CN107828754A - 一种酶活提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法 - Google Patents

一种酶活提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107828754A
CN107828754A CN201711324140.4A CN201711324140A CN107828754A CN 107828754 A CN107828754 A CN 107828754A CN 201711324140 A CN201711324140 A CN 201711324140A CN 107828754 A CN107828754 A CN 107828754A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
seq
sequence
genetic engineering
bacillus subtilis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711324140.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107828754B (zh
Inventor
饶志明
杨套伟
张显
徐美娟
刘会灵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201711324140.4A priority Critical patent/CN107828754B/zh
Publication of CN107828754A publication Critical patent/CN107828754A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107828754B publication Critical patent/CN107828754B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02002—Gamma-glutamyltransferase (2.3.2.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酶活提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，将第413位氨基酸由苏氨酸突变成半胱氨酸。本发明得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，γ‑谷氨酰转肽酶突变体酶的转肽反应活力较突变前提高12％，水解反应活力降低了50％。本发明表明413位氨基酸残基对γ‑谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得的γ‑谷氨酰转肽酶突变体可用于制备L‑茶氨酸。

Description

一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-茶氨酸，是存在于茶类植物中的一种天然氨基酸，决定茶叶的品质和风味，对人体具有多方面的健康功效，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量日益增加。目前，茶氨酸生产的研究主要集中在酶转化法，而其中γ-谷氨酰转肽酶又以其独特的优越性脱颖而出。
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT，EC2.3.2.2)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。当以L-谷氨酰胺为供体，乙胺为受体，γ-谷氨酰转肽酶催化转肽反应时，即可生成L-茶氨酸，该反应过程耗时短，不需要额外添加ATP，具有诸多优势。
γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸突出的问题是，存在水解反应，造成副产物L-谷氨酸的合成。一般情况下通过优化控制供体和受体之间用量比例、调节pH等条件来优化反应，降低副产物的合成，但是副产物L-谷氨酸积累仍然存在。因此，本发明在上述优化的基础上，通过定点突变改造γ-谷氨酰转肽酶，进一步提高其转肽酶活力，降低水解反应，对于提高L-茶氨酸工业化生产效率和产率具有重要意义和应用前景。
发明内容
本发明首先提供了一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体，其氨基酸序列是SEQ IDNO.1所示的序列。
编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
所述突变体是在氨基酸如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将413位氨基酸由苏氨酸突变成半胱氨酸。
本发明还提供了一种表达所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第413位的苏氨酸的密码子突变成了编码半胱氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pMA5。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因T413C。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-T413C，重组质粒化转化B.subtilis 168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-T413C/B.subtilis 168。
本发明在天然γ-谷氨酰转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ-谷氨酰转肽酶分子结构，突变体酶的转肽反应活力较突变前提高12％，水解反应活力降低了50％。本发明表明413位氨基酸残基对γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于制备L-茶氨酸。
具体实施方式
实施例1含γ-谷氨酰转肽酶突变体的重组载体的构建
(1)T413C突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-T413C。测序工作由上海生工完成。
实施例2产γ-谷氨酰转肽酶枯草芽孢杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质γ-谷氨酰转肽酶粒pMA5-T413C化学法转化入B.subtilis 168感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：
Sp-A：(NH4)2SO44，K2HPO428，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO4·7H2O 0.4
100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100Sp I培养基：Sp-A49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培养基：Sp I培养基98％，50mmol/LCaCl21％，250mmol/LMgCl21％。115℃湿热灭菌。
(2)将B.Subtilis 168的单菌落接种至2mL Sp I培养基中(50mL离心管)，37℃、200r/min培养过夜；
(3)取100μL培养液至5mL Sp I培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；
(4)取200μL培养液至2mL Sp II培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-T413C，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pMA5-T413C/B.subtilis 168。
实施例3重组菌pMA5-T413C/B.subtilis 168γ-谷氨酰转肽酶高效表达及酶活测定。
(1)将实施例2构建的重组菌pMA5-T413C/B.subtilis 168与表达未突变的酶的对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis 168分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽抱杆菌发酵培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。
(2)枯草芽抱杆菌发酵培养基：蔗糖25g/L,胰蛋白胨5g/L,玉米浆15g/L,MgSO40.3g和K2HPO4·3H2O 1g/L，添加卡那霉素至终浓度为50μg/ml，调节pH为7.2。
(3)转肽酶活定义为：在37℃反应条件下，每分钟内由γ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺经转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。。
(4)γ-谷氨酰转肽酶酶活测定方法：采用比色法测定，具体方法如下：取培养60h的菌液50mL，于4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1ml的标准反应体系中包含50mM硼酸盐-氢氧化钠(pH 10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺，60mM双甘二肽,750mMNaCl和10μl适当稀释的酶液。37℃反应10min后添加2ml 3.5N的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。
(3)结果表明重组菌pMA5-T413C/B.subtilis 168表达的γ-谷氨酰转肽酶的转肽酶活为16.4U/mL，比对照菌株pMA5-ansz/.subtilis 168(13.6U/mL)γ-谷氨酰转肽酶转肽酶活提高12％。
实施例4：γ-谷氨酰转肽酶突变体用于茶氨酸生物转化生产
以L-谷氨酰胺为供体，乙胺作为受体，缓冲液pH 4-12，添加适量的γ-谷氨酰转肽酶，反应温度25-65℃，最后用三氯乙酸终止反应。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工突变体
<400> 1
1 MetLysArgIleSerLeuThrValLeuSerIleCysLeuPheValPheSerPhePheLeu
21 ProValSerGlnValThrAlaAsnGluThrHisGlyAsnLysValAlaValGlyLysAsp
41 GlyMetValAlaThrAlaHisProLeuAlaSerGluIleGlyAlaAspValLeuLysLys
61 GlyGlyAsnAlaValAspAlaAlaValAlaIleGlnTyrAlaLeuAsnValThrGluPro
81 METMETSerGlyIleGlyGlyGlyGlyPheMETMETValTyrAspGlyLysThrLysGlu
101 ThrSerIleIleAsnSerArgGluArgAlaProGlnGlyAlaThrProAspMETPheLeu
121 ThrAspAspGlyLysValIleProPheAlaGluArgSerThrHisGlyAsnAlaValGly
141 ValProGlyThrValLysGlyLeuGluAlaAlaLeuAspLysTrpGlyThrArgSerMET
161 LysGluLeuIleGluProSerIleGlnLeuAlaGluAspGlyPheGluIleAspSerVal
181 LeuAlaLysAlaIleAspAspHisGlnAlaLysLeuLysLysThrAlaAlaAlaProIle
201 PheLeuProAsnAspGlnProLeuGluGluGlyAspLeuLeuValGlnProGlyLeuAla
221 LysThrPheLysLeuIleAlaLysLysGlySerLysAlaPheTyrGluGlyLysValAla
241 LysAlaLeuAlaAsnThrValGlnAspPheGlyGlyThrMETThrSerLysAspIleLys
261 ArgTyrGluValLysThrAspLysProIleTrpGlyAspTyrLysGlyTyrGlnLeuAla
281 SerMETProProProSerSerGlyGlyValPheMETLeuGlnIleLeuLysIleLeuAsp
301 HisPheAsnLeuSerGlnTyrAspProLysSerPheGluLysTyrGlnLeuLeuAlaGlu
321 ThrMETHisLeuSerTyrAlaAspArgAlaAlaTyrAlaGlyAspProGluPheValAsp
341 ValProLeuLysGlyLeuLeuAspAspAspTyrIleSerGluArgAlaSerLeuIleGln
361 LeuAspGlnMETAsnArgSerProLysGluGlyAspProTrpAlaTyrGluAspGluLys
381 AsnProSerProIleValProGlnProGluAspLysThrIleGlyGluThrThrHisPhe
401 ThrValAlaAspGlnTrpGlyAsnValValSerPheThrCysThrIleGluGlnLeuPhe
421 GlyThrGlyIleLeuValProGluTyrGlyPhePheLeuAsnAsnGluLeuThrAspPhe
441 AspAlaArgProGlyGlyAlaAsnGluValGlnProAsnLysArgProLeuSerSerMET
461 ThrProThrIleIlePheLysAspGlyGluProValMETThrValGlySerProGlyGly
481 ThrThrIleIleAlaSerValSerGlnThrIleLeuAsnLeuLeuGluTyrAspMETGlu
501 LeuGlnAspAlaValGluGluProArgIleTyrThrAsnSerLeuThrSerTyrArgTyr
521 GluValGlyValProLeuAspValArgThrLysLeuAsnAspMETGlyHisGlnPheGly
541 SerSerProIleAspIleGlyAsnValGlnAlaLeuLeuIleAspArgLysAlaGlyThr
561 PheThrGlyValAlaAspSerThrArgAsnGlyThrAlaValGlyValAsnLeuLysVal
581 AlaAlaAspGln
<210> 2
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
1 METLysArgIleSerLeuThrValLeuSerIleCysLeuPheValPheSerPhePheLeu
21 ProValSerGlnValThrAlaAsnGluThrHisGlyAsnLysValAlaValGlyLysAsp
41 GlyMETValAlaThrAlaHisProLeuAlaSerGluIleGlyAlaAspValLeuLysLys
61 GlyGlyAsnAlaValAspAlaAlaValAlaIleGlnTyrAlaLeuAsnValThrGluPro
81 METMETSerGlyIleGlyGlyGlyGlyPheMETMETValTyrAspGlyLysThrLysGlu
101 ThrSerIleIleAsnSerArgGluArgAlaProGlnGlyAlaThrProAspMETPheLeu
121 ThrAspAspGlyLysValIleProPheAlaGluArgSerThrHisGlyAsnAlaValGly
141 ValProGlyThrValLysGlyLeuGluAlaAlaLeuAspLysTrpGlyThrArgSerMET
161 LysGluLeuIleGluProSerIleGlnLeuAlaGluAspGlyPheGluIleAspSerVal
181 LeuAlaLysAlaIleAspAspHisGlnAlaLysLeuLysLysThrAlaAlaAlaProIle
201 PheLeuProAsnAspGlnProLeuGluGluGlyAspLeuLeuValGlnProGlyLeuAla
221 LysThrPheLysLeuIleAlaLysLysGlySerLysAlaPheTyrGluGlyLysValAla
241 LysAlaLeuAlaAsnThrValGlnAspPheGlyGlyThrMETThrSerLysAspIleLys
261 ArgTyrGluValLysThrAspLysProIleTrpGlyAspTyrLysGlyTyrGlnLeuAla
281 SerMETProProProSerSerGlyGlyValPheMETLeuGlnIleLeuLysIleLeuAsp
301 HisPheAsnLeuSerGlnTyrAspProLysSerPheGluLysTyrGlnLeuLeuAlaGlu
321 ThrMETHisLeuSerTyrAlaAspArgAlaAlaTyrAlaGlyAspProGluPheValAsp
341 ValProLeuLysGlyLeuLeuAspAspAspTyrIleSerGluArgAlaSerLeuIleGln
361 LeuAspGlnMETAsnArgSerProLysGluGlyAspProTrpAlaTyrGluAspGluLys
381 AsnProSerProIleValProGlnProGluAspLysThrIleGlyGluThrThrHisPhe
401 ThrValAlaAspGlnTrpGlyAsnValValSerPheThrThrThrIleGluGlnLeuPhe
421 GlyThrGlyIleLeuValProGluTyrGlyPhePheLeuAsnAsnGluLeuThrAspPhe
441 AspAlaArgProGlyGlyAlaAsnGluValGlnProAsnLysArgProLeuSerSerMET
461 ThrProThrIleIlePheLysAspGlyGluProValMETThrValGlySerProGlyGly
481 ThrThrIleIleAlaSerValSerGlnThrIleLeuAsnLeuLeuGluTyrAspMETGlu
501 LeuGlnAspAlaValGluGluProArgIleTyrThrAsnSerLeuThrSerTyrArgTyr
521 GluValGlyValProLeuAspValArgThrLysLeuAsnAspMETGlyHisGlnPheGly
541 SerSerProIleAspIleGlyAsnValGlnAlaLeuLeuIleAspArgLysAlaGlyThr
561 PheThrGlyValAlaAspSerThrArgAsnGlyThrAlaValGlyValAsnLeuLysVal
581 AlaAlaAspGln
<210> 3
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
1 atgaaacgca tttctctaac tgttttgtcc atatgtctgt ttgttttctc gttttttctg
61 ccggtcagcc aagtcactgc aaacgaaact catgggaata aagtagctgt tggcaaagat
121 gggatggtgg ctactgcaca tccgcttgca tcggagattg gtgctgacgt attgaaaaaa
181 ggtgggaacg cagtggatgc tgctgttgcc attcagtacg cacttaacgt aacagagcca
241 atgatgtctg gaattggcgg cggcggattt atgatggttt atgatgggaa gacaaaggaa
301 acatccatca tcaatagcag agagcgagca ccacagggcg caacacctga catgttttta
361 acagatgatg gaaaagtgat tccgtttgct gagcgatcta cacatggaaa tgcggtaggt
421 gttccaggga ctgtaaaagg tcttgaagct gcattagata agtggggtac tcgttctatg
481 aaggaattga ttgagccctc cattcaactt gcagaagatg gttttgaaat tgattctgtc
541 ttggcaaaag cgattgatga tcatcaagca aaattgaaaa aaacggccgc agcgccaatt
601 tttcttccaa atgatcagcc gctcgaagaa ggagatctgc ttgtccagcc aggtcttgca
661 aaaacattta aacttattgc gaaaaaagga agcaaagcgt tttatgaagg aaaagtagca
721 aaggcacttg caaatacagt tcaagatttt ggcgggacga tgacttcaaa agatatcaaa
781 cgttatgaag tcaagactga caagccaatc tggggagact ataaaggata tcagcttgca
841 agcatgccac caccaagctc aggcggggtg tttatgctac aaattctcaa aatacttgac
901 cattttaacc tgtctcagta tgaccccaaa tcattcgaaa aatatcagct tcttgctgaa
961 acgatgcacc tctcctatgc tgacagagcc gcatatgccg gcgaccccga attcgtagat
1021 gttccactaa aaggactatt agacgatgat tacatttcag aaagagcctc tctcattcaa
1081 ttagatcaaa tgaatcgcag cccgaaagaa ggagatcctt gggcatatga ggatgaaaaa
1141 aatccatccc caattgttcc tcagccagaa gataaaacca ttggtgagac gacccatttt
1201 actgttgcag atcagtgggg aaatgttgtg tcattcacct gcaccattga acaattattt
1261 ggtacaggga ttcttgttcc agagtatgga tttttcttaa ataatgaact aactgatttt
1321 gatgcacgac ctggcggtgc aaatgaagtc cagccaaata aacgtccatt atcaagtatg
1381 accccgacga tcatttttaa agatggagag cctgtcatga ctgttggatc tcctggtgga
1441 acgacgatca ttgcttctgt ttcacagacg attctcaatt tacttgaata tgacatggag
1501 cttcaggatg cggtagaaga gccaagaatc tacacaaaca gcttaacttc gtatcgttat
1561 gaagtaggtg tccctctaga tgtaagaaca aagttaaatg atatgggtca ccagtttggc
1621 agttcaccta ttgatatagg gaatgtgcaa gctttactga ttgatcgaaa agcagggaca
1681 tttactggag tagctgattc aacgagaaat ggaactgctg ttggtgtcaa tctaaaggta
1741 gctgcagatc aatag
<210> 4
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
1 atgaaacgca tttctctaac tgttttgtcc atatgtctgt ttgttttctc gttttttctg
61 ccggtcagcc aagtcactgc aaacgaaact catgggaata aagtagctgt tggcaaagat
121 gggatggtgg ctactgcaca tccgcttgca tcggagattg gtgctgacgt attgaaaaaa
181 ggtgggaacg cagtggatgc tgctgttgcc attcagtacg cacttaacgt aacagagcca
241 atgatgtctg gaattggcgg cggcggattt atgatggttt atgatgggaa gacaaaggaa
301 acatccatca tcaatagcag agagcgagca ccacagggcg caacacctga catgttttta
361 acagatgatg gaaaagtgat tccgtttgct gagcgatcta cacatggaaa tgcggtaggt
421 gttccaggga ctgtaaaagg tcttgaagct gcattagata agtggggtac tcgttctatg
481 aaggaattga ttgagccctc cattcaactt gcagaagatg gttttgaaat tgattctgtc
541 ttggcaaaag cgattgatga tcatcaagca aaattgaaaa aaacggccgc agcgccaatt
601 tttcttccaa atgatcagcc gctcgaagaa ggagatctgc ttgtccagcc aggtcttgca
661 aaaacattta aacttattgc gaaaaaagga agcaaagcgt tttatgaagg aaaagtagca
721 aaggcacttg caaatacagt tcaagatttt ggcgggacga tgacttcaaa agatatcaaa
781 cgttatgaag tcaagactga caagccaatc tggggagact ataaaggata tcagcttgca
841 agcatgccac caccaagctc aggcggggtg tttatgctac aaattctcaa aatacttgac
901 cattttaacc tgtctcagta tgaccccaaa tcattcgaaa aatatcagct tcttgctgaa
961 acgatgcacc tctcctatgc tgacagagcc gcatatgccg gcgaccccga attcgtagat
1021 gttccactaa aaggactatt agacgatgat tacatttcag aaagagcctc tctcattcaa
1081 ttagatcaaa tgaatcgcag cccgaaagaa ggagatcctt gggcatatga ggatgaaaaa
1141 aatccatccc caattgttcc tcagccagaa gataaaacca ttggtgagac gacccatttt
1201 actgttgcag atcagtgggg aaatgttgtg tcattcacca ctaccattga acaattattt
1261 ggtacaggga ttcttgttcc agagtatgga tttttcttaa ataatgaact aactgatttt
1321 gatgcacgac ctggcggtgc aaatgaagtc cagccaaata aacgtccatt atcaagtatg
1381 accccgacga tcatttttaa agatggagag cctgtcatga ctgttggatc tcctggtgga
1441 acgacgatca ttgcttctgt ttcacagacg attctcaatt tacttgaata tgacatggag
1501 cttcaggatg cggtagaaga gccaagaatc tacacaaaca gcttaacttc gtatcgttat
1561 gaagtaggtg tccctctaga tgtaagaaca aagttaaatg atatgggtca ccagtttggc
1621 agttcaccta ttgatatagg gaatgtgcaa gctttactga ttgatcgaaa agcagggaca
1681 tttactggag tagctgattc aacgagaaat ggaactgctg ttggtgtcaa tctaaaggta
1741 gctgcagatc aatag
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列，用于pcr
<400> 5
AGCGGGATCC ATGAAACGCA TTTCTCTAAC T
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列，用于pcr
<400> 6
ACCGACGCGT CTATTGATCT GCAGCTAC

Claims (8)

1.一种γ-谷氨酰转肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.一种表达权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的基因工程菌。
5.一种制备权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO.4所示序列的基础上，将第413位苏氨酸突变成半胱氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以SEQ ID NO.3所示核酸序列为模板，以序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR，即得到编码的413位氨基酸由苏氨酸突变成半胱氨酸的T413C突变体基因序列；(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-T413C，重组质粒化转化B.subtilis，获得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
7.权利要求1所述的突变体、编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列、含有编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列的载体或者表达权利要求1所述突变体的基因工程菌的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是用于生物转化生产L-茶氨酸。
CN201711324140.4A 2017-12-13 2017-12-13 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法 Active CN107828754B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711324140.4A CN107828754B (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711324140.4A CN107828754B (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107828754A true CN107828754A (zh) 2018-03-23
CN107828754B CN107828754B (zh) 2020-08-04

Family

ID=61642806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711324140.4A Active CN107828754B (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107828754B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611333A (zh) * 2018-05-10 2018-10-02 江南大学 一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
CN112111468A (zh) * 2020-09-23 2020-12-22 江南大学 一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN117701539A (zh) * 2023-12-26 2024-03-15 修实生物医药(南通)有限公司 转肽酶突变体及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003230384A (ja) * 2002-02-07 2003-08-19 National Food Research Institute γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株、その取得方法及び該変異株を用いたγ−ポリグルタミン酸の製造法
CN101560532A (zh) * 2009-05-25 2009-10-21 南京大学 L-茶氨酸酶法转化制备方法
CN103232980A (zh) * 2013-04-22 2013-08-07 华南理工大学 一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因
CN104404075A (zh) * 2014-12-09 2015-03-11 江南大学 一种利用重组Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶催化生成L-茶氨酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003230384A (ja) * 2002-02-07 2003-08-19 National Food Research Institute γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株、その取得方法及び該変異株を用いたγ−ポリグルタミン酸の製造法
CN101560532A (zh) * 2009-05-25 2009-10-21 南京大学 L-茶氨酸酶法转化制备方法
CN103232980A (zh) * 2013-04-22 2013-08-07 华南理工大学 一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因
CN104404075A (zh) * 2014-12-09 2015-03-11 江南大学 一种利用重组Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶催化生成L-茶氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMB89404.1: "gamma-glutamyltranspeptidase", 《GENBANK》 *
黄静: "γ-谷氨酰转肽酶的克隆、诱变及表达条件优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611333A (zh) * 2018-05-10 2018-10-02 江南大学 一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
CN108611333B (zh) * 2018-05-10 2020-06-09 江南大学 一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
CN112111468A (zh) * 2020-09-23 2020-12-22 江南大学 一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用
CN112111468B (zh) * 2020-09-23 2022-01-11 江南大学 一种γ-谷氨酰胺转肽酶突变体及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN117701539A (zh) * 2023-12-26 2024-03-15 修实生物医药(南通)有限公司 转肽酶突变体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107828754B (zh) 2020-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112322565B (zh) 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法
CN107828754A (zh) 一种酶活提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
CN113186142B (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
WO2013132518A1 (en) Recombinant nitrogen fixing microorganism and uses thereof
CN113528480B (zh) 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用
WO2017031839A1 (zh) 一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法
CN107384902B (zh) 一种麦芽糖转化率提高的海藻糖合酶及其制备方法和应用
CN112795569B (zh) 一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用
CN114874964A (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN108611333A (zh) 一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
CN113528553B (zh) 一种密码子优化的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用
CN114672525B (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
CN112980906B (zh) 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用
CN111411066B (zh) 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法
KR20200134333A (ko) 발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로
CN111748535A (zh) 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其在发酵生产l-丙氨酸中的应用
CN107099497B (zh) 一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法
CN113151337A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用
CN108384741B (zh) 一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌
CN113025548A (zh) 基于kosakonia sp.菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌及其方法和应用
CN112708569B (zh) 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用
CN107828768A (zh) 一种l‑天冬酰胺酶突变体及其构建方法
CN111424048A (zh) 一种表达酸性β-甘露聚糖酶的基因及其载体和应用
CN113817704B (zh) 一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法
CN113699087B (zh) 一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant