,同上),预测在该序列中没有信号肽。基于这一程序,预测的成熟蛋白包含389个氨基酸,具有40.4kDa的预测分子量和6.5的等电pH。
用NcoI和EcoRI消化质粒pSJ10699,并且使用凝胶电泳纯化生成的1.18kb片段。用NcoI和EcoRI消化质粒pSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5.2kb片段。混合、连接纯化的片段,并且将连接混合物转化进MG1655电感受态细胞,在37℃,在LB平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml)。通过使用ClaI的限制性分析,分析生成的菌落中的16个并且将两个视为包含希望的重组质粒,并且通过DNA测序进一步证实,将其保持,由此产生SJ10743(TG1/pSJ10743)和SJ10757(TG1/pSJ10757)。
pSJ10796
使用以下示出的引物671826和671827,从SJ10468的染色体DNA扩增来自路氏乳杆菌的1176bp硫解酶编码序列(不具有终止密码子)(同上)。
引物671826:
5’-AGTCAAGCTTCCATGGAGAAGGTTTACATTGTTGC-3’(SEQID NO:467)
引物671827:
5’-ATGCGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGACTAAATTTTCTTAAGCAGAACCG-3’(SEQ ID NO:468)
PCR反应编程为:94℃持续2分钟;并且然后19个循环,每个循环在95℃持续30秒、59℃持续1分钟、以及72℃持续2分钟;然后一个循环,在72℃持续5分钟。用NcoI+EcoRI消化大致1.2kb的PCR扩增的片段,通过琼脂糖凝胶电泳纯化,并且然后连接至质粒pSIP409的琼脂糖凝胶电泳纯化的EcoRI-NcoI载体片段(WO2012/058603)。将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2,选择氨苄青霉素抗性(200微克/ml),并且将通过限制酶切消化和DNA测序视为正确的转化体保持为SJ10694(SJ2/pSJ10694)。
路氏乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推断的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:469和470。编码序列是包括终止密码子的1179bp,并且编码的预测蛋白是392个氨基酸。使用信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,1997,同上),预测在该序列中没有信号肽。基于这一程序,预测的成熟蛋白包含392个氨基酸,具有41.0kDa的预测分子量和5.4的等电pH。
用NcoI和EcoRI消化质粒pSJ10694,并且使用凝胶电泳纯化生成的1.19kb片段。用NcoI和EcoRI消化质粒pSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5.2kb片段。混合、连接纯化的片段,并且将连接混合物转化进TG1电感受态细胞,在37℃,在LB平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml)。通过使用NsiI的限制性分析,分析生成的菌落中的四个并且将它们视为包含希望的重组质粒,并且通过DNA测序进一步证实了这些中的两个,将其保持,由此产生SJ10796(TG1/pSJ10796)和SJ10797(TG1/pSJ10797)。
pSJ10762
在三种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中,将来自发酵乳杆菌的异丙醇脱氢酶(SWISSPROT:B2GDH6)的1068bp CDS(不具有终止密码子)针对表达进行优化,并且合成地构建进入pSJ10703。
包含密码子优化的异丙醇脱氢酶CDS(sadh Lf)的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之前的序列5’-GGTAC CACTATTACA AGGAG ATTTT AGTC-3’(SEQ ID NO:471)(用来添加KpnI位点和乳杆菌RBS)以及紧密地在下游的XmaI和HindIII限制位点。这些构建体获得自Geneart AG公司,并且如前所述进行转化,产生SJ10703(SJ2/pSJ10703)和SJ10704(SJ2/pSJ10704)。
发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因的密码子优化的核苷酸序列(CO)和推断的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:472和473。编码序列是包括终止密码子的1071bp,并且编码的预测蛋白是356个氨基酸。使用信号P(SignalP)程序(Nielsen(尼尔森)等人,1997,同上),预测在该序列中没有信号肽。基于这一程序,预测的成熟蛋白包含356个氨基酸,具有37.9kDa的预测分子量和5.2的等电pH。
用BspHI和XmaI消化质粒pSJ10703,并且使用凝胶电泳纯化生成的1.1kb片段。用XmaI和NcoI消化质粒pSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化生成的5.1kb片段。混合、连接纯化的片段,并且将连接混合物转化进JM103连同TG1电感受态细胞,在37℃,在LB平板上,选择红霉素抗性(200微克/ml)。通过使用ClaI的限制性分析,分析转化体,并且将两个(来自每个宿主菌株中各一个)视为包含希望的重组质粒,并且通过DNA测序证实,将其保持为SJ10762(JM103/pSJ10762)和SJ10765(TG1/pSJ10765)。还证实转化体SJ10766(JM103/pSJ10766)包含发酵乳杆菌异丙醇脱氢酶基因。pSJ10762的质粒图示出于图6。
pSJ11298(热敏载体)
对于整合进入以及随后从乳杆菌染色体切除而有用的热敏载体是基于pG+Host4(Aggligene,法国;参见Biswas(比斯瓦斯)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1993,175,3628-3635)。使用质粒pUC19(Yanisch(雅尼奇)-Perron(佩龙)等人Gene(基因)1985,33,103-119)作为模板,以及以下示出的引物689229和689230,通过PCR扩增,获得在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制起点。
引物689229:
5’-GACTAAGCTTGGGCCCTCCTCGCTCACTGACTCGCT-3’(SEQ ID NO:474)
引物689230:
5’-GACTGAATTCGGGCCCTCATGACCAAAATCCCTTAACG-3’(SEQ ID NO:475)
用EcoRI+HindIII消化通过PCR扩增获得大致0.8kb的DNA片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
用EcoRI+HindIII消化pG+Host4,并且用碱性磷酸酶处理消化的载体。混合、连接片段的和载体DNA,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2感受态细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。包含具有插入pG+Host4骨架的pUC19复制起点的质粒的转化体被保持为SJ11298(SJ2/pSJ11298)。
根据以上描述的程序B,将质粒pSJ11298引入SJ11294突变乳杆菌菌株(参见实例3),并且在补充有红霉素(10微克/ml)的MRS培养基中,在30℃抑或37℃增殖获得的转化体(SJ11487)。过夜孵育后,将400μL的培养物接种进具有10微克/ml红毒素的1.5mL MRS中。在30℃抑或37℃生长3小时后,在0.8mL STE缓冲液(每升包含:26.8ml 25%蔗糖、50ml 1M Tris(pH 7.5)、和2ml 0.5M EDTA)中洗涤细胞,并且使用Qiagen公司spin试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国),提取质粒DNA。
与37℃培养物相比,从30℃培养物获得实质上更多的质粒DNA,证实了在路氏乳杆菌中这一质粒的复制的热敏性质。
pBKQ357
将质粒载体pSIP409(WO 2012/058603)用作模板,用于编码-葡萄糖醛酸酶的报告基因gusA的PCR扩增,使用修饰的随机化引物pr029:5’-CCCAT GTCGA CNNNN NNNNA GTTGT TGACA NNNNNNNNNN NNNNT GRTAW DNTNN NNNTA TAGCG TACTT AGCTGGCC-3’(SEQ ID NO:516)(由Rud(路德)等人描述,(Rud(路德)等人Microbiology(微生物学)2006,152,1011-1019),以及引物665282:5’-GCTAT CAATC AAAGC AAC-3’(SEQ ID NO:517),使用热启动DNA聚合酶(Finnzymes公司,芬兰)。
PCR反应编程为:94℃持续2分钟;并且然后30个循环,每个循环在94℃持续30秒、56℃持续1分钟、以及72℃持续1分钟;然后一个循环,在72℃持续5分钟。这生成编码侧翼是SalI和EcoRI限制位点的启动子和gusA基因的2kb片段。如制造商推荐,使用PCR纯化试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国),纯化PCR产物。然后将纯化的PCR产物用于运行一个另外的PCR循环,用引物665282,如下:94℃持续2:30分钟,56℃持续1分钟,以及72℃持续5分钟。再次如制造商推荐,使用PCR纯化试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国),纯化PCR产物(2kb)。
然后用SalI+EcoRI消化PCR产物,用琼脂糖凝胶电泳进行纯化,并且最终连接至质粒pSIP411的琼脂糖凝胶电泳纯化的SalI-EcoRI载体片段(3.1kb)(WO2012/058603)。将连接混合物用于转化大肠杆菌TG1,选择红霉素抗性(200微克/ml)。
将包含质粒pBKQ357(5.1kb)的大肠杆菌转化体鉴定为具有质粒编码的gusA基因的以下上游序列:5’-GTCGA CCCGG AAGTA GTTGTTGACA CGCAC CTGCT TGTGT GATAA ATTAA ATTTA TAGCGTACTT AGCTG GCC-3’(SEQ ID NO:518)。
pBKQ357的质粒图示出于图9。
pSJ11460
由Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)化学合成质粒pSJ11460,并且该质粒包含编码来自植物乳杆菌的乙酰乙酸脱羧酶的DNA序列。在标准Geneart载体中获得该基因,并且然后将该基因转化进大肠杆菌SJ2电感受态细胞,并且将转化体保持为SJ11460(该质粒表示为pSJ11460)。包含乙酰乙酸脱羧酶基因的合成的NcoI-KpnI片段(标为adc_D13974)具有SEQ ID NO:515中示出的核苷酸序列。
pSJ11464
由Geneart AG公司(Regenburg(雷根堡),德国)化学合成质粒pSJ11464,并且该质粒包含编码来自胃窦乳杆菌的仲醇脱氢酶的DNA序列。在标准Geneart载体中获得该基因,并且然后将该基因转化进大肠杆菌SJ2电感受态细胞,并且将转化体保持为SJ11464(该质粒表示为pSJ11464)。包含该醇脱氢酶基因的合成的KpnI-XmaI片段(标为sadh_D13976)具有SEQ ID NO:514中示出的核苷酸序列。
pTRGU1065
使用以下引物P540和P541,通过PCR扩增pBKQ357的载体骨架。
P540:5’-CAATGATCTAGACTCGAGGA-3’(SEQ ID NO:504)
P541:5’-GACGTACCATGGCTAAAATC-3’(SEQ ID NO:505)
对于该PCR反应,使用热启动DNA聚合酶(Finnzymes公司,芬兰),并且这一扩增反应编程为:30个循环,在98℃持续2分钟;98℃持续20秒,梯度从40℃至60℃持续30秒,72℃持续1分钟30秒;然后一个循环,在72℃持续5分钟。如在琼脂糖凝胶电泳上估计,所有测试的温度,除了47.7℃,导致3.3kb DNA片段的扩增。根据制造商的指示,用PCR纯化试剂盒(Qiagen公司,Hilden(希尔登),德国)纯化生成的PCR产物。
在37℃,分别用限制性内切酶NcoI+XmaI、NcoI+KpnI、和KpnI+XmaI(New England Biolabs公司,Ipswich(伊普斯威奇),马萨诸塞州,美国)将以上PCR产物、pSJ10701(WO2012/058603)、以及pSJ11464(同上)消化过夜。在37℃,用1U小牛肠磷酸酶(CIP)(NewEngland Biolabs公司)将pBKQ357的限制的PCR产物去磷酸化,持续30分钟。所有三种消化物随后经历在0.75%琼脂糖凝胶上的电泳,并且根据制造商的指示,使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)纯化具有大致3.3kb(pBKQ357扩增子)、0.9kb(adc_D72YKT)、以及1.1kb(sadh_D13976)的条带。
在室温下,使用包含10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶(F.Hoffmann-La Roche Ltd公司,巴塞尔,瑞士),将纯化的消化DNA片段以一个三片段连接反应进行连接,过夜。经由42℃热休克持续2分钟,将连接混合物的5μL整分试样转化进化学上的感受态大肠杆菌TG1。在37℃,摇动下恢复3小时后,将细胞在包含200μg/ml红霉素的LB琼脂平板上涂板,并且在37C孵育过夜。将一个菌落,大肠杆菌TRGU1065接种进具有100μg/mL红霉素的液体LB培养基中,并且在37℃孵育固液。使用Spin小量制备试剂盒(Qiagen公司),分离相应质粒pTRGU1065,并且经受DNA测序以证实adc_D72YKT和sadh_D13976被克隆进了载体。将来自液体过夜培养物的包含pTRGU44的大肠杆菌TRGU1065储存在-80℃的30%丙三醇中。pTRGU1065的质粒图示出于图7。
pTRGU1073
以基本上相同的方式,将质粒pTRGU1073构建为pTRGU1065(同上),其中adc_D72YKT被换成adc_D13974。从载体pSJ11460(如以下描述进行合成)克隆dc_D13974。pTRGU1073的质粒图示出于图8。
实例3:具有编码I型限制修饰系统的特异性亚基的破坏的基因(LAR_0818)的乳杆菌突变体的分离
从以下描述的转化实验最初产生包含破坏的特异性亚基的路氏乳杆菌突变体并且进行选择。
使用以上描述的实验方案(程序A),用质粒pSJ10795、pSJ10796、pSJ10798、和pSJ10743转化路氏乳杆菌SJ10655。在具有10微克/ml红霉素的MRS平板上,以及在具有10微克/ml红霉素的LCM平板(具有1%葡萄糖)上进行选择。在37℃,将这些平板厌氧孵育2天,随后对菌落进行计数。结果示于表1中。
表1:
转化的质粒 | 在MRS平板上的菌落数 | 在LCM平板上的菌落数 |
pSJ10795 | 大约200 | 大约200 |
pSJ10798 | 2 | 0 |
pSJ10743 | 大约200 | 大约400 |
pSJ10796 | 大约500 | 大约300 |
将来自MRS平板的每一个的两个菌落接种进具有10微克/ml红霉素的MRS培养基中,并且在37℃培养过夜,用于质粒提取。基于HindIII消化,证实了所有质粒。将具有pSJ10798的两个转化体保持为SJ11177和SJ11178。
将菌株SJ11177接种进MRS培养基并且在37℃孵育过夜。然后将整分试样用于接种补充有以下浓度的新生霉素的MRS培养基:0.06微克/ml、0.125微克/ml、抑或0.25微克/ml,并且在30℃孵育培养物,持续5天,不摇动。已经在所有培养物生长该菌株,并且将来自0.25微克/ml新生霉素培养物的稀释系列在MRS上涂板,以获得单菌落,并且将平板在37℃孵育过夜。孵育后,将平板复制到具有和不具有10微克/ml红霉素的MRS平板上,并且将这些新平板在37℃孵育过夜。基于该复制品,几乎所有菌落表现出红霉素敏感。将四个菌落接种进2ml MRS培养基,在37℃增殖4小时,并且将整分试样用于接种具有10微克/ml红霉素的2ml MRS培养基,并且将所有培养物在37℃孵育过夜。在含红霉素培养物中,观察到没有生长。
在该菌株保藏处,将来自MRS培养基的两个的菌株冷冻为SJ11294和SJ11295。将菌株SJ11294连续单菌落纯化三次,并且将生成的分离物保持为SJ11400。
实例4:乳杆菌突变株SJ11400的基因组分析和编码特异性亚基的破坏的基因(LAR_0818)的鉴定
使用测序试剂盒TruSeq(TM)SBS v5和HiSeq控制软件v.1.4.8,RTA 1.12.4.2以及CASAVA 1.8.2软件(Illumina公司,圣迭戈,加利福尼亚州,美国),使用Illumina Hi-Seq 2000序列分析仪对路氏乳杆菌突变株SJ11400进行测序。获得了35,837,340100bp的配对端读数(插入物大小300bp)的总数。因为发现对细菌基因组的最佳盖度是在400X左右,所以在装配前将读数集调节至9,319,114个读数。用Idba v0.19,将这些读数装配进155个重叠群中的1,909,167bp(Peng(彭)等人,Research in Computational Molecular Biology(计算分子生物学研究)2010,6044,426-440)。用maq软件(版本0.7.1),将误差率估计至每10kb 0.1个误差(http://maq.sourceforge.net)。通过用Maq软件解析作图结果,计算路氏乳杆菌突变株SJ11400的盖度。盖度图揭示,与路氏乳杆菌JCM1112基因组相比,突变体基因组中不存在大的空位。
使用CLC基因组学工作台(http://www.clcbio.com;版本4.8,具有默认设置)进行SNP分析。由于极高的盖度,仅将10%的读数用于SNP分析。在路氏乳杆菌突变株SJ11400和路氏乳杆菌亲本菌株SJ10655二者中的最显著SNP示出在表2。与亲本菌株的SNP分析相比,在基因LAR_0818中报道了突变株的新SNP。C-至-T取代导致在蛋白序列中位置162的终止密码子突变(Gln变成终止)。在图1中示出了野生型蛋白和突变的蛋白的tfastx比对。在JCM1112中,LAR0818蛋白被注释为由SEQ ID NO:1的编码序列编码的、具有SEQ ID NO:2的I型限制修饰系统的特异性亚基。
表2:
通过降低对SNP呼叫的变异频率的和盖度的要求,获得了一个扩展集的SNP。在LAR1344(Phe348Val、His342Gln)和LAR1346(Val320Phe、Gln313His)中发现了最高计分SNP。将LAR1344和1346二者注释为包含类似于LAR0818的特异性结构域的I型限制修饰蛋白。LAR1344和LAR1346的3-撇端具有指示重排可以发生在该区域的配对端读数的低盖度。当来自亲本菌株SJ10655的读数映射至JCM1112,映射模式表现类似,指示亲本菌株SJ10655和突变株SJ11400在这一区域类似,但是不同于JCM1112。通过将来自突变株SJ11400的读数映射至亲本菌株SJ10655中的LAR1344-LAR1346区域,证实了这一点。在这一情况下,存在配对端读数的显著盖度,并且没有SNP被呼叫,证实了在该区域,SJ11400和SJ10655是一致的,但是不同于JCM1112。
为了进一步调研LAR1344-1346区域,使用mummer软件(http://mummer.sourceforge.net;版本3.22),将来自亲本菌株SJ10655的区域比对至JCM1112中的相应区域。相应比对揭示,与JCM1112相比,在亲本菌株SJ10655中,LAR1344和LAR1346已经切换了位置。位于LAR1344和LAR1346之间的编码LAR1345的基因被注释为JCM1112中的位点特异性酪氨酸重组酶XerC。与JCM1112中的相应蛋白(分别是图2和3)相比,亲本菌株SJ10655中的LAR1344和LAR1346蛋白(与相关菌株SJ11400中的LAR1344和LAR1346蛋白是一致的)在C末端略有改变。先前已经做了描述,限制修饰系统连接至重组相关基因,例如整合酶、转化酶和转座酶(Anton(安东)等人Gene(基因)1997,187,19-27;Brassard(布拉萨德)等人Gene(基因)1995,157,69-72)并且在一些情况下,侧翼是同向重复(Lubys(卢比斯)等人Nucleic Acids Res.(核酸研究)1996,24,2760-2766;Gunn(耿)等人Nucleic Acids Res.(核酸研究)1997,25,4147-4152)。一个同向重复(5’-TCACCCTACAAACCTGAATTTG-3’;SEQ ID NO:493)被发现在LAR1344和LAR1346二者的上游,并且另一个同向重复(5’-TTTTGATTTGTCGACTTG-3’;SEQ ID NO:494)在这两个基因的末端。
实例5:具有编码I型限制修饰系统的特异性亚基的破坏的基因(LAR_0818)的乳杆菌突变体的改进的转化效率。
使用SJ10655亲本乳杆菌菌株和SJ11294突变体乳杆菌菌株,进行了初始转化实验。根据以上描述的程序(程序B),各自用pSJ10798或pSJ10762转化SJ10655和SJ11294。使用NanoDrop分光光度计,并且在由制造商(Thermo scientific公司,华盛顿州,美国)提供的软件中进行分析,确定pSJ10762的浓度为0.07 mg/ml。预期这一实例中使用的其他质粒的浓度是在类似水平。将pSJ10762和pSJ10798转化进SJ10655亲本菌株,分别生成100个和60个菌落。然而,对于pSJ10798和pSJ10762,使用SJ11294突变株的转化导致几乎长满的平板。与SJ10655亲本相比,对于pSJ10798和pSJ10762,SJ11294突变株导致转化处于10-100倍更高的频率。
使用SJ10655亲本乳杆菌菌株、SJ11294突变体乳杆菌菌株、以及单菌落纯化的SJ11400突变体乳杆菌菌株,进行随后的转化实验。根据以上描述的程序(程序B),各自用pSJ10762或“空”表达载体质粒pSJ10600转化菌株SJ10655、SJ11294、和SJ11400。对于每个转化,
生成的菌落数示出于表3中。
表3:
如与pSJ10762相比,用pSJ10600进行的亲本乳杆菌菌株SJ10655转化大约100倍更好。然而,突变体乳杆菌菌株SJ11294和SJ11400改进了对pSJ10762的效率,这样使得差异是大约6-10倍。
实例6:另外的乳杆菌限制修饰系统基因靶的鉴定。
基于在实例5中描述的改进的转化效率结果,additional,使用限制性内切酶数据库( http://rebase.neb.com;Roberts(罗伯茨)等人Nucleic Acids Res.(核酸研究)2010,38,D234-D236),鉴定用于改进的转化效率的基因破坏的另外的乳杆菌限制修饰系统靶。在表4中示出了在乳杆菌中,用于假定的I型修饰系统靶的检索结果。
表4:
实例7:具有编码I型限制修饰系统的限制性亚基(LAR_0819)的破坏的基因的乳杆菌突变体的构建
用容纳pJP042的路氏乳杆菌MM4菌株接种包含5μg/ml红霉素的MRS培养基(Pijkeren(皮克伦)和Britton(布里顿)Nuc.Acids Res.(核酸研究)2012,1-13;图5),并且在37C孵育过夜。在包含5μg/ml红霉素的10ml MRS中将该菌株继代培养,至OD600=0.1。在37℃孵育该培养物持续大致4小时,至OD600=0.8,并且在8000x g离心5分钟。弃去上清液,并且在10ml SET缓冲液(0.1M NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-Cl)中再悬浮。在8000x g将该悬浮液离心5分钟并且弃去上清液。然后在1ml裂解缓冲液(6.7%蔗糖、50mM Tris-Cl pH 8、0.1mM EDTA)中再悬浮这些细胞。添加溶菌酶至10mg/ml,并且在37℃孵育该混合物1小时。然后在8000x g,将溶菌产物离心5分钟。按照制造商的指导,使用PureYieldTM小量制备试剂盒(Promega公司,美国),从上清液分离质粒pJP042DNA。
通过在包含5μg/ml红霉素的40ml MRS中继代培养至OD=0.1,从包含5μg/ml红霉素的MRS中的过夜培养物将JCM1112细胞制作为感受态,并且在OD=0.8时收获。将细胞保持在冰上并且小心地用40ml冰冷的洗涤缓冲液(0.5M蔗糖、10%(V/V)丙三醇)洗涤两次,并且在400μl洗涤缓冲液中再悬浮。
将5μl的分离的pJP042(同上)添加至100μl新鲜制备的感受态细胞(同上),并且在BioRad Gene PulserTM中电穿孔,其中设置为2.5kV,25微法和400欧姆。向它添加1ml MRS培养基并且在37℃孵育细胞3小时。在37℃,在包含5μg/ml红霉素的MRS琼脂平板(包含15g/l细菌培养用琼脂的MRS培养基)上将电穿孔的细胞厌氧孵育过夜,用于选择pJP042转化体。使用recT1侧翼的引物,用菌落PCR,检查红霉素抗性菌落是否存在pJP042。在11个转化体中,分离了2个并且证实容纳了pJP042。在-80℃,在10%丙三醇中,将这些菌株中的一个储存为TRGU768。
为了通过重组工程破坏LAR_0819基因,使用PyRec 3.1(获得自Robert(罗伯特)Britton(布里顿),微生物基因组学实验室,密歇根州立大学,密歇根州,美国),设计以下四个寡核苷酸。
o819:5’-tctatttcta cattcggact agtataacta gcacttttgt agaAAGCTtagcctacttca tcaagacatc ttaaagcaat gccctctata-3’(SEQ ID NO:495)
o819_fwd:5’-gaaatactgatgattcgtccgataga-3’(SEQ ID NO:496)
o819_mama:5’-tagtataactagcacttttgtagaaagct-3’(SEQ ID NO:497)
o819_rev:5’-ttataagtagaaaattgggcaaaagcttgt-3’(SEQ ID NO:498)
将这四个寡核苷酸设计进构建体并且筛选具有框内终止密码子和HindIII限制位点的突变体。将序列o819用于核苷酸AAGCT的重组工程和掺入,这些核苷酸在互补方向实现了阅读框中的终止密码子,并且因此导致基因翻译的破坏。寡核苷酸o819_fwd、o819_mama、和o819_rev用于所有筛选的菌落的PCR筛选。575bp的扩增子表明,已经掺入突变,而单个1029bp扩增子表明,o819_mama引物并没有退火,这是由于寡核苷酸和野生型序列之间的错配。
在包含5μg/ml红霉素的40ml MRS培养基中将TRGU768的过夜培养物继代培养,至OD600=0.1。在37℃的大致2小时孵育后,OD600达到大致0.55,并且通过添加诱导肽(8μl;50μg/ml)MAGNSSNFIHKIKQIFTHR(SEQ ID NO:499),诱导recT1表达。在37℃的孵育延长20分钟。然后通过离心和在40ml冰冷的洗涤缓冲液(0.5M蔗糖、10%(v/v)丙三醇)中洗涤这些细胞两次,制备感受态细胞。最终,在800ul洗涤缓冲液中再悬浮这些细胞。对于每次转化,使用100μl的再悬浮细胞。然后如在以上程序A中描述,用5μl o819(20μg/μl),通过电穿孔转化这些细胞。在37℃,在1ml MRS培养基中的2小时孵育之后,在MRS琼脂平板上,将这些细胞厌氧孵育过夜。
使用o819_fwd、o819_mama、和o819_rev,通过PCR分析了96个单个菌落。一个菌落生成如通过琼脂糖凝胶电泳估计的具有正确大小的两个条带。在37℃,将培养物厌氧地涂板在MRS琼脂平板上过夜,以获得单菌落。使用o819_fwd、o819_mama、和o819_rev,用PCR测试了若干个菌落,生成如通过琼脂糖凝胶电泳估计的具有正确大小的两个扩增产物。在-80℃,在10%丙三醇中,将这些菌株中的一个储存为TRGU808。用o819_fwd和o819_rev在TRGU808上获得的PCR扩增产物的HindIII限制酶切消化导致1029bp产物的完全消化,成为575bp区域中的单个条带,证实对于LAR_0819的破坏,已经掺入了正确的突变。
测试TRGU808的红霉素敏感性,并且发现在包含5μg/ml红霉素的MRS培养基中生长过夜,证实了它仍然容纳质粒pJP042。通过首先在不具有红霉素的MRS培养基中将细胞孵育过夜,并且随后将它们涂板到MRS琼脂平板上,并且在37℃孵育过夜,分离红霉素敏感菌落。然后在包含5μg/ml红霉素的MRS琼脂平板上复制这些平板。鉴定了若干菌落对红霉素敏感,表明pJP042已经失去。在-80℃,在10%丙三醇中,将一个这样的菌落储存为TRGU863。
菌株TRGU808包含对编码I型限制修饰系统的限制性结构域(SEQ ID NO:8)的LAR_0819的编码序列(SEQ ID NO:7)的破坏。
实例8:具有编码IV型甲基引导的限制性内切酶的破坏的基因(LAR_0165)的乳杆菌突变体的构建
使用以下四个寡核苷酸,按与如以上对LAR_0819所作描述的类似方式破坏编码LAR_0165的基因。
o165:5’-gaccacgtaa agtttttaca tgacagcaat tcgtgccgta acgGAATTcaaattgtcgat gattggttgt tggttaataa ttgcggacct-3’(SEQ ID NO:500)
o165_fwd:5’-atttgttgtgtggactatgtacgttg-3’(SEQ ID NO:501)
o165_mam:5’-gcaattcgtgccgtaacggaatt-3’(SEQ ID NO:502)
o165_rev:5’-tggttttaatttttccggttgcgtca-3’(SEQ ID NO:503)
使用寡核苷酸o165,如以上描述,将菌株TRGU768(同上)重组。在37℃过夜孵育后,使用寡核苷酸o165_fwd、o165_mama、和o165_rev筛选192个菌落。鉴定了一个菌落,生成具有正确大小的两个条带:568bp和1047bp。在包含5μg/ml红霉素的MRS培养基中将突变体菌落生长过夜,并且在在-80℃,在10%丙三醇中储存为TRGU802。将25μl的过夜培养物涂板至MRS琼脂平板上,以获得单菌落,用于分离突变株的纯基因型。
使用寡核苷酸o165_fwd、o165_mama、o165_rev,通过PCR再分析八个单个菌落。一个菌落,设计的TRGU804具有正确破坏突变体,该正确破坏突变体具有纯基因型,并且在-80℃,在10%丙三醇中储存。1047bp PCR扩增产物的HindIII限制酶切消化证实了正确突变的掺入。
测试TRGU804的红霉素敏感性,并且发现在包含5μg/ml红霉素的MRS培养基中生长过夜,证实了它仍然容纳质粒pJP042。如以上对LAR_0819所作描述,将突变体针对pJP042进行处理,并且在-80℃,在10%丙三醇中,将生成的菌株储存为TRGU867。
菌株TRGU867包含对编码I型限制修饰系统的限制性结构域(SEQ ID NO:20)的LAR_0165的编码序列(SEQ ID NO:19)的破坏。
实例9:具有编码I型限制修饰系统的限制性亚基(LAR_0819)的破坏的基因和编码IV型甲基引导的限制性内切酶(LAR_0165)的破坏的基因的乳杆菌突变体的构建。
在包含5μg/ml红霉素的MRS培养基中将TRGU804(同上)培养过夜。按照实例7中描述的程序,用5μl的寡核苷酸o819(20μg/μl)进行转化。用寡核苷酸o819_fwd、o819_mama、和o819_rev筛选192个生成的菌落,提供了包含如以上描述的具有正确大小的两个带的五个突变株。在MRS培养基上涂板以获得单菌落后,分离纯基因型,通过PCR再分析这些纯基因型,并且用HindIII检查1029 bp PCR扩增产物的完全消化。HindIII消化的扩增子示出这些菌落是纯基因型并且已经掺入了正确突变。一个菌株并不在包含5μg/ml红霉素的MRS中生长过夜,表明质粒pJP042的失去。在-80℃,在10%丙三醇中,将这一菌落储存为TRGU872。
菌株TRGU872包含对编码I型限制修饰系统的限制性结构域(SEQ ID NO:8)的LAR_0819的编码序列(SEQ ID NO:7)的破坏;以及对编码I型限制修饰系统的限制性结构域(SEQ ID NO:20)的LAR_0165的编码序列(SEQ ID NO:19)的破坏。
实例10:具有编码I型限制修饰系统的限制性亚基(LAR_0819)的破坏的基因或编码IV型甲基引导的限制性内切酶(LAR_0165)的破坏的基因的乳杆菌突变体的改进的转化效率。
为了调研对乳杆菌基因LAR_0165、LAR_0819以及这二者的组合的破坏的转化的影响,使用0.4μl和0.3μl之间的质粒DNA溶液(在NanoDrop分光光度计上测量并且在由制造商提供的软件中分析;Thermo scientific公司,华盛顿州,美国),将以上描述的菌株SJ10655、TRGU863、TRGU867和TRGU872用0.5μg电穿孔。使用1 mm电穿孔比色皿,在BioRad Gene PulserTM中,进行电穿孔,其中设置为1.2 kV;25微法;400欧姆。获得的时间常数都在3.8 ms和5.4 ms之间。添加包含2%葡萄糖的400μl LCM培养基,并且在37℃,将细胞孵育(不摇动),持续4小时,之后在包含5μg/ml红霉素的MRS琼脂平板上涂板。对这些转化体进行计数的结果列于表5中。
表5:
菌株 | pSJ10600 | pSJ10762 | pTRGU1065 | pTRGU1073 |
SJ10655 | 1488 | 1 | 2 | 0 |
270 | 0 | 20 | 1 | |
928 | 1 | 9 | 0 | |
614 | 4 | 502 | 95 |
亲本菌株SJ10655可以容易地被空质粒pSJ10600而被其他测试的质粒转化。用pSJ10600观察到突变体TRGU863、TRGU867、和TRGU872示出某些差异,用pSJ10762观察到小的影响,但是对pTRGU1065和pTRGU1073示出大的差异。用质粒pTRGU1065和pTRGU1073容易地转化双突变体,对具有pTGU1073的TRGU863获得仅一个转化体,并且对pTRGU1065,转化体在9个和20个之间。因此,限制修饰系统亚基LAR_0819和LAR_0165的破坏对若干个测试质粒的转化效率具有大的影响。
实例11:经由同源重组,编码I型限制修饰系统的特异性亚基LAR_0818的乳杆菌基因的破坏
LAR_0818破坏载体pSJ11646(和pSJ11670)的构建。
作为用来经由同源重组,破坏编码I型限制修饰系统特异性亚基LAR_0818(SEQ ID NO:2)的路氏乳杆菌基因的工具,将pSJ11298起源的载体构建为包含LAR_0818基因,该基因来从并且包括起始和终止密码子,具有包含用于插入其他DNA的BamHI位点的小的内部删除。具有内部删除的LAR_0818基因的编码序列示出于(SEQ ID NO:488)。
使用来自SJ10655的染色体DNA作为模板,通过PCR扩增获得LAR_0818基因的两个部分,并且引物697361+697362用于上游(5’)部分,并且引物697363+697364用于下游(3’)部分。
引物697361:
5’-GACTGAATTCATGATTTATAAATACTTAGGAGATA-3’(SEQID NO:476)
引物697362:
5’-GACTGGATCCTAAATTAGATACAACTTTATTTTGTAT-3’(SEQ ID NO:477)
引物697363:
5’-GACTGGATCCTAGCTTTGAACAATCAAATAAATGA-3’(SEQID NO:478)
引物697364:
5’-GACTCGGCCGTTAAAAATATTTCTTAAGCAAAGTCT-3’(SEQ ID NO:479)
用EcoRI+BamHI消化使用引物697361+697362获得的大致0.5kb 5’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。用BamHI+EagI消化使用引物697363+697364获得的大致0.63kb 3’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
用EcoRI+EagI消化克隆载体pSJ11298,用碱性磷酸酶处理,与LAR_0818的纯化的5’-和3’-片段混合,连接,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。将容纳通过限制性分析和DNA测序视为正确的质粒的转化体保持为SJ11646(SJ2/pSJ11646)。将在宿主菌株大肠杆菌TG1中获得的另一类似转化体保持为SJ11670(TG1/pSJ11670)。
改进的LAR_0818破坏载体pSJ11700(和pSJ11701)的构建
为了制作更通用的破坏载体/整合载体,将多克隆位点插入分开LAR_08185’和3’片段的BamHI位点。
将多克隆位点从制备自dam-大肠杆菌宿主菌株的质粒pDN3000切下为75bp的BamHI-BclI片段(Diderichsen(迪德里希森)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1990,172,4315-4321),并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将这一片段连接至BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的、通过琼脂糖凝胶电泳纯化的pSJ11646DNA,并且通过电穿孔将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2。将通过限制性分析视为包含正确质粒的两个转化体保持为SJ11700(SJ2/pSJ11700)和SJ11701(SJ2/pSJ11701)。
包含侧翼是抗生素抗性盒的LAR_0818区段的pSJ11749的构建。
为了插入侧翼是解离酶位点的氯霉素抗性基因,通过用BclI+BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3372制备适当的1.2kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图9和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11700DNA片段连接。如以上描述,通过电穿孔,将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2,选择氯霉素抗性((10微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)这二者。将包含通过限制性分析视为正确的质粒的生成的转化体保持为SJ11749(SJ2/pSJ11749)。
通过抗生素抗性盒,路氏乳杆菌0818基因的破坏。
通过电穿孔(程序B)将质粒pSJ11749转化进路氏乳杆菌菌株SJ11400,在30℃,在MRS琼脂平板上厌氧孵育,选择红霉素抗性(10微克/ml)。包含如通过质粒DNA提取和消化证实的希望的质粒的三个转化体被保持为SJ11902、SJ11903、和SJ11904(所有pSJ11749/SJ11400)。
为了分离其中质粒pSJ11749已经整合进染色体的细胞,将菌株SJ11902、-03、和-04的小规模(2ml埃彭道夫(eppendorf)管)液体培养物(具有10微克/ml红霉素的MRS培养基)在30℃增殖过夜。将来自这些培养物的整分试样涂布在具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂平板上,将其在45℃厌氧孵育过夜。因为pSJ11749是基于热敏的pG+host4复制子,所以仅预期在45℃,在选择性平板上从包含染色体整合的质粒的细胞形成菌落(这是指,红霉素抗性基因将作为染色体的一部分而被复制)。在45℃获得单菌落,并且在45℃进一步重新分离。随后将来自在45℃第二次重新分离的单菌落接种进液体MRS培养基(不具有抗生素)中并且在30℃孵育。在对pG+host4复制的许可温度的孵育允许质粒复制从整合的分子开始,刺激重组,并且最终切下染色体整合的分子,并且从细胞失去。如果由同源的相同区段发生整合和切下,则将没有改变发生,并且生成的细胞将对红霉素和氯霉素这二者敏感。如果由同源的两个分开的区段发生整合和切下,则抗生素抗性盒(具有cat)将留在染色体中,并且生成的细胞将对红霉素敏感,但是抗氯霉素。
在30℃过夜孵育后,将来自MRS培养基的整分试样在具有氯霉素(6微克/ml)的MRS上涂板,通过复制涂板到分别具有氯霉素和红霉素(6和10微克/ml)的MRS上测试生成的菌落,重新分离氯霉素抗性的和红霉素敏感的菌落并且测试数次,并且最终,具有希望的氯霉素抗性的并且红霉素敏感的表型的四个菌株被保持为:SJ12025和SJ12026,二者都源自SJ11902,以及SJ12027和SJ12028,二者都源自SJ11904。
这些菌株具有由中心地插入编码序列的cat抗生素抗性盒破坏的染色体LAR_0818编码序列;引入中心地位于LAR_0818中的小删除,这除去了在菌株SJ11400中鉴定的LAR_0818内的突变的位点。
实例12:乳杆菌I型限制修饰系统特异性亚基基因LAR_0818破坏的修复
LAR_0818修复载体的构建
为了能够修复LAR_0818破坏,构建包含整个野生型LAR_0818编码区的热敏载体。
使用引物697361+697364(同上),LAR_0818编码区(SEQ ID NO:1)被包含在获得自SJ10655染色体DNA的PRC片段上。用EcoRI+EagI消化获得的1.13kb PCR片段,并且通过凝胶电泳进行纯化。
将热敏载体pSJ11298(同上)用EcoRI+EagI消化,用碱性磷酸酶处理,并且通过凝胶电泳进行纯化。将纯化的载体与包含LAR_0818编码区的纯化的PRC片段连接,并且将连接混合物转化进大肠杆菌TG1细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。
将通过限制性分析和DNA测序视为包含希望的质粒的两个转化体保持为SJ11668(TG1/pSJ11668)和SJ11669(TG1/pSJ11669)。
将LAR_0818破坏反转回野生型。
通过电穿孔(程序B)将质粒pSJ11668和pSJ11669引入菌株SJ12025和SJ12027,在30℃,在MRS琼脂平板上厌氧孵育,选择红霉素抗性(10微克/ml)。将转化体菌落在具有红霉素的MRS琼脂上涂板,在45℃厌氧孵育两天,在45℃重新分离生成的菌落(两天),并且将来自这些平板的菌落接种进液体MRS培养基并且在30℃孵育。在过夜孵育后,将整分试样涂布在MRS琼脂平板上,连同用于接种新的液体MRS培养基。将平板在37℃孵育,液体培养物在30℃。将这一程序连续重复若干次。通过复制涂板到MRS琼脂、具有氯霉素(6微克/ml)的MRS琼脂、以及具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂上,测试平板上出现的菌落的抗生素抗性表型。最终,从进入菌株SJ12027的pSJ11669的转化体获得了氯霉素敏感的和红霉素敏感的菌株。两个这样的菌株被保持为SJ12099、和SJ12100。
为了证实LAR_0818破坏反转回野生型,使用引物700148和700149,PCR扩增来自菌株SJ11400、SJ12099、和SJ12100的LAR_0818基因座DNA,并且使用相同引物作为测序引物,将扩增的DNA区段测序。
引物700148:
5’-GCGATGGTTAAACAACAAAATG-3’(SEQ ID NO:508)
引物700149:
5’-CCACAATAAATCACCTCTTTCTG-3’(SEQ ID NO:509)
DNA测序证实了中心地在SJ11400中的LAR_0818编码序列内的突变(变为终止密码子),并且证实了LAR_0818编码序列已经恢复回菌株SJ12099和SJ12100中的野生型序列。
从SJ11400内的LAR_0818突变修复回野生型序列而降低的转化
效率。
为了测试修复LAR_0818突变对转化效率的影响,使菌株SJ11400、SJ12099、和SJ12100成为感受态,用于通过电穿孔进行转化,并且用40纳克的每种以下质粒:pVS2(制备自SJ10655,即路氏乳杆菌野生型宿主菌株)、pSJ10600、pSJ10798、和pSJ10762(后三者制备自大肠杆菌宿主菌株)进行转化(电穿孔程序B)。在具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂平板上将转化混合物涂板(每个在两个平板上;分别是50微升和450微升),并且在37℃厌氧孵育两天或3天,之后计数。
在两个分开的实验中,在表6中示出了获得的转化体菌落的总数(顶部数字来自一个实验,底部数字来自分开的实验)。
表6:
实例13:具有经由同源重组破坏的I型限制修饰系统特异性亚基基因LAR_0818的乳杆菌突变体的转化效率
为了将进入菌株SJ12025和SJ12027(二者都具有由中心地插入编码序列的cat抗生素抗性盒破坏的LAR_0818编码序列)的转化与进入菌株SJ12099和SJ12100(包含野生型LAR_0818序列(通过重新引入野生型LAR_0818序列源自SJ12027;同上))的转化进行比较,使菌株SJ12025、SJ12027、SJ12099、和SJ12100成为感受态,用于通过电穿孔进行转化,并且用40纳克的每种以下质粒:pVS2(制备自SJ10655,即路氏乳杆菌野生型宿主菌株)、pSJ10600、pSJ10798、和pSJ10762(后三者制备自大肠杆菌宿主菌株)进行转化(电穿孔程序B)。在具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂平板上将转化混合物涂板(每个在两个平板上;分别是50微升和450微升),并且在37℃厌氧孵育两天或3天,之后计数。
在两个分开的实验中,在表7中示出了获得的转化体菌落的总数(顶部数字来自一个实验,底部数字来自分开的实验)。
表7:
Nd:未进行转化
实验示出,具有进入LAR_0818基因的res-cat-res盒的插入的菌株SJ12027按与pSJ10600大致相同的频率转化有质粒pSJ10798和pSJ10762,即与pSJ10600相比,不具有针对这些质粒的具体限制性屏障,而修复的菌株SJ12099和SJ12100示出用质粒pSJ10798和pSJ10762的强烈降低的转化频率,表明针对SJ12099和SJ12100中的那些质粒的限制性屏障的重新引入。
实例14:用于经由同源重组,破坏编码I型限制修饰系统特异性亚基LAR_1344和LAR_1346的乳杆菌基因的载体的构建
LAR_1344破坏载体pSJ11679(和pSJ11680)的构建。
作为用来经由同源重组,破坏/删除编码I型限制修饰系统的特异性亚基LAR_1344(SEQ ID NO:14)的路氏乳杆菌基因的工具,将pSJ11298起源的载体构建为包含从LAR_1344编码序列上游延伸的并且刚进入它的染色体片段(5’_LAR_1344;SEQ ID NO:489),随后是从LAR_1344编码序列的端部延伸的并且在下游的染色体片段(3’_LAR_1344;SEQ ID NO:490)。
使用来自SJ10655的染色体DNA作为模板,通过PCR扩增获得这两个片段,并且引物697369+697370用于5’片段,并且引物697371+697372用于3’片段。
引物697369:
5’-GACTGAATTCCTTCAAGATAAGAAGAAA-3’(SEQ ID NO:480)
引物697370:
5’-GACTGGATCCGTAGTTAAATATTCATCTTTGG-3’(SEQ IDNO:481)
引物697371:
5’-GACTGGATCCAGCTTAATGCAAGAATATTTTGGG-3’(SEQID NO:482)
引物697372:
5’-GACTCGGCCGTCTGAACTTATGTGGATGAA-3’(SEQ ID NO:483)
用EcoRI+BamHI消化使用引物697369+697370获得的大致0.99kb 5’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。用BamHI+EagI消化使用引物697371+697372获得的大致1.0kb 3’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
用EcoRI+EagI消化克隆载体pSJ11298,用碱性磷酸酶处理,与LAR_1344的纯化的5’-和3’-片段混合,连接,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。将容纳通过限制性分析和DNA测序视为正确的质粒的两个转化体保持为SJ11679(SJ2/pSJ11679)和SJ11680(SJ2/pSJ11680)。
LAR_1344破坏载体pSJ11698(和pSJ11699)的构建。
为了制作更通用的破坏载体/整合载体,将多克隆位点插入分开LAR_13445’和3’片段的BamHI位点。
将多克隆位点切下为来自从dam-大肠杆菌宿主菌株制备的质粒pDN3000的75bp的BamHI-BclI片段(Diderichsen(迪德里希森)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1990,172,4315-4321),并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将这一片段连接至BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的、通过琼脂糖凝胶电泳纯化的pSJ11679DNA,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞。将通过限制性分析视为包含正确质粒的两个转化体保持为SJ11698(SJ2/pSJ11698)和SJ11699(SJ2/pSJ11699)。
将抗生素抗性标记插入LAR_1344破坏载体。
为了进一步改进破坏载体,紧邻5’和3’染色体片段之间的多克隆位点插入抗生素抗性标记。抗生素抗性标记进一步侧翼是来自质粒pAMβ1的针对位点特异性重组酶(解离酶)的识别位点(res),因此允许通过由解离酶介导的位点特异性重组,最终删除该标记(参见WO96/23073)。
为了插入侧翼是解离酶位点的氯霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3372制备适当的1.2kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图9和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11698DNA连接。如以上描述,通过电穿孔,将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2,选择氯霉素抗性(10微克/ml),其中通过复制涂板检查菌落的氯霉素抗性和红霉素抗性这二者。将其中质粒通过限制性分析和DNA测序视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11728(SJ2/pSJ11728)和SJ11729(SJ2/pSJ11729)。
为了插入侧翼是解离酶位点的大观霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3358制备适当的1.5kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图18和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11698DNA连接。将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,同时选择大观霉素抗性(180微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11739(SJ2/pSJ11739)和SJ11740(SJ2/pSJ11740)。
LAR_1346破坏载体pSJ11677(和pSJ11678)的构建。
作为用来经由同源重组,破坏/删除编码I型限制修饰系统的特异性亚基LAR_1346(SEQ ID NO:12)的路氏乳杆菌基因的工具,将pSJ11298起源的载体构建为包含从LAR_1346编码序列上游延伸的并且刚进入它的染色体片段(5’_LAR_1346;SEQ ID NO:491),随后是从LAR_1344编码序列的端部延伸的并且在下游的染色体片段(3’_LAR_1346;SEQ ID NO:492)。
使用来自SJ10655的染色体DNA作为模板,通过PCR扩增获得这两个片段,并且引物697365+697366用于5’片段,并且引物697367+697368用于3’片段。
引物697365:
5’-GACTGAATTCGGAAAATCAGTAATAAAGAATAC-3’(SEQ IDNO:484)
引物697366:
5’-GACTGGATCCATAAAGCCCACTGGACCAG-3’(SEQ ID NO:485)
引物697367:
5’-GACTGGATCCAAACTTTGTTCAACAAGTCGAC-3’(SEQ IDNO:486)
引物697368:
5’-GACTCGGCCGAGGGTATTGATTATCAATAATTCG-3’(SEQ IDNO:487)
用EcoRI+BamHI消化使用引物697365+697366获得的大致1.0kb 5’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。用BamHI+EagI消化使用引物697367+697368获得的大致1.0kb 3’片段,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
用EcoRI+EagI消化克隆载体pSJ11298,用碱性磷酸酶处理,与LAR_1346的纯化的5’-和3’-片段混合,连接,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。将容纳通过限制性分析和DNA测序视为正确的质粒的两个转化体保持为SJ11677(SJ2/pSJ11677)和SJ11678(SJ2/pSJ11678)。
改进的LAR_1346破坏载体pSJ11696(和pSJ11697)的构建。
为了制作更通用的破坏载体/整合载体,将多克隆位点插入分开LAR_13465’和3’片段的BamHI位点。
将多克隆位点切下为来自从dam-大肠杆菌宿主菌株制备的质粒pDN3000的75bp的BamHI-BclI片段(Diderichsen(迪德里希森)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1990,172,4315-4321),并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将这一片段连接至BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的、通过琼脂糖凝胶电泳纯化的pSJ11677DNA,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞。将通过限制性分析视为包含正确质粒的两个转化体保持为SJ11696(SJ2/pSJ11696)和SJ11697(SJ2/pSJ11697)。
将抗生素抗性标记插入LAR 1346破坏载体
为了插入侧翼是解离酶位点的氯霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3372制备适当的1.2kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图9和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11696DNA连接。如以上描述,通过电穿孔,将连接的混合物转化进大肠杆菌SJ2,选择氯霉素抗性(10微克/ml),其中通过复制涂板检查菌落的氯霉素抗性和红霉素抗性这二者。将其中质粒通过限制性分析和DNA测序视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11726(SJ2/pSJ11726)和SJ11727(SJ2/pSJ11727)。
为了插入侧翼是解离酶位点的大观霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3358制备适当的1.5kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图18和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11696DNA连接。将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,同时选择大观霉素抗性((180微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11737(SJ2/pSJ11737)和SJ11738(SJ2/pSJ11738)。
用于LAR_1344和LAR_1346(pSJ11741,pSJ11742)的同时破坏/
删除的载体的构建
作为用来经由同源重组,破坏/删除编码I型限制修饰系统特异性亚基LAR_1344(SEQ ID NO:14)的路氏乳杆菌基因和编码I型限制修饰系统特异性亚基LAR_1346(SEQ ID NO:12)的路氏乳杆菌基因这二者的工具,将pSJ11298起源的载体构建为包含从LAR_1344编码序列上游延伸的并且刚进入它的染色体片段(5’_LAR_1344;SEQ IDNO:489),随后是从LAR_1346编码序列的端部延伸的并且在下游的染色体片段(3’_LAR_1346;SEQ ID NO:492)。
各自用BamHI-KpnI消化质粒pSJ11679和pSJ11677。通过琼脂糖凝胶电泳纯化生成的片段(分别是1.87kb和4.7kb),连接,并且通过电穿孔转化进大肠杆菌SJ2。针对红霉素抗性(200微克/ml)选择转化体,并且将通过限制性分析视为包含正确质粒的两个转化体保持为SJ11741(SJ2/pSJ11741)and SJ11742(SJ2/pSJ11742)。
改进的LAR_1344-1346删除载体pSJ11755(和pSJ11756)的构建
为了制作更通用的破坏载体/整合载体,将多克隆位点插入分开LAR_1344-1346片段的BamHI位点。将多克隆位点切下为来自从dam-大肠杆菌宿主菌SJ11671株制备的质粒pDN3000的75bp的BamHI-BclI片段(Diderichsen(迪德里希森)等人J.Bacteriol.(细菌学杂志)1990,172,4315-4321),并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将这一片段连接至BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的、通过琼脂糖凝胶电泳纯化的pSJ11741DNA,并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2电感受态细胞。将通过限制性分析视为包含正确质粒的两个转化体保持为SJ11755(SJ2/pSJ11755)和SJ11756(SJ2/pSJ11756)。
将抗生素抗性标记插入LAR_1344-1346删除载体
为了插入侧翼是解离酶位点的氯霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3372制备适当的1.2kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图9和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11755DNA连接。通过电穿孔,将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2,同时选择氯霉素抗性(10微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的三个生成的转化体保持为SJ11799(SJ2/pSJ11799)、SJ11800(SJ2/pSJ11800)和SJ11801(SJ2/pSJ11801)。
为了插入侧翼是解离酶位点的大观霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3358制备适当的1.5kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图18和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11755DNA连接。将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2化学上的感受态细胞,同时选择大观霉素抗性(180微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11794(SJ2/pSJ11794)和SJ11795(SJ2/pSJ11795)。
实例15:具有经由同源重组破坏的I型限制修饰系统的特异性亚基LAR_1344或LAR_1344和LAR_1346这二者的路氏乳杆菌菌株的构建
具有破坏的LAR_1344(除了LAR_0818以外)的路氏乳杆菌菌株
SJ11774(和SJ11775)的构建
使用以上描述的实验方案B,通过电穿孔,将质粒pSJ11729(同上)引入菌株SJ11400(同上),选择红霉素抗性(10微克/ml),在37℃,在MRS琼脂平板上厌氧孵育。将获得的11个转化体中的两个在30℃,在具有10微克/ml红霉素的MRS培养基中增殖4天,随后将100微升的整分试样转移至具有6微克/ml氯霉素的1.8ml MRS培养基中,在45℃孵育过夜,并且随后在具有6微克/ml氯霉素的MRS上针对单菌落进行涂板。
将两个这样的菌落接种进MRS培养基并且在30℃孵育过夜,随后将整分试样用于接种新的MRS培养基,在30℃,再次孵育过夜。将这些培养物在具有6微克/ml氯霉素的MRS琼脂平板上针对单菌落进行涂板,平板在45℃孵育过夜,复制涂板至具有6微克/ml氯霉素抑或10微克/ml红霉素的MRS琼脂平板上,将复制平板在37℃孵育过夜,并且分离红霉素敏感的、氯霉素抗性的菌株。PCR扩增证实,ermR基因缺失,并且质粒pSJ11729的res-cat-res区段已经插入路氏乳杆菌SJ11400染色体,替代了在该染色体位置原来存在的LAR_1344基因。两个这样的菌株被保持为SJ11774和SJ11775。
具有破坏的LAR_1344和LAR_1346这二者(除了LAR_0818以
外)的路氏乳杆菌菌株SJ11841、SJ11842、和SJ11844的构建。
使用以上描述的实验方案B,通过电穿孔,将质粒pSJ11794和pSJ11795中的每一个引入菌株SJ11774和SJ11775,选择红霉素抗性(10微克/ml),在30℃,在MRS琼脂平板上厌氧孵育。基本上如前所述,通过质粒整合/切下程序取得转化体(在45℃琼脂平板上,分离红霉素抗性菌落,在无抗生素液体MRS中,在30℃增殖这些菌落,在具有大观霉素(240微克/ml)的MRS琼脂平板上涂板至单菌落,复制涂板至具有大观霉素(240微克/ml)、氯霉素(6微克/ml)、抑或红霉素(10微克/ml)的三组MRS琼脂平板,并且分离大观霉素抗性的、红霉素敏感的并且氯霉素敏感的菌落)。保持三个这样的菌株:
SJ11841,获得自菌株SJ11774中pSJ11794的整合/切下。
SJ11842,获得自菌株SJ11774中pSJ11795的整合/切下。
SJ11844,获得自菌株SJ11775中pSJ11795的整合/切下。
具有属于灭活的三个不同的限制性内切酶系统的基因的路氏乳杆
菌宿主菌株SJ11845和SJ11890的构建。
使用以上描述的实验方案B,通过电穿孔,将设计为部分删除AR_1344和LAR_1346这二者,并且用cat基因替代这些的质粒pSJ11801引入菌株TRGU872(具有已经破坏的LAR_0165和LAR_0819),在30℃,在MRS琼脂平板上厌氧孵育,选择红霉素抗性(10微克/ml)。将四个菌落接种进具有红霉素(10微克/ml)和氯霉素(6微克/ml)的2ml MRS培养基,并且在37℃孵育2天。细胞已经在这些培养基中的两个中生长,并且在具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂平板上涂板至单菌落,在45℃孵育2天,将单菌落接种进无抗生素的2ml MRS,在30℃孵育3天,随后将整分试样在具有氯霉素(6微克/ml)的MRS琼脂平板上涂板,在37℃孵育,并且将通过复制涂板鉴定的红霉素敏感的、氯霉素抗性的菌株保持为SJ11845。
随后使用来自pAMbeta1的解离酶,通过位点特异性删除来除去存在于SJ11845染色体中的cat基因。质粒pSJ3008(AKA pWT)是携带pAMbeta1解离酶基因的pAMbeta1的衍生物(在WO 96/23073中描述,图3和实例6)。这一质粒可以用于表达可以对在质粒pSJ3372上侧翼于cat基因的两个res位点(用于解离酶的识别位点)起作用的解离酶蛋白(参见WO 96/23073,图9和实例),导致来自该构建体的cat基因的位点特异性删除。当pSJ3372用于构建pSJ11801,将片段如此使用,这样使得在插入pSJ11801的cat基因的任一侧上具有功能res位点。因此,cat基因(现在存在于LAR_1344-LAR_1346基因座中的SJ11845的染色体中),侧翼具有功能res位点。
将菌株SJ11845制作为电穿孔感受态的,并且用质粒pSJ3008转化,在30℃,选择红霉素抗性(10微克/ml)。将转化体接种进无抗生素的液体MRS培养基,并且在30℃孵育。生长后,在MRS琼脂平板上将整分试样涂板至单菌落(37℃),连同重新接种至液体MRS培养基,30℃。重复此过程一次。复制涂板用于鉴定红霉素敏感的连同氯霉素敏感的菌落。将具有通过PCR扩增和DNA测序证实的cat基因的希望的删除的一个这样的菌株保持为SJ11890。
实例16:将DNA引入具有经由同源重组破坏的I型限制修饰系统特异性亚基LAR_1344或LAR_1344和LAR_1346这二者的路氏乳杆菌菌株
为了测试灭活LAR_1344对转化效率的影响,使菌株SJ10655、SJ11400、SJ11774、和SJ11775成为感受态,用于通过电穿孔进行转化,并且用40纳克的每种以下质粒:pVS2(制备自SJ10655,即路氏乳杆菌野生型宿主菌株)、pSJ3008(pAMbeta1衍生物,pWT,制备自枯草芽孢杆菌)、pSJ10600、pSJ10798、pSJ10762、pTRGU1065、和pTRGU1073(后五者制备自大肠杆菌宿主菌株)进行转化(电穿孔程序B)。在具有红霉素(10微克/ml)的MRS琼脂平板上将转化混合物涂板(每个在两个平板上;分别是50微升和450微升),并且在37℃厌氧孵育两天或3天,之后计数。所得结果示出于表8。
表8:
当归一化至制备自野生型路氏乳杆菌的pVS2(将制备自SJ10655的pVS2的菌落的计数设置为100)时,获得了相对转化率,如示出于表9。
表9:
这些结果表明,除了已经存在于SJ11400宿主菌株中的LAR_0818突变,LAR_1344突变的引入,或组合的LAR_1344-LAR_1346突变的引入,会对在用某些DNA分子进行转化时的转化频率具有正效应。
实例17:具有限制系统基因的破坏的路氏乳杆菌菌株的转化的另外实例。
实验17.1:
用于以上实例16的质粒制剂也用于转化多个批次的制备自菌株TRGU863、TRGU872、和SJ11845的电穿孔感受态细胞。这些数据呈现于下表10,连同已经呈现于实例16中的菌株SJ10655和SJ11400的数据,用于比较。该表包含进入TRGU867和TRGU872的两个独立的电穿孔的数据。
表10:转化体pr.40纳克质粒DNA(如实例16中描述电穿孔)。
这一实验证实,某些质粒具有进入包含任一LAR_0818突变、LAR_0819突变、或LAR_0165突变的菌株的增加的可转化性,并且当LAR_0819和LAR_0165突变同时存在时,某些质粒具有特别增加的可转化性。
实验17.2:
对于以下实验,制作了质粒DNA的新制品(除了pVS2,其中使用如前的相同批次(40纳克/微升)),并且制备了新的多个批次的电穿孔感受态路氏乳杆菌菌株。结果示于表11中。
表11:转化体pr.1微升质粒DNA(如实例16中描述的电穿孔)。
在这一实验中,与一般获得的相比,前两个批次,SJ10655和SJ11400似乎给出了异常低个数的转化体,并且会是非常差批次的电穿孔感受态细胞。后四个细胞批次,TRGU867、TRGU872、和SJ11800总体上看上去是更好的感受态(如从pSJ10600系可见),并且在此的这些结果表明LAR_0165突变连同LAR_0819突变、以及包含这两个突变的组合的对转化频率的正效应。
实验17.3:
对于以下实验,制备了新的多个批次的电穿孔感受态细胞,而使用的质粒DNA制品与实验18.2中使用的相同。结果示于表12中。
表12:转化体pr.1微升质粒DNA(如实例16中描述的电穿孔):
因此对于表明的质粒,TRGU867(LAR_0165)和SJ11400(LAR_0818)转化优于缺乏破坏的菌株(SJ10655、SJ12099)。另外地,对于表明的质粒,TRGU872(LAR_0165+LAR_0819)和SJ11890(LAR_0165+LAR_0819+LAR_1344-LAR_1346)转化优于缺乏破坏的菌株,并且优于菌株TRGU867和SJ11400。
实例18:用于通过同源重组破坏LAR_0165的质粒的构建。
LAR_0165破坏载体pSJ11897(和pSJ11898)的构建。
作为用来经由同源重组破坏/删除编码IV型限制性内切酶LAR_0165(SEQ ID NO:20)的路氏乳杆菌基因的工具,将pSJ11298起源的载体构建为包含一种染色体片段,延伸510个碱基对,在进入SEQ ID NO:19的LAR_0165编码序列大致100个碱基对开始,随后是一种染色体片段,延伸500个碱基对,离SEQ ID NO:19的LAR_0165编码序列的端部大致70个碱基对终止。将这两个片段侧翼于路氏乳杆菌染色体中LAR_0165编码序列的1.67kb内部区段。
使用来自SJ10655的染色体DNA作为模板,通过PCR扩增获得这两个片段,并且引物P5+P6用于5’片段,并且引物P7+P8用于3’片段。
引物P5:
5’-GACTGAATTCAATCATCGACAATTTGGCAA-3’(SEQ IDNO:510)
引物P6:
5’-GAATGGATCCCGGGCTAGCTAATTTTTCCGGTTGCGTCA-3’(SEQ ID NO:511)
引物P7:
5’-GCTAGCCCGGGATCCATTCGAGCAGGACTAGAAAGTGA-3’(SEQ ID NO:512)
引物P8:
5’-GACTCTAGACGGCCGGCTTTTTTCTTTGGCCCAAC-3’(SEQID NO:513)
获得大致0.5kb的两个片段,混合,用作新的(SOE)PCR反应中的模板,其中引物是P5和P8。获得大致1kb的预期片段,用EcoRI+EagI消化,并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
用EcoRI+EagI消化克隆载体pSJ11698,用碱性磷酸酶处理,与纯化的1kb PCR片段混合,连接,并且将连接混合物转化进大肠杆菌TG1电感受态细胞,选择红霉素抗性(200微克/ml)。将容纳通过限制性分析和DNA测序视为正确的质粒的两个转化体保持为SJ11897(TG1/pSJ11897)和SJ11898(TG1/pSJ11898)。
将抗生素抗性标记插入LAR_0165破坏载体。
为了进一步改进破坏载体,紧邻5’和3’染色体片段之间的克隆位点插入抗生素抗性标记。抗生素抗性标记进一步侧翼是来自质粒pAMβ1的针对位点特异性重组酶(解离酶)的识别位点(res),因此允许通过由解离酶介导的位点特异性重组,最终删除该标记(参见WO96/23073)。
为了插入侧翼是解离酶位点的氯霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3372制备适当的1.2kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图9和实例)。将片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11897DNA连接。通过电穿孔,将连接混合物转化进大肠杆菌TG1,选择氯霉素抗性(10微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11926(TG1/pSJ11926)和SJ11927(TG1/pSJ11927)。
为了插入侧翼是解离酶位点的大观霉素抗性基因,通过用BclI-BamHI消化并且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化从pSJ3358制备适当的1.5kb片段(制备自dam-大肠杆菌宿主;参见WO 96/23073,图18和实例)。将这些片段混合并且与BamHI-消化的、碱性磷酸酶处理的并且琼脂糖凝胶纯化的pSJ11897DNA连接。将连接混合物转化进大肠杆菌TG1电感受态细胞,同时选择大观霉素抗性(180微克/ml)和红霉素抗性(200微克/ml)。将其中质粒通过限制性分析视为正确的两个生成的转化体保持为SJ11905(TG1/pSJ11905)和SJ11906(TG1/pSJ11906)。
虽然出于理解清晰的目的,已经通过说明和举例的方式,在一些细节上描述了以上内容,但是对于本领域普通技术人员而言显然的是,可以实践任何等价的方面或修改。因此,这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。
可以通过以下编号的段落进一步描述本发明:
[1]亲本乳杆菌菌株的一种分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏。
[2]如段落[1]所述的分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统的限制性亚基的内源基因的破坏或对编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因的破坏。
[3]如段落[1]所述的分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统的限制性亚基的内源基因的破坏。
[4]如段落[1]所述的分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因的破坏。
[5]如段落[1]所述的分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统的限制性亚基的内源基因的破坏和对编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因的破坏。
[6]如段落[1]-[5]中任一项所述的分离的突变体,其中(a)该限制性亚基与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15的全长互补链杂交;或(c)编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[7]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[8]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、或其成熟多肽序列或由它们组成。
[9]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列或由它们组成。
[10]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:8或由其组成。
[11]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:8的成熟多肽序列或由其组成。
[12]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:16或其成熟多肽序列或由它们组成。
[13]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:16或由其组成。
[14]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:16的成熟多肽序列或由其组成。
[15]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15的全长互补链杂交。
[16]如段落[1]-[6]中中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或其成熟多肽编解码序列具有至少60%,例如至少65%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸。
[17]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[18]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:7或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[19]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:7或由其组成。
[20]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或由其组成。
[21]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:15或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[22]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:15或由其组成。
[23]如段落[1]-[6]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该限制性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列或由其组成。
[24]如段落[1]-[23]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码一个限制性亚基的基因的编码序列中。
[25]如段落[1]-[23]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码一个限制性亚基的基因的启动子序列中。
[26]如段落[1]-[5]中任一项所述的分离的突变体,其中(a)该特异性亚基与SEQ ID NO:2、4、6、12、14、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、或13的全长互补链杂交;或(c)编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、或13、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[27]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基与SEQ ID NO:2、4、6、12、14、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[28]如段落[1]-[5]或[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:2、4、6、12、14、或其成熟多肽序列或由它们组成。
[29]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列或由它们组成。
[30]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:2或由其组成。
[31]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列或由其组成。
[32]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列或由它们组成。
[33]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:4或由其组成。
[34]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:4的成熟多肽序列或由其组成。
[35]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列或由它们组成。
[36]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:6或由其组成。
[37]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:6的成熟多肽序列或由其组成。
[38]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:12或其成熟多肽序列或由它们组成。
[39]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:12或由其组成。
[40]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:12的成熟多肽序列或由其组成。
[41]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:14或其成熟多肽序列或由它们组成。
[42]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:14或由其组成。
[43]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:14的成熟多肽序列或由其组成。
[44]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、或13的全长互补链杂交。
[45]如段落[1]-[26]中中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括与SEQ ID NO:1、3、5、11、13、或其成熟多肽编解码序列具有至少60%,例如至少65%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸。
[46]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:1、3、5、11、13、或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[47]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[48]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:1或由其组成。
[49]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或由其组成。
[50]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:3或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[51]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:3或由其组成。
[52]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或由其组成。
[53]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:5或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[54]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:5或由其组成。
[55]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或由其组成。
[56]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:11或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[57]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:11或由其组成。
[58]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或由其组成。
[59]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:13或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[60]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:13或由其组成。
[61]如段落[1]-[26]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该特异性亚基的基因的编码序列包括SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或由其组成。
[62]如段落[1]-[61]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码一个特异性亚基的基因的编码序列中。
[63]如段落[1]-[61]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码一个特异性亚基的基因的控制序列中。
[64]如段落[1]-[63]中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体产生至少25%更少(例如至少50%更少、至少60%更少、至少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少)的由破坏的基因编码的I型限制修饰系统亚基。
[65]如段落[1]-[64]中任一项所述的分离的突变体,其中编码I型限制修饰系统亚基的内源基因被灭活。
[66]如段落[1]-[65]中任一项所述的分离的突变体,该突变体进一步包括对编码一个非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
[67]如段落[1]-[66]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白是一个IV型限制修饰系统蛋白。
[68]如段落[66]或[67]中任何一项所述的分离的突变体,其中(a)该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交;或(c)编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[69]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[70]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列或由它们组成。
[71]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20或其成熟多肽序列或由它们组成。
[72]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20或由其组成。
[73]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20的成熟多肽序列或由其组成。
[74]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22或其成熟多肽序列或由它们组成。
[75]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22或由其组成。
[76]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22的成熟多肽序列或由其组成。
[77]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交。
[78]如段落[66]-[68]中中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或其成熟多肽编解码序列具有至少60%,例如至少65%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸。
[79]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[80]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[81]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19或由其组成。
[82]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或由其组成。
[83]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[84]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21或由其组成。
[85]如段落[66]-[68]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或由其组成。
[86]如段落[66]-[85]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列中。
[87]如段落[66]-[85]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的启动子序列中。
[88]如段落[66]-[87]中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体产生至少25%更少(例如至少50%更少、至少60%更少、至少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少)的由破坏的基因编码的非I型限制修饰系统蛋白。
[89]如段落[66]-[88]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的内源基因被灭活。
[90]亲本乳杆菌菌株的一种分离的突变体,该突变体包含对编码一个非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
[91]如段落[90]所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白是一个IV型限制修饰系统蛋白。
[92]如段落[90]或[91]所述的分离的突变体,其中(a)该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交;或(c)编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[93]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[94]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列或由它们组成。
[95]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20或其成熟多肽序列或由它们组成。
[96]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20或由其组成。
[97]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20的成熟多肽序列或由其组成。
[98]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22或其成熟多肽序列或由它们组成。
[99]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22或由其组成。
[100]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:22的成熟多肽序列或由其组成。
[101]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交。
[102]如段落[90]-[92]中中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或其成熟多肽编解码序列具有至少60%,例如至少65%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸。
[103]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[104]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[105]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19或由其组成。
[106]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或由其组成。
[107]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21或其成熟多肽编码序列或由它们组成。
[108]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21或由其组成。
[109]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列包括SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或由其组成。
[110]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列中。
[111]如段落[90]-[92]中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的启动子序列中。
[112]如段落[90]-[111]中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体产生至少25%更少(例如例如至少50%更少、至少60%更少、至少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少)的由破坏的基因编码的非I型限制修饰系统蛋白。
[113]如段落[90]-[112]中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的内源基因被灭活。
[114]如段落[1]-[113]中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体具有改进的转化效率。
[115]如段落[114]所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,使用pSJ10762、pTRGU1065、或pTRGU1073作为转化体DNA,该突变体具有改进的转化效率。
[116]如段落[1]-[115]中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下转化并且培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体能够产生至少10倍(例如至少100倍、至少1000倍、至少10000倍、或至少100000倍)更多的转化体。
[117]如段落[1]-[116]中任一项所述的分离的突变体,其中该乳杆菌菌株选自植物乳杆菌、食果糖乳杆菌、和路氏乳杆菌。
[118]如段落[117]所述的分离的突变体,其中该乳杆菌菌株是路氏乳杆菌菌株。
[119]用于获得如段落[1]-[118]中任一项所述的分离的突变体的一种方法,该方法包括在一个亲本乳杆菌菌株中,破坏编码该I型限制修饰系统亚基或该非I型限制修饰系统蛋白的内源基因。
[120]用于获得如段落[1]-[118]中任一项所述的分离的突变体的一种方法,该方法包括:(a)培养一种亲本乳杆菌菌株;(b)在(a)的亲本乳杆菌菌株中,破坏编码该I型限制修饰系统亚基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因;以及(c)分离生成自(b)的突变体菌株。
[121]用于获得乳杆菌转化体的一种方法,该方法包括将一种异源多核苷酸转化进如段落[1]-[118]中任一项所述的分离的乳杆菌突变体。
[122]用于获得乳杆菌转化体的一种方法,该方法包括:(a)培养如段落[1]-[118]中任一项所述的分离的乳杆菌突变体;(b)将一种异源多核苷酸转化进(a)的乳杆菌突变体;以及(c)分离生成自(b)的转化体菌株。
[123]如段落[121]或[122]所述的方法,该方法进一步包括修复对编码该I型限制修饰系统亚基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
[124]由如段落[121]-[123]中任一项所述的方法产生的一种乳杆菌转化体。
[125]一种产生多肽的方法,该方法包括:(a)培养如段落[124]所述的乳杆菌转化体;其中该异源多核苷酸编码该多肽;以及(b)回收该多肽。
[126]一种产生发酵产物的方法,该方法包括:(a)培养如段落[124]所述的乳杆菌转化体;其中该异源多核苷酸编码该发酵通路的一种多肽并且其中该转化体能够产生该发酵产物;以及(b)回收该发酵产物。
[127]如段落[126]所述的方法,其中该发酵产物是一种醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、类异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[128]如段落[127]中任一项所述的方法,其中该发酵产物是丙醇(例如异丙醇或正丙醇)。
Claims (23)
1.亲本乳杆菌菌株的一种分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏。
2.如权利要求1所述的分离的突变体,该突变体包含对编码I型限制修饰系统的限制性亚基的内源基因的破坏或对编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因的破坏。
3.如权利要求2所述的分离的突变体,其中(a)该限制性亚基与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15的全长互补链杂交;或(c)编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
4.如权利要求2或3所述的分离的突变体,其中该限制性亚基包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、或其成熟多肽序列或由它们组成。
5.如权利要求2所述的分离的突变体,其中(a)该特异性亚基与SEQ ID NO:2、4、6、12、14、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、或13的全长互补链杂交;或(c)编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQ ID NO:1、3、5、11、或13、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
6.如权利要求2或6所述的分离的突变体,其中该特异性亚基包括SEQ ID NO:2、4、6、12、14、或其成熟多肽序列或由它们组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该I型限制修饰系统亚基的基因的编码序列中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体产生至少25%更少(例如至少50%更少、至少60%更少、至少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少)的由破坏的基因编码的I型限制修饰系统亚基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的突变体,其中编码该I型限制修饰系统亚基的内源基因被灭活。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的突变体,该突变体进一步包括对编码一个非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
11.如权利要求10所述的分离的突变体,其中(a)该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性;(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下,编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的全长互补链杂交;或(c)编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、或其成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
12.如权利要求10或11所述的分离的突变体,其中该非I型限制修饰系统蛋白包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、或其成熟多肽序列或由它们组成。
13.如权利要求10-12中任一项所述的分离的突变体,其中破坏发生在编码该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列中。
14.如权利要求10-13中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体产生至少25%更少(例如至少50%更少、至少60%更少、至少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少)的由破坏的基因编码的非I型限制修饰系统蛋白。
15.如权利要求10-14中任一项所述的分离的突变体,其中编码该非I型限制修饰系统蛋白的内源基因被灭活。
16.如权利要求1-15中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体具有改进的转化效率。
17.如权利要求16所述的分离的突变体,其中当在相同条件下培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,使用pSJ10762、pTRGU1065、或pTRGU1073作为转化体DNA,该突变体具有改进的转化效率。
18.如权利要求1-17中任一项所述的分离的突变体,其中当在相同条件下转化并且培养时,与亲本乳杆菌菌株相比,该突变体能够产生至少10倍(例如至少100倍、至少1000倍、至少10000倍、或至少100000倍)更多的转化体。
19.如权利要求1-18中任一项所述的分离的突变体,其中该乳杆菌菌株选自植物乳杆菌、食果糖乳杆菌、和路氏乳杆菌。
20.用于获得如权利要求1-19中任一项所述的分离的突变体的一种方法,该方法包括:(a)培养一种亲本乳杆菌菌株;(b)在(a)的亲本乳杆菌菌株中,破坏编码该I型限制修饰系统亚基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因;以及(c)分离生成自(b)的突变体菌株。
21.用于获得乳杆菌转化体的一种方法,该方法包括:(a)培养如权利要求1-19中任一项所述的分离的乳杆菌突变体;(b)将一种异源多核苷酸转化进(a)的乳杆菌突变体;以及(c)分离生成自(b)的转化体菌株。
22.如权利要求21所述的方法,该方法进一步包括修复对编码该I型限制修饰系统亚基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
23.通过如权利要求21或22所述的方法产生的一种乳杆菌转化体。
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