CN107641630A - 突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用，其核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。本发明通过定点突变技术，所得到的含有突变基因的鞘氨醇单胞菌能够显著的提高降解微囊藻毒素，具有广泛的应用前景。

Description

突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类能诱发肝脏肿瘤的单环七肽化合物，其化学性质稳定，常规水处理技术难以有效去除，而微生物法是去除MCs最安全和有效的方法。国内外在微生物降解MCs方面做了大量研究，但在微生物降解MCs的途径及其分子机理方面则少有深入报道。本研究的目的是通过对1株高效降解MCs的菌株—鞘氨醇单胞菌USTB-05降解微囊藻毒素LR(MC-LR)的特性、降解蛋白信息的获取、降解蛋白的克隆与表达、酶的活性验证及降解产物的分子结构测定，推测鞘氨醇单胞菌USTB-05降解MC-LR的途径与分子机理。

USTB-05菌为革兰氏阴性菌，实验发现在有氧状态下、温度30℃、初始pH值为7.0的条件下对MC-LR的降解能力最强。通过USTB-05菌无细胞提取液降解MC-LR，发现至少有3种酶参与了降解过程。

基因是分子生物学信息携带者，本发明的发明人在先研究(博士学位论文：王华生，鞘氨醇单胞菌USTB-05降解微囊藻毒素LR的途径与分子机理研究，2014年5月28日)表明，通过PCR、反向PCR等生物技术手段，获得了4段降解蛋白USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C和USTB-05-D，并且发现USTB-05-A、USTB-05-B及USTB-05-C分别与mlr基因簇对应的基因同源性很高，推测它们具有相同的降解功能。采用生物技术手段，分别成功克隆了USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C三段降解蛋白，构建了含有MC-LR降解蛋白的重组菌。在IPTG浓度为0.1mM、温度30℃和诱导时间3h条件下，重组菌目的蛋白诱导表达量最大。

然而，如何进一步提高微囊藻毒素降解蛋白的降解能力是发明人一直期待解决的技术问题。

发明内容

本发明针目前降解效率低等问题，利用定点诱变(site-directed mutagenesis)技术，改变编码蛋白质基因中DNA顺序，提供一种突变微囊藻毒素降解蛋白基因，特别是涉及USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C的突变。

在本发明中，突变之后USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C蛋白的核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

本发明的有益效果在于，本发明的突变微囊藻毒素降解蛋白基因能够显著的提高鞘氨醇单胞菌降解微囊藻毒素的能力，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：培养及诱导条件：

USTB-05复合培养基组成如下：MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO44.0g/L，NaCl 1.0g/L，CaCl2 20.0mg/L，FeSO4 5.0mg/L，ZnCl2 5.0mg/L，MnCl2·4H2O5.0mg/L，CuCl2 0.5mg/L，葡萄糖15.0g/L，酵母浸粉1.5g/L。在去离子水中溶解，定容至终体积，pH值调至合适值即为液体培养基。在液体培养基中按1.2～1.5％加入琼脂粉后可制备出对应的固体培养基。配制好的培养基需经过121℃高压蒸汽灭菌20min。

首先分析降解基因USTB-05-A、USTB-05-B和USTB-05-C可能的功能区域，然后分别对功能区域的基因进行定点诱变，所设计的诱变的目标基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3。对诱变后的基因进行多聚酶链式反应(PCR)扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证无误后，回收目的基因片段，把目的基因片段连接至pGEM-T easy克隆载体，并把连接载体转化至E.coli DH5α。经平板培养后进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落接种于LB培养基(Amp浓度50μg/mL)中培养(37℃、200rpm、18h)，经离心收集菌细胞，提取其中质粒经双酶切验证无误后，取新鲜菌液进行诱变基因的测序。并对诱变基因所表达的酶催化降解MC-RR或MC-LR，进行活性验证。

实施例2：菌株降解MC-LR的活性研究

分别取经测序验证同时含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3序列的菌株和从滇池底泥中筛选的能高效降解MC-LR的Sphingopyxis sp.USTB-05进行试验。

挑取含有诱变基因的菌株和USTB-05单克隆菌落接种于液体培养基中，在30℃、200rpm下培养3d后，按1％的接种量接种到新鲜培养基中。在30℃和转速200rpm条件下培养3d后，所获得菌体用于后续降解实验。

称取50g藻粉(藻粉过100目筛)，加入500mL 40％甲醇溶液中，混合均匀后放置于-70℃冰箱反复冻融3次，每次冷冻时间5h以上，并超声波振荡约1h，使藻细胞破裂并释放出藻毒素。然后在高速冷冻离心机上离心3次(第1次：12000rpm，20min；第2，3次：12000rpm，30min)。上清液经0.45μm滤膜过滤，再过固相萃取柱(Waters OASISTM HLB Cartridge)吸附。固相萃取流程如下：加无水甲醇→超纯水→藻毒素过滤液→35％甲醇洗涤→80％甲醇洗脱→70℃旋转蒸馏。蒸馏结晶体中加入一定量的超纯水配置成MCs储备液，置于冰箱中冷冻保存备用。

用超纯水配制一系列不同浓度的标准品MC-LR溶液，在HPLC上定量测定，分别建立峰高和峰面积与MC-LR浓度之间的一元线性回归方程。实验中根据测定样品的峰高或峰面积代入建立的方程，即可计算出MC-LR的浓度。HPLC分析测定中有机相为乙腈(色谱纯级)，水相中含有0.05％的三氟乙酸；流速1.0mL/min；紫外检测波长为238nm，进样量20μl；采用Purospher STAR RP-18e(5μm)分离柱。

在30℃，初始pH值为7.0的USTB-05最佳降解条件下进行对比试验，在最佳条件下，USTB-05菌在12h内可将初始浓度为15.38mg/L的MC-LR完全降解，此时其OD680nm达到0.65左右。而含有诱变基因的菌株在8h内可将初始浓度为15.38mg/L的MC-LR完全降解，此时其OD680nm也能达到0.65左右。由此可见，通过定点突变技术，能够提高菌株的降解能力达到33％左右。

以上实施例显示并描述了本发明的基本原理、制备方法。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

序列表

<110> 江西理工大学

<120> 突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)

<400> 1

ggatccatgc gggagtttgt caaacagcga cctttgctct gcttctatgc gttggctatc 60

ctgatcgctc tcacggccca tgtgcggcgc gcgatgagcc cgactccgct cggcccgatg 120

ttcaagatgc tgcaggagac gcacgctcac ctcaacatta ttaccgctgt caggtctacg 180

ttcgattacc cgggagccta tacgcttttg ctgtttccgg ccgccccaat gctcgcggct 240

ctgatcgtaa ccggtatcgg atacgggcgc tcaggatttc gtgaactgct cagccgatgc 300

gccccgtggc gatcgcctgt ttcctggcgt cagggcgtta ccgtcatagc cgtgtgtttc 360

cttgcgttct tcgcgctcac aggaattatg tgggttcaga catatctcta cgctccgccc 420

ggcacgcttg atcgcacctt cttgcgctat gggtcagatc cggtcgccat ttatatgatg 480

ctggcagcat cgctgctact cagccctggc ccgctgctcg aagaactggg ctggcgcggc 540

tttgcgctgc cgcagctcct caagaagttt gaccccctgg ccgcagcggt gatcctcggc 600

ctcatgtggt gggcttggca tttgccgcgc gacttgccga cgctgttctc cggcgaacct 660

ggcgcggcct ggggcgttat cgtcaagcaa ttcgttatca ttccggggtt catcgccggc 720

accatcatcg ctgttttcgt atgcaacaag ctcggcggat cgatgtgggg tggcgtgctc 780

attctcgtga cccttaccgc actgggcgta aacgtcactg ccgaatgggc tccaacggtt 840

gcagggcttg ggtggcgccc ttgggatttg gtcgaattcg ccgtggccat tgggctcgtc 900

ctgatttgtg gaaggagcct tggtgccgca tctcctgaca atgcgcgatt ggcttggggc 960

aacgtgccgc caaagctgcc gggcggagcg actgacaagt ccggcgcgaa cgcgtgaaag 1020

ctt 1023

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)

<400> 2

ggatccatga ctgcaacaaa gcttttcctg gcgctgacgg tcgcaatgcc aatggcgact 60

tcccatgtcg atccgaagga gctcgatgcg gtatttgctg atatccggcc ggatcaaccg 120

ggctgcgctt atgctgtgga tctgcgcggc aaggttctct atcagggcgg ctttggactt 180

gctgatctag ccacccgcga gccgatcaca cccgcaacac gcttcgaact ggcggcaaca 240

tcggcgcagt tcacggccgc tctcatcctg atcttggtac aggaacgccg acttaaattg 300

gcggcatcta tccgcaccta tctgcctgac ctccctaagg tctacgatcc ggtcacggtc 360

gcggacttgt tgcaccacac cagcggcatt cgcgagtatt tcgatgcatt cagggcacgc 420

ggagacgatg agagcaaacc ccattcccgc gaggaagtgc tggccttcgt caaggcgcaa 480

cgcggactcg acggcccacc tggccgtcgt ttttcctacg tcaacaccaa ttacttcctg 540

ctcgcagaaa tcgtggaacg cctaaccgga aagtcatttc cggatgctgc gcgggagcgg 600

ctcttcattc cggcgggcat gacggaaact cgcgcaacgc ttgatacgac cagtctcgtt 660

gcaggtgacg cgcgcggcta tcaaatcgac aagaacggta gctttgtctc cgcagcctgg 720

acctggcaag gctatggcga ccgcggcgtg cggactaatg ttggcgatct tgctctttgg 780

catggggcat cgctcgcggc gacaaccggc ggtgaggcac tcgaagtggc ccgcctcgcg 840

aacgggaaac tgcgttctgg cagatctgtc gattatgccg gtgggttgtt cgtggatgat 900

cggcaaagcg agcgtgttgt gtcgcattcg ggcttggttg taggcaatcg cgccatggat 960

gtgctgtatc cggacagcgg cattggtatc agcgtgatgt gcaatcgcga cgatatcgcg 1020

ccagctgagc gtgcgcgcaa aattgctttg ctcgtgaagc cgggggcgcc cgatccagca 1080

tttgatcgcg caattgatcc tgccgaaatg aaacgcctgg ggaaagttgg cgacctgcgc 1140

tccgcgcctg acggctatta tcgcgatccc ttgtacggac agtatctcat cgtcgctcac 1200

cgagacggtg agccgattgt cagctacaat atgagagctg agaaagtgac gcgccgccag 1260

gacggcatct accgcgcgcg ccggggtgtt ctgctaagct atgcagtcgc acaggttgga 1320

atcgagcgtg tcgttcagtg gactgaaagt ggacccattc cgtacgatta tgtcggaact 1380

ggcgcacttg aaaccaagtt gtttcggccc ggacaatatc gcagcgatga gcttggcatc 1440

actgtgaccc tgtcaagaga tctgaaggga tggtcgttgg atactcctgc aggtgcagtg 1500

cctttagagg ctgcgctggc agatgacctt gtgggcccgg acgctgcatt ttcgttgcat 1560

gctgttggtc ctcaaatctt tacatttcac accgtcaatc tgagcgggat agagttcaga 1620

cggcttccgt aggagctc 1638

<210> 3

<211> 1584

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)

<400> 3

ggatccatgg agatgcagcg gcttgctgcg aacaacatca aaccgaagac tcgtgttatg 60

cttgatcgtc gaacattgat gggaggcata ttgtcgatgg ctggatcgaa ggcgacaggt 120

gcaaccctgc tgggtcgagg gttgcgcgtg tttgtggcga ccttcggcac cgagacgaat 180

tcattctcac ccttgccaac cggactggat gcattccagg cgacgatgct ctggcgcccc 240

ggagagcacc cggatttcgc aaccgaggcg accggaccgc tttgggccgc tcgagagcgt 300

gcccgcgagg gacgctacga ggtcatcgag ggaacctgtg ccttcgccat gccgggtggt 360

ccggtcagcg cgcaagccta ccaactgctg cgcgacgaga tcctcgatca actgcgacgg 420

gcaatgccgg tggatatcgt ggctttcggt ttacacggcg caatgcttgc cttcggggag 480

gacgagtgcg aggcggacct tctcgagcgt gcccgggcga ttgtcgggcc agatgtagcg 540

ctaggggctg agcttgatct tcacgctcac ttgtcgccgc gaatggtccg cgctgccgat 600

gtcattgtgg cgttcaaata ttatccgcat acggactatg tcgagcgcgc gcgcgatctt 660

ctcgatttgc tcgagagagt ccgtgcgggc gagatcaggc cgacctcaag cctgttcgac 720

tgccggatgg tcggcggatt gacgacgcag gacttggtcg cagagctgat cgagcgcgag 780

cggcgagggg aagtcctttc cggctcactg atccaaggct ttcgtgcggg cgatgtagcg 840

cgcatggggt cgaaagtgct gatctatacc aacaatgacc agccggctgc agcgtcgatc 900

gcacaagact ttgctcgccg ataccaagcg atggctccga tcatgaaagg taacggccca 960

gagcgaagct ttgcggccga tatcgagctt gccaaggctg cgaccgcttt tcccgtaatt 1020

ttggtcgata gttcggacaa tcccggcggt ggggcttcgg gtgacaatat ggcattggcc 1080

cgggcgatgt tggataatgc actgatcccg gcatgcattg gtccgatatg ggatcctctc 1140

gcagtacgat tggcctttga agcgggcctt ggtgccgatt tttcgctgcg tgtcggtggc 1200

aaggtcggcg aggcatccgg gctgcctctc gacgttcgcg gcaaaatcac agggcttgcc 1260

aagaatgtca cccaaaacct gcagggttcc cggccgcccc tgggacgtgt cgtttgcatt 1320

agtactggcg gtctcgacat catcgtcagc gagattcggg accagtgcta cggtcccgag 1380

atgttccggg cggtcggtgt cgaacctgcg aaaaagcgct acgttgccgt aaagtcgtcc 1440

gagcagtgga gaatcggttt cggggacatg gggcgcagtg tgatctacgt cgcttcgagc 1500

cagcagtcgt ccatccgtca ctatcacaag cgctcccggc cgatgtggcc attcgagcct 1560

gtcgactttt cagcctagga gctc 1584

Claims (5)

1.突变微囊藻毒素降解蛋白基因，其核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3。

2.突变微囊藻毒素降解蛋白基因，所述基因通过USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C定点突变而来。

3.权利要求1所述的突变微囊藻毒素降解蛋白基因所表达的微囊藻毒素降解蛋白。

4.鞘氨醇单胞菌，其特征在于同时含有EQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3基因序列。

5.权利要求4所述的鞘氨醇单胞菌在降解微囊藻毒素中的应用。