CN103232980A

CN103232980A - 一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因

Info

Publication number: CN103232980A
Application number: CN2013101398524A
Authority: CN
Inventors: 叶茂
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong Industry Technical College
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-04-22
Also published as: CN103232980B

Abstract

本发明提供一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因，该氨酰转肽酶蛋白质分子具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，该谷氨酰转肽酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。另外，本发明还公开了一种利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，该方法通过采用本发明的重组谷氨酰转肽酶，以谷氨酰胺类单体为原料合成γ-聚谷氨酸。本发明的谷氨酰转肽酶能够以谷氨酰胺类单体为原料合成γ-聚谷氨酸，对丰富谷氨酰转肽酶家族成员，开发新的γ-聚谷氨酸合成途径都具有重要意义。

Description

一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因。

背景技术

γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)是一种由D-或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺键结合而成的阴离子聚合物。γ-PGA是一种水溶性可生物降解的新型绿色生物材料，具有可食用性、无毒性、成膜性、粘结性、保湿性等特点，其应用非常广泛，既可以作为药物载体、增稠剂和保湿剂用于医药、食品和化妆品中，又可以作为保水剂及水果、蔬菜的防冻剂、保鲜剂，还可以作为水处理的絮凝剂和重金属螯合剂等。随着人们环保意识日益增强，γ-聚谷氨酸作为可生物降解高分子材料已备受关注。

谷氨酰转肽酶(glutamyltranspeptidase，GTP，EC 2.3.2.2)，又称谷氨酰转移酶，广泛存在于微生物、植物以及动物体内。GTP可以催化以下三类反应：当催化反应的受体是氨基酸（或肽）时，形成γ-谷氨酰氨基酸或肽；当γ-谷氨酰供体同时又是受体时，就发生自身转肽反应；当亲核试剂是水时，最终的结果为水解反应。近年来，由于生物技术发展突飞猛进，生物催化与生物转化技术在工业生产中逐渐兴起，利用GTP制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。已经报道利用该酶的“γ-谷氨酰基化”反应催化合成了谷胱甘肽、茶氨酸、γ-D-谷氨酰-L-色氨酸、7-氨基头孢烷酸、γ-谷氨酰-牛磺酸等多种化合物。但到目前为止，尚未有能够合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶的研究报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种谷氨酰转肽酶基因，该基因编码能够合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶。

本发明所解决的技术问题在于提供一种谷氨酰转肽酶，该酶能够以谷氨酰胺类单体为原料合成γ-聚谷氨酸，对丰富谷氨酰转肽酶家族成员，开发新的γ-聚谷氨酸合成途径都具有重要意义。

本发明所解决的技术问题在于提供一种合成γ-聚谷氨酸的方法，利用基因工程获取的重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种谷氨酰转肽酶蛋白质分子，该蛋白质分子具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种谷氨酰转肽酶基因，该谷氨酰转肽酶基因具有编码权利要求1中蛋白质分子的核苷酸序列。

其中，在本发明的一个实施例中，该谷氨酰转肽酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

对于具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的谷氨酰转肽酶基因，该序列无内含子，具有1782bp完整的开放读码框，编码593个氨基酸的多肽。

另外，本发明还提供了一种获取谷氨酰转肽酶基因的方法，包括如下步骤：

步骤一、提取沿海红树林淤泥样品，提取起总DNA并纯化；

步骤二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；

步骤三、将酶切产物连接到pUC18/BamHI(BAP)载体上，电击转化大肠杆菌JM109中，构建红树林宏基因组文库，用含有l-氨苄青霉素、γ-谷酰基-对硝基苯胺、葡萄糖和氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选谷氨酰转肽酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；

步骤四、经测序和Blast比较设计引物，以阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到如SEQ ID NO:1所示的目的片段。

其中，步骤四中设计用于扩展目的片段的引物包括：

上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’；

下游引物F2：5’-CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’。

另外，本发明还提供了一种重组谷氨酰转肽酶的制备方法，包括如下步骤：

（1）采用如权利要求5中所述方法获取谷氨酰转肽酶基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（2）用上述基因目的片段经过HindIII和BamHI双酶切，与表达载体pET-32a(+)连接；

（3）用表达载体pET-32a(+)转化宿主细胞BL21，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得重组谷氨酰转肽酶。该重组谷氨酰转肽酶具有以谷氨酰胺类单体为原料合成γ-聚谷氨酸的作用。

另外，本发明还提供了一种利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用如权利要求5中方法制备重组谷氨酰转肽酶；

（2）将上述重组谷氨酰转肽酶粗酶液或纯化的酶液加入到谷氨酰胺溶液中，以 Tris-HCl缓冲液调节PH为7.0-8.0，在15-30℃条件下进行酶催化反应6-12h，合成γ-聚谷氨酸，并加入终止液终止γ-聚谷氨酸反应。

其中，合成的γ-聚谷氨酸的分子量大小为5~10kDa。

优选地，步骤（2）中酶催化反应的最适温度为20℃，最适pH值为7.0，最适底物浓度为10M谷氨酰胺。

相比于现有技术，本发明的技术方案应用宏基因组技术获得的谷氨酰转肽酶，该酶能够以谷氨酰胺类单体为原料合成γ-聚谷氨酸，对丰富谷氨酰转肽酶家族成员，开发新的γ-聚谷氨酸合成途径都具有重要意义。另外，本发明的方案还通过对该酶在合成γ-聚谷氨酸反应中的最适条件进行研究，发现在以谷氨酰胺单体为原料的γ-聚谷氨酸合成反应中，本发明的谷氨酰转肽酶催化反应的最适温度是20℃，最适pH值为7.0，最适底物浓度为10M谷氨酰胺，采用上述反应条件能够高效、快速地合成目的产物γ-聚谷氨酸，并具有很好的应用价值。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1 重组谷氨酰转肽酶纯化的SDS-PAGE电泳图。M: Protein Marker; 1: 纯化后蛋白。

图2 重组谷氨酰转肽酶合成的γ-聚谷氨酸的SDS-PAGE电泳图。M: Protein Marker; 1: 重组谷氨酰转肽酶粗酶液合成的γ-聚谷氨酸; 2: 纯化后重组谷氨酰转肽酶合成的γ-聚谷氨酸.。

图3 纯化的谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸最适反应pH值的测定结果。

图4纯化的谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸最适反应温度的测定结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1 谷氨酰转肽酶基因的获得及合成γ-聚谷氨酸功能的验证

1、谷氨酰转肽酶基因的获得

从广东省湛江市沿海红树林淤泥样品，构建红树林宏基因组文库。用含有100μg/ml氨苄青霉素、0.1% γ-谷酰基-对硝基苯胺、1%葡萄糖和0.5%氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选谷氨酰转肽酶阳性克隆。将文库中的细胞同影印接种针复制到固体选择性培养基平板上，37℃下培养3天，筛选菌落周围有黄色水解圈出现的阳性克隆子。

为了筛选出合成γ-聚谷氨酸的克隆子，挑取在筛选培养基上产生黄色水解圈的克隆子，接种到10ml含100μg/ml氨苄青霉素和0.5mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的LB培养液中，30℃，250 r/min下培养24h，12000r/min离心2min收集菌体，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.5)洗涤菌体二次，Tris-HCl缓冲液重新悬浮菌体，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎菌体，离心收集上清(粗酶液)。取1ml粗酶液，加入1 ml 20%的谷氨酰胺，2 ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.5)，30℃水浴12h后，加入1ml 15%醋酸溶液终止反应。取上述反应液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，能够使谷氨酰胺聚合成大分子的γ-聚谷氨酸的为真阳性克隆子。通过筛选获得一个阳性克隆子。

提取上述阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，得到一个谷氨酰转肽酶的核酸序列，该序列由1782个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为ggt_015；该核酸编码的多肽，含593个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其命名为GGT_015。

2、基因片段的克隆

根据核酸ggt_015序列，设计扩增引物：上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’ (下划线为BamHI酶切位点序列)；下游引物F2：5’-CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’(下划线为HindIII酶切位点序列)。

以阳性克隆子的质粒为模版，以F1和F2为引物，进行PCR扩增，反应体系为：PrimeSTAR^TM HS DNA Ploymerase (2.5U/μl) 0.3μl，5×缓冲液 6μl，dNTP Mix(2.5mM) 2.4μl，模板(100ng/μl) 0.6μl，引物F1和F2(10 mM)各0.3μl，超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，68 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃。

将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用BamHI和HindIII双酶切16，与经过同样处理的pET-32a(+) (Invitrogen)表达载体进行连接，电转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒DNA，进行测序验证发现其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的序列相同，能够有效地获取目的基因片段。

3、重组谷氨酰转肽酶GGT_015的获得

将含有经测序验证正确质粒的菌株接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，250 r/min下培养14h，按1%的接种量转接至100ml的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，当生长至OD₆₀₀=0.8时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度0.6mM，20℃，200 r/min下培养20h，12000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于20ml 50mM Tri-HCl (pH7.5)中，用超声波破碎仪破碎菌体，4℃，13000r/min离心15min，收集上清，即获得重组谷氨酰转肽酶粗酶液。

将重组谷氨酰转肽酶粗酶液用Invitrogen公司的His标签蛋白纯化试剂盒Proband Purification system进行纯化重组蛋白，具体操作步骤按该公司产品说明书进行。纯化后的重组蛋白液氮速冻，保存至超低温冰箱中。

4、合成γ-聚谷氨酸功能的验证

将上述重组谷氨酰转肽酶粗酶液1ml或纯化的酶液10μl，加入1 ml 20%的谷氨酰胺，2 ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.5)，30℃水浴12h后，加入1ml 15%醋酸溶液终止反应。取上述反应液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，由于重组谷氨酰转肽酶可以将谷氨酰胺合成多肽——γ-聚谷氨酸，γ-聚谷氨酸能被考马斯亮蓝R-250染色，所以在SDS-PAGE电泳上γ-聚谷氨酸显示蓝色。结果表明，重组谷氨酰转肽酶GGT_015具有合成γ-聚谷氨酸的能力，且合成的γ-聚谷氨酸的分子量大小为5~10kDa（如附图2所示）。

实施例2 重组谷氨酰转肽酶GGT_015合成γ-聚谷氨酸条件的研究

1、pH值对合成γ-聚谷氨酸能力的影响

取10μl纯化的酶液，加入1ml 20%的谷氨酰胺，分别在pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液中，30℃下分别水浴反应2h、4h、6h、8h，加入1ml 15%醋酸溶液终止反应，214nm波长测定光吸收值，吸收值越大表明合成γ-聚谷氨酸的量越大。同时以灭活的酶液做对照。结果如图3所示，GGT_015合成γ-聚谷氨酸的最适pH值为7.5；低于或高于此pH值，GGT_015的合成能力会相对降低。

2、温度对合成γ-聚谷氨酸能力的影响

取10μl纯化的酶液，加入1ml 20%的谷氨酰胺，2 ml Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.5)，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下分别水浴反应2h、4h、6h、8h，加入1ml 15%醋酸溶液终止反应，214nm波长测定光吸收值。同时以灭活的酶液做对照。结果如图4所示，GGT_015合成γ-聚谷氨酸的最适温度为20℃；低于或高于此温度，GGT_015的合成能力会相对降低。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110> 华南理工大学

<120>一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因

<160> 4

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<400> 1

ATGGCTTTCA CCCTGTGGGT TGCTTCTTTC CTGGGTAACA TGTTCATGGC 50

TCTGTCTATC TCTCCGCCGG CTGTTGCTAA CTCTCTGCCG TACGGTGTTG 100

CTCCGCTGCG TCACCCGGTT CTGTCTGCTT CTGGTTCTGA CGGTGGTGTT 150

GTTTCTCTGT CTGACATGCT GGCTCGTCAG GCTGGTATGG CTATCCTGCT 200

GCGTCGTGGT GGTTCTGCTG TTGACGCTGC TGTTGCTGGT GGTGTTGCTC 250

TGGTTGTTAT CCCGCCGGCT GGTGGTCTGG GTGGTGGTGG TTTCCTGCTG 300

GACAAAGAAA AACTGCAGCG TGCTGCTCCG GCTAACGCTA TCGTTGAACG 350

TGAACTGGCT GCTGCTCGTA CCAAAAAACA GATGTTCCTG GACGACGGCT 400

TGATCCAGCT GGCTTCTGGT GCTTCTTGGT GGCTGTCTTC TGGTGGTGGT 450

GTTGCTGTTG CTTCTGCTGC TGACGCTCGT GGTGGTAAAC TGGCTCTGAT 500

CCAGGTTGTT CAGCCGGCTA TCTACTACCT GGCTGAAGGT GGTTTCAACT 550

CTGCTCGTAA CGCTGCTGAC GACCTGCGTC GTCAGGGTGG TGAAGTTCCG 600

AAAACCGCTG CTAAAAAAAA ATTCTTCAAC AACGGTTCTC CGTACAAACG 650

TCCGAAACTG CTGCTGCAGA AACTGGCTGC TGCTCTGATC ACCGCTACCG 700

GTGGTGGTGC TTTCTACGGT GGTCTGGCTG AAATCGCTGC TATCGCTATG 750

CAGGACGGTG GTGGTCTGCT GACCAAAAAA GACCTGGCTG CTTACAAAGC 800

TGCTGAACGT CCGCCGCCGG GTGGTGCTGG TGAAACCTTC CACCAGGCTC 850

TGATGCCGCC GGTTGTTTCT GGTGGTGGTG TTATCATCGC TCTGCTGAAC 900

CTGCTGGAAT TCTTCCTGCT GGTTAAAAAA GGTCACGGTT CTGCTGCTGC 950

TTACCACATG ATCCTGGAAG CTGCTCGTCG TGCTGCTGCT GACGCTTACT 1000

CTCGTTACCT GGGTGACCCG TTCTTCATGG TTCCGCCGGA AGAACTGCTG 1050

CACGCTGCTT ACGCTAAAAC CCTGCTGGCT ATCATCGGTG GTCACGGTGA 1100

CGAATCTAAA CTGCCGAACG TTGACTTCTT CCGTGAAGCT GCTAAAAACC 1150

ACTACTACAC CGCTGCTGCT GAATCTCCGG GTGGTGGTAC CACCTCTGTT 1200

TTCCTGGTTG TTGCTGCTGC TGGTGTTGTT GCTTCTACCT ACTCTCTGCT 1250

GACCACCTAC GGTGGTTCTA TCATCGCTGG TGGTACCGGT CTGGCTGCTC 1300

ACAACCAGAT GGACGACGAC GCTGTTTCTC CGGGTCCGCC GAACTACGGT 1350

GGTCTGGGTG GTGGTGCTAA CGCTAACGTT GTTCCGCCGA AACGTCCGTT 1400

CTCTTCTATG CCGCCGATCT TCCTGGTTCC GCAGGGTGGT CCGCCGCTGC 1450

TGTGGTTCGG TTCTTCTGGT GGTCCGATGA TCATCACCCT GGTTCTGCAG 1500

GTTGTTGTTG TTTGGAACCT GGAAGACTTC ATGCTGGTTG TTGCTGCTGC 1550

TACCGACGCT CGTCGTTCTC ACCACGTTCT GCTGCCGCCG GAACTGCTGT 1600

ACGAACCGGG TTCTCCGCCG ACCGACCTGC GTCTGCTGGA AGACAAAAAA 1650

CACCACGTTG CTGCTTCTGG TGGTGGTCTG CTGGCTGCTA CCATCTCTCT 1700

GGTTTACGGT GACGGTGAAC TGGCTGCTGC TCCGGACCCG TCTCGTCAGG 1750

GTGCTGGTGC TCTGGCTCTG GAAGGTTACT GA 1782

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<400> 2

Met Ala Phe Thr Leu Trp Val Ala Ser Phe Leu Gly Asn Met Phe Met Ala Leu Ser Ile Ser Pro Pro

5 10 15 20

Ala Val Ala Asn Ser Leu Pro Tyr Gly Val Ala Pro Leu Arg His Pro Val Leu Ser Ala Ser Gly Ser

25 30 35 40 45

Asp Gly Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Met Leu Ala Arg Gln Ala Gly Met Ala Ile Leu Leu Arg

50 55 60 65

Arg Gly Gly Ser Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Gly Gly Val Ala Leu Val Val Ile Pro Pro Ala Gly

70 75 80 85 90

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Phe Leu Leu Asp Lys Glu Lys Leu Gln Arg Ala Ala Pro Ala Asn Ala

95 100 105 110

Ile Val Glu Arg Glu Leu Ala Ala Ala Arg Thr Lys Lys Gln Met Phe Leu Asp Asp Gly Trp Ile Gln

115 120 125 130 135

Leu Ala Ser Gly Ala Ser Trp Trp Leu Ser Ser Gly Gly Gly Val Ala Val Ala Ser Ala Ala Asp Ala

140 145 150 155

Arg Gly Gly Lys Leu Ala Leu Ile Gln Val Val Gln Pro Ala Ile Tyr Tyr Leu Ala Glu Gly Gly Phe

160 165 170 175 180

Asn Ser Ala Arg Asn Ala Ala Asp Asp Leu Arg Arg Gln Gly Gly Glu Val Pro Lys Thr Ala Ala

185 190 195 200

Lys Lys Lys Phe Phe Asn Asn Gly Ser Pro Tyr Lys Arg Pro Lys Leu Leu Leu Gln Lys Leu Ala

205 210 215 220 225

Ala Ala Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gly Gly Ala Phe Tyr Gly Gly Leu Ala Glu Ile Ala Ala Ile Ala

230 235 240 245

Met Gln Asp Gly Gly Gly Leu Leu Thr Lys Lys Asp Leu Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Glu Arg Pro

250 255 260 265

Pro Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Phe His Gln Ala Leu Met Pro Pro Val Val Ser Gly Gly Gly Val

270 275 280 285 290

Ile Ile Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Phe Phe Leu Leu Val Lys Lys Gly His Gly Ser Ala Ala Ala

295 300 305 310 315

Tyr His Met Ile Leu Glu Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Ser Arg Tyr Leu Gly Asp Pro

320 325 330 335

Phe Phe Met Val Pro Pro Glu Glu Leu Leu His Ala Ala Tyr Ala Lys Thr Leu Leu Ala Ile Ile Gly

340 345 350 355 360

Gly His Gly Asp Glu Ser Lys Leu Pro Asn Val Asp Phe Phe Arg Glu Ala Ala Lys Asn His Tyr

365 370 375 380

Tyr Thr Ala Ala Ala Glu Ser Pro Gly Gly Gly Thr Thr Ser Val Phe Leu Val Val Ala Ala Ala Gly

390 395 400 405

Val Val Ala Ser Thr Tyr Ser Leu Leu Thr Thr Tyr Gly Gly Ser Ile Ile Ala Gly Gly Thr Gly Leu

410 415 420 425 430

Ala Ala His Asn Gln Met Asp Asp Asp Ala Val Ser Pro Gly Pro Pro Asn Tyr Gly Gly Leu Gly

435 440 445 450

Gly Gly Ala Asn Ala Asn Val Val Pro Pro Lys Arg Pro Phe Ser Ser Met Pro Pro Ile Phe Leu Val

455 460 465 470 475

Pro Gln Gly Gly Pro Pro Leu Leu Trp Phe Gly Ser Ser Gly Gly Pro Met Ile Ile Thr Leu Val Leu

480 485 490 495

Gln Val Val Val Val Trp Asn Leu Glu Asp Phe Met Leu Val Val Ala Ala Ala Thr Asp Ala Arg

500 505 510 515 520

Arg Ser His His Val Leu Leu Pro Pro Glu Leu Leu Tyr Glu Pro Gly Ser Pro Pro Thr Asp Leu Arg

525 530 535 540

Leu Leu Glu Asp Lys Lys His His Val Ala Ala Ser Gly Gly Gly Leu Leu Ala Ala Thr Ile Ser Leu

545 550 555 560 565

Val Tyr Gly Asp Gly Glu Leu Ala Ala Ala Pro Asp Pro Ser Arg Gln Gly Ala Gly Ala Leu Ala

570 575 580 585

Leu Glu Gly Tyr

590

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT 29

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC 27

Claims

1.一种谷氨酰转肽酶蛋白质分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种分离出的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该谷氨酰转肽酶基因具有编码权利要求1中蛋白质分子的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该谷氨酰转肽酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.如权利要求2所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该序列无内含子，具有1782bp完整的开放读码框，编码593个氨基酸的多肽。

5.一种获取谷氨酰转肽酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一、提取沿海红树林淤泥样品，提取起总DNA并纯化；

步骤二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；

步骤三、将酶切产物连接到pUC18/BamHI(BAP)载体上，电击转化大肠杆菌JM109中构建红树林宏基因组文库，用含有l-氨苄青霉素、γ-谷酰基-对硝基苯胺、葡萄糖和氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选谷氨酰转肽酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；

6.如权利要求5所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，步骤四中设计用于扩展目的片段的引物包括：

上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’；

下游引物F2：5’-CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’。

7.一种重组谷氨酰转肽酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（3）用表达载体pET-32a(+)转化宿主细胞BL21，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得重组谷氨酰转肽酶。

8.一种利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用如权利要求5中方法制备重组谷氨酰转肽酶；

9.如权利要求8所述利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，合成的γ-聚谷氨酸的分子量大小为5~10kDa。

10.如权利要求8所述利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤（2）中酶催化反应的最适温度为20℃，最适pH值为7.0，最适底物浓度为10M谷氨酰胺。