CN107739734A - 一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体，属于酶工程领域。本发明通过对谷氨酰胺转氨酶进行定点突变，改变谷氨酰胺转氨酶活性位点附近的氨基酸残基，提高谷氨酰胺转氨酶的催化效率，实现了谷氨酰胺转氨酶酶活的进一步提高。本发明构建的酶活提高的重组解脂耶氏酵母，谷氨酰胺转氨酶酶活较出发菌株提高1.45倍，摇瓶发酵的酶活可达16.995U/mL，发酵罐发酵酶活可达59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。
最初TGase来源于豚鼠肝脏，但其来源少，分离纯化工艺复杂，不利于酶的大规模生产。随后，在植物，如豌豆、玉米的种子，一些植物的细胞壁、叶绿体中也发现了TGase，但是上述来源的TGase分离成本高、产量低，所以仅限于基础研究。微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产TGase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-MTG)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性MTG。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。野生菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍在1.0-6.0U/mL，野生菌株产量较低。
近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达MTG成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量较低，如刘松的《Overproduction ofpro-transglutaminase from Streptomyces hygroscopicus in Yarrowia lipolytica andits biochemical characterization》中将吸水链霉菌来源的pro-TGase的突变体N355Q异源表达得到重组菌产量可达35U/mL，重组菌产谷氨酰胺转氨酶的产量有提升较小。因此，如何在食品级表达体系中稳定、高效的表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种谷氨酰胺转氨酶酶活提高的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示谷氨酰胺转氨酶的第300位的氨基酸进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示谷氨酰胺转氨酶的第300位的谷氨酸突变成色氨酸，得到的谷氨酰胺转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。
本发明的第三个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，得到重组质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)用编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2的谷氨酰胺转氨酶的基因作为大引物，以质粒pINA1297/hpro-mTG为模板，扩增全质粒，得到表达载体pINA1297/hpro-E300W。
(3)重组质粒pINA1297/hpro-E300W线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-E300W。
本发明第四个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法的步骤如下：
(1)摇瓶发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。
(2)发酵罐发酵：将重组菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm，当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。
本发明的有益效果：
1.本发明得到了一种谷氨酰胺转氨酶酶活提高的突变体polh/hpro-E300W，摇瓶发酵酶活可达16.995U/mL，发酵罐发酵酶活可达59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。
2.解脂耶氏酵母为食品级表达体系(已被FDA认定是安全的)，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产。易于培养，发酵方法简单，周期短。高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶。本发明采用的po1h系的解脂耶氏酵母已敲除胞外蛋白酶基因，所以胞外几乎无杂蛋白，易于谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。
3.本发明使用的谷氨酰胺转氨酶基因来源于茂源链霉菌，pH适应范围广，稳定性高(pH适应范围为5-9，最适反应pH范围为6-7，最适反应温度为55℃)。
附图说明
图1：基因工程菌发酵mTG酶活
图2：基因工程菌发酵上清SDS-PAGE图
具体实施方式
培养基：
LB培养基：Yeast Extract 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培养基：Yeast Extract 10g/L，Tryptone 20g/L，葡萄糖20g/L。
YNB培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L。
固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。
发酵培养基：甘油15g/L，酵母粉20g/L，氯化铵2.64g/L，磷酸二氢钾0.32g/L，无水硫酸镁0.25g/L，维生素B13.34×10-4g/L，调节pH至8.0。
pro-MTG的体外活化：
取40μL发酵上清，加入2μL中性蛋白酶dispase(0.1mg/mL)，用旋涡振荡仪混匀，37℃保温20min。
谷氨酰胺转氨酶酶活力的测定：
采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶酶活。1个单位的酶活定义为：在37℃的条件下,每分钟催化α-N-CBZ-GLN-GLY合成1μmol的L-谷氨酸-γ-单轻胺酸所用的酶量(U/mL)。酶活测定条件：在37℃条件下，40μL发酵上清液，100μL 30mMα-N-CBZ-GLN-GLY反应10min，加入40μL终止剂(3M HCl，12％三氯乙酸，5％FeCl3)终止反应。在525nm处测定吸光值，通过L-谷氨酸-γ-单轻胺酸绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
酶纯化方法：
发酵液于5000rpm，4℃条件下离心20min，收集上清液。上清液转移至透析袋中，于pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液中低温(4℃)透析12h，然后过0.22μm滤膜，并将样品收集至洁净的试管中。pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液平衡强阳离子交换柱Fractogel EMDSO3 -，进样，之后继续用pH5.0的0.05mol/L醋酸盐缓冲液洗下与柱子结合不牢的杂蛋白，然后用含有0-1.0mol/L NaCl的醋酸盐缓冲液(pH5.0，0.05mol/L)洗脱，在出峰处收集目的蛋白mTG。
实施例1突变位点的确定
运用Discovery Studio2017软件进行虚拟氨基酸突变，确定活性位点中的关键氨基酸，并根据预测结果对影响酶与底物亲和力的位点进行针对性突变，即Y24W、R89W、E300W、Y302R。
实施例2：定点突变表达菌株的构建
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融使用One Step Cloning Kit进行连接后，构建质粒pINA1297/hpro-mTG。
(2)以实验室保留的质粒pET 20b/mpro-mTG为模板，P1和P2，P3和P4，P5和P4，P1和P6为引物进行PCR，通过PCR扩增得到含有Y24W、R89W、E300W、Y302R的突变基因片段。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22μL。PCR条件为：98℃3min，98℃10s，60℃5s，72℃1min，72℃10min，30个循环。两种PCR产物经Dpn I消化后，分别进行胶回收。以质粒pINA297/hpro-MTG为模板，以回收产物为大引物，分别进行大引物PCR获得定点突变的表达载体片段。PCR体系为同上，PCR条件为：98℃3min，98℃10s，55℃15s，72℃6min 20s，72℃20min，30个循环。PCR产物经Dpn I消化后进行胶回收，转化E.coliJM109，菌落PCR筛选阳性转化子。分别挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确即说明基因工程菌pINA1297/Y24W、pINA1297/hpro-R89W，pINA1297/hpro-E300W、pINA1297/Y302R构建成功。将重组质粒pINA1297/Y24W、pINA1297/hpro-R89W，pINA1297/hpro-E300W、pINA1297/Y302R分别经快切酶Not I线性化，胶回收后转化解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-Y24W、po1h/hpro-R89W，po1h/hpro-E300W、po1h/hpro-Y302R。
表1引物
实施例3基因工程菌hpro-Y24W，hpro-R89W，hpro-E300W，hpro-Y302R摇瓶发酵
将实施例1中构建的基因工程菌hpro-Y24W，hpro-R89W，hpro-E300W，hpro-Y302R与前期构建的出发菌株hpro-MTG分别接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，次日按10％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶(规格：250mL)培养120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活分别为0.916U/mL，9.87U/mL，16.995U/mL和0.635U/mL，hpro-MTG酶活为11.7U/mL，即第300位氨基酸的突变较出发菌株产谷氨酰胺转氨酶酶活大大提高。SDS-PAGE的结果显示，基因工程菌hpro-E300W谷氨酰胺转氨酶的表达水平也有增加(图2)。
实施例4基因工程菌hpro-E300W发酵罐发酵
基因工程菌hpro-E300W接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高可达59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。
实施例5酶学性质
对纯化谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质方面的研究，具体见表2。可以看出，hpro-E300W和hpro-R89W的比酶活较出发菌株分别提高了1.31倍和1.17倍，hpro-Y24W和hpro-Y302R的比酶活较出发菌株有所下降。所有突变体的Km值均具有不同程度的上升，说明突变会不同程度的影响酶与底物的亲和力。hpro-E300W的Kcat/Km值有较大的提高，说明该突变基因工程菌使得酶的催化效率提高，hpro-R89W，hpro-Y24W和hpro-Y302R的Kcat/Km值变小，酶的催化效率降低。
表2酶学性质
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
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225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgccgccga gcgtcagtgc gctcttccgg gcccccgact ccgacgacag ggtcacc 57
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgcggtcga agtccgagta accccaggac cagttgcgga acttgctctc 50
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttcgcgtcct tcgacgagga ctggttcaag aacgagctga agaa 44
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggccatgga ggtaccggat cctattacgg ccagccctgc tttacc 46
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgacccgta ccgtccctcg tggggcaggg ccgagacggt cgt 43
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctccgcggt cgaagtccga gcgaccctcg gaccagttgc gga 43
Claims (10)
1.一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶的突变体，其特征在于，为以下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列的第300位的氨基酸进行突变；
(c)将(a)限定的氨基酸序列的第300位的谷氨酸突变成色氨酸，得到谷氨酰胺转氨酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(c)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，所述基因工程菌为表达突变体(a)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-mTG。
6.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为表达突变体(c)的基因工程菌，其构建方法如下：
(1)用编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2的谷氨酰胺转氨酶突变体的基因作为大引物，以谷氨酰胺转氨酶的质粒表达载体pINA1297/hpro-mTG为模板，扩增全质粒，得到表达载体pINA1297/hpro-E300W；
(2)重组质粒pINA1297/hpro-E300W线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得基因工程菌po1h/hpro-E300W。
7.应用权利要求3-6任一所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶突变体的方法，其特征在于，所述方法为：
将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：
发酵罐发酵：将基因工程菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm，当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。
9.根据权利要求7或8所述方法得到的谷氨酰胺转氨酶。
10.权利要求9所述谷氨酰胺转氨酶在医药、化妆品生产以及皮革加工方面的应用。
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