CN112111468A

CN112111468A - 一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112111468A
Application number: CN202011006299.3A
Authority: CN
Inventors: 杨套伟; 饶志明; 刘栓英; 徐美娟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN112111468B

Abstract

本发明公开了一种γ‑谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用，属于基因工程领域；本发明在天然γ‑谷氨酰胺转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ‑谷氨酰胺转肽酶分子结构，本发明所提供的突变体T401P、T422S，其转肽酶活较原始菌株分别提高了32.3％、41.8％；比酶活分别提高了近4.5倍、5.1倍，本发明表明401位点及422位点残基对于GGT催化苦味氨基酸具有重要影响，可用于改善含苦味氨基酸产品的口感与品质，这对于γ‑谷氨酰胺转肽酶在医药和食品行业的应用具有重要意义。

Description

一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT，EC2.3.2.2)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。γ-谷氨酰胺转肽酶可以用于临床诊断、催化合成氨基酸衍生物方面、催化合成药物或药物前体、催化合成茶氨酸、谷胱甘肽等，还可以用于改善某些苦味氨基酸的风味。这对于医学、化工行业以及食品的发展意义重大。

氨基酸通过脱水缩合组成多肽，研究表明多肽在食品中具有呈味的作用，但在起呈味的氨基酸中存在着一类苦味氨基酸，其种类主要包括：芳香族氨基酸(V、F、W)，碱性氨基酸(R、K、H)和支链氨基酸(L、V、I)。随着生活水平不断提高，人们对于食物味道的要求也越来越高，所以苦味氨基酸对于食品等行业的发展是极其不利的。

一种酶活提高的γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其构建方法(申请号：201711324140.4)中提到，通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶的413位点的苏氨酸突变为半胱氨酸，其转肽酶活力较原始菌株仅提高12％；一种转肽活力提高的γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其构建方法(申请号：201810442796.4)中提到，通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶第463位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸，其转肽酶活力较原始菌株仅提高22.6％，因此，目前即使有对γ-谷氨酰胺转肽酶进行改造，其改造后的酶活相较于原始菌株，提高的幅度并不大，并且对于利用以上获得的经改造后的γ-谷氨酰胺转肽酶作为催化剂生产茶氨酸的应用过程中，其转肽效率不高，进而导致副产物积累，产物产率不高等问题；还是不能够满足生产上的需求。

γ-谷氨酰胺转肽酶催化合成γ-谷氨酰肽突出的问题是，因为此酶存在水解反应，造成产物合成产率不高。一般情况下通过优化控制供体和受体之间用量比例、温度以及酶量等条件来优化反应，降低副产物的合成以提高产率，但是产物产率依然不高。如何通过对于γ-谷氨酰胺转肽酶进行理性改造，从而提高其转肽酶活力，从而进一步提高γ-谷氨酰肽的产率，这对于γ-谷氨酰肽的工业化生产以及对于食品、医药行业的发展具有重大意义。

发明内容

本发明首先提供了一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸突变得到的；

或者，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第422位氨基酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸得到的，命名为突变体T401P；

或者，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第422位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸得到的，命名为突变体T422S。

本发明还提供了编码上述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pMA5质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌168。

本发明还提供了一种生成γ-谷氨酰肽的方法，将上述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体添加至含有供体和受体的反应体系中进行反应，得到反应液，从反应液中分离得到γ-谷氨酰肽，所述供体为L-谷氨酰胺，所述受体为L-氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体在反应体系中的加酶量为0.8～1.2U/mL。

在本发明的一种实施方式中，γ-谷氨酰胺转肽酶突变体在反应体系中的加酶量为1U/mL。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中，所述L-谷氨酰胺与L-氨基酸的浓度比为1:1～1:6。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中，所述L-谷氨酰胺与L-氨基酸的浓度比为1:4。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸为：L-精氨酸(L-Arg)、L-色氨酸(L-Trp)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-异亮氨酸(L-IIe)、L-赖氨酸(L-Lys)。

本发明还提供了上述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述宿主细胞，或上述方法在制备γ-谷氨酰肽或者含γ-谷氨酰肽产品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明在天然γ-谷氨酰胺转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ-谷氨酰胺转肽酶分子结构，本发明所提供的突变体T401P、T422S，其转肽酶活较原始菌株分别提高了32.3％、41.8％；比酶活分别提高了近4.5倍、5.1倍。

(2)本发明表明401位点及422位点残基对于GGT催化苦味氨基酸具有重要影响，可用于改善含苦味氨基酸产品的口感与品质，这对于γ-谷氨酰胺转肽酶在医药和食品行业的应用具有重要意义。

附图说明

图1：不同重组菌发酵得到的胞外粗酶液中γ-谷氨酰胺转肽酶的酶活、比酶活。

具体实施方式

下述实施例所涉及的载体pMA5购自生物风公司，B.subtilis 168感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞购自invitrogen公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

发酵培养基：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母提取物20g/L，MgSO₄ 1g/L和K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，添加卡那霉素(50mg/mL)至终浓度为50μg/mL，调节pH为7.2。

LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂20/L。

LB液体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

γ-谷氨酰胺转肽酶酶活、比酶活测定方法：

采用比色法测定，具体方法如下：取培养48h的菌液50mL，于4℃条件下10000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1mL的标准反应体系中包含100mM tris-Hcl(pH 10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-对硝基苯胺一水合物，60mM双甘二肽和5μL适当稀释的酶液。37℃反应15min后添加0.2mL3.5mol的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。

BSA蛋白浓度测定：

普通酶标仪：波长：595nm，T：25℃，(1)将1mg/mL牛血清蛋白进行梯度稀释，分别稀释为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL；(2)取20μL稀释后的牛血清蛋白溶液加入200μL的Bradford充分混合，在595nm处测定吸光值制定标准曲线；(3)加入适当浓度的目的蛋白与200μL的Bradford充分混合，反应5分钟；在595nm测定相应吸光值，利用相应标曲从而计算相应蛋白浓度。

转肽酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内由γ-L-谷氨酰基-对硝基苯胺一水合物经转肽反应生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。

比酶活为每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位是u/mg。

γ-Glu-Arg的含量的检测方法：

采用的是2,4-二硝基氟苯的液相检测方法：样品衍生方法：100μL样品、0.5MpH9.0的NAHCO3和1％的2,4-二硝基氟苯，在60℃避光处理30min，之后在冷水浴10min，加入1mL0.01MpH7.0K2HPO4进行充分混合；以50mMNaCH3COOH(含1％的N,N-二甲基甲酰胺，用CH3COOH调至6.4)为流动相A；以50％的乙腈溶液作为流动相B；流速：1mL/min柱温：40℃；紫外波长：336nm；柱子：C18柱。

实施例1：含γ-谷氨酰胺转肽酶突变体的重组载体的构建

(1)原始质粒的构建：化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的γ-谷氨酰胺转肽酶(ggt)基因，将γ-谷氨酰胺转肽酶(ggt)基因与pMA5质粒分别用BamHI、MluI双酶切，得到酶切产物；将得到的酶切产物纯化后用同源重组连接酶37℃连接1h，得到连接产物；将连接产物化学法转化大肠杆菌JM109感受态细胞；转化液涂布含氨苄霉素(50mg/L)LB液体培养基，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，得到重组质粒，命名为pMA5-ggt。测序工作由上海生工完成。

(2)含T401P突变体的重组质粒获得：以步骤(1)得到的pMA5-ggt为模板，采用以下引物序列进行PCR，按照步骤(1)的方法，即得到含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码突变体T401P的基因的重组质粒：pMA5-T401P。

引物T401P-F：GAGACGACCCATTTTCCTGTTGCAGATCAGTGG(SEQ ID NO.5)

引物T401P-R：CCACTGATCTGCAACAGGAAAATGGGTCGTCTC(SEQ ID NO.6)

含T422S突变体的重组质粒获得：以步骤(1)得到的pMA5-ggt为模板，采用以下引物序列进行PCR，按照步骤(1)的方法，即得到含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码突变体T422S的基因的重组质粒：pMA5-T422S。

引物T422S-F：GAACAATTATTTGGTTCTGGGATTCTTGTTCCA(SEQ ID NO.7)

引物T422S-F：TGGAACAAGAATCCCAGAACCAAATAATTGTTC(SEQ ID NO.8)

含I11L突变体的的重组质粒获得：以步骤(1)得到的pMA5-ggt为模板以下引物序列进行PCR，，按照步骤(1)的方法，即得重组质粒：pMA5-I11L。

引物I11L-F：CTAACTGTTTTGTCCTTATGTCTGTTTGTTTTC(SEQ ID NO.9)

引物I11L-R：GAAAACAAACAGACATAAGGACAAAACAGTTAG(SEQ ID NO.10)

含H135C突变体的重组质粒获得：以步骤(1)得到的pMA5-ggt为模板，以下引物序列进行PCR，按照步骤(1)的方法，即得重组质粒：pMA5-H135C。

引物H135C-F：GCTGAGCGATCTACATGTGGAAATGCGGTAGGT(SEQ ID NO.11)

引物H135C-R：ACCTACCGCATTTCCACATGTAGATCGCTCAGC(SEQ ID NO.12)

含V564L突变体的重组质粒获得：以步骤(1)得到的pMA5-ggt为模板，以下引物序列进行PCR，按照步骤(1)的方法，即得重组质粒：pMA5-V564L。

引物V564L-F：GGGACATTTACTGGACTTGCTGATTCAACGAGA(SEQ ID NO.13)

引物V564L-R：TCTCGTTGAATCAGCAAGTCCAGTAAATGTCCC(SEQ ID NO.14)

实施例2：产γ-谷氨酰胺转肽酶枯草芽孢杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pMA5-ggt；pMA5-T401P；pMA5-T422S；pMA5-I11L；pMA5-H135C；pMA5-V564L化学法转化入B.subtilis 168感受态细胞，得到转化子；取转化子涂布含有卡那霉素(50mg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养12h，挑取阳性转化子验证，验证成功即得到以下重组菌：pMA5-ggt/B.subtilis 168；pMA5-T401P/B.subtilis 168；pMA5-T422S/B.subtilis 168；pMA5-I11L/B.subtilis 168；pMA5-H135C/B.subtilis 168；pMA5-V564L/B.subtilis 168。

实施例3：重组菌γ-谷氨酰胺转肽酶高效表达及酶活测定

将实施例2构建的重组菌pMA5-ggt/B.subtilis 168；pMA5-T401P/B.subtilis168；pMA5-T422S/B.subtilis 168；pMA5-I11L/B.subtilis 168；pMA5-H135C/B.subtilis168；pMA5-V564L/B.subtilis 168的单菌落分别接种于10mL含卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基中，37℃，200rmp，培养10h，得到种子液；将种子液按6％(v/v)的接种量转接于发酵培养基中，37℃培养48h，得到发酵液；取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，即分别得到含野生酶的粗酶液、含突变体T401P的粗酶液、含突变体T422S的粗酶液、含突变体I11L的粗酶液、含突变体H135C的粗酶液、含突变体V564L的粗酶液，用于酶活力的测定，结果如表1所示。

表1不同重组菌发酵得到的胞外粗酶液中γ-谷氨酰胺转肽酶的酶活、比酶活

γ-谷氨酰胺转肽酶	酶活(U/mL)	比酶活(U/mg)
			WT	20.24	3.14
T401P	26.78	14.13
			T422S	28.71	16.01
I11L	10.32	1.21
			H135C	8.98	1.01
V564L	15.33	2.52

结果表明重组菌pMA5-T422S/B.subtilis 168；pMA5-T401P/B.subtilis 168表达的γ-谷氨酰胺转肽酶的转肽酶活为28.71U/mL、26.78U/mL。比对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis 168(20.24U/mL)γ-谷氨酰胺转肽酶酶活提高41.8％、32.3％(见图1)。

重组菌pMA5-T422S/B.subtilis 168；pMA5-T401P/B.subtilis 168表达的γ-谷氨酰胺转肽酶的比酶活为16.01U/mg、14.13U/mg，是对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis 168(比酶活为3.14U/mg)γ-谷氨酰胺转肽酶比酶活的5.1倍、4.5倍。

实施例4：γ-谷氨酰胺转肽酶突变体用于γ-Glu-Arg转化生产

向100mM pH为10的Tris-Hcl缓冲液体系中，分别添加γ-谷氨酰胺转肽酶、供体L-谷氨酰胺和受体L-精氨酸，在反应体系中，底物供体L-谷氨酰胺和受体L-精氨酸的比例为(Gln:Arg＝50mM：200mM)1:4，缓冲液的pH控制为10，温度为37℃，γ-谷氨酰胺转肽酶的加酶量为1U/mL，反应2h后用三氯乙酸终止反应。

通过高效液相色谱，利用C₁₈柱采用2,4二硝基氟苯的检测方法，分别将实施例3得到的γ-谷氨酰胺转肽酶野生酶及突变体T401P、T422S作为催化剂合成γ-Glu-Arg，检测结果显示：

其中，采用T422S作为催化剂，产物γ-Glu-Arg的产量可达50mM，γ-Glu-Arg的产量产量为14.10g/L，产率达到93％；

采用T401P作为催化剂，产物γ-Glu-Arg的产量可达43mM，γ-Glu-Arg产量为12.90g/L，产率为85％；

采用WT作为催化剂，产物γ-Glu-Arg的产量可达21.5mM，γ-Glu-Arg产量为6.52g/L，产率为43％。

实施例5：γ-谷氨酰胺转肽酶突变体用于其他γ-谷氨酰肽转化生产

具体实施方式同实施例4，区别在于：以L-谷氨酰胺为供体，其他六种苦味氨基酸：L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Leu、L-IIe、L-Lys作为受体；

通过高效液相色谱，利用C₁₈柱采用2,4二硝基氟苯的检测方法；结果如表2所示：

表2野生酶以及突变体合成6种γ-谷氨酰肽的比较

由表2可以看出，本发明的突变体对于生成γ-谷氨酰肽的产率均得到了提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用

<130> BAA200899A

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Arg Ile Ser Leu Thr Val Leu Ser Ile Cys Leu Phe Val Phe

1 5 10 15

Ser Phe Phe Leu Pro Val Ser Gln Val Thr Ala Asn Glu Thr His Gly

20 25 30

Asn Lys Val Ala Val Gly Lys Asp Gly Met Val Ala Thr Ala His Pro

35 40 45

Leu Ala Ser Glu Ile Gly Ala Asp Val Leu Lys Lys Gly Gly Asn Ala

50 55 60

Val Asp Ala Ala Val Ala Ile Gln Tyr Ala Leu Asn Val Thr Glu Pro

65 70 75 80

Met Met Ser Gly Ile Gly Gly Gly Gly Phe Met Met Val Tyr Asp Gly

85 90 95

Lys Thr Lys Glu Thr Ser Ile Ile Asn Ser Arg Glu Arg Ala Pro Gln

100 105 110

Gly Ala Thr Pro Asp Met Phe Leu Thr Asp Asp Gly Lys Val Ile Pro

115 120 125

Phe Ala Glu Arg Ser Thr His Gly Asn Ala Val Gly Val Pro Gly Thr

130 135 140

Val Lys Gly Leu Glu Ala Ala Leu Asp Lys Trp Gly Thr Arg Ser Met

145 150 155 160

Lys Glu Leu Ile Glu Pro Ser Ile Gln Leu Ala Glu Asp Gly Phe Glu

165 170 175

Ile Asp Ser Val Leu Ala Lys Ala Ile Asp Asp His Gln Ala Lys Leu

180 185 190

Lys Lys Thr Ala Ala Ala Pro Ile Phe Leu Pro Asn Asp Gln Pro Leu

195 200 205

Glu Glu Gly Asp Leu Leu Val Gln Pro Gly Leu Ala Lys Thr Phe Lys

210 215 220

Leu Ile Ala Lys Lys Gly Ser Lys Ala Phe Tyr Glu Gly Lys Val Ala

225 230 235 240

Lys Ala Leu Ala Asn Thr Val Gln Asp Phe Gly Gly Thr Met Thr Ser

245 250 255

Lys Asp Ile Lys Arg Tyr Glu Val Lys Thr Asp Lys Pro Ile Trp Gly

260 265 270

Asp Tyr Lys Gly Tyr Gln Leu Ala Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Gly

275 280 285

Gly Val Phe Met Leu Gln Ile Leu Lys Ile Leu Asp His Phe Asn Leu

290 295 300

Ser Gln Tyr Asp Pro Lys Ser Phe Glu Lys Tyr Gln Leu Leu Ala Glu

305 310 315 320

Thr Met His Leu Ser Tyr Ala Asp Arg Ala Ala Tyr Ala Gly Asp Pro

325 330 335

Glu Phe Val Asp Val Pro Leu Lys Gly Leu Leu Asp Asp Asp Tyr Ile

340 345 350

Ser Glu Arg Ala Ser Leu Ile Gln Leu Asp Gln Met Asn Arg Ser Pro

355 360 365

Lys Glu Gly Asp Pro Trp Ala Tyr Glu Asp Glu Lys Asn Pro Ser Pro

370 375 380

Ile Val Pro Gln Pro Glu Asp Lys Thr Ile Gly Glu Thr Thr His Phe

385 390 395 400

Thr Val Ala Asp Gln Trp Gly Asn Val Val Ser Phe Thr Thr Thr Ile

405 410 415

Glu Gln Leu Phe Gly Thr Gly Ile Leu Val Pro Glu Tyr Gly Phe Phe

420 425 430

Leu Asn Asn Glu Leu Thr Asp Phe Asp Ala Arg Pro Gly Gly Ala Asn

435 440 445

Glu Val Gln Pro Asn Lys Arg Pro Leu Ser Ser Met Thr Pro Thr Ile

450 455 460

Ile Phe Lys Asp Gly Glu Pro Val Met Thr Val Gly Ser Pro Gly Gly

465 470 475 480

Thr Thr Ile Ile Ala Ser Val Ser Gln Thr Ile Leu Asn Leu Leu Glu

485 490 495

Tyr Asp Met Glu Leu Gln Asp Ala Val Glu Glu Pro Arg Ile Tyr Thr

500 505 510

Asn Ser Leu Thr Ser Tyr Arg Tyr Glu Val Gly Val Pro Leu Asp Val

515 520 525

Arg Thr Lys Leu Asn Asp Met Gly His Gln Phe Gly Ser Ser Pro Ile

530 535 540

Asp Ile Gly Asn Val Gln Ala Leu Leu Ile Asp Arg Lys Ala Gly Thr

545 550 555 560

Phe Thr Gly Val Ala Asp Ser Thr Arg Asn Gly Thr Ala Val Gly Val

565 570 575

Asn Leu Lys Val Ala Ala Asp Gln

580

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaacgca tttctctaac tgttttgtcc atatgtctgt ttgttttctc gttttttctg 60

ccggtcagcc aagtcactgc aaacgaaact catgggaata aagtagctgt tggcaaagat 120

gggatggtgg ctactgcaca tccgcttgca tcggagattg gtgctgacgt attgaaaaaa 180

ggtgggaacg cagtggatgc tgctgttgcc attcagtacg cacttaacgt aacagagcca 240

atgatgtctg gaattggcgg cggcggattt atgatggttt atgatgggaa gacaaaggaa 300

acatccatca tcaatagcag agagcgagca ccacagggcg caacacctga catgttttta 360

acagatgatg gaaaagtgat tccgtttgct gagcgatcta cacatggaaa tgcggtaggt 420

gttccaggga ctgtaaaagg tcttgaagct gcattagata agtggggtac tcgttctatg 480

aaggaattga ttgagccctc cattcaactt gcagaagatg gttttgaaat tgattctgtc 540

ttggcaaaag cgattgatga tcatcaagca aaattgaaaa aaacggccgc agcgccaatt 600

tttcttccaa atgatcagcc gctcgaagaa ggagatctgc ttgtccagcc aggtcttgca 660

aaaacattta aacttattgc gaaaaaagga agcaaagcgt tttatgaagg aaaagtagca 720

aaggcacttg caaatacagt tcaagatttt ggcgggacga tgacttcaaa agatatcaaa 780

cgttatgaag tcaagactga caagccaatc tggggagact ataaaggata tcagcttgca 840

agcatgccac caccaagctc aggcggggtg tttatgctac aaattctcaa aatacttgac 900

cattttaacc tgtctcagta tgaccccaaa tcattcgaaa aatatcagct tcttgctgaa 960

acgatgcacc tctcctatgc tgacagagcc gcatatgccg gcgaccccga attcgtagat 1020

gttccactaa aaggactatt agacgatgat tacatttcag aaagagcctc tctcattcaa 1080

ttagatcaaa tgaatcgcag cccgaaagaa ggagatcctt gggcatatga ggatgaaaaa 1140

aatccatccc caattgttcc tcagccagaa gataaaacca ttggtgagac gacccatttt 1200

actgttgcag atcagtgggg aaatgttgtg tcattcacca ctaccattga acaattattt 1260

ggtacaggga ttcttgttcc agagtatgga tttttcttaa ataatgaact aactgatttt 1320

gatgcacgac ctggcggtgc aaatgaagtc cagccaaata aacgtccatt atcaagtatg 1380

accccgacga tcatttttaa agatggagag cctgtcatga ctgttggatc tcctggtgga 1440

acgacgatca ttgcttctgt ttcacagacg attctcaatt tacttgaata tgacatggag 1500

cttcaggatg cggtagaaga gccaagaatc tacacaaaca gcttaacttc gtatcgttat 1560

gaagtaggtg tccctctaga tgtaagaaca aagttaaatg atatgggtca ccagtttggc 1620

agttcaccta ttgatatagg gaatgtgcaa gctttactga ttgatcgaaa agcagggaca 1680

tttactggag tagctgattc aacgagaaat ggaactgctg ttggtgtcaa tctaaaggta 1740

gctgcagatc aatag 1755

<210> 3

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaacgca tttctctaac tgttttgtcc atatgtctgt ttgttttctc gttttttctg 60

ccggtcagcc aagtcactgc aaacgaaact catgggaata aagtagctgt tggcaaagat 120

gggatggtgg ctactgcaca tccgcttgca tcggagattg gtgctgacgt attgaaaaaa 180

ggtgggaacg cagtggatgc tgctgttgcc attcagtacg cacttaacgt aacagagcca 240

atgatgtctg gaattggcgg cggcggattt atgatggttt atgatgggaa gacaaaggaa 300

acatccatca tcaatagcag agagcgagca ccacagggcg caacacctga catgttttta 360

acagatgatg gaaaagtgat tccgtttgct gagcgatcta cacatggaaa tgcggtaggt 420

gttccaggga ctgtaaaagg tcttgaagct gcattagata agtggggtac tcgttctatg 480

aaggaattga ttgagccctc cattcaactt gcagaagatg gttttgaaat tgattctgtc 540

ttggcaaaag cgattgatga tcatcaagca aaattgaaaa aaacggccgc agcgccaatt 600

tttcttccaa atgatcagcc gctcgaagaa ggagatctgc ttgtccagcc aggtcttgca 660

aaaacattta aacttattgc gaaaaaagga agcaaagcgt tttatgaagg aaaagtagca 720

aaggcacttg caaatacagt tcaagatttt ggcgggacga tgacttcaaa agatatcaaa 780

cgttatgaag tcaagactga caagccaatc tggggagact ataaaggata tcagcttgca 840

agcatgccac caccaagctc aggcggggtg tttatgctac aaattctcaa aatacttgac 900

cattttaacc tgtctcagta tgaccccaaa tcattcgaaa aatatcagct tcttgctgaa 960

acgatgcacc tctcctatgc tgacagagcc gcatatgccg gcgaccccga attcgtagat 1020

gttccactaa aaggactatt agacgatgat tacatttcag aaagagcctc tctcattcaa 1080

ttagatcaaa tgaatcgcag cccgaaagaa ggagatcctt gggcatatga ggatgaaaaa 1140

aatccatccc caattgttcc tcagccagaa gataaaacca ttggtgagac gacccatttt 1200

cctgttgcag atcagtgggg aaatgttgtg tcattcacca ctaccattga acaattattt 1260

ggtacaggga ttcttgttcc agagtatgga tttttcttaa ataatgaact aactgatttt 1320

gatgcacgac ctggcggtgc aaatgaagtc cagccaaata aacgtccatt atcaagtatg 1380

accccgacga tcatttttaa agatggagag cctgtcatga ctgttggatc tcctggtgga 1440

acgacgatca ttgcttctgt ttcacagacg attctcaatt tacttgaata tgacatggag 1500

cttcaggatg cggtagaaga gccaagaatc tacacaaaca gcttaacttc gtatcgttat 1560

gaagtaggtg tccctctaga tgtaagaaca aagttaaatg atatgggtca ccagtttggc 1620

agttcaccta ttgatatagg gaatgtgcaa gctttactga ttgatcgaaa agcagggaca 1680

tttactggag tagctgattc aacgagaaat ggaactgctg ttggtgtcaa tctaaaggta 1740

gctgcagatc aatag 1755

<210> 4

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaacgca tttctctaac tgttttgtcc atatgtctgt ttgttttctc gttttttctg 60

ccggtcagcc aagtcactgc aaacgaaact catgggaata aagtagctgt tggcaaagat 120

gggatggtgg ctactgcaca tccgcttgca tcggagattg gtgctgacgt attgaaaaaa 180

ggtgggaacg cagtggatgc tgctgttgcc attcagtacg cacttaacgt aacagagcca 240

atgatgtctg gaattggcgg cggcggattt atgatggttt atgatgggaa gacaaaggaa 300

acatccatca tcaatagcag agagcgagca ccacagggcg caacacctga catgttttta 360

acagatgatg gaaaagtgat tccgtttgct gagcgatcta cacatggaaa tgcggtaggt 420

gttccaggga ctgtaaaagg tcttgaagct gcattagata agtggggtac tcgttctatg 480

aaggaattga ttgagccctc cattcaactt gcagaagatg gttttgaaat tgattctgtc 540

ttggcaaaag cgattgatga tcatcaagca aaattgaaaa aaacggccgc agcgccaatt 600

tttcttccaa atgatcagcc gctcgaagaa ggagatctgc ttgtccagcc aggtcttgca 660

aaaacattta aacttattgc gaaaaaagga agcaaagcgt tttatgaagg aaaagtagca 720

aaggcacttg caaatacagt tcaagatttt ggcgggacga tgacttcaaa agatatcaaa 780

cgttatgaag tcaagactga caagccaatc tggggagact ataaaggata tcagcttgca 840

agcatgccac caccaagctc aggcggggtg tttatgctac aaattctcaa aatacttgac 900

cattttaacc tgtctcagta tgaccccaaa tcattcgaaa aatatcagct tcttgctgaa 960

acgatgcacc tctcctatgc tgacagagcc gcatatgccg gcgaccccga attcgtagat 1020

gttccactaa aaggactatt agacgatgat tacatttcag aaagagcctc tctcattcaa 1080

ttagatcaaa tgaatcgcag cccgaaagaa ggagatcctt gggcatatga ggatgaaaaa 1140

aatccatccc caattgttcc tcagccagaa gataaaacca ttggtgagac gacccatttt 1200

actgttgcag atcagtgggg aaatgttgtg tcattcacca ctaccattga acaattattt 1260

ggttctggga ttcttgttcc agagtatgga tttttcttaa ataatgaact aactgatttt 1320

gatgcacgac ctggcggtgc aaatgaagtc cagccaaata aacgtccatt atcaagtatg 1380

accccgacga tcatttttaa agatggagag cctgtcatga ctgttggatc tcctggtgga 1440

acgacgatca ttgcttctgt ttcacagacg attctcaatt tacttgaata tgacatggag 1500

cttcaggatg cggtagaaga gccaagaatc tacacaaaca gcttaacttc gtatcgttat 1560

gaagtaggtg tccctctaga tgtaagaaca aagttaaatg atatgggtca ccagtttggc 1620

agttcaccta ttgatatagg gaatgtgcaa gctttactga ttgatcgaaa agcagggaca 1680

tttactggag tagctgattc aacgagaaat ggaactgctg ttggtgtcaa tctaaaggta 1740

gctgcagatc aatag 1755

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagacgaccc attttcctgt tgcagatcag tgg 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccactgatct gcaacaggaa aatgggtcgt ctc 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaacaattat ttggttctgg gattcttgtt cca 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggaacaaga atcccagaac caaataattg ttc 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaactgttt tgtccttatg tctgtttgtt ttc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaaacaaac agacataagg acaaaacagt tag 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctgagcgat ctacatgtgg aaatgcggta ggt 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acctaccgca tttccacatg tagatcgctc agc 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggacattta ctggacttgc tgattcaacg aga 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctcgttgaa tcagcaagtc cagtaaatgt ccc 33

Claims

1.一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，其特征在于，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸突变得到的；

2.如权利要求1所述的一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，其特征在于，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第401位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸得到的；

或者，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-谷氨酰胺转肽酶的第422位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸得到的。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pMA5质粒。

6.携带权利要求3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌。

8.一种生成γ-谷氨酰肽的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的γ-谷氨酰胺转肽酶突变体添加至含有供体和受体的反应体系中进行反应，得到反应液，从反应液中分离得到γ-谷氨酰肽，所述供体为L-谷氨酰胺，所述受体为L-氨基酸。

9.如权利要求8所述的一种生成γ-谷氨酰肽的方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体在反应体系中的加酶量为0.8～1.2U/mL；可选的，反应体系中，所述L-谷氨酰胺与L-氨基酸的浓度比为1:1～1:6。

10.权利要求1或2所述γ-谷氨酰胺转肽酶突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4或5所述的重组质粒，或权利要求6或7所述的宿主细胞，或权利要求8或9所述的方法在制备γ-谷氨酰肽或者含γ-谷氨酰肽产品方面的应用。